Interacciones genético-ambientales en la salud

humana

William J. Jo, M.S., Ph.D.Department of Nutritional Sciences

and ToxicologyUniversity of California, Berkeley, CA,

U.S.A.williamjo@berkeley.edu

Financiamiento

National Institute of Environmental Health Sciences(NIEHS), National Institute of Health (NIH), USA

Superfund Basic Research Program at UC Berkeley (SBRP)

Interacciones genético-ambientales en la salud humana

•Variabilidad genética y su influencia en los efectos del ambiente sobre la salud humana

•Identificando nuevos genes que influyen interacciones genético-ambientales▫Determinación del genotipo a nivel de

individuo (genotyping)▫Perfilamiento funcional en levadura

Variabilidad genética y respuestas a estímulos medio ambientales

• Diferencia en la respuesta de las personas hacia xenobióticos (e.g. fármacos, toxinas, toxicantes) → variabilidad genética

• Algunos individuos o subpoblaciones estan más o menos propensos a desarrollar enfermedades a consecuencia de estar expuestos crónicamente a substancias tóxicas

Estudiando el impacto del medio ambiente en la salud humana

Salud / Enfermedad

GenéticaAmbiente

Edad

Determinar el rol de las variaciones en el genoma humano como modificadores de los efectos nocivos de contaminantes en el ambiente (i.e. interacciones genético-ambientales)

Los polimorfismos de un nucleótido son la fuente de variación mas comun

• = single nucleotide polymorphism (SNP)

• Variación en un nucleótido en la secuencia del DNA

• SNP ≠ mutación, definido por la frecuencia en la población (> 1%)

• Se estima que hay un SNP por cada 1,000 bp (~10,000,000) en el genoma humano

Como es que ciertos SNPs pueden influenciar en la salud humana?

•No todos los SNPs interaccionan con el ambiente

•SNPs con efectos en la actividad catalítica, función, estabilidad o niveles de expresión de proteinas implicadas con el metabolismo o detoxificación de xenobióticos

•e.g. genotipo NAT2 en fumadores y asociación con cáncer de vejiga

Estudio de interacciones genético-ambientales

• Retos:▫ ¿Qué genes determinan y/o alteran los riesgos de

enfermedad a consecuencia de exposiciones a toxicantes en el medio ambiente? → 25,000 genes

▫ Especificamente, ¿qué variantes (SNPs) en estos genes son las que estan asociadas a un incremento en riesgo?

• Objetivos:▫ Comprender mecanismos de toxicidad▫ Identificar subpoblaciones susceptibles para diseñar

estrategias de prevención y/o terapias con el propósito de preservar la salud pública

Interacciones genético-ambientales en la salud humana

•Variabilidad genética y su influencia en los efectos del ambiente sobre la salud humana

•Identificando nuevos genes que influyen interacciones genético-ambientales▫Determinación del genotipo a nivel de

individuo (genotyping)▫Perfilamiento funcional en levadura

Benceno y hematotoxicidad

• Clasificado por el IARC como un agente carcinogénico de tipo I

• Asociado a un incremento del riesgo de leucemia

• Exposición ocupacional y población en general

• Humo de cigarrillo, emisiones vehiculares, gasolina y solventes

Estudiando los efectos nocivos del benceno en humanos • 250 trabajadores en fábricas

de zapatos (Tianjin, China) expuestos al benceno comparados con 140 controles sin exposición.

• Exposición al benceno disminuye los conteos de glóbulos blancos con respecto a controles (5,490±1,350 vs. 6,480±1,710 células por µl respectivamente; p < 0.0001) (Lan et al., 2004)

Identificando SNPs funcionales a través de la epidemiología molecular• Muestras de DNA de estos individuos fueron

analizadas para determinar su genotipo• 1,433 SNPs candidatos localizados en 414 genes

seleccionados de la base de datos SNP500Cancer (http://snp500cancer.nci.nih.gov)

• Determinar si la presencia de algún SNP está corelacionado a un conteo menor de glóbulos blancos en el grupo con exposición

Determinando el genotipo de las personas a nivel de SNPs

1,433 SNPs = 1,433 experimentos por individuo ó 1 ensayo Illumina

Illumina Goldengate assay PCR de alelo específico

Efectos de diversos SNPs en el número de glóbulos blancos

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

CC

AC

AA

AA

AG

GG

GG

GT

+T

T

CC

CT

GG

CG

CC

CC

CG

GG

GG

GA

TT

TG

GG

BLM (rs2270132) BLM(rs16944894)

BLM(rs414634)

RAD51(rs4924496)

TP53 (rs1042522) WDR79(rs2287499)

WRN(rs2230009)

WRN (rs2725362)

WB

C c

ou

nt

Controls Exposed

pcontrol=0.63

pexposed=0.00021

pcontrol=0.54

pexposed=0.0038

pcontrol=0.29

pexposed=0.0077

pcontrol=0.0019

pexposed=0.00053

pcontrol=0.53

pexposed=0.0011 pcontrol=0.53

pexposed=0.0011

pcontrol=0.39

pexposed=0.00029

pcontrol=0.49

pexposed=0.00029

Interacciones genético-ambientales en la salud humana

•Variabilidad genética y su influencia en los efectos del ambiente sobre la salud humana

•Identificando nuevos genes que influyen interacciones genético-ambientales▫Determinación del genotipo a nivel de

individuo (genotyping)▫Perfilamiento funcional en levadura

El arsénico, un agente carcinogénico

• Clasificado por la IARC como un agente carcinogénico de tipo I

• Contaminacion principalmente de origen natural• Exposición a través del agua potable• Alto riesgo de diversos cánceres y enfermedades

pulmonares

Disminuir los niveles de proteína para estudiar la función de un gen

Gen mRNAOpción 1 Proteína

Gen mRNA Proteína

X

Opción 2

Knock out

RNA interferencia (células humanas)

Perfilamiento funcional en levadura

• Se utiliza una colección de cepas mutantes, cada una deficiente en las dos copias de un gen diferente

- Gen # 1 Cepa mutante # 1

Cepa mutante # 2

Cepa mutante # 3

Cepa mutante # 4757

- Gen # 2

- Gen # 3

- Gen # 4757

Perfilamiento funcional en levadura

• Cada cepa mutante esta identificada de manera única por dos “etiquetas” moleculares (secuencia de 20bp)

• Permite evaluar el crecimiento de todas las levaduras mutantes simultáneamente (Giaever et al., 2002)

ACAGATTTAACCCACACGGGGACTTACACTTACGTCCGAA

GCACTACGAGTTACGATCAAGACACTGACTGACATCGAGA

Cómo identificar nuevos genes implicados en resistencia al arsénico

Experimento # 1

Experimento # 2

Total # de experimentos = 4,757!3 réplicas biológicas, 3 concentraciones > 14,000!

Control

+ As

Control

+ As

Gen 1 confiere resistencia

Gen 2 no confiere resistencia

Identificación de nuevos genes a través de la toxicogenómica

Perfilamiento funcional

Contando etiquetas moleculares – intensidad α número de células

Microarray5*2 lecturas – réplicas técnicas

ACAGATTTAACCCACACGGGGACTTACACTTACGTCCGAA

Ausencia del gen SAS2 en levadura resulta en susceptibilidad al arsénico

• Curvas de crecimiento confiman resultados obtenidos por perfilamiento funcional

• SAS2 es homólogo a MYST1 en humanos, codifican acetil-transferasa de la lisina 16 en la histona 4 (H4K16)

Estudiando la funcion de MYST1 mediante RNA interferenciaCélulas UROtsa (epitelio de vejiga

urinaria)

Niveles de proteína β-actina

Niveles de proteína MYST1

MYST1MYST1MYST1

Silenciamiento de MYST1 incrementa la susceptibilidad al arsénico en células humanas

Control

↓MYST1

Silenciamiento de MYST1 reduce los niveles de acetilación de H4K16

• El incremento en susceptibilidad al arsénico podría estar asociado a la reducción en acetilación de H4K16 (cambio epigenético)

• Rol potencial en expresión de genes en respuesta al arsénico o en reparación del DNA

Interacciones genético-ambientales en la salud humana

•Variabilidad genética y su influencia en los efectos del ambiente sobre la salud humana

•Identificando nuevos genes que influyen interacciones genético-ambientales▫Determinación del genotipo a nivel de

individuo (genotyping)▫Análisis en paralelo de mutantes en

levadura

Conclusiones• Existe la necesidad de

incorporar el componente genético como factor modificante de los efectos nocivos de toxicantes en la salud humana

• Existen diversos métodos para descubrir nuevos genes (y sus variantes) que interaccionan con el ambiente, dos son el genotyping y el perfilamiento funcional

Gracias por su atención!