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Inducción de brotes de Valeriana officinalis a partir de yemas apicales y axilares Espín Pamela, Guerra Karla, Guevara Patricia, Játiva Sofía 1 1 Escuela Politécnica del Ejército (ESPE), Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ingeniería en Biotecnología, PO Box: 171-5-231-B. Sangolquí-Ecuador. E-mails: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected] RESUMEN El propósito de este trabajo fue inducir brotes de Valeriana officinalis a partir de yemas apicales y axilares mediante la utilización de la técnica de cultivo in vitro. Para ello se recolectaron muestras de Valeriana officinalis en la Reserva Ecológica El Ángel (Carchi- Ecuador). A continuación, se rociaron con fungicida y ácido cítrico, cubriendo el sitio del corte con papel parafilm para su transporte al laboratorio. De dichas muestras se cortaron explantes de 1-1,5cm los cuales se lavaron con detergente 3% (10 minutos), luego se realizó tres lavados con agua estéril; finalmente, se sometió a los explantes a una solución de cloro al 5%, con 3 gotas de Tween-20 por cada 100ml, durante 10minutos. Para la siembra se utilizó medio MS + 1 mg L -1 de BAP. Al final se obtuvo 8 frascos sembrados (1 explante por frasco). Los resultados fueron observados a los 16 días de la siembra, y se obtuvo que la viabilidad del total de explantes introducidos fue de un 12,5% que representó los dos únicos explantes con viabilidad intermedia calificados con 1 en una escala de 0 a 2. De igual forma, se logro determinar un porcentaje de necrosis del 68,75% y un porcentaje de contaminación del 31,25% que se debió principalmente a bacterias. Por lo que se concluye que la inducción de brotes en Valeriana officinalis, se vio afectada principalmente por la

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Inducción de brotes de Valeriana officinalis a partir de yemas apicales y axilares

Espín Pamela, Guerra Karla, Guevara Patricia, Játiva Sofía1

1 Escuela Politécnica del Ejército (ESPE), Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ingeniería en Biotecnología, PO Box: 171-5-231-B. Sangolquí-Ecuador.

E-mails: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]

RESUMENEl propósito de este trabajo fue inducir brotes de Valeriana officinalis a partir de yemas apicales y axilares mediante la utilización de la técnica de cultivo in vitro. Para ello se recolectaron muestras de Valeriana officinalis en la Reserva Ecológica El Ángel (Carchi-Ecuador). A continuación, se rociaron con fungicida y ácido cítrico, cubriendo el sitio del corte con papel parafilm para su transporte al laboratorio. De dichas muestras se cortaron explantes de 1-1,5cm los cuales se lavaron con detergente 3% (10 minutos), luego se realizó tres lavados con agua estéril; finalmente, se sometió a los explantes a una solución de cloro al 5%, con 3 gotas de Tween-20 por cada 100ml, durante 10minutos. Para la siembra se utilizó medio MS + 1 mg L -1 de BAP. Al final se obtuvo 8 frascos sembrados (1 explante por frasco). Los resultados fueron observados a los 16 días de la siembra, y se obtuvo que la viabilidad del total de explantes introducidos fue de un 12,5% que representó los dos únicos explantes con viabilidad intermedia calificados con 1 en una escala de 0 a 2. De igual forma, se logro determinar un porcentaje de necrosis del 68,75% y un porcentaje de contaminación del 31,25% que se debió principalmente a bacterias. Por

lo que se concluye que la inducción de brotes en Valeriana officinalis, se vio afectada principalmente por la producción de compuestos fenólicos que no permitieron un correcto desarrollo en el medio de cultivo, ocasionando elevados niveles de necrosis en los explantes manipulados. Además que la mala manipulación y el proceso de desinfección del explante, ocasionaron una contaminación por bacterias en su mayoría, que también afectó la viabilidad de los mismos.

Palabras Clave: Valeriana officinalis, cultivo in vitro, inducción de brotes.

INTRODUCCIÓNAl norte del Ecuador, en la provincia del Carchi, se encuentra ubicada La Reserva Ecológica El Ángel a 3523 msnm. Está constituida por 15715 hectáreas de páramo y bosque de frailejones (Halberstadt, 2010). Dentro del páramo El Ángel se encuentra la reserva "Polylepis Lodge" conformada por una gran diversidad de especies animales y vegetales. Especies vegetales encontradas en la zona son: La hierba del infante del cerro (Lachemilla orbiculata), Zarcillo Sacha (Brachyotum jamesonii), Frailejones (Espeletia pycnophylla), Cardón Santo

(Erymgium humile), Valeriana (Valeriana officinalis), diferentes variedades de gencianas y orquídeas, etc. Las especies animales abarcan desde una gran diversidad de aves: colibríes de diferentes tipos, cara-caras, halcones y patos salvajes, hasta mamíferos: zorros y ciervos. Este sector es uno de los pocos lugares en Ecuador donde todavía se puede ver el famoso Cóndor de los Andes (Vultur gryphus) (Halberstadt, 2010).Valeriana officinalis, conocida como Valeriana, es una planta perenne con una altura que va desde 20 hasta 120 cm. Los rizomas, de color gris-amarillento, son ovoides o cilíndricos de 3-5 cm, están cubiertos por muchas raíces pequeñas. Las hojas son pinnadas con foliolos dentados. Las flores son pequeñas de color rosa pálido, acomodadas en forma de corimbo terminal (Muñoz et al., 1999; Fonnegra et al., 2007). Constituye la materia prima para la fabricación de fármacos para el equilibrio nervioso. Además, se usa mucho como sedante y calmante en el control de histeria, insomnio, neurosis, calambres abdominales (cólicos), hiperexcitabilidad, alteraciones menopáusicas, etc. Se emplea sola o combinada con anticonvulsivantes en trastornos convulsivos. El extracto fermentado de valeriana o su infusión se aplica fumigado en agricultura ecológica para proteger a las plantas de las heladas tardías.El cultivo in vitro es una técnica que permite la multiplicación de plantas clones libres de enfermedades. Las porciones más adecuados para utilizarse como explantes son las hojas y yemas en la inducción de respuestas morfogénicas in vitro (Azcon, 2001; Fonegra et al., 2007; Muñoz et al., 1999). Por ello el propósito de este trabajo es inducir brotes de Valeriana officinalis a

partir de yemas apicales y axilares mediante la utilización de la técnica de cultivo in vitro.

MATERIALES Y MÉTODOSSe tomaron muestras de yemas apicales de plantas ubicadas en la reserva El Ángel (Carchi-Ecuador). Las plantas fueron seleccionadas en base a sus características morfológicas, el número de yemas (apicales y axilares) y la ausencia de enfermedades y contaminación a simple vista. Las ramas fueron cortadas con tijeras para podar, tratando en lo posible de obtener muestras que se encuentren en la parte media de la planta. Las muestras se rociaron con fungicida. Además, se roció ácido cítrico al 1%, sobretodo en el sitio donde se cortó la rama, mismo que posteriormente se cubrió con parafilm. Finalmente, se las muestras se colocaron en fundas plásticas y en un cooler para ser transportadas al laboratorio. Ya en el laboratorio, a cada muestra se cortó las hojas en exceso. El explante (yemas apicales y terminales) se obtuvo mediante cortes con bisturí con una medida longitudinal entre 1 y 1,5 cm. El proceso de desinfección estuvo constituido por varias etapas: se lavó con abundante agua corriente para eliminar los contaminantes superficiales; se sumergió los explantes en una solución de detergente al 3%, durante 10 minutos; a continuación, se lavó tres veces con agua estéril para retirar el exceso de detergente; finalmente, se sometió a los explantes a una solución de cloro al 5%, con 3 gotas de Tween-20 por cada 100ml, durante 10minutos. Para la inoculación de los explantes, en cámara de flujo laminar se lavó los explantes 3 veces con agua estéril para eliminar el exceso de hipoclorito de sodio. Se removió las partes oxidadas por el cloro y se inoculó un

explante por frasco (medio MS + 1 mg L-1 de BAP).Se realizaron ocho siembras en total las cuales se incubaron a 22°C, 0.6456 Luxes y 49% de humedad. Se reportaron cambios a los 16 días de la siembra.RESULTADOSLos resultados fueron observados a los 16 días de la siembra. La viabilidad del total de explantes introducidos fue de un 12,5% que representa los dos únicos explantes con viabilidad intermedia calificados con 1 en

una escala de 0 a 2 como se observa en el Gráfico 1. De igual forma, se logró determinar un porcentaje de necrosis del 68,75%, de los cuales la mayoría presentaba una necrosis intermedia; y un porcentaje de contaminación del 31,25% debido principalmente a bacterias que colonizaban alrededor de a base del explante. A continuación se observan dichos resultados de viabilidad, necrosis y contaminación en los Gráficos 1, 2 y 3 respectivamente.

1 2 3 4 5 6 7 80

1

2

Gráfico 1. Resultados de viabilidad de los explantes de Valeriana a los 16 días de la siembra.Interpretación: Viable (2), Intermedio (1), No viable (0)

Explante

Viab

ilida

d

1 2 3 4 5 6 7 80

1

2

Gráfico 2. Resultados de necrosis de los explantes de Valeriana a los 16 días de la siembra. Interpretación: Necrosado (2), Intermedio (1), No necrosado (0)

Explante

Nec

rosid

ad

1 2 3 4 5 6 7 80

1

2

B B B B B y H

Gráfico 3. Resultados de contaminacion de los explantes de Valeriana a los 16 días de la siembra. Interpretación: Contaminado (2), Intermedio (1), No contaminado (0); Factor de

contaminación: Hongo (H), Bacteria (B)

Explante

Cont

amin

ació

n

En las imágenes que se muestra a continuación (Imagen 1) se puede verificar el estado de los explantes a los 16 días de la siembra, donde claramente se visualiza la viabilidad de los dos explantes de los frascos

con número 1 y 5 (por debajo de la superficie del agar); la necrosis avanzada en los explantes 6, 7 y 8, y la contaminación por hongo en el frasco número 7.

Imagen 1. Estado de los explantes de Valeriana officinalis a los 16 días de la siembra.

DISCUSIÓNComo pudimos observar, el mayor problema en la inducción de Valeriana, fue el elevado porcentaje de necrosis que presentaron los explantes (68,75%). Por lo que se considera este factor como el principal determinante para que solo dos explantes hayan podido ser considerados viables. Éste es un fenómeno frecuente en varias especies, especialmente en las plantas leñosas, con importantes implicaciones prácticas y económicas. El daño o muerte celular se puede producir por la reacción de especies químicas muy reactivas como las quinonas que son producto de la oxidación de compuestos fenólicos por la enzima polifenol oxidasa (PPO), así como la oxidación de radicales libres de diferentes componentes celulares (Azofeifa, 2009). Por lo general, los sustratos de estas enzimas PPOs varían entre los diferentes tejidos, siendo comúnmente la tirosina o los fenoles. La enzima entra en contacto con el sustrato cuando la célula sufre algún daño, estrés o se encuentra en estado senescente dando como resultado a muerte del explante. En el caso particular del cultivo in vitro, la oxidación es causada principalmente por el efecto abrasivo del agente desinfectante aplicado durante la

asepsia del explante, los cortes que sufre, la composición del medio de cultivo o incluso el volumen y calidad del frasco de cultivo (Azofeifa, 2009).El explante número 5 que podemos visualizar en la Imagen 1 se consideró como viable a pesar de su oscurecimiento en la parte localizada sobre el agar, porque el resto se mantenía completo y sin ningún agente que afecte su desarrollo como bacteria u hongo. Para ello, Azofeifa (2009) menciona en su publicación que una de las medidas prácticas para el manejo del oscurecimiento de los explantes cultivados in vitro es podar el tejido necrosado y hacer uso de sellos en el explante, pues se considera que esto promueve la recuperación y crecimiento del mismo; por otro lado, los sellos de cera de parafina en los bordes del explante, también son una buena manera de reducir la liberación de fenoles y evitar oscurecimiento del medio de cultivo en caso de que esto suceda.En cuanto a los microorganismos contaminantes se pudo diferenciar agentes fúngicos y bacterianos, siendo estos últimos los que se presentaron en mayor proporción. Se conoce que la contaminación microbiana puede tener dos orígenes: a) microorganismos que colonizan la superficie

o el interior del explante (endófitos) y b) microorganismos introducidos durante la manipulación en el laboratorio (Hernández & Gonzáles, 2010). Y dada la ubicación del foco de contaminación (alrededor del explante), se podría asumir que los microorganismos provenían del mismo explante o que hubo contaminación al momento de la siembra. Las bacterias que crecieron en el medio de cultivo eran de color blanquecino, y cubrían el explante en la base a manera de lóbulos, por lo que se sospecha que pertenecían a las familias Pseudomonadaceae y Enterobacteriaceae pues según Leifert et al. (1994) en las primeras fases de la micropropagación, las bacterias que se detectan son gram negativas, pertenecientes a estas familias y se explica porque son las más abundantes en la superficie aérea de las plantas.

CONCLUSIONESLa inducción de brote de Valeriana officinalis, se vio afectada principalmente por la producción de compuestos fenólicos que no permitieron un correcto desarrollo en el medio de cultivo, ocasionando elevados niveles de necrosis (68,75%) en los explantes manipulados. Además que la mala manipulación del explante y un posible fallo en el proceso de desinfección, ocasionó una contaminación por bacterias en su mayoría, que también afectó la viabilidad de los mismos. Y se sospecha que estas bacterias pertenecen a las familias Pseudomonadaceae y Enterobacteriaceae ya que son las más abundantes en la superficie aérea de las plantas.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS1. AZCÓN, B. (2001). Fundamentos de

Fisiología Vegetal. Mc Graw-Hill Interamericana. España.

2. AZOFEIFA, A. (2009). Problemas de oxidación y oscurecimiento de explantes cultivados in vitro [en línea] [Consultado el: 19 mayo 2013]. Disponible en: <http://www.latindex.ucr.ac.cr/agromeso-20-1/v20n1_p153-Azofeifa.pdf>

3. FONNEGRA R., JIMÉNEZ S., (2007), Plantas medicinales aprobadas en Colombia, Editorial Universidad de Antioquia, Segunda Edición, Colombia. Pág. 80. [En línea] [Consultado el: 19 mayo 2013]. Disponible en: <http://books.google.com.ec/books?id=K8eI7ZeFpsC&pg=PA257&dq=valeriana+officinalis&hl=es&sa=X&ei=FFCaUYOXKIX48wToxoGoCg&ved=0CCwQ6AEwAA#v=onepage&q&f=true>

4. HALBERSTADT. (2010). Ecuador & the Galapagos Islands. Viva publishing Network. Ecuador. Pp 195-196.

5. HERNÁNDEZ Y., & GONZÁLEZ M. (2010). Efectos de la contaminación microbiana y oxidación fenólica en el establecimiento in vitro de frutales perennes [en línea] [Consultado el: 19 mayo 2013]. Disponible en: < http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0258-593620100004000 15&script=sci_arttext>

6. LEIFERT C., MORRIS C. Y WAITES W. (1994). Ecology of microbial saprophytes and pathogens in tissue culture and field grown plant: reason for contamination in vitro. Critical Review in Plant Sciences 13: 139-181

7. MUÑOZ O., MONTES M., WILKOMIRSKY T., (1999), Plantas medicinales de uso en Chile: química y farmacológica. Editorial Universitaria. Chile. Pág. 297. [En línea] [Consultado el: 19 mayo 2013]. Disponible en:<http://books.google.com.ec/books?id=cuviT1SKao8C&pg=PA297&dq=valeria

na+officinalis&hl=es&sa=X&ei=FFCaUYOXKIX48wToxoGoCg&ved=0CDQQ6AEwAQ#v=onepage&q&f=true>