introduccion bioseparaciones

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Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología

Procesos Industriales de Separación

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa


The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001)


Proceso de bioseparación

• Definición: Recuperación, aislamiento, purificación y refinamiento de productos sintetizados por procesos biotecnológicos

• Definición extendida: Etapas de refinamiento final de procesos tales como tratamiento de efluentes y purificación de agua por biotecnología

“UPSTREAM”

- formulación de medios

- desarrollo de inóculo

- esterilización

- inoculación

“DOW'STREAM”

- extracción de producto,

purificación y refinamiento

- tratamiento de aguas

- recuperación de subproducto

FERME�TACIÓ�

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¿Por qué necesitamos bioseparación?

• Enriquecimiento del producto objetivo

• Reducción de volumen

• Remoción de impurezas específicas

• Mejoramiento de la estabilidad del producto

• Alcanzar las especificaciones del producto

• Prevención de la degradación del producto

• Prevención de otras catálisis diferentes a las deseadas

• Prevención de envenenamiento del catalizador


Retos en ingeniería de bioseparaciones

•Bajas concentraciones de producto

•Gran número de impurezas

•Termolabilidad de bioproductos

•Estrecho margen de operación de pH y fuerza iónica

•Sensibilidad al esfuerzo cortante de bioproductos

•Baja solubilidad de bioproductos en solventes

orgánicos

•Inestabilidad de bioproductos en solventes orgánicos

•Estrictos requerimientos de calidad•Porcentaje de pureza

•Ausencia de impurezas específicas

Un proceso ideal de bioseparación debe combinar alta capacidad con alta selectividad, y debe asegurar estabilidad del producto


Efecto del producto en el proceso de separación

Extensión y tipo

del proceso de

separación

'aturaleza

del producto

Calidad

requerida

(Mercado)

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Productos biológicos

ProductoProductoProductoProducto NaturalezaNaturalezaNaturalezaNaturaleza dededede lalalala bioseparaciónbioseparaciónbioseparaciónbioseparaciónrequeridarequeridarequeridarequerida

Bebidas alcohólicas:Cerveza, vino, licores

Clarificación, distilación

Ácidos orgánicos:Ácido acético, ácido cítrico

Precipitación, filtración, adsorción, extracción con solventes

Vitaminas:Vitamina C, vitamina B12, riboflavina


Amino ácidos:Lisina, glicina, fenilalanina


Antibióticos:Penicilinas, neomicina, bacitracina


Carbohidratos:Almidón, azúcares, dextranas

Precipitación, filtración, adsorción

Lípidos:Glicerol, grasas, ácidos grasos



Productos biológicos (cont...)

Proteínas:Alimentos y sus aditivosNutracéuticosEnzimas industrialesHormonasEnzimas farmacéuticasProductos derivados de plasmaAnticuerpos monoclonalesFactores de crecimientoTrombolíticosProteínas derivadas de r-DNAProteínas de diagnósticoVacunas

Filtración, precipitación, centrifugación, adsorción, cromatografía, separacionesbasadas en membranas

Productos basados en DNA:Pruebas de DNA, plásmidos, nucleótidos, oligonucleótidos

Filtración, precipitación, centrifugación, adsorción, cromatografía, separacionesbasadas en membranas

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Un buen proceso de separación:

• Asegura la pureza deseada del producto

• Asegura la estabilidad del producto

• Mantiene costos bajos

• Es reproducible

• Es escalable

• Cumple con las regulaciones establecidas


La economía del proceso está determinada por:

• Capital invertido

• Costos de operación

• Otros factores

– Eficiencia de las operaciones unitarias individuales

– Pérdidas en cada etapa

– Destrucción o degradación del producto durante el proceso

– Estado físico del producto al final de cada etapa

– Costo del tratamiento del efluente


Correlación entre concentración de producto antes de la

purificación y precio de venta

Precio de venta ($/kg)

10 -3 10 -1 101 10 3 10 5 10 7 10 9 10 1110 -7

10 -5

10 -3

10 -1

10 1

10 3

10 5

Agua

EtanolÁcido cítrico

Factor VIIII

Urokinasa

Luciferasa

PenicilinaTreonina

CefalosporinaGentamicina

Proteasasmicrobianas

Amilasas

Ácido giberélico

Renina

Hormona humana de crecimientoActivador plasminógenode tejido

Vacuna B hepatitis

Glicerofosfatodeshidrogenasa

Insulina

Glucosaoxidasa

Amino ácidos

Antibióticos

Enzimas

Enzimas de

diagnósticoAnticuerpos

monoclonalesEnzimas

terapéuticas

(Knight, 1989)

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Importancia económica de la ingeniería de la

bioseparación

Costo de bioseparación

ProductoProductoProductoProducto Precio relativo Precio relativo Precio relativo Precio relativo aproximadoaproximadoaproximadoaproximado

Costo del proceso de Costo del proceso de Costo del proceso de Costo del proceso de separación (%)separación (%)separación (%)separación (%)

Etanol 1 15Proteína unicelular 0.8 20

Biomasa de levadura 2 20Ácido cítrico 3.2 30-40

Glutamato monosódico 5 30-40Xantanas 20 50

Penicilina G 60 20-30Enzimas a granel 100 40-65

Proteínas terapéuticas/DNA

>500 60-80


Importancia de los procesos de separación

a diferentes niveles de producción

'ivel de producción Alto1 Medio2

Bajo 3

Fuente m.o.seleccionado

m.o. mutadosy DNA recomb.

m.o.DNA recomb.

Pureza requerida Bajo70 - 99 %

Mediana a alta90 - 99 %

Alta99.95 - 100 %

Eficiencia de recuperación 90 - 100 % 50 – 90 % 5 – 50 %Costo recup./costo de producción 0.1 – 0.2 0.3 – 0.7 0.5 – 0.9Costo recup./(costo de producción+ costo de desarrollo)

0.1 – 0.2 0.1 – 0.5 0.01 – 0.2

1 Ácido cítrico, 300,000 TON/año (1987)2 Insulina, 1 TON/ año (1987)3 Interferon, 10-5TON/año (1987)


Estrategias para bioseparación

Están disponibles un gran número de métodos de bioseparaciónLa estrategia está basada en como estos métodos pueden ser mejor

utilizados para una separación dada

Se necesita tomar en cuenta lo siguiente:• El volumen de la corriente de proceso• La abundancia relativa del producto en esta corriente de

proceso• El uso que se le intenta dar al producto, esto es,

requerimientos de pureza• El costo del producto• Requerimientos de estabilidad

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Las tecnologías de separación pueden clasificarse de acuerdo a su principio fundamental

(Las barras representan el costo relativo de cada proceso)



Pureza

Etapas

•Purificación inicial

•Estabilización

•Clarificación

•Concentración

Remoción de:

proteínas, ácidos nucléicos,

endotoxinas y virus

Pureza final

Captura

Purificación

intermedia

Refinamiento

Proceso de purificación cromatográfica de macromoléculas


Capacidad

Recuperación

Resolución

Velocidad

Selección y combinación de técnicas de purificación

Cada técnica ofrece un balanceEntre resolución, capacidad,Velocidad y recuperación

Minimice el manejo de la muestraMinimice el número de etapasUse diferentes técnicas en cada etapa

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Propiedades de las técnicas de purificación comúnmente usadas

Precipitación porpH

Carga Alta Muy baja Medio Bajo >1 mg ml-1 Volumen pequeñoConcentración alta

Precipitación con(NH4)2SO4

Hidrofobicidad Alta Muy baja Alto Bajo >1 mg ml-1 I altoVolumen pequeñoConcentración alta

Extracción en dosfases acuosas

MezclaBioafinidad

AltaAlta

Muy bajaAlta

AltoVariable

BajoAlto

Puedecontenersólidos

Concentración depolímero alta (PEG)

Cromatografía deintercambio iónico

Carga Media Media Medio Medio I BajopH correcto

I altopH diferente

Cromatografía deinteracciónhidrofóbica

Hidrofobicidad Media Media Medio Medio I alto I bajopH diferente

Cromatoenfoque Carga / pI Baja Alta Medio Alto I bajo Presencia de anfolitos

Cromatografía deafinidad de teñido

Mezcla Media Alta Medio Medio I bajopH neutral

I altopH diferente

Cromatografía deafinidad de ligando

Bioactividad Media-Baja Muy alta Bajo Alto Dependientesobre elligando

Condiciones dedesnaturalizaciónpotencial

Cromatografía depermeación en gel

Tamaño Muy baja Baja Alto Medio Volumen bajo Diluido

Técnica Propiedadexplotada

Capacidad Resolución Rendimientopromedio

Costo Composiciónmuestra

Composiciónproducto


Estrategia convencional:

• Recuperación, aislamiento, purificación y refinamiento

• Basado en arreglos lógicos de métodos de bioseparación

• Las técnicas de baja resolución, alta capacidad (por ejemplo, precipitación, filtración, centrifugación, cristalización) se usan primero para recuperación y aislamiento

• Las técnicas de alta resolución (por ejemplo, adsorción, cromatografía, electroforesis) son entonces usadas para purificación y aislamiento


Métodos de bioseparación

Baja resolución – alta capacidad• Ruptura celular• Precipitación• Centrifugación• Extracción líquido-líquido• Percolación• Filtración• Extracción con fluídos supercríticos• Microfiltración• Diálisis

Alta resolución – baja capacidad• Ultracentrifugación• Adsorción• Cromatografía de lecho empacado• Separación por afinidad• Electroforesis

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Métodos de bioseparación (cont...)

Alta resolución-alta capacidad

• Ultrafiltración

• Cromatografía de lecho fluidizado

• Cromatografía de membrana

• Cromatografía de columna de “Monolith”


Captura

Capacidad

Recuperación

Resolución

Velocidad

� Use una técnica de alta capacidad para reducir el volumen de la muestra� Concéntrese en lo robusto y simple de la primera etapa de purificación

� Definición: Purificación inicial de la molécula objetivo de un material crudo� Meta: Rápido aislamiento, estabilización y concentración


Purificación intermedia

Capacidad

Recuperación

Resolución

Velocidad

� Use diferentes técnicas en cada etapa�Minimice el número de etapas

� Definición: Nueva remoción de contaminantes� Meta: Purificación y concentración

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Refinamiento

Capacidad

Recuperación

Resolución

Velocidad

� Use diferentes técnicas en cada etapa

� Definición: Remoción final de contaminantes traza, Ajuste de pH, sales oaditivos para almacenamiento

� Meta: Producto final de alto nivel de pureza requerido


Planeando las estrategias de purificación

Elección de las técnicasCapacidad (C)Resolución (R)Rendimiento de proteínaCosto

Ordenando las técnicasPrecipitación (alta C y baja R)Intercambio iónico (mediana C y mediana R)Cromatografía de afinidad (mediana/baja C y alta R)


Reducción del volumen de operación en cada etapa

Reducción

del volumen

Precipitación

Centrifugación

DiálisisIntercambio iónico

Filtración en gel

SecadoEnzima

en polvo

Sobrenadante

Precipitado

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Producción de celulasas (Ghose y Pathak, 1973)

Cultivo sumergido

Cultivo sólido

(Técnica koji)

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Producción de enzimas

Cultivo microbiano

Fermentador para siembra

Cultivo sumergido Cultivo sólido

Extracto crudo

Adición deestabilizantes

Enzima en solución

Precipitación

Cromatografía

Secado

Enzima en polvo


Ubicación de las enzimas

Centrifugación o filtración

Rompimientocelular

Centrifugacióno filtración

Precipitación Cromatografía

Secado Ultrafiltración

Extracciónlíquido-líquido

Enzimasextracelulares

Enzimasintracelulares


Estrategia de purificación

Calidad

Cantidad

Economía

Producción

Enzima

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Preservando la actividad

La desnaturalización

La inactivación

La proteólisis

Otras precauciones

Minimizar


El problema más común es la pérdida de

actividad repentina, debida a:

• Falla del ensayo

• Composición incorrecta del buffer

• Impureza de los reactivos

• Proteólisis

• Precipitación

• Presencia de un inhibidor

• Pérdida de un inhibidor o cofactor


Conceptos de purificación de proteínas

• Factor de purificación

– Es la relación entre la actividad específica después de una técnica de purificación y la actividad específica en el extracto crudo

• Rendimiento

– Es la evaluación de la cantidad de actividad o proteína activa obtenida después de una técnica de purificación. Generalmente es reportada en %. Siendo el 100% la actividad del extracto crudo

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