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Formación in vitro del bulbo del ajo morado(Allium sativum L.)

In vitro formation of purple garlic(Allium sativum L.) bulb

H. Mujica1, M.E. Sanabria2, N. Mogollón2 y Y. Perozo

1Universidad Pedagógica Experimental "Libertador", Instituto Pe-dagógico de Barquisimeto; Departamento de Educación TécnicaAgropecuaria.2Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado"; Postgrados deAgronomía; Laboratorio de Microtecnia e Histopatología Vegetal yLaboratorio de Cultivo in vitro.

Resumen

Para estudiar la bulbificación in vitro del ajo morado (Allium sativum L.)se extrajeron ápices caulinares de los "dientes" del bulbo previamente greladosy desinfectados. Estos ápices se cultivaron en el medio de Murashige y Skoogcon 2,0 mg.L-1 de 2 isopenteniladenina (2ip); 0,1 mg.L-1 de ácido naftalenoacético(ANA) y 30 g.L-1 de sacarosa. Los cultivos crecieron a 41,54 µmol.m-2 s-1 de lumi-nosidad, fotoperíodo de 16 horas luz y 23 ±2ºC. Las vitroplantas regeneradasfueron seccionadas a 2 cm de longitud desde la corona de la planta, se elimina-ron sus raíces y se cultivaron en un medio para inducir la bulbificación, consti-tuido por los mismos componentes anteriores, excluyendo el ANA y aumentan-do la sacarosa a 90 g.L-1. Para los estudios histológicos se realizaron cincomuestreos de tres vitroplantas cada uno, entre los 0 y 28 días de cultivo. En labulbificación in vitro se distinguieron dos etapas de desarrollo. La primera co-rrespondió al estado morfogénico iniciado desde el día 0 hasta los 20 días decultivo, y la segunda, al llenado y maduración del bulbo a partir del día 7 de lainducción a la bulbificación. El bulbo se desarrolló por organogénesis directa,siendo su estructura similar al de cebolla hasta los 21 días, para luego diferen-ciarse por la formación de los "dientes". Las raíces adventicias se originaron delos meristemos en una región cerca al ápice del tallo.Palabras clave: cultivo in vitro, ajo morado, histología, bulbificación.

Recibido el 10-6-2005 Aceptado el 1-11-2007Autor de correspondencia e-mail: hmujicar@yahoo.com; mesanabria@ucla.edu.ve;norcam@intercable.net.ve

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Abstract

With the purpose of studying the in vitro bulb formation of the purplegarlic (Allium sativum L.) shoot tips of the "teeth" of the bulbs were extracted,sprouted, and disinfected. These shoot tips were cultivated in Murashige andSkoog medium with 2.0 mg.L-1 of isopenteniadenine (2ip); 0.1 mg.L-1 ofnaphthalene acetic acid (ANA) and 30 g.L-1 of sucrose. The cultures grew up at41.54 µmol.m-2.s-1 luminosity, 16 hours of light, and 23 + 2ºC. The in vitroregenerated plants were cut off at 2 cm of length from the plant neck; theirroots were cut off and cultivated in a bulb-formation medium, made up fromsimilar components, but excluding the ANA and incrementing the sucrose to90 g.L-1. For histological studies, five samplings of three in vitro plants eachwere conducted between the 0 to the 28 day of culture. In the in vitro bulbformation, two stages of development were observed. The first one correspondingto the morphological stage initiated from the 0 to the 20 day of culture, and thesecond one, to the filled and maturity begun on the 7 day of the bulb-formationinduction. The bulb developed by direct organogenesis, presenting an onion-like structure until the 21 day, differentiating later on by its "teeth" formation.The adventitious roots originated from the meristems in a region near the apexof the stem.Key words: in vitro culture, purple garlic, histology, bulb formation.

Introducción

El ajo (Allium sativum L.) es unaplanta herbácea constituida por unbulbo subterráneo, formado por "dien-tes" unidos en su base alrededor deltallo verdadero y recubiertos porcatáfilos blancos o morados, cuya to-nalidad varia según la variedad y laaltura del sitio de siembra (Ramos,1991). Las hojas son alargadas, pla-nas y envainadoras; las flores de co-lor rosado o verde y no producen se-millas. El falso tallo es blando, liso yde hasta 40 cm de longitud, de dondenacen bulbillos aéreos. El sistema ra-dical consta de numerosas raíces ad-venticias simples, delgadas y pocoramificadas que crecen superficialesen el suelo. Las especies de este géne-ro presentan el mismo patrón básico

Introduction

Garlic (Allium sativum L.) is anherbaceous plant formed by anunderground bulb, with "teeth"grouped in a basement around truestem and recovered by white or purplecataphyll, whose tone variesaccording variety and height ofsowing place (Ramos, 1991). Leavesare enlarged, flats and veined; flowersof pink or green color and they do notproduce seeds. Pseudo-stem is soft,smooth and until 40 cm length, fromwhere aerial bulblet. The root systemhave numerous simple adventitiousroots, thin and little ramified thatgrows superficially in soil. Species ofthis genus shows the same basicpattern of apical growth; both in rootand in stem and frequency of

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de crecimiento apical, tanto en la raízcomo en el tallo y la frecuencia de ra-mificación del brote apical varía conla especie, el cultivar y las condicio-nes de crecimiento (Brewster, 1994).

Las diversas metodologías tradi-cionales utilizadas para los estudioshistológicos, han contribuidosignificativamente en la comprensiónde la formación de nuevos individuospropagados por cultivo in vitro, ya quepermiten observar los cambiosmorfológicos y anatómicos que ocurrenen el tejido experimental. Además, pro-veen ideas de los procesos celulares quepermiten proponer hipótesis para futu-ras investigaciones (Yeung, 1999).

Los procesos morfogenéticos enlos cuales se logra la propagación invitro son variables y dependen prin-cipalmente de la relación auxina/citocinina (Him y Páez de Cásares,1998). Considerando que el desarro-llo de brotes in vitro tiene alguna va-riación epigenética, es convenienterealizar estudios histológicos paraconocer el origen de los órganos rege-nerados y también observar los dife-rentes cambios anatómicos que ocu-rren durante la organogénesis(Valverde et al., 1992).

Ayabe y Sumi (1998) realizaronestudios histológicos de tallo de ajo yobservaron que el desarrollo del bro-te estaba dividido en cuatro etapas:expansión de la zona rodeada por laparte basal de los primordios foliares,formación de las yemas axilares enforma de domo, diferenciación de layema directamente de cada domo y eldesarrollo del brote. Estos mismosautores señalaron que la formacióncelular interna y del domo fue simi-lar a la del ápice caulinar.

ramification of the apical shoot varywith specie, cultivar and growingconditions (Brewster, 1994).

Different traditionalmethodologies used for thehistological studies, have contributedin a significant way on theunderstanding of formation of newindividual propagated by in vitroculture, because they permit to observethe morphological anatomic changesthat occurs in the experimental tissue.Also, they provide idea about thecellular processes that permit topropone hypothesis for nextresearches (Yeung, 1999).

The morphogenetic process inwhich in vitro propagation is achievedis variables and principally dependson auxine/cytokinin relationship (Himy Páez de Cásares, 1998). Byconsidering that developing of in vitrobuds has any epigenetic variation, itis convenient to accomplishhistological studies for knowing theorigin of regenerated organs and also,to observe different anatomic changesthat occurs during organogenesis(Valverde et al., 1992).

Ayabe and Sumi (1998) madehistological studies of garlic stem andthey observed that bud developmentwas divided into four stages:expansion of zone rounded by thebasal part of the foliar primordial,axillary buds formation likedome-shaped, differentiation of thebud directly of each dome-shaped andshoot development. These authorssaid that the internal cellularformation and of dome-shaped wassimilar to the cauline apex.

Histological evaluations in floralexplants (Tulipa gesneriana L.),

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Evaluaciones histológicos enexplantes florales de tulipán (Tulipagesneriana L.), demostraron que laformación de brotes adventicios seinició a partir de las primeras dos ca-pas celulares subepidérmicas y unnúmero de células del explante origi-nal contribuyó a la formación de losmismos (Wilmink et al., 1995).

Considerando lo anteriormenteplanteado, el objetivo de esta investi-gación consistió en identificar los cam-bios morfológicos e histológicos queocurrieron durante la formación delbulbo de ajo morado (Allium sativumL.) desarrollado in vitro.

Materiales y métodos

Material vegetalSe utilizaron bulbos de ajo tipo

morado cosechados en estado de ma-durez, provenientes del caseríoVolcancito, Municipio Crespo, Esta-do Lara, ubicado a 1500 msnm y contemperatura media anual de 20 a25ºC. Dichos bulbos fueron disgrega-dos en sus respectivos "dientes" y semantuvieron bajo refrigeración (8 a10ºC) durante 15 días para estimularel proceso de grelación.

Propagación in vitroDespués que los "dientes" alcan-

zaron la grelación, se les eliminó la tú-nica protectora externa, y posteriormen-te, se desinfectaron sumergiéndolos enuna solución de Betadine® (2%),Kasumin® (20%) e Hipoclorito de sodio(i.a. 5,25%) al 20%, durante 20 minutosen cada uno. Después de cada desinfec-tante, los propágulos se enjuagaron tresveces con agua destilada estéril.

Bajo la cámara de flujo laminar(IAS-Burbank®) y con la ayuda de un

showed formation of adventitiousshoots begin from the first two cellularlayer sub-epidermal and a cellsnumber of the original explantcontributed to its formation (Wilminket al., 1995).

When considering the previouslyestablished, the purpose of thisresearch consisted on identify themorphological and histologicalchanges that happened during thebulb formation of purple garlic(Allium sativum L.) developed in vitro

Materials and methods

Vegetable materialGarlic bulbs of purple type,

harvested in maturity stage were used,coming from Volcancito, Crespomunicipality, Lara state, located at1500 msnm and with an annual meantemperature of 20 to 25ºC. These bulbswere dispersed in its respective "teeth"and they were maintained underrefrigeration (8 to 10ºC) during 15 daysfor stimulating the shooting process.

In vitro propagationAfter "teeth" reached shooting,

the external protector tunic, and theywere consequently disinfected byimmersion in a Betadine® solution(2%), Kasumin® (20%) and sodiumhypo chloride (i.a. 5.25%) to 20%,during 20 min in each of them. Aftereach disinfectant, propagules werewashed three times with steriledistilled water.

Under the laminar flux camera(IAS-Burbank®) and with theassistance of a stereoscopic microscope(Wild-MSA®), the disinfected garlic"teeth" were transversally halfsectioned, with the purpose of showing

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microscopio estereoscópico (Wild-MSA®), los "dientes" de ajo desinfec-tados se seccionarontransversalmente en la mitad, a finde exponer el ápice caulinar en creci-miento. Posteriormente se eliminaronlas hojas envainadoras, extrayendo eldomo meristemático con dosprimordios foliares. El explante obte-nido, de 2,0 mm de longitud aproxi-madamente, se colocó en una soluciónde Hipoclorito de sodio al 1% durante5 minutos y luego se enjuagó tres ve-ces con agua destilada estéril, antesde su cultivo en tubos de ensayocontentivos del medio nutritivo.

Para la obtención de lasvitroplantas, el medio empleado estu-vo constituido por las sales mineralesde Murashige y Skoog (1962), suple-mentado con 2 isopenteniladenina(2ip) 2,0 mg.L-1; ácido naftalenacético(ANA) 0,1 mg.L-1; tiamina 0,1 mg.L-1;ácido nicotínico 0,5 mg.L-1; piridoxina0,5 mg.L-1; inositol 100 mg.L-1, 30 g.L-1

de sacarosa y 8 g.L-1 de agar. Estemedio se dispensó en tubos de ensayo(25 x 150 mm) en alícuotas de 20 mLpor tubo, esterilizándolo en autoclavepor 15 minutos a 121ºC y 15 lb.pul-2 depresión. Para el crecimiento y desarro-llo de los explantes, los cultivos se co-locaron en un cuarto de crecimiento a41,54 µmol.m-2. s-1 de luminosidad, bajoun fotoperíodo de 16 h diarias y 23 ±2°C, durante treinta días.

Bulbificación in vitroLas vitroplantas obtenidas en la

fase anterior fueron empleadas parainducir la bulbuficación in vitro. Alrespecto, se seleccionaron aquellasque habían alcanzado un desarrolloadecuado (6 a 12 cm de longitud), ybajo la cámara de flujo laminar, los

the growing cauline apex.Subsequently, they limited thesheathing leaves, by extracting themeristematic dome-shaped with twofloral primordia. Explant obtained, of2.0 mm length approximately, wasplaced on a solution of sodium hypochloride to 1% during 5 min and afterwas washed three times with steriledistilled water, before its cultivationin essay tubes having the nutritivemedium.

For the vitro plants obtaining,medium used was formed by themineral salts of Murashige and Skoog(1962), supplemented with 2isopenteniladenine (2ip) 2.0 mg.L-1;naftalenacetic acid (ANA) 0.1 mg.L-1;thiamine 0.1 mg.L-1; nicotinic acid 0.5mg.L-1; pyridoxine 0.5 mg.L-1; inositol100 mg.L-1, 30 g.L-1 of sucrose and 8g.L-1 of agar. This medium wasdispersed in essay tubes (25 x 150mm) in aliquots of 20 mL tube, bysterilizing it on autoclave during 15min to 121ºC and 15 lb.pul-2 ofpressure. For the explants growingand development, culture was placedon a growing chamber at 41.54µmol.m-2.s-1 light, under a dailyphotoperiod of 16 h and 23 ± 2ºC,during thirty days.

In vitro bulb formationVitro plants obtained in

previous phase were used for inducethe in vitro bulb formation. On thisrespect, those that had reached anadequate developed were selected (6to 12 cm length), and under thelaminar flux camera, buds wereselected at 2 cm length from the plantneck and its roots were eliminated.These explants were cultivated inflasks of 250 mL having 20 mL of the

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brotes fueron seccionados a 2 cm delongitud desde la corona de la plantay eliminadas sus raíces. Estosexplantes se cultivaron en frascos de250 mL contentivos de 20 mL delmedio inductor de la bulbificación,previamente esterilizado en las mis-mas condiciones descritas para lamicropropagación.

El medio para inducir labulbificación in vitro estuvo constitui-do por los mismos componentes que elanterior, excluyendo el ANA y aumen-tando la sacarosa de 30 a 90 g.L-1. Loscultivos se colocaron en un cuarto decrecimiento a 61,58 µmol.m-2.s-1 de lu-minosidad, bajo un fotoperíodo de 16h diarias y 23 ± 2°C, durante 60 días.

Estudio histológicoLas plantas inducidas a

bulbificar in vitro fueron muestreadasdesde el día 0 hasta el día 28, a inter-valos de siete días, para un total decinco muestreos, extrayendo en cadauno de ellos, tres vitroplantas delmedio de cultivo. En los dos primerosmuestreos se eliminó la parte aéreade las vitroplantas, seccionándolas a2 cm desde el cuello de la misma;mientras que a partir del día 14 secortaron por encima del cuello delbulbo (3 a 4 cm aproximadamente).Estos materiales fueron fijados enF.A.A. (formol: alcohol: ácido acético70%) por un período mínimo de 24 h(Cutter, 1978). Posteriormente sedeshidrataron en una batería crecien-te de glicerina:agua, desde 20 a 100%y luego en otra batería decreciente deetanol-xilol, desde 100 a 25% (Torresy Mogollón, 1997).

Las muestras fueron incluidasen Paraplast X-Trac® a 56°C, por 24horas en la estufa. Los bloques con las

inducing medium of bulb formation,previously sterilized in the sameconditions described for micropropagation.

The inducing medium of the invitro bulb formation was formed by thesame components that the previousone, by excluding the ANA andincreasing sucrose of 30 to 90 g.L-1.Crops was placed in a growingchamber at 61.58 µmol.m-2.s-1 light, ina photoperiod of 16 h daily and 23 ±2ºC, during 60 days.

Histological studyThe induced plants to form in

vitro bulb formation were sampledfrom day 0 to day 28, at interval ofseven days for a total of fivesamplings, by extracting in each ofthem, three vitro plants of cultivationmedium. In the two first samplingsthe aerial part of vitro plants waseliminated, by choosing at 2 cm fromthe neck; whereas from day 14 theywere cut above bulb neck (3 to 4 cmapproximately). These materials werefixed F.A.A. (formalin: alcohol: aceticacid 70%) during a minimum periodof 24 h (Cutter, 1978). They weredehydrated in a growing battery ofglycerin: water, from 20 to 100% andafter in other decreasing battery ofethanol-xylol from 100 to 25% (Torresand Mogollón, 1997).

Samples were included inParaplast X-Trac® at 56ºC, during 24hours in oven. Blocks with structureswere transversal and longitudinallysectioned at 20mM with a displacingmicrotome (Leica® model 820) andtincture was made in a direct, total,supravital and panchromatic waywith eosin at 2%. Sections wereobserved, photographed and described

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estructuras se seccionaron transver-sal y longitudinalmente a 20 mM conun micrótomo de desplazamiento(Leica® modelo 820) y la tinción se rea-lizó de forma directa, total, supravitaly pancromática con Eosina al 2%. Lassecciones se observaron, fotografiarony describieron bajo un microscopioóptico (Olympus® BX40).

Resultados y discusión

El estudio de los cambioshistológicos que ocurrieron durante laformación in vitro del bulbo de ajopermitió distinguir dos etapas de de-sarrollo. La primera correspondió alestado morfogénico iniciada desde elestablecimiento de los brotesseccionados a 2 cm desde la corona dela planta (día 0), hasta 20 días des-pués de cultivados en el medio de in-ducción a la bulbificación. Esta etapase caracterizó por el comienzo de laproducción de hojas envainadoras des-de el meristemo apical y por un ligeroensanchamiento de la base del brote(figura 1A). La segunda etapa corres-pondió al llenado y maduración delbulbo, lo cual se observó después delséptimo día de cultivo en el medio deinducción a la bulbificación. Ésta secaracterizó por el crecimiento de lasyemas preformadas, ubicadas en lasaxilas de las hojas. Cada yema formóun "diente" del bulbo, continuando sudesarrollo hasta los 60 días (figuras1B y 1C).

El llenado del bulbo se produjopor la acumulación de fotoasimiladosy nutrientes en las hojasenvainadoras, contribuyendo al en-grosamiento del mismo. También seobservó que en esta segunda etapa,

under a optical microscope (Olympus®BX40).

Results and discussion

Study about histologicalchanges that occur during the in vitrobulb formation permitted todistinguish two development stages.The first one corresponded to themorphogenic state initiated from thebuds establishment sectioned at 2 cmfrom the plant neck (day 0) to 20 daysafter cultivation in the inducingmedium for the bulb formation. Thisstage was characterized by theproduction beginning of sheathingleaves from the apical meristem andby a light enlarging of the budbase (figure 1A). The second stagecorresponded to the filled andmaturity of bulb, which was observedafter seventh crop day in the inducingmedium to the bulb formation. Thiswas characterized by the preformedbuds growing, placed in the leavesaxil. Each bud formed a "teeth" ofbulb, following its development until60 days (figure 1B and 1C).

The bulb filled was produced bythe accumulation of photo assimilatesand nutrients in the sheathing leaves,by contributing to its thickened. Also,in the second stage, the leavesproduction continued from the centralapical meristem, placed in stem as adish way and the root primordiaformation from meristems. Theseresults were similar to those obtainedby Goleniowski et al., (2001), whenestablishing the same stages showeda maximum activity of solubleperoxidase in the morphogenic stageand the presence of ionic peroxidase

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continuó la producción de hojas des-de el meristemo apical central, ubica-do en el tallo en forma de disco y laformación de primordios de raíces apartir de los meristemos. Estos resul-tados fueron similares a los obtenidospor Goleniowski et al., (2001), al se-ñalar las mismas etapas, e indicaronuna máxima actividad de laperoxidasa soluble en la etapamorfogénica y la presencia deperoxidasas iónicas durante el llena-

Figura 1. Cambios morfológicos observados durante la formación invitro del bulbo de ajo (Allium sativum L.) tipo morado. (A)etapa morfogénica y (B y C) etapa de llenado y maduracióndel bulbo.

Figure 1. Morphological changes observed during in vitro formationof garlic (Allium sativum L.) bulb, purple type (A)morphogenic stage and (B and C) fill stage and bulbmaduration.

A B

C

during the bulb filled, which wereexplained as the result of the photoassimilates accumulation process.

From the beginning of bulbdevelopment (day 7), this showed asimilar structure to those describedin onion (Brewster, 1994), it means,seven sheathing leaves that recoverthe meristematic apex placed in thestem center. The buds differentiationof axillary buds that later would formthe "teeth", but if vascular bundle

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do del bulbo, lo cual explicaron comoel resultado del proceso de acumula-ción de fotoasimilados.

Desde los inicios del desarrollodel bulbo (día 7), éste presentó unaestructura similar a la descrita encebolla (Brewster, 1994), es decir, sie-te hojas envainadoras recubriendo elápice meristemático ubicado en el cen-tro del tallo. No se observó la diferen-ciación de las yemas axilares que for-marían más tarde los "dientes", perosi se detallaron los haces vascularesen las hojas externas, así como sus 6a 7 capas de tejido parenquimáticocorrespondientes al mesófilo (figurano mostrada).

En la figura 2 se presentan loscambios anatómicos que ocurrierondurante el proceso de desarrollo delbulbo. En el día 0, las secciones mos-traron la típica organización anatómi-ca de tallo, observándose el meristemoapical conformado por dos zonas: unaexterna que corresponde a la túnica yotra interna al corpus. La primera,constituida por una capa de célulasque envolvió al corpus, se dividió demanera anticlinal, y la segunda, poruna masa de posición central cuyascélulas se dividieron anticlinal ypericlinalmente (figura 2A). Estospatrones de división proporcionaronal ápice cambios cíclicos durante laformación de los primordios foliares.Inicialmente apareció como un peque-ño domo que se alargó gradualmente,y luego formó una protuberancia al-terna en un lado, lo que correspondióa la base foliar a partir de la cual seformó la yema que inició el "diente".Estas observaciones concuerdan conlas descripciones de Ayabe y Sumi(1998), quienes encontraron que la

were detailed in the external leaves,likewise its 6 or 7 layers ofmeristematic parenchymatic tissuecorresponding to the mesophilous (notshowed figure).

In figure 2 the anatomic changesthat occurred during the process ofbulb development are shown. On day0, sections showed the typical stemanatomic organization, by beingwatching the apical meristem formedby two regions: one external thatcorresponds to the tunic and the otherone internal, to the corpus. Theexternal one is formed by a cells layerthat enveloped the corpus, wasdivided of anticlinal way, and theinternal layer, by a mass of centralportion whose cells were divided ofanticlinal and periclinally way (figu-re 2A). These division patterns gavecyclical changes to the apex duringthe formation of foliar primordia.Initially, it appeared like a littledome-shaped that was graduallyenlarged and after it formed analternate protuberance in one side,that corresponded to the foliarbasement from which the bud thatbegan the "teeth". These observationsagree with descriptions of Ayabe andSumi (Ayabe and Sumi, 1998), whofound that internal cellularorganization and formation process ofthe structure in dome-shaped of invitro garlic were similar to thosehappened in situ.

From day 7 the first bulbformation modifications were observedby the thickened on the sheathingleaves basement and the increase onits number. In the primary thickenedregion the meristematic centersformed a group of little cells, of dense

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organización celular interna y los pro-cesos de formación de la estructuraen forma de domo del ajo in vitro, fue-ron similares a lo que ocurren in situ.

A partir del día 7 se observaronlas primeras manifestaciones debulbificación por el engrosamiento dela base de las hojas envainadoras y elincremento en el número de éstas. Enla región de engrosamiento primariofueron visibles los centrosmeristemáticos que estaban formadospor una agrupación de células peque-ñas, de citoplasma denso y núcleosdifusos fuertemente teñidos, lo cuales indicativo de una alta división ce-lular (figura 2B).

En el día 14, los meristemos res-ponsables del crecimiento de la raízse individualizaron y la polarizaciónde las divisiones celulares dieron laforma punteada al primordio radical(figura 2C). Paralelamente las hojasenvainadoras continuaron su desarro-llo hacia la periferia, incrementandoel grosor del bulbo. Así mismo, se di-ferenciaron los haces vasculares co-laterales con elementos traqueales (fi-gura 2D).

El desarrollo del bulbo se produ-jo por organogénesis directa median-te los procesos de inducción y diferen-ciación de los tejidos. Esto es compa-rable con lo descrito por Him y Páez(1998) en la formación in vitro delrizoma del jengibre (Zingiberofficinale R.), lo que probablementepuede ser típico de lasmonocotiledóneas. Las raíces se ori-ginaron de manera adventicia, a par-tir de los centros meristemáticos ubi-cados en la región de engrosamientoprimario, cerca del ápice del tallo.Luego emergieron a un lado de éste y

cytoplasm and diffuse nucleus stronglydyed were visible, that is indicative ofa high cellular division (figure 2B). Inday 14, meristems responsible of rootgrowing were individualized andpolarization of cellular divisions gavethe pointed shape to the rootprimordium (figure 2C). In a parallelway, the sheathing leaves continue itsdevelopment toward the periphery, byincreasing the bulb thick, likewise, thecollateral bundle with trachealelements (figure 2D).

The bulb development wasproduced by direct organogenesisthrough the processes of inductionand differentiation of tissues. This iscomparable to those expressed by Himand Paez (1998) in the in vitroformation of ginger rhizome (Zingiberofficinale R.), that could be probablytypical of monocotyledonous. Rootswere originated by adventitious way,from meristematic centers located inthe primary thickened region, next tothe stem apex. After, they emerged byone side of this, and they growhorizontally before of taking curvesand continue its growing towarddown, like described by Nuevo andBautista (2001).

Between days 21 and 28 (figure 3),bulb was partially developed andacquired a totally different configurationto the initial one, due to the "teeth"formation,which were formed by anexternal and dry protector leave, areserve thickened leave that formed thehigher mass and the apical meristem,similar to the first stages of bulbformation of in situ garlic, described byBrewster (1994) and Rahin andFordham (2001).

At 28 days of bulb formation

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crecieron horizontalmente antes detornarse curvas y continuar su creci-miento hacia abajo, tal cual lo descri-bieron Nuevo y Bautista (2001).

Entre los días 21 y 28 (figura 3),el bulbo se encontró parcialmente de-sarrollado y adquirió una configura-ción totalmente diferente a la inicial,debido a la formación de los "dientes".Estos estaban constituidos por unahoja protectora externa y seca, unahoja de reserva engrosada que confor-maba la mayor masa y el meristemoapical, similar a las primeras etapas

Figura 2. Cambios anatómicos observados durante el desarrollo in vitrodel bulbo de ajo (Allium sativum L.) tipo morado. A: 0 día; B:7 días; C y D: 14 días; d: domo meristemático; pf: primordiosfoliares; he: hojas envainadoras; m: meristemo; rep: regiónde engrosamiento primario; pr: primordio radical, et:elementos traqueales. 400X.

Figure 2. Anatomic changes observed during in vitro development ofgarlic (Allium sativum L.) bulb, purple type. A: 0 days; B: 7days; C and D: 14 days; d: meristematic domo; fp: foliarprimordia; sl: sheathing leaves; m: meristem; ptr: primarythickened region; rp: root primordia, te: tracheal elements.400X.

induction, bulbs showed three or four"teeth", formed from the axillary budsthickened located in basement of thesheathing leaves, by partiallydetermining its configuration. Fromthis period, the formation process ofnew "teeth" and development of thosealready existents, in such a way thatat the end of bulb formation period(60 days), bulbs reached a mean ofseven "teeth". These observationsdiffers from described by Camara etal., (1993), when founding that at 30days the garlic bulbs cv. ‘Gigante

A B

C D

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de la formación del bulbo de ajo insitu, descritas por Brewster (1994);Rahin y Fordham (2001).

A los 28 días de la inducción a labulbificación, los bulbos presentaronde tres a cuatro "dientes", formados apartir del engrosamiento de las yemasaxilares ubicadas en la base de lashojas envainadoras, determinandoparcialmente su configuración. A par-tir de este período continuó el procesode formación de nuevos "dientes" y eldesarrollo de los ya existentes, de talmanera que al final del periodo debulbificación (60 días), los bulbos lle-garon a alcanzar un promedio de sie-te "dientes". Estas observaciones di-fieren de lo descrito por Câmara et al.

Figura 3. Estructura anatómica del bulbo de ajo (Allium sativum L.)tipo morado a los 28 días del proceso de bulbificación in vitro.400X. d: "dientes", hp: hoja protectora, hr: hoja de reserva.

Figure 3. Anatomic structure of garlic (Allium sativum L.) bulb, purpletype at 28 days of in vitro bulb process 400X. t: "tooth", pl:protector leave, rl: reserve leaf.

Roxo’ were in harvest stage. Thisdifference could be attributed to aproper answer of cultivar used and tothe nutritional conditions ofenvironment and those of cultivationin relation to light and temperaturewere not the same.

Conclusions

Bulb formation in vitro garlicincluded two development stages: thefirst one corresponding to themorphogenic state and the secondone, to its filled and maturity

The first traces of in vitro bulbformation were observed from day 7being characterized by the thickening

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(1993), al encontrar que a los 30 díaslos bulbos de ajo cv. ‘Gigante Roxo’estaban en estado de cosecha. Estadiferencia podría atribuirse a una res-puesta propia del cultivar utilizado yal hecho de que las condicionesnutricionales del medio y las de culti-vo en cuanto a luz y temperatura, nofueron exactamente las mismas.

Conclusiones

La formación del bulbo de ajo invitro comprendió dos etapas de desa-rrollo: la primera correspondiente alestado morfogénico y la segunda, alllenado y maduración del mismo.

Los primeros indicios debulbificación in vitro se observaron apartir del día siete, caracterizándosepor el engrosamiento de la base de lashojas envainadoras y el cambio en laintensidad de la coloración, a medidaque el bulbo fue desarrollándose.

A los 21 días de haberse inicia-do el proceso de bulbificación in vitrodel ajo, se observó la formación de los"dientes" a partir de las yemas ubica-das en las axilas de las hojasenvainadoras.

Las raíces adventicias formadasen los bulbos de ajo in vitro se origi-naron a partir de los meristemos ubi-cados en la región de engrosamientoprimario, cerca del ápice del tallo.

Agradecimientos

Los autores expresan el agrade-cimiento al Consejo de DesarrolloCientífico, Humanístico y Tecnológi-co (CDCHT-UCLA) proyecto No.CDCHT-017-AG-2006 por elcofinanciamiento a esta investigación.

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At 21 days of beginning theprocess of garlic in vitro bulbformation, the "teeth" formation wasobserved from the buds located in theaxil of the sheathing leaves.

The adventitious roots formed ingarlic in vitro bulb were originatedfrom meristems located in theprimary thickened region, next to thestem apex.

Acknowledgements

Authors want to express theirthanks to the Consejo de DesarrolloCientifico, Humanistico andTecnologico (CDCHT-UCLA) projectNo. CDCHT-017-AG-2006 by the co-financing to this research.

End of english version

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