jcinvest00179-0106 alternate pathway components in human glomerulonephritis

7/29/2019 jcinvest00179-0106 alternate pathway components in human glomerulonephritis

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P r o p e r d i n a n d C3 P r o a c t i v a t o r : A l t e r n a t e PathwayC o m p o n e n t s i n Human G l o m e r u l o n e p h r i t i sR O B E R T H . MCLEAN a n d A L F R E D F . MICHAELF r o m t h e D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s , U n i v e r s i t y o f Minnesota H o s p i t a l s ,M i n n e a p o l i s , M i n n e s o t a 5 5 4 5 5

A B S T R A C T S e r o l o g i c a l a n d i m m u n o p a t h o l o g i c a l s t u d -i e s o f h u m a n g l o m e r u l o n e p h r i t i s h a v e s u g g e s t e d t h a ta l t e r n a t e p a t h w a y s o f a c t i v a t i o n o f t h e t h i r d c o m p o n e n to f c o m p l e m e n t ma y b e i m p o r t a n t i n s o m e f o r m s o f g l o -m e r u l o n e p h r i t i s . We h a v e i n v e s t i g a t e d t h e r o l e o f t w oa l t e r n a t e p a t h w a y p r o t e i n s , p r o p e r d i n a n d C 3 p r o a c t i -v a t o r , i n 2 2 p a t i e n t s w i t h c h r o n i c m e m b r a n o p r o l i f e r a -t i v e g l o m e r u l o n e p h r i t i s , 2 1 p a t i e n t s w i t h s y s t e m i c l u p u se r y t h e m a t o s u s , 2 0 p a t i e n t s w i t h a c u t e p o s t s t r e p t o c o c c a lg l o m e r u l o n e p h r i t i s , a n d 1 9 p a t i e n t s w i t h o t h e r f o r m s o fr e n a l d i s e a s e . C 3 ( m e a s u r e d a t P A ) , p r o p e r d i n , a n d C 3p r o a c t i v a t o r w e r e a s s a y e d b y s i n g l e r a d i a l i m m u n o d i f f u -s i o n .I n s e r a w i t h l o w P A (< 2 S D) , m e a n p r o p e r d i n w a s

m o s t s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d i n p a t i e n t s w i t h a c u t e p o s t -s t r e p t o c o c c a l g l o m e r u l o n e p h r i t i s b u t w a s a l s o s i g n i f i -c a n t l y d e c r e a s e d i n c h r o n i c m e m b r a n o p r o l i f e r a t i v e g l o -m e r u l o n e p h r i t i s a n d i n u n t r e a t e d s y s t e m i c l u p u s e r y t h e -m a t o s u s . P r o p e r d i n l e v e l s i n o t h e r r e n a l d i s e a s e , a c u t eg l o m e r u l o n e p h r i t i s , a n d c h r o n i c m e m b r a n o p r o l i f e r a t i v eg l o m e r u l o n e p h r i t i s w i t h n o r m a l f i A l e v e l s w e r e n o ts i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m n o r m a l . A p o s i t i v e c o r r e l a -t i o n b e t w e e n P A a n d p r o p e r d i n l e v e l s i n i n d i v i d u a l s e r aw a s p r e s e n t i n a l l d i s e a s e s e x c e p t s y s te m i c l u p u s e r y t h e -m a t o s u s .S e r u m C 3 p r o a c t i v a t o r w a s m a r k e d l y d e c r e a s e d i n a c -t i v e s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s a n d t h e r e w a s a p o s i -t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n f i 1 A a n d C 3 p r o a c t i v a t o r l e v e l si n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s a n d o t h e r r e n a l d i s e a s e sb u t n o t a c u t e p o s t s t r e p t o c o c c a l g l o m e r u l o n e p h r i t i s .P r o p e r d i n i n f r e s h s e r a f r o m f o u r p a t i e n t s w i t h s y s -t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s a n d f i v e w i t h c h r o n i c mem-b r a n o p r o l i f e r a t i v e g l o m e r u l o n e p h r i t i s s h o w e d i n c r e a s e dm i g r a t i o n t o w a r d t h e c a t h o d e o n i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s ,s u g g e s t i n g i n v i v o c h a n g e o f t h e p r o p e r d i n m o l e c u l e .A p r e l i m i n a r y r e p o r t o f t h e s e f i n d i n g s w a s p r e s e n t e d a tt h e S o c i e t y f o r P e d i a t r i c R e s e a r c h , 2 5 May 1 9 7 2 , W a s h -i n g t o n , D . C .R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 7 A u g u s t 1 9 7 2 a n d i n r e v i s e df o r m 1 0 N o v e m b e r 1 9 7 2 .

T h e o b s e r v a t i o n o f r e d u c e d s e r u m l e v e l s o f p r o p e r d i na n d C 3 p r o a c t i v a t o r a n d a l t e r e d e l e c t r o p h o r e t i c m i g r a -t i o n o f p r o p e r d i n i n s o m e p a t i e n t s w i t h g l o m e r u l o n e p h r i -t i s p r o v i d e ne w e v i d e n c e f o r p a r t i c i p a t i o n o f t h e s e a l t e r -n a t e p a t h w a y p r o t e i n s i n g l o m e r u l o n e p h r i t i s .INTRODUCTION

T h e r e i s c o n s i d e r a b l e e v i d e n c e t h a t i m m u n o l o g i c a l f a c -t o r s a r e i m p o r t a n t i n t h e p a t h o g e n e s i s o f s o m e f o r m s o fh u m a n g l o m e r u l o n e p h r i t i s ( 1 ) . T h e e f f e c t o r m e c h a n i s mo f t h i s i n j u r y i n v o l v e s i n p a r t t h e c o m p l e m e n t s y s t e m .T h e e x i s t e n c e o f a n a l t e r n a t e p a t h w a y o f a c t i v a t i o n o fc o m p l e m e n t w h i c h e n t e r s t h e c o m p l e m e n t s e q u e n c e a t C 3h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n v i t r o b y s e v e r a l w o r k e r s ( 2 - 4 ) ,b u t t h e r e l e v a n c e o f t h i s p a t h w a y i n h u m a n g l o m e r u l o -n e p h r i t i s i s u n k n o w n .T h e p r o p e r d i n s y s t e m a s o r i g i n a l l y d e s c r i b e d ( 2 ) c o n -s i s t s o f t h e n o r m a l s e r u m p r o t e i n p r o p e r d i n , m a g n e s i u m ,a n d t w o o t h e r s e r u m f a c t o r s : F a c t o r A ( h y d r a z i n e s e n -s i t i v e ) ( 5 ) a n d F a c t o r B ( h e a t l a b i l e ) ( 6 ) . A t 3 7 0 C i nt h e p r e s e n c e o f p o l y s a c c h a r i d e s s u c h a s z y m o s a n o r i n u -l i n , t h e p r o p e r d i n s y s t e m a c t i v a t e s C 3 . A d e f i n i t e r o l eo f t h e p r o p e r d i n s y s t e m i n h u m a n d i s e a s e h a s b e e n s u g -g e s t e d b y t h e d e m o n s t r a t i o n o f r e d u c e d s e r u m l e v e l s i nc e r t a i n r e n a l d i s e a s e s ( 7 , 8 ) a n d i t s p r e s e n c e i n g l o m e r u -l a r d e p o s i t s i n a c u t e p o s t s t r e p t o c o c c a l g l o m e r u l o n e p h r i -t i s ( A G N ) 1 a n d c h r o n i c m e m b r a n o p r o l i f e r a t i v e g l o m e r u -l o n e p h r i t i s (CMPGN) a s s o c i a t e d w i t h h y p o c o m p l e m e n -t e m i a ( 9 ) .

S a n d b e r g , O s l e r , S h i n , a n d O l i v e i r a ( 3 ) d e m o n -s t r a t e d t h a t t h e F c f r a g m e n t o f g u i n e a p i g y 2 a c t i v a t e d1 A b b r e v i a t i o n s u s e d i n t h i s p a p e r : A G N , a c u t e p o s t s t r e p -t o c o c c a l g l o m e r u l o n e p h r i t i s ; C 3 P A , C 3 p r o a c t i v a t o r ;CMPGN, c h r o n i c m e m b r a n o p r o l i f e r a t i v e g l o m e r u l o n e p h r i t i s ;C o F , a n t i c o m p l e m e n t a r y f a c t o r f r o m c o b r a v e n o m ; G A H P 1 C ,g o a t a n t i h u m a n p C ; GAHC3PA, g o a t a n t i h u m a n C 3 P A ;H S F , h y d r a z i n e - s e n s i t i v e f a c t o r ; P B S , p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ; P c , p r o p e r d i n w i t h i n c r e a s e d c a t h o d a l m i g r a t i o n o ne l e c t r o p h o r e s i s ; RAHP, r a b b i t a n t i h u m a n p r o p e r d i n ; S L E ,s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s .

6 3 4 T h e J o u r n a l o f C l i n i c a l I n v e s t i g a t i o n V o l u m e 5 2 M a r c h 1 9 7 3


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t h e e n t i r e c o m p l e m e n t s e q u e n c e , w h e r e a s t h e F ( a b ' ) 2f r a g m e n t o f b o t h ' 4 a n d ' v 2 a c t i v a t e d o n l y t h e t e r m i n a lc o m p l e m e n t s e q u e n c e ( C - 9 ) . B o t h t 2 a n d ' Y 1 a g g r e g a t e sa n d F ( a b ' ) s f r ag m e n t s h a v e b e e n s h o w n t o a c t i v a t e t h eC 3 a c t i v a t o r s y s t e m ( 1 0 , 1 1 ) .T h e C 3 a c t i v a t o r s y s t e m ( 4 , 1 2 ) i n c l u d e s a n o r m a l s e -rum p r o t e i n C 3 p r o a c t i v a t o r ( C 3 P A ) w h i c h a c t i v a t e s C 3i n t h e p r e s e n c e o f c a t i o n s a n d a n a c t i v a t i n g s u b s t a n c e s u c ha s c o b r a v e n o m , p o l y s a c c h a r i d e s , o r c e r t a i n i m m u n o -g l o b u l i n s . O t h e r p r o t e i n s o f t h e C 3 P A p a t h w a y i n -c l u d e a h y d r a z i n e - s e n s i t i v e f a c t o r (HSF) w h i c h a p p e a r st o b e C 3 . An a c t i v a t e d f r a g m e n t o f C 3 , C 3 b ( H S F a ) ,a n d a 3 S - a g l o b u l i n (C3PA c o n v e r t a s e ) a r e n e c e s s a r yf o r a c t i v a t i o n o f C 3 P A . C 3 P A h a s t h e s a m e a n t i g e n i cd e t e r m i n a n t s a s g l y c i n e - r i c h P - g l y c o p r o t e i n w h i c h h a sr e c e n t l y b e e n r e p o r t e d t o h a v e F a c t o r B a c t i v i t y i n t h ep r o p e r d i n s y s t e m ( 1 3 ) . T h e r e l a t i o n s h i p o f t h e p r o p e r d i ns y s t e m t o t h e C 3 a c t i v a t o r s y s t e m i s p r e s e n t l y u n c l e a r .T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e t h e p o s -s i b l e r o l e o f t h e a l t e r n a t e p a t h w a y i n g l o m e r u l o n e p h r i t i si n m a n , a s r e f l e c t e d b y c h a n g e s i n s e r u m l e v e l s o f p r o -p e r d i n , C 3 P A , a n d P i A .

METHODSP a t i e n t sT h e p a t i e n t s w e r e s e e n a t t h e U n i v e r s i t y o f M i n n e s o t aH o s p i t a l s a n d w e r e d i v i d e d i n t o f o u r g r o u p s .( a ) C h r o n i c m e m b r a n o p r o l i f e r a t i v e g l o m e r u l o n e p h r i t i s(CMPGN) ( 9 m a l e s , 1 3 f e m a l e s ) . As p r e v i o u s l y r e p o r t e d ,t h e d i a g n o s i s o f CMPGN w a s b a s e d o n t h e c l i n i c a l p i c t u r e ,t h e r e n a l p a t h o l o g i c a l f i n d i n g s b y l i g h t a n d i m m u n o f l u o r e s -c e n t m i c r o s c o p y , a n d t h e p r e s e n c e o f h y p o c o m p l e m e n t e m i aa t s o m e t i m e d u r i n g t h e p e r i o d o f o b s e r v a t i o n ( 9 ) . P a t i e n t sr a n g e d i n a g e f r o m 8 t o 3 5 y r .( b ) S y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s i s ( S L E ) ( 5 m a l e s , 1 6f e m a l e s ) w a s d i a g n o s e d b y t h e p r e s e n c e o f a n t i - D N A a n t i -

b o d y a n d LE c e l l s , h y p o c o m p l e m e n t e m i a , a n d s y s t e m i cs y m p t o m s . F e v e r , a r t h r i t i s , s k i n l e s i o n s , a n d a b n o r m a l u r i -n a r y s e d i m e n t w e r e u s u a l l y p r e s e n t a t s o m e t i m e d u r i n g t h ep a t i e n t ' s c o u r s e . P a t i e n t s r a n g e d i n a g e f r o m 1 1 t o 4 2 y r .( c ) A c u t e p o s t s t r e p t o c o c c a l g l o m e r u l o n e p h r i t i s (AGN)( 1 1 m a l e s , 9 f e m a l e s ) . T h i s i n c l u d e d 2 p a t i e n t s w i t h s p o r -a d i c A GN a n d 1 8 p a t i e n t s w i t h e p i d e m i c AGN. T h e c l i n i c a la n d m o r p h o l o g i c f e a t u r e s o f t h e l a t t e r g r o u p o f p a t i e n t sh a v e b e e n r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( 1 4 ) . P a t i e n t s r a n g e d i na g e f r o m 1 i t o 1 3 y r .( d ) O t h e r r e n a l d i s e a s e s ( 1 2 m a l e s , 7 f e m a l e s ) . T h i sg r o u p i n c l u d e d f i v e p a t i e n t s w i t h v a s c u l i t i s , t w o w i t h a n a -p h y l a c t o i d p u r p u r a , t w o w i t h f o c a l g l o m e r u l o n e p h r i t i s , f o u rw i t h p r o l i f e r a t i v e g l o m e r u l o n e p h r i t i s ( n o t p o s t s t r e p t o c o c c a l ) ,t w o w i t h m e m b r a n o u s g l o m e r u l o p a t h y , o n e w i t h a c u t e t u b u -l a r n e c r o s i s , o n e w i t h h e r e d i t a r y a n g i o n e u r o t i c e d e m a a n dg l o m e r u l o n e p h r i t i s , o n e w i t h h e m o l y t i c - u r e m i c s y n d r o m e ,a n d o n e w i t h e n d - s t a g e r e n a l d i s e a s e o f u n k n o w n e t i o l o g y .P a t i e n t s r a n g e d i n a g e f r o m 3 t o 2 1 y r .C o l l e c t i o n o f s e r aB l o o d s p e c i m e n s w e r e d r a w n i n t o s e r u m t u b e s a n d a l -l o w e d t o c l o t a t r o o m t e m p e r a t u r e . S e r a w e r e c e n t r i f u g e d ,s e p a r a t e d , a n d o n e a l i q u o t f r o z e n a t - 7 0 ' C w i t h i n 6 h . A

s e c o n d a l i q u o t ( 0 . 3 m l ) w i t h s o d i u m a z i d e ( 0 . 0 2 % ) w a st i g h t l y s e a l e d a n d p l a c e d i n a 3 7 0 C i n c u b a t o r f o r 7 d a y sf o r c o n v e r s i o n o f a l l 8 , C t o # , A ( a g e d s e r a ) . T h e a l i q u o tk e p t a t -70'C w a s u s e d f o r m e a s u r e m e n t o f C3PA a n dp r o p e r d i n b y i m m u n o d i f f u s i o n m e t h o d s. S e r a f r o m t h e 1 8p a t i e n t s w i t h e p i d e m i c AGN h a d b e e n s t o r e d a t - 7 0 ' Cs i n c e 1 9 6 5 .I m m u n o d i f f u s i o n a s s a y o f 8 3 1 C / , 8 1 A , p r o p e r d i n ,a n d C 3 PAI m m u n o d i f f u s i o n a s s a y s w er e c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o am o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o f M a n c i n i , C a r b o n a r a , a n dH e r e m a n s ( 1 5 ) . G l y c i n e - s a l i n e - E D T A ( 0 . 0 0 2 M) b u f f e rw a s u s e d f o r a l l d i l u t i o n s ( g l y c i n e 7 . 5 g , s o d i u m c h l o r i d e8 . 5 g , d i s s o d i u m EDTA 0 . 7 4 4 5 g , 1 N s o d i u m h y d r o x i d e2 . 5 m l , p H t o 8 . 2 w i t h 1 0 % N a 2 C O s ) . An a p p r o p r i a t ed i l u t i o n o f a n t i s e r u m i n 1% a g a r o s e w a s p o u r e d i n t o d i s -p o s a b l e s q u a r e P e t r i p l a t e s w h i c h w e r e o n a f l a t s u r f a c ea n d t h e n s t o r e d i n t h e c o l d f o r n o t more t h a n 3 0 d a y s .3 6 2-mm d i a m e t e r w e l l s w er e m a d e on e a c h p l a t e . S e r i a ld i l u t i o n s o f t h e r e f e r e n c e serum f o r t h e p r o t e i n b e i n gm e a s u r e d w er e p l a c e d on e v e r y p l a t e f o r c o n s t r u c t i o n o f t h es t a n d a r d c u r v e o f a r e a v s . c o n c e n t r a t i o n . S p e c i m e n s werea s s a y e d i n d u p l i c a t e u s i n g 5 A l i n e a c h w e l l , d e l i v e r e d b y am i c r o s y r i n g e ( H a m i l t o n C o . , W h i t t i e r , C a l i f . ) . A f t e r f u l ld e v e l o p m e n t o f p r e c i p i t i n r i n g s i n a h u m i d e n v i r o n m e n t a tr o o m t e m p e r a t u r e , t h e d i a m e t e r s were m e a s u r e d u s i n g am e a s u r i n g m a g n i f i e r ( B a u s c h & L o m b , I n c . , R o c h e s t e r ,N . Y . ) a n d t h e a r e a c a l c u l a t e d . T h e c o n c e n t r a t i o n o f t h ep r o t e i n w as t h e n d e t e r m i n e d f r o m t h e s t a n d a r d c u r v e o fa r e a v s . c o n c e n t r a t i o n .9 1 C / , P l AHuman 8 l C w as i s o l a t e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a c -c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f M u i l l e r - E b e r h a r d , N i l s s o n , a n dA r o n s s o n ( 1 6 ) . G o a t a n t i s e r u m ( G A H f t L C ) p r o d u c e d b ym u l t i p l e i n j e c t i o n s i n c o r p o r a t e d i n F r e u n d ' s a d j u v a n t w a su s e d i n t h e i m m u n o d i f f u s i o n a s s a y o f 8 1 A . T h i s a n t i s e r u mp r o d u c e d a s i n g l e l i n e b y d o u b l e d i f f u s i o n i n a g a r o s e g e la g a i n s t n o r m a l h u m a n s e r u m . I n f r e s h s e r u m a s i n g l e a r ci n t h e f - r e g i o n w a s f o u n d b y i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s i nI o n a g a r ( C o l a b L a b s . , I n c . , G l e n w o o d , I l l . ) . D o u b l e d i f -f u s i o n r e v e a l e d no l i n e s o f i d e n t i t y b e t w e e n h u m a n seruma n d G A H p 8 1 C , g o a t a n t i h u m a n C 3 PA ( G A H C 3 P A ) , a n dr a b b i t a n t i h u m a n p r o p e r d i n ( R A H P ) .T h e a g e d r e f e r e n c e s e r u m u s e d i n jA a s s a y s w a s k i n d l yq u a n t i t a t e d b y D r . C l a r k W e s t a n d s t o r e d a t - 2 0 C . N a -t i v e C 3 h a s t h r e e a n t i g e n i c s i t e s , C 3 a , C 3 c ( f A ) , a n dC 3 d . W i t h a g i n g , t h e C 3 a s i t e i s l o s t a n d C 3 c ( # , A ) i s t h ed o m i n a n t a n t i g e n i c s i t e . S e r u m l e v e l s o f c o m p l e m e n t r e -p o r t e d i n t h i s p a p e r a r e a m e a s u r e o f t h i s a n t i g e n i c s i t e .F o r i m m u n o d i f f u s i o n a s s a y , a l i q u o t s o f t h e p a t i e n t s ' a g e ds e r a w e r e d i l u t e d 1 / 1 0 i n n o r m a l s a l i n e , a p p l i e d t o t h e i m -m u n o d i f f u s i o n p l a t e , a n d a l l o w e d t o d e v e l o p f o r 2 1 h b e f o r eb e i n g r e a d . T h e a v e r a g e AA c o n c e n t r a t i o n o f 3 3 o r t h o p e d i cp a t i e n t s ( a g e d 1 - 1 8 y r ) w i t h o u t s y s t e m i c o r r e n a l d i s e a s e swas 1 6 5 + 4 1 m g / 1 0 0 m l ( 1 S D ) w i t h a r a n g e o f 1 0 0 - 2 4 7

m g / 1 0 0 m l . T h e c o n c e n t r a t i o n i n a s i n g l e s e r u m d e t e r m i n e don 1 0 d i f f e r e n t o c c a s i o n s a v e r a g e d 1 5 1 7 m g / 1 0 0 m l ( 1S D ) , ( S E + 2 . 2 ) .P r o p e r d l i nHuman s e r u m p r o p e r d i n w a s i s o l a t e d a c c o r d i n g t o p u b -l i s h e d m e t h o d s ( 1 7 ) . A n t i s e r u m w a s p r o d u c e d i n r a b b i t sb y m u l t i p l e i n j e c t i o n s o f p r o p e r d i n i n c o r p o r a t e d i n c o m -P r o p e r d i n a r n d C 3 P A i n G l o m e r u l o n e p h r i t i s 6 3 5


3/11

p l e t e F r e u n d ' s a d j u v a n t . T h e s p e c i f i c i t y o f t h i s a n t i s e r u mh a s p r e v i o u s l y b e e n r e p o r t e d . D o u b l e d i f f u s i o n o f RAHPa g a i n s t n o r m a l h u m a n s e r u m y i e l d e d a s i n g l e l i n e a n d g a v en o l i n e o f i d e n t i t y w i t h GAHC3PA. A s p r e v i o u s l y r e p o r t e d ,t h e RAHP d i d n o t r e a c t w i t h C l q , C 3 , o r C 5 ; i n a d d i t i o n ,t h e r e w a s n o r e a c t i o n w i t h i s o l a t e d C 3 P A o r w i t h C 3 P A i nf r e s h a n d a g e d s e r u m . A s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , i m m u n o -e l e c t r o p h o r e s i s o f f r e s h n o r m a l h u m a n s e r u m f o r p r o p e r d i np r o d u c e d a s i n g l e p r e c i p i t i n l i n e m i g r a t i n g i n t h e p - g l o b u l i nr e g i o n ( 1 8 ) .S e r i a l d i l u t i o n s i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) ( 0 . 1 5M s o d i u m c h l o r i d e a n d 0 . 0 1 M s o d i u m p h o s p h a t e , pH 7 . 4 0 )o f i s o l a t e d p r o p e r d i n s h o w e d a l i n e a r r e l a t i o n s h i p b y i m -m u n o d i f f u s i o n b e t w e e n d i l u t i o n s o f 1 / 2 t o 1 / 8 . T h e r e f e r -e n c e s e r u m f o r p r o p e r d i n a s s a y h a d a c o n c e n t r a t i o n o f 4 . 6 4, A g N p e r m l o f p r o p e r d i n a n d s h o w e d a l i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e n a r e a a n d c o n c e n t r a t i o n i n d i l u t i o n s o f 1 / 1 t o 1 / 1 6 .F o r i m m u n o d i f f u s i o n a s s a y ' a 1 / 2 d i l u t i o n o f t h e p a t i e n t s 's e r a w h i c h h a d b e e n s t o r e d a t - 7 0 ' C w a s p l a c e d i n t h ew e l l s . T h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o p r o c e e d f o r a t l e a s t 7 2 h .P r e c i p i t i n r i n g s w e r e v i s i b l e a t t h e e n d o f 7 2 h , b u t w e r et o o f a i n t t o b e a c c u r a t e l y r e a d . T h e p l a t e s w e r e w a s h e d i ns a l i n e w i t h t w o c h a n g e s o f s a l i n e o v e r 4 8 h , a n d t h e ns o a k e d i n 0 . 1 % t a n n i c a c i d f o r 1 0 m i n . T h i s r i n s e w a sf o l l o w e d b y a 1 0 m i n w a s h w i t h 0 . 2 % 8 - a n i l i n o - 1 - n a p h t h a -l e n e s u l f o n i c a c i d (ANSA) i n 5% a c e t i c a c i d a n d 1 m i n i n5% a c e t i c a c i d a l o n e ( A n a l y t i c a l C h e m i s t s , I n c . , P a l oA l t o , C a l i f . ) . T h e p l a t e c o u l d t h e n b e w a s h e d w i t h s a l i n ea n d d i a m e t e r s r e a d . A l i q u o t s o f t h e n o r m a l r e f e r e n c e s e r u m

2 W e s t b e r g , N . G . , R . H . M c L e a n , a n d A . F . M i c h a e l .D e t e r m i n a t i o n o f s e r u m p r o p e r d i n l e v e l s b y i m m u n o d i f f u s i o n .I n t . A r c h . A l l e r g y A p p l . I m m u n o l . I n p r e s s .

w e r e s t o r e d a t - 7 0 ' C a n d w e r e a r b i t r a r i l y g i v e n a l e v e lo f 1 0 0 % . A l l r e s u l t s w e r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t o f t h i sr e f e r e n c e s e r u m .T h e n o r m a l m e a n s e r u m p r o p e r d i n l e v e l f o r 3 3 c h i l d r e n( a g e 1 - 1 8 y r ) w a s 1 0 7 1 7 % ( 1 SD) w i t h a r a n g e o f5 0 - 1 7 3 % . T h e c o n c e n t r a t i o n o f p r o p e r d i n i n a s i n g l e s e r u mm e a s u r e d o n 1 1 s e p a r a t e o c c a s i o n s h a d a m e a n o f 1 2 7+ 7 % o , ( 1 S D ) , ( S E 2 ) .C3 p r o a c t i v a t o r ( C 3 P A )Human C3PA w a s i s o l a t e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o fG b t z e a n d M i f l l e r - E b e r h a r d ( 4 ) . T r a c e a m o u n t s o f I g Gi n t h e f i n a l p r e p a r a t i o n o f C 3 P A w e r e r e m o v e d b y p as s ag eo v e r a S e p h a r o s e 4 B i m m u n o a d s o r b e n t c o l u m n ( P h a r m a c i aF i n e C h e m i c a l s I n c . , P i s c a t a w a y , N . J . ) c o u p l e d t o a n t i -I g G . P u r e C 3 P A s h o w e d n o r e a c t i v i t y w i t h a n t i s e r u m t oI g G , I g M , I g A , , 1 C , o r p r o p e r d i n . A n t i s e r u m w a s p r e p a r e di n a g o a t b y m u l t i p l e s u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n s i n c o m p l e t eF r e u n d ' s a d j u v a n t . D o u b l e d i f f u s i o n o f f r e s h s e r u m a g a i n s tGAHC3PA i n a g a r o s e s h o w e d c o m p l e t e i d e n t i t y w i t h GAH-C3PA a n t i s e r u m k i n d l y p r o v i d e d b y D r . M i i l l e r - E b e r h a r da n d w i t h r a b b i t a n t i s e r u m t o C 3 a c t i v a t o r ( g l y c i n e - r i c hB - g l y c o p r o t e i n I I ) o b t a i n e d f r o m B e h r i n g w e r k e A G , M a r -b u r g - L a h n , W e s t G e r m a n y . T h e r e w a s n o i d e n t i t y w h e ns e r u m w a s r e a c t e d a g a i n s t G A H C 3 P A a n d G A H / % C t h a t

h a d b e e n p r e p a r e d a g a i n s t , 1 A a b s o r b e d t o z y m o s a n .By i m m u n o d i f f u s i o n a s s a y a s t r a i g h t l i n e w a s d e s c r i b e dw h e n a 1 / 2 t o 1 / 1 6 d i l u t i o n o f i s o l a t e d C3PA w a s p l o t t e da g a i n s t a r e a . T h e a m o u n t o f C3PA i n a n o r m a l r e f e r e n c es e r u m w a s a s s a y e d u s i n g i s o l a t e d C3PA c o n t a i n i n g 7 3 . 5 j u gN p e r m l f o r t h e s t a n d a r d c u r v e . P r o t e i n n i t r o g e n w a sm e a s u r e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f L o w r y u s i n g b o v i n e

TABLE IM ea n S e r u m L e v e l s o f , 8 1 A , P r o p e r d i n , a n d C3PA D e t e r m i n e d b y I m m u n o d i f f u s i o n A s s a y i n P a t i e n t s

w i t h CMPGN, S L E , AGN, a n d O t h e r R e n a l D i s e a s e s . V a l u e s G r o u p e d a c c o r d i n g t oL e v e l o f S e r u m , 1 A *Lo w , 8 i A l e v e l s * N o r m a l j 3 i A l e v e l s *

P r o p e r - P r o p e r -D i s e a s e f l i A j d i n C 3 P A P l A t d i n C 3 P A

mg / % , u g N/ml m g / % j g N / m I l1 0 0 m l n o r m a l 1 0 0 m l n o r m a l

CMPGN 42424 72i15 33+ 7 1 1 5 3 3 92+31 3111( 1 8 ) A ( 1 8 ) ( 1 4 ) ( 1 1 ) ( 1 1 ) ( 7 )S LE 6 5 t 1 8 9025 2 7 9 1 0 6 i 1 7 95+27 3 3 9( 1 6 ) ( 1 6 ) ( 1 3 ) ( 1 0 ) ( 1 0 ) ( 8 )A GN 4 4 - 2 4 6024 3610 113 10 9 5 4 2 4 4 6 4 1 5( 1 4 ) ( 1 4 ) ( 1 2 ) ( 1 0 ) ( 1 0 ) ( 8 )O t h e r r e n a l d i s e a s e s 1 5 1 4 5 1 2 4 4 3 4011( 1 9 ) ( 1 9 ) ( 1 5 )N o r m a l 1 6 5 + 4 1 1 0 7 1 7 4612( 3 3 ) ( 3 3 ) ( 3 2 )* Low # , A l e v e l s i n d i c a t e v a l u e s l e s s t h a n 8 3 mg p e r 1 0 0 m l ( 2 S D b e l o w mean o f n o r m a l ) ; n o r m a l , 1 Al e v e l s i n d i c a t e v a l u e s t h a t a r e e q u a l t o o r g r e a t e r t h a n 8 3 mg p e r 1 0 0 m l . M u l t i p l e s e r a f r o m p a t i e n t sw e r e f i r s t g r o u p e d b y f , 1 A l e v e l a n d t h e n a v e r a g e d .T 1 A l e v e l i n e a c h p a t i e n t i s c a l c u l a t e d b y a v e r a g i n g t h e v a l u e s o f a l l s e r a f r o m t h a t p a t i e n t f o r w h i c hp r o p e r d i n l e v e l s a r e a l s o a v a i l a b l e . Th e v a l u e s r e p r e s e n t t h e mean 1 S D . Th e n u m b e r i n p a r e n t h e s i s i s t h e n u m b e r o f p a t i e n t s w i t h t h e i n d i c a t e d d i s e a s e w i t h i n e a c h g r o u p .I n s e v e n p a t i e n t s w i t h CMPGN, f i v e p a t i e n t s w i t h S L E , a n d f o u r p a t i e n t s w i t h AGN, v a l u e s a r ei n c l u d e d i n b o t h # , A s u b g r o u p s s i n c e s e r a w er e o b t a i n e d a t v a r y i n g s t a g e s o f t h e d i s e a s e .

6 3 6 R . H . McLean and A . F . M i c h a e l


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s e r u m a l b u m i n ( A r m o u r P h a r m a c e u t i c a l C o . , C h i c a g o , I l l . )a s a s t a n d a r d . R e c o v e r y o f i s o l a t e d C 3 P A a d d e d t o a 1 / 8d i l u t i o n o f t h e r e f e r e n c e p o o l w a s 1 0 6 % . F o r i m m u n o d i f -f u s i o n a s s a y s e r i a l t w o f o l d d i l u t i o n s i n P BS o f a n o r m a lr e f e r e n c e s e r u m w e r e p l a c e d o n e a c h a s s a y p l a t e . A r e f e r -e n c e s e r u m c o n t a i n i n g 3 3 . 3 A g N p e r m l w a s u s e d a s as t a n d a r d i n a l l s u b s e q u e n t i m m u n o d i f f u s i o n a s s a y s f o r C 3 P A .P a t i e n t s ' s e r a w e r e d i l u t e d 1 / 4 o r 1 / 3 i n P BS b e f o r ei m m u n o d i f f u s i o n . T h e c o n c e n t r a t i o n o f C 3 P A i n t h e s e r ao f 3 2 n o r m a l c h i l d r e n a g e d 1 - 1 8 w a s 4 6 + 1 2 A g N p e r m l( 1 S D ) . T h e r a n g e w a s 2 8 - 7 6 A g N p e r m l a n d s e v e n a s -s a y s o f t h e s a m e s e r u m a t d i f f e r e n t t i m e s r e v e a l e d a c o n -c e n t r a t i o n o f 3 5 4 l s g N p e r m l ( 1 S D ) , ( S E 1 . 3 ) .I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s o f p r o p e r d i nP r o p e r d i n i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s ( 1 8 ) w a s p e r f o r m e d i n2% N o b l e a g a r u s i n g t h e g l y c i n e - s a l i n e - E D T A ( 0 . 0 0 2 M)b u f f e r p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( i m m u n o d i f f u s i o n a s s a y o f# , s C / # , / A p r o p e r d i n a n d C 3 P A ) . O n l y s e r a k e p t a t - 7 0 ' Cw e r e e x a m i n e d . A v o l t a g e o f 4 - 5 V / c m w a s m e a s u r e da c r o s s t h e b a t h s u p p l i e d b y a c o n s t a n t c u r r e n t ( 5 0 mA)p o w e r s u p p l y . I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d o nh u m a n s e r a p l a c e d i n 4-mm w e l l s f o r 4 h a t r o o m t e m -p e r a t u r e . RAHP ( d i l u t e d 1 / 1 2 ) w a s p l a c e d i n t h e t r o u g h sa n d p r e c i p i t i n a r c s a p p e a r e d b y 1 2 - 1 8 h w i t h f u l l d e v e l o p -

m e n t a f t e r 3 d a y s . A r c s w e r e m a d e m o r e v i s i b l e b y u s i n gg o a t a n t i s e r u m a g a i n s t r a b b i t I g G ( 1 9 ) .I n v i t r o s t u d i e sC o b r a v e n o m f a c t o r e f f e c t o n t p r o p e r d i n . T h e a n t i c o m p l e -m e n t a r y f a c t o r f r o m c o b r a v e n o m N a j a n a j a ( C o F ) w a si s o l a t e d b y t h e m e t h o d o f M f i l l e r - E b e r h a r d a n d F j e l l s t r o m( 2 0 ) . 1 U o f CoF w a s e q u a l t o 3 . 7 5 A i g p r o t e i n a s a s s a y e db y t h e m e t h o d o f M f i l l e r - E b e r h a r d a n d F j e l l s t r o m i n w h i c h1 U o f CoF c a u s e s 50 % d e c r e a s e i n t h e h e m o l y t i c c o m p l e -m e n t i n 0 . 5 m l o f a 1 : 2 0 d i l u t i o n o f f r e s h s e r u m .1 , 2 , a n d 2 0 U o f C oF w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 . 0 m l o ff r e s h h u m a n s e r u m a t 3 7 0 C f o r 3 0 m i n . T h e r e a c t i o n w a ss t o p p e d b y f r e e z i n g a t - 7 0 ' C . I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s f o rp r o p e r d i n , 8 1 C , a n d C 3 P A w a s p e r f o r m e d o n t h e s e r u m a sp r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 4 , 1 8 ) .E n d o t o z i n e f f e c t o n p r o p e r d i n . E n d o t o x i n ( E s c h e r i c h i ac o l i 0 2 6 : B 6 l i p o p o l y s a c c h a r i d e B [ D i f c o L a b s . , D e t r o i t ,M i c h . ] ) w a s s u s p e n d e d i n P BS i n a c o n c e n t r a t i o n o f 6 0 0j u g p e r m l ; 3 1 l , 1 0 A l , a n d 7 5 / i l w e r e a d d e d t o 0 . 5 m l o ff r e s h h u m a n s e r u m ( 3 . 6 , 1 2 , 9 0 j i g p e r m l s e r u m , r e s p e c -t i v e l y ) . A f t e r 3 0 m i n i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C , i m m u n o e l e c t r o -p h o r e s i s f o r p r o p e r d i n , / 8 1 C , a n d C 3 P A w a s p e r f o r m e d a sd e s c r i b e d a b o v e .

R E SULT SP r o p e r d i n . A s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n t h es e r u m l e v e l o f p r o p e r d i n w a s n o t e d i n p a t i e n t s w i t h

CMPGN a n d AGN w h o s e s e r u m l e v e l o f P 1 A w a s d e -c r e a s e d m o r e t h a n 2 S D b e l o w t h e m e a n o f n o r m a l v a l -u e s ( 1 6 5 - 8 2 ) ( T a b l e I a n d A p p e n d i x ) . T h e m o s t s t r i k -i n g d e c r e a s e i n s e r u m l e v e l s o f p r o p e r d i n w a s s e e n i n p a -t i e n t s w i t h AGN ( 6 0 2 4 ) , a n d CMPGN ( 7 2 + 1 5 ) ; an o n s i g n i f i c a n t d e c r e a s e w a s o b s e r v e d i n s e r a f r o m p a -t i e n t s w i t h S LE ( 9 0 2 5 ) . T h e l e v e l i n p a t i e n t s w i t ho t h e r r e n a l d i s e a s e s ( 1 2 4 + 4 3 ) w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f -f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e s . C o m p a r i s o n o f t h e s e r u mp r o p e r d i n l e v e l s i n t h e n o r m a l t o t h e l o w p 1 A s u b g r o u p s

TABLE I IC o r r e l a t i o n C o e f f i c i e n t s o f S e r u m L e v e l s o f 3 1 A v s . P r o p e r d i n a n d# 1 A v s . C3PA i n P a t i e n t s w i t h CMPGN, A G N , S L E ,O t h e r R e n a l D i s e a s e , a n d N o r m a l S u b j e c t s . I f M f o r et h a n O n e S e r u m was A v a i l a b l e f r o m E a c hP a t i e n t , t h e n a S i n g l e S e r u m Wasr a n d o m l y S e l e c t e d . *

v i A s . p r o p e r d i n v 1 A s . C 3 P AD i s e a s e r 4 P P

CMPGN 0 . 6 2 6 P < 0 . 0 0 5 0 . 1 3 1 0 . 1 < PS L E 0 . 2 2 9 0 . 1 < P 0 . 5 6 7 P < 0 . 0 5AGN 0 . 8 4 4 P < 0 . 0 0 1 0 . 0 1 4 0 . 1 < PO t h e r r e n a l d i s e a s e s ( 0 . 6 4 7 P < 0 . 0 0 5 0 . 5 9 5 P < 0 . 0 2Normal 0 . 0 2 7 0 . 1 < P 0 . 5 1 0 P < 0 . 0 0 5* R e g r e s s i o n a n a l y s i s b y m e t h o d o f l e a s t s q u a r e s .

r i s c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t o f t h e r e g r e s s i o n l i n e .

o f e a c h d i s e a s e c a t e g o r y d e m o n s t r a t e d a s i g n i f i c a n t d i f -f e r e n c e i n t h e p r o p e r d i n l e v e l i n CMPGN a n d AGN b u tno d i f f e r e n c e f o r S L E .A p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n serum l e v e l s o f # , A a n dp r o p e r d i n w as s e e n i n p a t i e n t s w i t h AGN ( P < 0 . 0 0 1 ) ,CMPGN ( P < 0 . 0 0 5 ) , a n d o t h e r r e n a l d i s e a s e s ( P


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GM P G N

F I G u R E 2 S e r u m p r o p e r d i n l e v e l s i n s i x ICMPGN. S e r a w e r e c o l l e c t e d o v e r 3 - 1 2 ml e v e l s v a r i e d i n t h e 2 S D b e l o w t h e m e a n . Onr e c e i v e d i m m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y . S h a d e d a tt h e n o r m a l r a n g e o f p r o p e r d i n 2 S D .t u a t e d w i t h i n 1 - 2 S D b e l o w t h e m e a n . I n t w o i n s t a n c e si n i t i a l l y l o w v a l u e s i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y . By c o n t r a s t ,i n t w o p a t i e n t s w i t h n o n e p i d e m i c AGN, f r o m w hom r e -

AGN

p e a t e d s e r u m s p e c i m e n s w e r e o t b a i n e d o v e r a p e r i o d o f3 m o , s e r u m p r o p e r d i n l e v e l s i n c r e a s e d r a p i d l y t o w a r dt h e mean d u r i n g t h e f i r s t 2 mo o f i l l n e s s ( F i g . 3 ) . I ne p i d e m i c AGN, t h e s e r u m p r o p e r d i n l e v e l w a s l e s s t h a n2 S D b e l o w t h e m e a n i n 9 / 1 2 p a t i e n t s i n w h o m t h e d a t eo f o n s e t o f s y m p t o m s w a s k n o w n ; a l l b u t o n e o f t h e s en i n e s e r a w e r e t a k e n w i t h i n t h e f i r s t 1 5 d a y s a f t e r o n s e to f s y m p t o m s . T h e v a r i a t i o n o f s e r u m p r o p e r d i n l e v e l s i no n e p a t i e n t ( E . B . ) w i t h S LE d u r i n g a z a t h i o p r i n e a n dp r e d n i s o n e t h e r a p y i s s h o w n i n F i g . 4 . A s i m i l a r p a t -t e r n o f g r a d u a l i n c r e a s e w i t h c l i n i c a l i m p r o v e m e n t o ft h e d i s e a s e w a s n o t e d i n t h r e e o t h e r p a t i e n t s ( L . P . ,M . T . , G . 0 . ) w i t h S LE ( T a b l e I I I ) . One o f t h e s ep a t i e n t s ( L . P . ) s h o w e d a d e c l i n e o f s e r u m p r o p e r d i nf r o m p r e v i o u s l y h i g h e r l e v e l s w i t h c l i n i c a l e x a c e r b a t i o no f t h e d i s e a s e ( n o t s h o w n ) .T h e o n l y g r o u p o f p a t i e n t s r e c e i v i n g i m m u n o s u p -p r e s s i v e t h e r a p y i n t h i s s t u d y w e r e t h o s e w i t h S L E . S i xw e r e e v a l u a t e d b e f o r e i n s t i t u t i o n o f i m m u n o s u p p r e s s i v ep a t i e n t s w i t h t h e r a p y , o n e w a s s t u d i e d w h i l e o n l o w d o s e , a l t e r n a t ep a i r o p e r t ( d * ) d a y p r e d n i s o n e , a n d o ne h a d b e e n on p r e d n i s o n e d a i l yr e a r e p r e s e n t s f o r 1 mo w i t h o u t r e s p o n s e . T h e m e a n p r o p e r d i n l e v e l

S LE

a _ \19 C 4 f !. ( c r -l_ ,

0--- _ - *

2 '( .1 o

vo .A-

o_ 0

2 o ~o a 4Q -..__ -0o


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TABLE I I IR e l a t i o n s h i p i n P a t i e n t s w i t h SLE o f I m m u n o e l e c t r o p h o r e t i c M i g r a t i o n o f P r o p e r d i n t oS e r u m L e v e l s o f P I A , P r o p e r d i n , a n d C3PA*D u r a t i o n

P a t i e n t T h e r a p y t o f t h e r a p y P i A P r o p e r d i n C 3 P A I E P mo m g / 1 0 0 m l % n o r m a l j i g N / m l

1 . E . B . P , A 1 5 3 9 4 8 C2 6 6 7 7 2 0 C4 7 7 1 1 1 2 1 N6 1 3 5 1 3 5 2 4 N

2 . L . P . P 0 2 5 4 3 3 0 C6 6 5 6 8 2 9 N6 . 5 6 7 6 4 1 6 CP , A 8 1 2 0 1 0 6 2 3 C

3 . G . O . P 0 3 1 1 1 2 2 8 C0 . 2 5 1 0 1 1 3 3 2 4 C2 . 5 1 9 7 1 6 0 5 0 C4 . M. T . P 5 5 9 7 2 1 7 CP , A 6 9 4 7 2 1 7 C

7 . 5 1 2 6 1 3 0 3 6 C5 . K . G . 0 3 1 5 5 3 5 A r c n o tv i s i b l eP , A 2 1 2 6 8 9 N* N o r m a l v a l u e s , 6 1 A 1 6 5 + 4 1 mg p e r 1 0 0 m l , p r o p e r d i n 1 0 7 + 1 7 % , C 3 P A 4 6 + 1 2 . g N p e r m l .P, p r e d n i s o n e ; A , a z a t h i o p r i n e I E P , i m m u n o e l e c t r o p h o r e t i c m i g r a t i o n o f p r o p e r d i n ; N , n o r m a l m i g r a t i o n ; C , i n c r e a s e d c a t h o d a lm i g r a t i o n .

( 7 4 2 5 ) o f t h e u n t r e a t e d S LE p a t i e n t s s h o w e d a s i g -n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m t h e n o r m a l c o n t r o l s b u t n o t f r o mt h e r e m a i n i n g S LE p a t i e n t s i n t h e l o w f 1 A a n d n o r m a l, 8 1 A g r o u p s .C 3 P A . A s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n s e r u mC 3 P A w a s f o u n d i n p a t i e n t s w i t h l o w # 1 A i n C M P G N( 3 3 7 ) a n d S LE ( 2 7 9 ) . S e r a w i t h n o r m a l 8 1 A l e v e l sa l s o h a d d e c r e a s e d C 3 P A l e v e l s i n C M P G N ( 3 1 + 1 1 )a n d S LE ( 3 3 9 ). T h e d e c r e a s e d C 3 P A l e v e l s i nC M P G N d i d n o t c o r r e l a t e w i t h t h e l e v e l o f r e n a l f u n c -t i o n . I n S LE s e r u m C 3 P A l e v e l s 2 S D b e l o w t h e m e a nw e r e f o u n d i n s i x p a t i e n t s . F i v e o f t h e s i x h a d s e v e r el u p u s n e p h r i t i s a n d a b n o r m a l i t i e s o f r e n a l f u n c t i o n .A s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n s e r u m C 3 P A w a s s e e n i n AGNs e r a w i t h l o w , 8 1 A ( 3 6 1 0 ) b u t n o t i n s e r a w i t h n o r m a lj 8 1 A . No d i f f e r e n c e s w e r e n o t e d w h e n l e v e l s i n o t h e r r e n a ld i s e a s e s w e r e c o m p a r e d w i t h n o r m a l v a l u e s .S t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e r e g r e s s i o n l i n e s o f O 1 A v s .C 3 P A w i t h o n e s e r u m f r o m e a c h p a t i e n t i s s h o w n i nT a b l e I I . T h e r v a l u e d e r i v e d f r o m a n a l y s e s o f C 3 P Aa n d P 1 A l e v e l s w a s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m z e r o i nS L E , o t h e r r e n a l d i s e a s e s , a n d i n t h e n o r m a l p o p u l a -t i o n b u t n o t f o r CMPGN a n d AGN.

A s c a t t e r g r a m o f C 3 P A l e v e l s i n 4 0 s e r a f r o m 2 1 p a -t i e n t s w i t h S LE i s s h o w n i n F i g . 5 a n d i l l u s t r a t e s t h ep o s i t i v e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n s e r u m l e v e l s o f p 1 A a n d7 0 S LE60 -

' . . 40z

-3 0a .0 2 0

1 0

0ES00 0 0*eel

0 %S

U 2 0 40 6 0

S*0

0 *

0

- 2 S D

8 0 1 0 o 1 2 03 1 A ( m g / 1 0 0 m l ) 1 4 0 1 6 0 1 8 0 20 0F I G U R E 5 S c a t t e r g r a m o f P 1 A v s . C 3 P A o f 4 0 s e r a f r o m2 1 p a t i e n t s w i t h S L E . V e r t i c a l l i n e i n d i c a t e s P 1 A l e v e l 2S D b e l o w t h e m e a n . A p o s i t i v e c o r r e l a t i o n w a s s h o w n t ob e p r e s e n t b y r e g r e s s i o n a n a l y s i s o f a s i n g l e s e r u m f r o me a c h p a t i e n t .

P r o p e r d i n a n d C 3 P A i n G l o m e r u l o n e p h r i t i s 6 3 9

5 0 k


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C 3 P A . L o n g i t u d i n a l s t u d i e s o f a p a t i e n t w i t h S LE o v e ra p e r i o d o f 7 mo s h o w s t h e e f f e c t o f i m m u n o s u p p r e s s i v et h e r a p y o n C 3 P A l e v e l s ( F i g . 3 ) . I n t h i s p a t i e n t , v a l -u e s 2 S D b e l o w t h e m e a n o f s e r u m C 3 P A r o s e t o n o r m a la s 1 , A l e v e l s i n c r e a s e d . T h r e e o t h e r p a t i e n t s ( G . O . ,M . T . , L . P . ) f o l l o w e d 3 - 9 mo w i t h S LE s h o w e d i n -c r e a s i n g l e v e l s o f C 3 P A w i t h c l i n i c a l i m p r o v e m e n t( T a b l e I I I ) .T h e m e a n s e r u m C 3 P A l e v e l i n t h e e i g h t p a t i e n t s w i t hS LE e v a l u a t e d b e f o r e i m m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y o r

F I G U R E 6 I m m u n o e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n o f s e r u m p r o p e r -d i n . ( A ) A n o r m a l serum i s i n t h e u p p e r w e l l ; p a t i e n t ' ss e r u m w i t h S LE ( E . B . ) i s i n t h e l o w e r w e l l . RAHP w a sp l a c e d i n t h e t r o u g h . C a t h o d e on t h e r i g h t . C o m p a r e d t ot h e c o n t r o l s e r u m , t h e p r e c i p i t i n a r c a r i s e s more p o s t e r i o r l yi n t h e w e l l , a n d t h e p o i n t o f g r e a t e s t c u r v a t u r e o f t h e p r e -c i p i t i n a r c h a s s h i f t e d t o w a r d t h e c a t h o d e ( P c ) . ( B ) A n o r -m a l c o n t r o l s e r u m i s on t h e l o w e r w e l l ; serum f r o m a p a t i e n tw i t h a c t i v e S LE i s i n t h e u p p e r w e l l . RAHP i s p l a c e d i nt h e t r o u g h . C a t h o d e on t h e r i g h t . S LE serum p r e c i p i t i na r c i s s h i f t e d c a t h o d a l l y w h e n c o m p a r e d t o t h e n o r m a lc o n t r o l s e r u m .

w h i l e o n a l t e r n a t e d a y p r e d i s o n e w a s 3 0 5 A g N p e r m la n d d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m l e v e l s o f t h e l o w o rn o r m a l 8 1 3 A s u b g r o u p s . C o m p a r i s o n o f t h e l o w 1 1 A g r o u pt o t h e n o r m a l P 1 A g r o u p w i t h i n e a c h d i s e a s e c a t e g o r ys h o w e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n s e r u m C 3 P A l e v e l sf o r C M P GN , S L E , a n d AGN. S e q u e n t i a l s e r u m C 3 P Al e v e l s e x a m i n e d o v e r 3 mo d e c r e a s e d i n o n e p a t i e n t w i t hAGN ( P . P . ) s h o w n i n F i g . 3 , b u t r e m a i n e d i n t h e l o wr a n g e i n t h e s e c o n d ( G . T . ) . I n e i g h t p a t i e n t s w i t hC M P G N w h o h a d t w o o r m o r e s e r a a v a i l a b l e , s e r u mC 3 P A l e v e l s w e r e l o w e r t h a n t h e m e a n b u t w i t h i n t h er a n g e o f n o r m a l .I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s . 1 9 n o r m a l p a t i e n t s ( w i t h o u tr e n a l d i s e a s e ) s h o w e d a p r o p e r d i n p r e c i p i t i n a r c i n t h e1 - g l o b u l i n r e g i o n o n i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s ( F i g . 6 ) .

F o u r o f f i v e p a t i e n t s w i t h S LE e v a l u a t e d s e q u e n t i a l l yh a d s e r a d e m o n s t r a t i n g i n c r e a s e d c a t h o d a l m i g r a t i o n o fp r o p e r d i n o n i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s ( d e s i g n a t e d P c )w h e n c o m p a r e d t o n o r m a l s e r a ( T a b l e I I a n d F i g . 6 ) .P a t i e n t s 1 a n d 2 h a d a b n o r m a l m i g r a t i o n o f p r o p e r d i nd u r i n g p e r i o d s o f a c t i v i t y b u t n o r m a l m i g r a t i o n d u r i n gr e m i s s i o n . S e r a f r o m p a t i e n t 5 a n d o n e o t h e r p a t i e n t w i t hS LE h a d p r o p e r d i n l e v e l s 2 S D b e l o w t h e m e a n ( 5 5 a n d4 7 % o f n o r m a l ) ; p r o p e r d i n c o u l d n o t b e d e t e c t e d i ne i t h e r s e r a b y i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s . A s i m i l a r e v a l u a -t i o n o f s e r a f r o m f o u r o t h e r p a t i e n t s w i t h t r e a t e d S LE r e -v e a l e d n o r m a l p r o p e r d i n m i g r a t i o n i n t w o a n d i n d e t e r m i -n a t e r e s u l t s i n t w o . S e r a f r o m 5 o f 1 5 p a t i e n t s w i t hC M P G N a l s o s h o w e d i n c r e a s e d c a t h o d a l m i g r a t i o n o fp r o p e r d i n . T h i s c o u l d n o t c l e a r l y b e c o r r e l a t e d w i t h t h ea c t i v i t y o f t h e r e n a l d i s e a s e . A s i m i l a r a n a l y s i s o f 1 0 s e r af r o m f o u r p a t i e n t s w i t h s p o r a d i c AGN f a i l e d t o d e t e c ta n y a b n o m a l i t i e s . I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s o f s e r a f r o m 1 0p a t i e n t s ( 1 2 s e r a ) w i t h o t h e r f o r m s o f r e n a l d i s e a s e h a v en o t s h o w n a n y w i t h c a t h o d a l m i g r a t i o n o f p r o p e r d i n .A f t e r i n c u b a t i o n o f n o r m a l h u m a n s e r u m w i t h 1 , 2 , a n d2 0 U o f CoF p e r m l o f s e r a , i n c r e a s e d c a t h o d a l m i g r a -t i o n o f p r o p e r d i n w a s o b s e r v e d o n i m m u n o e l e c t r o p h o r e -s i s a t a l l c o n c e n t r a t i o n s o f CoF ( F i g . 7 ) . S i m i l a rc h a n g e s c o u l d b e s e e n a f t e r i n c u b a t i o n o f s e r u m w i t h e n -d o t o x i n i n a c o n c e n t r a t i o n o f 3 . 6 , 1 2 , a n d 9 0 i g p e r m l o fs e r u m . D o u b l e d i f f u s i o n i n a g a r o s e o f n o r m a l s e r a a n ds e r a w i t h a b n o r m a l p r o p e r d i n m i g r a t i o n a g a i n s t RAHPd i d n o t s h o w s p u r r i n g . No a n t i g e n i c l o s s c o u l d b e d e m -o n s t r a t e d a f t e r i n c u b a t i o n w i t h CoF o r e n d o t o x i n . I m -m u n o d i f f u s i o n a s s a y o f p r o p e r d i n s h o w e d n o c h a n g e i nc o n c e n t r a t i o n a f t e r i n c u b a t i o n w i t h CoF o r e n d o t o x i n .A g a r o s e , I o n a g a r , a n d b a r b i t a l b u f f e r ( p H 8 . 6 ) w e r ef o u n d t o b e l e s s s a t i s f a c t o r y f o r t h e d e m o n s t r a t i o n o fp r o p e r d i n b y i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s . I m m u n o e l e c t r o p h o -r e s i s f o r C 3 P A i n a l i q u o t s o f t h e a b o v e s e r a s h o w e d ane w y - m i g r a t i n g a r c i n a d d i t i o n t o t h e P - a r c n o t e d i nc o n t r o l s e r a . I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s f o r # , 3 C / 1 3 1 A d e m -

6 4 0 R . H . M c L e a n a n d A . F . M i c h a e l


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o n s t r a t e d t h e a p p e a r a n c e o f a new a r c m o r e a n o d a l t ot h e f l - m i g r a t i n g a r c f o r A 1 C .D I S C U S S I O N

T h e s i g n i f i c a n c e o f a n a l t e r n a t e c o m p l e m e n t p a t h w a y i nh u m a n d i s e a s e , p a r t i c u l a r l y i m m u n e - r e l a t e d g l o m e r u l o -n e p h r i t i s , i s u n k n o w n . T h e s e s t u d i e s h a v e a t t e m p t e d t od e f i n e t h e r o l e o f t w o c o m p o n e n t s i n t h i s p a t h w a y , p r o -p e r d i n a n d C 3 P A , i n p a t i e n t s w ho a r e known t o h a v ea l t e r a t i o n s i n t h e s e r u m l e v e l o f c o m p l e m e n t o r i t s c o m -p o n e n t s a n d i m m u n o p a t h o l o g i c e v i d e n c e o f c o m p l e m e n t -m e d i a t e d g l o m e r u l a r i n j u r y . I t i s r e c o g n i z e d t h a t t h ep r e c i s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r o p e r d i n a n d t h e C 3 p r o -a c t i v a t o r s y s t e m h a s n o t b e e n d e f i n e d , a n d t h a t s e r u ml e v e l s o f t h e c o m p o n e n t s o f t h e c o m p l e m e n t p a t h w a y s a r es t a t i c v a l u e s w h i c h r e f l e c t t h e n e t e f f e c t o f s e v e r a lf o r c e s .A d e c r e a s e i n s e r u m h e m o l y t i c c o m p l e m e n t h a s b e e n

o b s e r v e d i n a n u m b e r o f d i f f e r e n t f o r m s o f g l o m e r u l o -n e p h r i t i s i n c l u d i n g AGN, CMPGN, S L E , a n d c e r t a i ni n s t a n c e s o f i n f e c t i o n a n d n e p h r i t i s ( 2 1 - 2 5 ) . E x a m i n a -t i o n o f t h e s e r u m c o m p l e m e n t c o m p o n e n t s h a s s h o w nt h a t CMPGN i s c h a r a c t e r i z e d b y r e l a t i v e l y n o r m a l e a r l yc o m p o n e n t s ( C l , C 4 , C 2 ) , a n d d e p r e s s i o n o f t e r m i n a lc o m p o n e n t s ( C 3 - C 9 ) , w h e r e a s i n p a t i e n t s w i t h a c t i v eS LE a l l c o m p o n e n t s a r e d e c r e a s e d . I n AGN a l l c o m -p o n e n t s w i t h t h e f r e q u e n t e x c e p t i o n o f C l q a r e d e c r e a s e de a r l y b u t o n l y C 3 i s d e c r e a s e d l a t e r i n t h e d i s e a s e .G e w u r z e t a l . n o t e d t h e s i m i l a r i t y o f t h e c o m p l e m e n tc o m p o n e n t p r o f i l e p r o d u c e d b y l i p o p o l y s a c c h a r i d e s a n dp o l y s a c c h a r i d e s t o t h a t n o t e d i n CMPGN a n d AGN( 8 ) . P a r t i c i p a t i o n o f t h e a l t e r n a t e p a t h w a y i n d i f f u s eg l o m e r u l a r d i s e a s e a s s o c i a t e d w i t h h y p o c o m p l e m e n t e m i ai s s u g g e s t e d b y t h e r e s u l t s o f t h e p r e s e n t s t u d y : d e p r e s -s i o n o f s e r u m l e v e l s o f p r o p e r d i n a n d C 3 P A , a c o r r e l a -t i o n b e t w e e n t h e l e v e l s o f A 1 C w i t h p r o p e r d i n a n d / o rC 3 P A i n s o m e d i s e a s e s b u t n o t o t h e r s , a n d c h a n g e s i nt h e e l e c t r o p h o r e t i c m i g r a t i o n o f s e r u m p r o p e r d i n i n v i v o .T h e p a t i e n t s w i t h g l o m e r u l o n e p h r i t i s h a v e b e e n e v a l u a t e do n t h e b a s i s o f t h e s e r u m l e v e l o f P f A s i n c e b o t h p r o -p e r d i n a n d C 3 P A p a r t i c i p a t e i n t h e a c t i v a t i o n o f C 3 .T h i s s e p a r a t i o n i s a n a r b i t r a r y o n e , a n d i t i s r e c o g n i z e dt h a t c e r t a i n v a l u e s i n t h e n o r m a l 8 1 A g r o u p s a r e s t i l ld i f f e r e n t f r o m n o r m a l .P a t i e n t s w i t h AGN h a d t h e l o w e s t l e v e l s o f s e r u mp r o p e r d i n a n d s h o w e d t h e c l o s e s t c o r r e l a t i o n w i t h s e r u mP A . W i t h t w o e x c e p t i o n s , a l l p r o p e r d i n v a l u e s w h i c hw e r e l e s s t h a n 2 S D b e l o w t h e m e a n w e r e d e t e c t e d i ns e r a d r a w n w i t h i n 2 w k o f t h e o n s e t o f c l i n i c a l i l l n e s s .I n s e q u e n t i a l s t u d i e s i n t w o p a t i e n t s , p r o p e r d i n a n d fAl e v e l s s h o w e d a c o n c o m i t a n t r e t u r n t o n o r m a l . S i g n i f i c a n tC 3 P A d e p r e s s i o n o c c u r r e d i n AGN, b u t t h e s e r u m l e v e lw a s l e s s d e p r e ss e d t h a n i n CMPGN o r S L E . P a t i e n t sw i t h CMPGN r e s e m b l e d AGN i n t h e s i g n i f i c a n t d e p r e s -

F I G U R E 7 I m m u n o e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n o f s e r u m p r o -p e r d i n i n c u b a t e d w i t h C o F . N o r m a l s e r u m c o n t r o l i s i nu p p e r w e l l . 0 . 1 m l o f s a m e s e r u m i n c u b a t e d w i t h 2 U o fCoF ( 2 0 U p e r m l ) i n b o t t o m w e l l . C a t h o d e o n t h e r i g h t .T h e p r e c i p i t i n a r c i n t h e s e r u m i n c u b a t e d w i t h CoF s h o w sa b n o r m a l c a t h o d a l m i g r a t i o n ( P c ) s i m i l a r t o t h a t n o t e d i nt h e S LE s e r a o f F i g . 6 .s i o n i n l e v e l s o f p r o p e r d i n a n d C 3 P A a n d t h e p o s i t i v ec o r r e l a t i o n b e t w e e n f P 1 A a n d p r o p e r d i n , b u t n o t b e t w e e nPA a n d C3PA. U n l i k e AGN, f i v e p a t i e n t s w i t h CMPGNh a d o n e o r m o r e s e r a w i t h a b n o r m a l m i g r a t i o n o f p r o -p e r d i n o n i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s .C 3 P A w a s m o s t s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d i n S LE a n d i n -c r e a s e d t o n o r m a l a s t h e s e r u m P 1 A l e v e l r e t u r n e d t on o r m a l i n r e s p o n s e t o i m m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y .F o u r p a t i e n t s s t u d i e d d u r i n g p e r i o d s o f h y p o c o m p l e -m e n t e m i a s h o w e d a b n o r m a l m i g r a t i o n o f p r o p e r d i n o ni m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s , a n d i n t w o p a t i e n t s t h i s h a s b e -c o m e n o r m a l w i t h r e m i s s i o n o f t h e d i s e a s e . S e r u mp r o p e r d i n w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d e p r e s s e d i n s e r a f r o mS LE p a t i e n t s w i t h l o w p 1 A , b u t a s i g n i f i c a n t d e c r e a s ew a s p r e s e n t i n S LE p a t i e n t s who w e r e n o t y e t o n i m -m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y o r wh o w e r e e a r l y i n t h e t r e a t -m e n t c o u r s e .I t i s o f i n t e r e s t t h a t a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n w a s s h o w nb e t w e e n # , A a n d C 3 P A f o r S LE a n d n o r m a l s e r a .N o r m a l s e r a d i d n o t s h o w a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n o f # , 1 Av s . p r o p e r d i n . T h e r e a s o n f o r t h i s d i f f e r e n c e b e t w e e nC 3 P A a n d p r o p e r d i n i n n o r m a l s e r a i s u n k n o w n . S i m i -l a r l y , t h e s i g n i f i c a n c e o f t h e p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e nP A a n d b o t h p r o p e r d i n a n d C 3 P A i n o t h e r r e n a l d i s -e a s e s i s n o t k n o w n .C a t h o d a l m i g r a t i o n o f p r o p e r d i n ( P c ) w a s n e v e r d e -t e c t e d i n s e r a f r o m n o r m a l p a t i e n t s o r p a t i e n t s w i t hr e n a l d i s e a s e o t h e r t h a n S L E o r C M P G N . H o w e v e r ,c a t h o d a l m i g r a t i o n h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n a g i n gs e r u m ( 1 8 ) o r a f t e r i n c u b a t i o n w i t h C oF a n d e n d o t o x i n .



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I n S LE a n d C M P GN , P c ma y r e p r e s e n t a d i f f e r e n t f o r mo f p r o p e r d i n w h i c h h a s r e s u l t e d f r o m i n v i v o a c t i v a t i o no f t h e a l t e r n a t e p a t h w a y . S i n c e c e r t a i n a n t i g e n s ma yh a v e b e e n l o s t f r o m t h e m o l e c u l e d u r i n g i s o l a t i o n p r o -c e d u r e s o r may b e p r e s e n t i n s u c h s m a l l c o n c e n t r a t i o n sa s t o b e u n d e t e c t a b l e b y i m m u n o d i f f u s i o n , i t i s p o s s i b l et h a t t h e c h a n g e i n e l e c t r o p h o r e t i c m i g r a t i o n o c c u r sw i t h o u t t h e a p p e a r a n c e o r d i s a p p e a r a n c e o f d i f f e r e n ta n t i g e n s r e c o g n i z e d b y t h e a n t i p r o p e r d i n s e r u m u s e d .A c h a n g e o f s o m e t y p e i n t h e p r o p e r d i n m o l e c u l e m u s th a v e o c c u r r e d t o c a u s e t h e i n c r e a s e d c a t h o d a l m i g r a -t i o n , b u t t h e n a t u r e o f t h i s c h a n g e i s u n k n o w n . I n e a r l yAGN, s e r u m p r o p e r d i n w a s t o o l o w t o b e d e t e c t e d o ni m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s b u t w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o fp r o p e r d i n s u b s e q u e n t l y i n c r e a s e d , n o a b n o r m a l i t y w a sn o t e d . E v i d e n c e a g a i n s t t h e p o s s i b i l i t y t h a t c h a n g e s i ns e r u m c o n c e n t r a t i o n o f p r o p e r d i n r e s u l t e d i n i m m u n o -e l e c t r o p h o r e t i c c h a n g e i n c l u d e : n o r m a l s e r u m p r o p e r d i nl e v e l s i n p a t i e n t s w i t h a b n o r m a l m i g r a t i o n ( T a b l e I I I ,c a s e s 1 - 4 ) , a b s e n c e o f c a t h o d a l m i g r a t i o n w i t h d i l u t i o no f n o r m a l s e r u m , a n d n o c h a n g e i n p r o p e r d i n c o n c e n t r a -t i o n b y i m m u n o d i f f u s i o n a s s a y a f t e r i n c u b a t i o n w i t h CoFo r e n d o t o x i n .

T h e q u e s t i o n o f t h e b i o l o g i c i m p o r t a n c e o f t h e a l t e r -n a t e p a t h w a y o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n i s u n k n o w n . P r o -p e r d i n h a s b e e n f o u n d d e p o s i t e d o n g l o m e r u l i i n CMPGN,AGN, s o m e c a s e s o f S LE a n d i n o t h e r r e n a l d i s e a s e ( 9 ) .U t i l i z i n g t h e z y m o s a n a s s a y , s e r u m l e v e l s o f p r o p e r d i nh a v e b e e n n o t e d t o b e d e c r e a s e d i n s o m e f o r m s o f r e n a ld i s e a s e ( 8 ) , b u t t h e z y m o s a n a s s a y s h o w s a 26% i n c i -d e n c e o f l o w t i t e r s i n n o r m a l s u b j e c t s ( 7 ) , a n d i t i sp r o b a b l e t h a t t h i s a s s a y i s i n f l u e n c e d b y o t h e r p r o t e i n s

b e s i d e s p r o p e r d i n . T h e C 3 P A s y s t e m h a s b e e n f o u n d t ob e n e c e s s a r y i n t h e m e d i a t i o n o f p a r o x y s m a l h e m o g l o b i -n u r i a ( 2 6 ) , b u t we h a v e n o t d e t e c t e d g l o m e r u l a r d e p o -s i t i o n o f C 3 P A i n h u m a n g l o m e r u l o n e p h r i t i s . A l p e r h a ss h o w n t h a t g l y c i n e - r i c h P - g l y c o p r o t e i n f u n c t i o n s a sF a c t o r B i n t h e p r o p e r d i n s y s t e m ( 1 3 ) , a n d h e h a s d e -s c r i b e d o n e p a t i e n t w i t h a c o n g e n i t a l d e f i c i e n c y o fg l y c i n e - r i c h 3 - g l y c o p r o t e i n who h a s d e c r e a s e d C 3 a n dh a s h a d a l i f e l o n g h i s t o r y o f s e r i o u s i n f e c t i o n s ( 2 7 ) .T h i s s u g g e s t s t h a t t h e a l t e r n a t e p a t h w a y ma y b e i n v o l v e di n d e f e n s e a g a i n s t i n f e c t i o n .

T h e m e c h a n i s m o f a c t i v a t i o n o f t h e a l t e r n a t e p a t h w a yi n h u m a n g l o m e r u l o n e p h r i t i s i s u n k n o w n . A C 3 n e p h r i t i cf a c t o r ( C 3 N e f ) h a s b e e n d e s c r i b e d i n p a t i e n t s w i t hC M P G N w h i c h a c t i v a t e d C 3 t o P i A a n d a 2 D i n t h e p r e s -e n c e o f c o f a c t o r a n d m a g n e s i u m ( 2 8 ) . C 3 n e p h r i t i c f a c -t o r i s n o t C 3 P A b u t a p p a r e n t l y r e q u i r e s C 3 P A f o r C 3 a c -t i v a t i o n ( 2 9 ) . M u l l e r - E b e r h a r d a n d G o t z e ( 1 2 ) h a v es h o w n t h a t o n c e C 3 i s a c t i v a t e d t o C 3 b a n d C 3 a , t h eC3PA s y s t e m i s a c t i v a t e d a n d b e c o m e s a u t o c a t a l y t i c .I n t h i s s i t u a t i o n , a c t i v a t i o n o f t h e c l a s s i c a l c o m p l e m e n tp a t h w a y w o u l d b e e x p e c t e d t o r e c r u i t t h e a l t e r n a t e p a t h -w a y , a n d t h i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e d e p r e s s e d l e v e l s o fC 3 P A i n S LE n o t e d i n t h i s s t u d y . H o w e v e r , i n d i s e a s e ss u c h a s C M P G N i n w h i c h o n l y t h e t e r m i n a l c o m p l e m e n tc o m p o n e n t s a r e d e c r e a s e d , a s e p a r a t e m e c h a n i s m t o f i r s ta c t i v a t e C 3 m u s t e x i s t , a n d , a s s u g g e s t e d b y M u l l e r -E b e r h a r d a n d G o t z e , t h e p r o p e r d i n s y s t e m c o u l d a c t a tt h i s p o i n t . I t i s o f s i g n i f i c a n c e t h a t a c i r c u l a t i n g a b n o r -m a l f o r m o f p r o p e r d i n h a s b e e n d e t e c t e d i n C M P G N a n dS LE w h i c h c a n b e p r o d u c e d i n v i t r o b y k n o w n a c t i v a t i n gf a c t o r s o f t h e a l t e r n a t e p a t h w a y .

TABLE IVS t a t i s t i c a l E v a l u a t i o n o f Mean S e r u m L e v e l s o f # , B A , P r o p e r d i n , a n d C 3 P A i n P a t i e n t s w i t h CMPGN, S L E , AGN, a n d O t h e rR e n a l D i s e a s e . Low a n d N o r m a l t 3 1 A g r o u p s w i t h i n E a c h D i s e a s e C a t e g o r y C o m p a r e d t o N o r m a l C o n t r o l sb y M e t h o d o f D u n n e t t ( 3 0 )

P r o p e r d i n C 3 P AS i m u l t a n e o u s95% c o n f i d e n c ei n t e r v a l s

Lower U p p e rP i A g r o u p s ( i t - c , ) * l i m i t l i m i tLo w # i A

.. ..

.s ..

N o r m a l , B AL o ..

L o w , P i A.. ..

- 1 2 3- 1 4 4- 1 2 1- 50- 59- 52- 1 4

- 1 4 7 . 0-125-1 4 7-7 9- 8 9- 8 2- 3 8

- 9 9- 7 5-9 5- 2 1- 2 9- 2 2

1 0- 1 1 2 - 1 4 4 - 7 9-90 - 1 2 2 - 5 8

S i m u l t a n e o u s S i m u l t a n e o u s9 5% c o n f i d e n c e 9 5 % c o n f i d e n c ei n t e r v a l s i n t e r v a l sLower U p p e r Lower U p p e r( S t - i c ) l i m i t l i m i t ( i t - F C ) l i m i t l i m i t

- 3 5 - 5 5 -15 - 1 3 - 22 -4- 1 7 - 3 8 4 - 1 9 - 2 8 - 1 0- 4 7 - 6 9 - 2 5 - 1 0 - 2 0 -0.55- 1 5 - 3 9 9 - 1 5 - 2 7 -3- 1 2 - 3 7 1 3 - 1 3 - 2 4 - 2- 1 2 - 3 7 1 3 0 - 1 1 1 1

1 7 - 3 3 7 - 6 - 1 5 3- 3 2 - 6 0 - 5 - 1 7 - 2 8 - 6-9 - 36 1 8 - 1 9 - 3 1 - 7

6 4 2 R . H. McL ean and A . F . M i c h a e l

D i s e a s eCMPGNS LEAGNCMPGNS LEAGNO t h e r r e n a l

d i s e a s e sS L E - u n t r e a t e dqT . F . - t r e a t e d* ( S t - g o ) i s t h e d i f f e r e n c e o f t h e mean s e r u m l e v e l o f t h e d i s e a s e g r o u p ( i t ) f r o m t h e mean o f t n e n o r m a l c o n t r o l s x c 5 ) .. - r , - L l e u L r - u

I I I - -C 'u- - - tr^ IQ ( ; . . )


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APPENDIXA l l mean s e r u m P i A l e v e l s w e r e s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e da t 5% s i m u l t a n e o u s s i g n i f i c a n c e l e v e l when c o m p a r e d t on o r m a l i n a l l d i s e a s e g r o u p s , e x c e p t o t h e r r e n al d i s -e a s e s . A l t h o u g h w i t h i n t h e n o r m a l r a n g e , mean 8 , 1 Al e v e l s w e r e s t i l l s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m n o r m a l i nn o r m a l # , A s u b g r o u p s o f e a c h d i s e a s e c a t e g o r y ( T a b l eI V ) .

C o m p a r e d t o n o r m a l c o n t r o l s mean s e r u m p r o p e r d i nl e v e l s w e r e s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d i n t h e l o w f i A s u b -g r o u p s o f p a t i e n t s w i t h CMPGN a n d AGN; S L E p a -t i e n t s w i t h l o w f 1 A w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , b u tu n t r e a t e d p a t i e n t s w i t h S L E a n d l o w P i A w e r e s i g -n i f i c a n t l y d e c r e a s e d .Mean s e r u m C 3 P A l e v e l s w e r e s i g n i f i c a n t l y d e -c r e a s e d i n a l l d i s e a s e s e x c e p t t h e n o r m a l PA s u b g r o u p so f p a t i e n t s w i t h AGN a n d o t h e r r e n a l d i s e a s e s .

A d d e n d u m . S i n c e s u b m i s s i o n o f t h i s m a n u s c r i p t , o t h e rw o r k e r s h a v e r e p o r t e d d a t a o f s e r u m l e v e l s o f F a c t o r B( g l y c i n e - r i c h p - g l y c o p r o t e i n , C 3 P A ) i n h u m a n g l o m e r u l o -n e p h r i t i s . ( H u n s i c k e r , L . G . , S . R u d d y , C . B . C a r p e n t e r ,P . H . S c h u r , J . P . M e r r i l l , H . J . M u i l l e r - E b e r h a r d , a n dK . F . A u s t i n . 1 9 7 2 . M e t a b o l i s m o f t h i r d c o m p l e m e n t c o m -p o n e n t ( C 3 ) i n n e p h r i t i s . I n v o l v e m e n t o f t h e c l a s s i c a n da l t e r n a t e ( p r o p e r d i n ) p a t h w a y s f o r c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n .N . E n g l . J . A l e d . 2 8 7 : 8 3 5 . )D e c r e a s e d s e r u m l e v e l s o f F a c t o r B w e r e f o u n d i n 8 o f1 2 p a t i e n t s w i t h S LE a n d n e p h r i t i s a n d i n 6 o f 1 2 p a t i e n t sw i t h CMPGN.

ACKNOWLEDGMENTST h e a u t h o r s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e t h e g i f t o f C 3 P A a n t i -s e r u m f r o m H . J . M u i l l e r - E b e r h a r d . C . W e s t h a s k i n d l yp e r f o r m e d 8 1 A a s s a y s o n s e v e r a l r e f e r e n c e s e r a . W e e x -p r e s s o u r s i n c e r e a p p r e c i a t i o n f o r t h e e x p e r t t e c h n i c a l a s -s i s t a n c e o f K a y T o w n s e n d a n d F e r n K n u d s o n . T h e s t a t i s t i c a ls t u d i e s w e r e p e r f o r m e d u n d e r t h e g u i d a n c e o f D r . J a m e sB o e n t o w h o m we e x p r e s s o u r t h a n k s .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e N a t i o n a lI n s t i t u t e s o f H e a l t h (AM 1 2 3 7 5 , A I 1 0 7 0 4 , HE 0 6 3 1 4 ) , t h eA m e r i c a n H e a r t A s s o c i a t i o n , a n d t h e K i d n e y F o u n d a t i o no f t h e U p p e r M i d w e s t .

REFERENCES1 . F i s h , A . J . , A . F . M i c h a e l , a n d R . A . G o o d . 1 9 7 1 .P a t h o g e n e s i s o f g l o m e r u l o n e p h r i t i s . I n D i s e a s e s o f t h eK i d n e y . M . B . S t r a u s s a n d L . G . W e l t , e d i t o r s . L i t t l e ,B r o w n a n d C o m p a n y , B o s t o n , M a s s . 2 n d e d i t i o n . 3 7 3 .2 . P i l l e m e r , L . , L . B l u m , I . H . L e p o w , 0 . A . R o s s , E . W .T o d d , a n d A . C . W a r d l a w . 1 9 5 4 . T h e p r o p e r d i n s y s t e ma n d i m m u n i t y . I . D e m o n s t r a t i o n a n d i s o l a t i o n o f a ne ws e r u m p r o t e i n . S c i e n c e ( W a s h . D . C . ) . 1 2 0 : 2 7 9 .3 . S a n d b e r g , A . L . , A . G . O s l e r , H . S . S h i n , a n d B .O l i v e i r a . 1 9 7 0 . T h e b i o l o g i c a c t i v i t i e s o f g u i n e a p i ga n t i b o d i e s . I I . M o d e s o f c o m p l e m e n t i n t e r a c t i o n w i t h ' y la n d - y 2 i m m u n o g l o b u l i n s . J . I m m u n o l . 1 0 4 : 3 2 9 .4 . G o t z e , O . , a n d H . J . M u i l l e r - E b e r h a r d . 1 9 7 1 . T h e C 3 -a c t i v a t o r s y s t e m : An a l t e r n a t e p a t h w a y o f c o m p l e m e n ta c t i v a t i o n . J . E x p . M e d . 1 3 4 : 9 0 5 .5 . P e n s k y , J . , T . W u r z , L . P i l l e m e r , a n d I . H . L e p o w .1 9 5 9 . T h e p r o p e r d i n s y s t e m a n d i m m u n i t y . X I I . A s s a y

p r o p e r t i e s a n d p a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f a h y d r a z i n e - s e n s i -t i v e s e r u m f a c t o r ( F a c t o r A ) i n t h e p r o p e r d i n s y s t e m .Z . I m m u n i t a e t f o r s c h . 1 1 8 : 3 2 9 .6 . B l u m , L . , L . P i l l e m e r , a n d I . H . L e p o w . 1 9 5 9 . T h ep r o p e r d i n s y s t e m a n d i m m u n i t y . X I I I . A s s a y a n d p r o p -e r t i e s o f a h e a t - l a b i l e s e r u m f a c t o r ( F a c t o r B ) i n t h ep r o p e r d i n s y s t e m . Z . I m m u n i t a e t f o r s c h . 1 1 8 : 3 4 9 .7 . S o u l i e r , J . P . , a n d D . M e n a c h e . 1 9 5 8 . V a r i a t i o n s p a t h -o l o g i q u e s d u c o m p l e m e n t e t d e l a p r o p e r d i n e c h e zl ' h o m m e . A c t a H a e m a t o l . ( B a s e l ) . 2 0 : 2 6 0 .8 . G e w u r z , H . , R . J . P i c k e r i n g , G . N a f f , R . S n y d e r m a n ,S . E . M e r g e n h a g e n , a n d R . A . G o o d . 1 9 6 9 . D e c r e a s e dp r o p e r d i n a c t i v i t y i n a c u t e g l o m e r u l o n e p h r i t i s . I n t . A r c h .A l l e r g y A p p l . I m m u n o l . 3 6 : 5 9 2 .9 . W e s t b e r g , N . G . , G . B . N a f f , J . T . B o y e r , a n d A . F .M i c h a e l . 1 9 7 1 . G l o m e r u l a r d e p o s i t i o n o f p r o p e r d i n i na c u t e a n d c h r o n i c g l o m e r u l o n e p h r i t i s w i t h h y p o c o m p l e -m e n t e m i a . J . C l i n . I n v e s t . 5 0 : 6 4 2 .1 0 . O l i v e i r a , B . , A . G . O s l e r , R . P . S i r a g a n i a n , a n d A . L .S a n d b e r g . 1 9 7 0 . T h e b i o l o g i c a c t i v i t i e s o f g u i n e a p i ga n t i b o d i e s . I . S e p a r a t i o n o f y l a n d y 2 i m m u n o g l o b u l i n sa n d t h e i r p a r t i c i p a t i o n i n a l l e r g i c r e a c t i o n s o f t h e i m -m e d i a t e t y p e . J . I m m u n o l . 1 0 4 : 3 2 0 .1 1 . S a n d b e r g , A . L . , 0 . G o t z e , H . J . M f i l l e r - E b e r h a r d ,a n d A . G . O s l e r . 1 9 7 1 . C o m p l e m e n t u t i l i z a t i o n b y g u i n e ap i g ' y l a n d y 2 i m m u n o g l o b u l i n s t h r o u g h t h e C 3 a c -t i v a t o r s y s t e m . J . I m m u n o l . 1 0 7 : 9 2 0 .1 2 . M u i l l e r - E b e r h a r d , H . J . , a n d 0 . G o t z e . 1 9 7 2 . C 3 p r o -a c t i v a t o r c o n v e r t a s e a n d i t s m o d e o f a c t i o n . J . E x p .M e d . 1 3 5 : 1 0 0 3 .1 3 . A l p e r , C . A . , I . G o o d k o f s k y , a n d I . H . L e p o w . 1 9 7 2 .S t u d i e s o f g l y c i n e - r i c h f - g l y c o p r o t e i n ( G B G ) , p r o p e r -d i n f a c t o r B a n d C 3 p r o a c t i v a t o r ( C 3 P A ) . F e d . P r o c .3 1 : 7 8 7 . ( A b s t r . )1 4 . F i s h , A . J . , R . C . H e r d m a n , A . F . M i c h a e l , R . J .P i c k e r i n g , a n d R . A . G o o d . 1 9 7 0 . E p i d e m i c a c u t e g l o -m e r u l o n e p h r i t i s a s s o c i a t e d w i t h t y p e 4 9 s t r e p t o c o c c a l p y -o d e r m a . I I . C o r r e l a t i o n s t u d y o f l i g h t , i m m u n o f l u o r e s -c e n t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c f i n d i n g s . Am. J . M e d . 4 8 :2 8 .1 5 . M a n c i n i , G . , A . 0 . C a r b o n a r a , a n d J . F . H e r e m a n s .1 9 6 5 . I m m u n o c h e m i c a l q u a n t i t a t i o n o f a n t i g e n s b y s i n g l er a d i a l i m m u n o d i f f u s i o n . I m m u n o c h e m i s t r y . 2 : 2 3 5 .1 6 . M u i l l e r - E b e r h a r d , H . J . , U . N i l s s o n , a n d T . A r o n s s o n .1 9 6 0 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t w o p i - g l y c o p r o -t e i n s o f h u m a n s e r u m . J . E x p . M e d . 1 1 1 : 2 0 1 .1 7 . P e n s k y , J . , C . F . H i n z , J r . , E . W . T o d d , R . J . W e d g e -w o o d . J . T . B o y e r , a n d I . H . L e p o w 1 9 6 8 . P r o p e r t i e so f h i g h l y p u r i f i e d h u m a n p r o p e r d i n . J . I m m u n o l . 1 0 0 :1 4 2 .1 8 . M c L e a n , R . H . , a n d A . F . M i c h a e l . 1 9 7 2 . T h e i m m u n o -e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n o f p r o p e r d i n i n f r e s h a n d a g e dh u m a n s e r u m . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 4 1 : 4 0 3 .1 9 . A l p e r , C . A . , T . B o e n i s c h , a n d L . W a t s o n . 1 9 7 2 . G e n e t i cp o l y m o r p h i s m i n h u m a n g l y c i n e - r i c h , g l y c o p r o t e i n . J .E x p . M e d . 1 3 5 : 6 8 .2 0 . M i u l l e r - E b e r h a r d , H . J . , a n d K . F j e l l s t r o m . 1 9 7 1 . I s o -l a t i o n o f t h e a n t i c o m p l e m e n t a r y p r o t e i n f r o m c o b r av e n o m a n d i t s m o d e o f a c t i o n o n C 3 . J . I m m u n o l . 1 0 7 :1 6 6 6 .2 1 . L a n g e , K . , F . G r a i g , J . O b e r m a n , L . S l o b o d y , G . O g u r ,a n d F . L o C a s t o . 1 9 5 1 . C h a n g e s i n s e r u m c o m p l e m e n td u r i n g t h e c o u r s e a n d t r e a t m e n t o f g l o m e r u l o n e p h r i t i s .A r c h . I n t e r n . M e d . 8 8 : 4 3 3 .2 2 . G e w u r z , H . , R . J . P i c k e r i n g , S . E . M e r g e n h a g e n , a n dR . A . G o o d . 1 9 6 8 . T h e c o m p l e m e n t p r o f i l e i n a c u t e



11/11

g l o m e r u l o n e p h r i t i s , s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s i s a n dh y p o c o m p l e m e n t e m i c c h r o n i c g l o m e r u l o n e p h r i t i s . I n t .A r c h. A l l e r g y A p p l . I m m u n o l . 3 4 : 5 6 6 .2 3 . K o h l e r , P . F . , a n d R . T e n B e n s e l . 1 9 6 9 . S e r i a l c o m p l e -m e n t c o m p o n e n t a l t e r a t i o n s i n a c u t e g l o m e r u l o n e p h r i t i sa n d s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s i s . C l i n . E x p . I m m u n o l .4 : 1 9 1 .2 4 . L e w i s , E . J . , C . B . C a r p e n t e r , a n d P . H . S c h u r . 1 9 7 1 .S e r u m c o m p l e m e n t c o m p o n e n t l e v e l s i n h u m a n g l o m e r -u l o n e p h r i t i s . A n n . I n t e r n . M e d . 7 5 : 5 5 5 .2 5 . M i c h a e l , A . F . , N . G . W e s t b e r g , A . J . F i s h , a n d R . L .V e r n i e r . 1 9 7 1 . S t u d i e s o n c h r o n i c m e m b r a n o p r o l i f e r a t i v eg l o m e r u l o n e p h r i t i s w i t h h y p o c o m p l e m e n t e m i a . J . E x p .M e d . 1 3 4 : 2 0 8 S .2 6 . G 6 t z e , O . , a n d H . J . M i l l e r - E b e r h a r d . 1 9 7 2 . P a r o x y s -m a l n o c t u r n a l h e m o g l o b u l i n u r i a . H e m o l y s i s i n i t i a t e d b yt h e C 3 a c t i v a t o r s y s t e m . N . E n g l . J . M e d . 2 8 6 : 1 8 0 .

2 7 . A l p e r , C . A . , N . A b r a m s o n , R . B . J o h n s o n , J r . , J . H .J a n d l , a n d F . S . R o s e n . 1 9 7 0 . I n c r e a s e d s u s c e p t i b i l i t yt o i n f e c t i o n a s s o c i a t e d w i t h a b n o r m a l i t i e s o f c o m p l e -m e n t - m e d i a t e d f u n c t i o n s a n d o f t h e t h i r d c o m p o n e n t o fc o m p l e m e n t ( C 3 ) . N . E n g l . J . M e d . 2 8 2 : 3 4 9 .2 8 . V a l l o t a , E . H . , J . F o r r e s t a l , R . E . S p i t z e r , N . C . D a v i s ,a n d C . D . W e s t . 1 9 7 0 . C h a r a c t e r i s t i c s o f a n o n - c o m -p l e m e n t - d e p e n d e n t C 3 - r e a c t i v e c o m p l e x f o r m e d f r o mf a c t o r s i n n e p h r i t i c a n d n o r ma l s e r u m . J . E x p . M e d .1 3 1 : 1 3 0 6 .2 9 . R u l e y , E . J . , J . F o r r e s t a l , C . W a t s o n , N . C . D a v i d , a n dC . D . W e s t . 1 9 7 2 . R e l a t i o n o f n e p h r i t i c f a c t o r t oa l t e r n a t e p a t h w a y i n C 3 b r e a k d o w n . F e d . P r o c . 3 1 :7 8 8 .3 0 . S t e e l e , R . G . D . , a n d J . H . T o r r i e . 1 9 6 0 . P r i n c i p l e s a n dP r o c e d u r e s o f S t a t i s t i c s , M c G r a w - H i l l B o o k C o . , Ne wY o r k . 1 1 1 .

6 4 4 R . H . McLean a n d A . F . M i c h a e l

jcinvest00179-0106 alternate pathway components in human glomerulonephritis

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