Patch clamp 1

Patch clampTécnica de fijación de membranas (en ingles patch clamp)En electroscopia la fijación de membranas es una técnica de laboratorio que permite el estudio individual o múltiplede canales iónicos. Esta técnica puede ser aplicada en una amplia variedad de células, pero es especialmente útil enel estudio de células excitables como las neuronas cardiomiocitos, fibras musculares y células pancreáticas beta.También puede ser aplicada al estudio de los canales iónicos en las bacterias principalmente en esferoplastosgigantes preparados. La fijación de membranas es una mejora de la abrazadera de voltaje, desarrollada por ErwinNeher y Bert Sakmann a finales de los 70 y comienzos de los 80. Este descubrimiento registró las corrientes de uncanal iónico por primera vez, demostrando su participación en prosesos fundamentales de la célula como laconducción del potencial de acción. Neher y Sakmann recibieron el Premio Nobel en Fisiología o Medicina en 1991gracias a este trabajo.

Técnica básicaLa grabación en la fijación de membrana usa una micropipeta como electrodo que tiene una punta abierta de cerca deun micrómetro de diámetro, un tamaño que encierra un área superficial que a menudo contiene uno o pocos canalesiónicos moleculares. Este tipo de electrodo es diferente del Sharp micorelctrode utilizado para implantar células enregistros intracelulares tradicionales donde es sellado en la superficie de la membrana celular, en lugar de insertarlas.En algunos experimentos la punta de la micropipeta es calentada en una micro forja para producir una superficiesuave que ayuda a formar un sello de alta resistencia con la membrana. El interior de la pipeta es llenado con lasolución correspondiente a la composición iónica de la solución de baño, como en el caso de la grabación conectadapor células o el citoplasma de todas las células. Un alambre de cloruro de plata es puesto en contacto con estasolución y conduce la corriente eléctrica al amplificador. El investigador puede cambiar la composición de lasolución o adicionar medicinas para estudiar los canales iónicos bajo diferentes condiciones. La micropipeta presionaotra vez la membrana celular para ayudar a la formación de un sello de alta resistencia entre el vidrio y la membrana(un gigasello ya que la resistencia eléctrica es mayor a la de un sello gigahom). La gran resistencia de este sello haceposible aislar eléctricamente las corrientes moderadas a través de la fijación de membrana con la incursión de pocoruido, de esta forma brinda una estabilidad mecánica a la grabación. A diferencia de la grabación tradicional de laabrazadera de voltaje con dos electrodos, la fijación de membranas usa un solo electrodo para registrar corrientes.Muchos amplificadores de la fijación de membranas no utilizan un verdadero circuito de abrazadera de voltaje sinoamplificadores diferenciales que utilizan un electrodo para establecer el nivel cero de corriente. Esto permite alinvestigador mantener un voltaje constante mientras se observa cambios en la corriente. Alternativamente puede sersujetada completamente manteniendo la energía constante mientras se observan cambios en el voltaje de lamembrana.

Patch clamp 2

Un esferoplasto arreglado con una pipeta decristal

Variaciones

Algunas variaciones pueden ser aplicadas dependiendo de lo que elinvestigador quiera estudiar, las técnicas “inside-out” y “ outside-out”se llaman membrana extirpada ya que la membrana es removida de lasuperficie principal de la célula. Las técnicas de agrupación de célulasy membrana extirpada son usadas para estudiar el comportamiento decanales iónicos individuales en la sección de la membrana unida alelectrodo. El “whole-cell patch” y el parche perforado permite alinvestigador estudiar el comportamiento eléctrico de toda la célula, enlugar de corrientes en un solo canal. El “whole-cell patch” permiteacceso al interior de la célula por medio de una resistencia eléctricabaja, actualmente esta técnica ha sustituido en gran medida técnicas de grabación con electrodos de alta resistenciapara registrar corrientes a través de toda la membrana celular. Técnica de agrupación de células En esta técnica elelectrodo es sellado a un trozo de membrana y la célula permanece intacta. Esto permite la grabación de lascorrientes a través de un solo canal iónico en esa parte específica de la membrana, sin perturbar el interior de lacélula. Para los canales que están modulados por receptores metatrópicos, el neurotransmisor o droga en estudio esusualmente incluido dentro de la solución en la pipeta, donde puede hacer contacto con lo que había sido lasuperficie externa de la membrana. Mientras la actividad resultante del canal puede atribuirse a la droga usada,usualmente no es posible cambiar la concentración de la droga. Así la técnica se limita a un punto en la curva derespuesta de dosis por cada parte. Habitualmente la reacción de la dosis se lleva a cavo usando varias células ymembranas. De todas formas el “voltage-gated ion channels” puede ser sujetados en diferentes potenciales demembrana usando la mismo lugar, lo que causa la activación del canal y completa la curva I – v (corriente-voltaje)puede ser estabilizada con una sola fijación de membrana.

Patch clamp 3

El diagrama muestra las variaciones de la técnica de fijación demembrana

“inside-out patch”Después de la formación del gigasello, la micro pipetaes rápidamente retirada de la célula, de esta formarasgado el parche de la membrana celular, elparchequeda unido a la micro pipeta, de esta formaqueda la superficie intracelular de la membrana quedaexpuesta al medio externo. Esto es muy útil para elinvestigador cuando desea manipular el medioambiente en la superficie intracelular de los canalesiónicos. Por ejemplo los canales que se activan porligamentos intracelulares pueden ser estudiados através de un rango de concentraciones de ligandos.

“whole-cell patch”

Grabación de una célula entera de una neuronadel Hipocampo. La pipeta en la fotografía ha sido

marcada con un color leve azul.

En contraste el “whole-cell patch” involucra grabaciones de Corrientesa través de múltiples canales a la vez sobre toda la membrana celular.El electrodo se deja en el lugar de la célula, pero se aplica mas succiónpara romper cierto “pedazo” de la membrana, produciendo así unacceso al espacio intracelular. La ventaja del “whole-cell patch” sobrela grabación con micro electrodo de punta (puntudo), es que la aperturamás grande de la pico en la fijación de membrana provee menorresistencia y en consecuencia mayor acceso eléctrico al interior de lacélula. Una desventaja de esta técnica es que el volumen del electrodoes mayor que el de la célula, de este modo el contenido al interior de lacélula es lentamente remplazado por el que está en el electrodo, esto seconoce como la dialices del contenido. Debido a esto cualquierpropiedad de la célula que dependa del contenido intercelular se altera.Usualmente la solución utilizada en la pipeta se aproxima a un contenido con mucho potasio como en el interiorcelular. Generalmente el comienzo del “whole-cell patch” tarda aproximadamente 10 minutos, en este espacio esposible hacer mediciones antes de comenzar la diálisis.

Patch clamp 4

“Outside-out patch”Después de formado el “whole-cell patch”, el electrodo puede ser lentamente retirado de la célula, permitiendo a unbulbo de la membrana “bleb out” de la célula. Cuando el electrodo esta halado lo suficiente, esta “bleb” se separa dela célula y se reforma como una membrana convexa en el final del electrodo (como una pelota abierta en la punta delelectrodo), con la parte exterior de la membrana hacia el exterior del electrodo, de esta manera si el “bleb” de lamembrana es lo suficientemente pequeñas posible realizar grabaciones de un solo canal. “Outside-out patch” brindaal investigador la oportunidad de estudiar las propiedades de un canal iónico cuando se aísle de la célula y se exponea diferentes soluciones en la superficie extracelular de la membrana. Esta es la ventaja distintiva que tiene el“Outside-out patch” frente al “whole-cell patch”. Sin embargo es más difícil de realizar ya que conlleva mas pasos ensu elaboración.

Fijación de membrana perforadaEn esta variación del “whole-cell patch “ el investigador comienza desde el la creación del gigohm, pero no usasucción para romper el “pedazo” de la membrana. En este método el electrodo contiene una concentración menor dela solución de un agente antibiótico o antifúngico como el anfotericina beta, nistatina, la gramicidina. Como lasmoléculas de antibiótico se difunden dentro de la membrana fijada en pequeñas perforaciones, proveen accesoeléctrico al interior de la célula. Este método tiene la ventaja de reducir la diálisis de la célula que ocurre en el“whole-cell patch” , pero también tiene varias desventajas. En primer lugar la resistencia la acceso es alta en relacióncon el “whole-cell patch”, debido a que la membrana parcial ocupa la punta del electrodo (la resistencia al accesoresulta siendo la suma de la resistencia del electrodo y la resistencia a la unión electrodo-célula).Esto disminuiría elacceso eléctrico y en consecuencia la proporción de corriente, además se incrementa el ruido en la grabación y semagnifica cualquier serie de error de resistencia. Segundo puede tomar una significante cantidad de tiempo para queel antibiótico perfore la membrana(10 – 30 minutos, pero puede ser reducido situando los electrodos en la formacorrecta). Tercero la membrana debajo de la punta del electrodo es debilitada debido a las perforaciones formadaspor el antibiótico y puede romperse. Si el “pedazo” de membrana se rompe la grabación cambia a toda la célula y elantibiótico contamina el interior de la célula.

Parche sueltoLa fijación suelta de membrana se diferencia ya que usa un sello suelto en lugar de un gigacello hermético usando enla técnica convencional .Una ventaja del sello suelto es que la pipeta que se usa puede ser movida repetitivamente dela membrana luego de la grabación y aun así la membrana permanecerá intacta. Este método permite repetirmediciones en varios lugares de la célula sin destruir la integridad de la membrana. Por otro lado un gran desventajaes que la resistencia entre la pipeta y la membrana es reducida grandemente, permitiendo a la corriente filtrase através del sello. Este filtrado puede ser corregido, pero de todos modos este método ofrece la oportunidad decomparar y constatar grabaciones hechas desde diferentes áreas en la célula de interés.

Fuentes y contribuyentes del artículo 5

Fuentes y contribuyentes del artículoPatch clamp  Fuente: http://es.wikipedia.org/w/index.php?oldid=61823353  Contribuyentes: Alex299006, Janoiki, Juanygerman, Kokoo, Technopat, 10 ediciones anónimas

Fuentes de imagen, Licencias y contribuyentesArchivo:Patchclamp Spheroplast1.jpg  Fuente: http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Archivo:Patchclamp_Spheroplast1.jpg  Licencia: Public Domain  Contribuyentes: Original uploaderwas Vlad75 at en.wikipediaArchivo:Patchmodes.svg  Fuente: http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Archivo:Patchmodes.svg  Licencia: Public Domain  Contribuyentes: Bilz0rArchivo:WholeCellPatchClamp-03.jpg  Fuente: http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Archivo:WholeCellPatchClamp-03.jpg  Licencia: Public Domain  Contribuyentes: derivative work:Rosentod (talk) WholeCellPatchClamp.jpg: レ イ キ ャ ビ ク 22:10, 6 April 2007 (UTC)

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