ks determination

8/9/2019 Ks Determination

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2 4 6 A . O . HAVWTREY AND M . H . SILK 1 9 6 1a p l e a s u r e t o a c k n o w l e d g e t h e a s s i s t a n c e o f Mr D . C o o k ea n d Mr H . F . M o n t a u b a n v a n S w i j n d r e g t i n c e r t a i n o f t h ee x p e r i m e n t s , a n d o n e o f u s ( A . O . H . ) w i s h e s t o t h a n kP r o f e s s o r F . G . H o l l i m a n o f t h e D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y ,U n i v e r s i t y o f C a p e T o w n , f o r v a l u a b l e d i s c u s s i o n s a n de n c o u r a g e m e n t d u r i n g t h e c o n d u c t o f t h e w o r k .

REFERENCESB i r n s , M . , E s s n e r , E . & N o v i k o f f , A . ( 1 9 5 9 ) . P r o c . A m e r .A 8 8 . C a n c e r R e 8 . 3 , 7 .B r o d i e , A . F . ( 1 9 5 5 ) . I n M e t h o d 8 i n E n z y m o l o g y , v o l . 2 ,p . 6 9 3 . E d . b y C o l o w i c k , S . P . & K a p l a n , N . 0 . NewY o r k : A c a d e m i c P r e s s I n c .C h a n c e , B . ( 1 9 5 6 ) . I n E n z y m e 8 : U n i t s o f B i o l o g i c a l S t r u c t u r ea n d F u n c t i o n , p . 4 4 7 . E d . b y G a e b l e r , 0 . H . New Y o r k :A c a d e m i c P r e s s I n c .C l e l a n d , K . W. & S l a t e r , E . C . ( 1 9 5 3 ) . B i o c h e m . J . 5 3 , 5 4 7 .C r a n e , R . K . & S o l s , A . ( 1 9 5 5 ) . I n M e t h o d s i n E n z y m o l o g y ,v o l . 1 , p . 2 7 7 . E d . b y C o l o w i c k , S . P . & K a p l a n , N . 0 .New Y o r k : A c a d e m i c P r e s s I n c .D a w k i n s , M . J . R . , J u d a h , J . D . & R e e s , K . R . ( 1 9 5 9 ) .

B i o c h e m . J . 7 2 , 2 0 4 .De M o s s , R . D . ( 1 9 5 5 ) . I n M e t h o d 8 i n E n z y m o l o g y , v o l . 1 ,p . 3 3 0 . E d . b y C o l o w i c k , S . P . & K a p l a n , N . 0 . NewY o r k : A c a d e m i c P r e s s I n c .D o u n c e , A . L . , W i t t e r , R . F . , M o n t y , K . J . , P a t e , S . &C o t t o n e , M . A . ( 1 9 5 5 ) . J . b i o p h y 8 . b i o c h e m . C y t o l . 1 , 1 3 9 .E r n s t e r , L . ( 1 9 5 8 ) . A c t a c h e m . 8 c a n d . 1 2 , 6 0 0 .E r n s t e r , L . ( 1 9 5 9 ) . S y m p . b i o c h e m . S o c . 1 6 , 5 4 .E r n s t e r , L . , J a i l i n g , O . , L 6 w , H . & L i n d b e r g , 0 . ( 1 9 5 5 ) .E x p . C e l l B e 8 . 3 , 1 2 4 .F i s k e , C . H . & S u b b a r o w , Y . ( 1 9 2 5 ) . J . b i o l . C h e m . 6 6 , 3 7 5 .G l o c k , G . E . & M c L e a n , P . ( 1 9 5 7 ) . B i o c h e m . J . 6 5 , 4 1 3 .G r a n t , J . K . & M o n g k o l k u l , K . ( 1 9 5 8 ) . B i o c h e m . J . 6 9 , 3 6 P .H a w t r e y , A . 0 . & S i l k , M . H . ( 1 9 6 0 a ) . B i o c h e m . J . 7 4 , 2 1 .H a w t r e y , A . 0 . & S i l k , M . H . ( 1 9 6 0 b ) . B i o c h i m . b i o p h y 8 .A c t a , 3 7 , 1 8 5 .K a p l a n , N . O . , C o l o w i c k , S . P . & N e u f e l d , E . F . ( 1 9 5 3 ) . J .b i o l . C h e m . 2 0 5 , 1 .

K a p l a n , N . O . , S w a r t z , M . N . , F r e c h , M . E . & C i o t t i , M ; M.( 1 9 5 6 ) . P r o c . n a t . A c a d . S c i . , W a 8 h . , 4 2 , 4 8 1 .K i t , S . & G r i f f i n , A . C . ( 1 9 5 8 ) . C a n c e r R e 8 . 1 8 , 6 2 1 .L a n g , C . A . & N a s o n , A . ( 1 9 5 9 ) . J . b i o l . C h e m . 2 3 4 , 1 8 7 4 .N a v a z i o , F . , E r n s t e r , B . B . & E r n s t e r , L . ( 1 9 5 7 ) . B i o c h i m .b i o p h y 8 . A c t a , 2 6 , 4 1 6 .P l a u t , G . W. E . & S u n g , S . C . ( 1 9 5 4 ) . J . b i o l . C h e m . 2 0 7 ,3 0 5 .P u r v i s , J . L . ( 1 9 5 8 a ) . B i o c h i m . b i o p h y 8 . A c t a , 8 0 , 4 4 0 .P u r v i s , J . L . ( 1 9 5 8 b ) . N a t u r e , L o n d . , 1 8 2 , 7 1 1 .R a c k e r , E . ( 1 9 5 5 ) . I n M e t h o d s i n E n z y m o l o g y , v o l . 1 ,p . 5 0 0 . E d . b y C o l o w i c k , S . P . & K a p l a n , N . 0 . NewY o r k : A c a d e m i c P r e s s I n c .R e i n a f a r j e , B . & P o t t e r , V . R . ( 1 9 5 7 ) . P r o c . A m e r . Am .C a n c e r R e 8 . 2 , 2 4 1 .S i l k , M . H . , H a w t r e y , A . 0 . & M a c i n t o s h , I . J . C . ( 1 9 5 8 ) .C a n c e r R e 8 . 1 8 , 1 2 5 7 .S o m o g y i , M . ( 1 9 5 2 ) . J . b i o l . C h e m . 1 9 5 , 1 9 .S t e i n , A . M . , K a p l a n , N . 0 . & C i o t t i , M . M . ( 1 9 5 9 ) . J . b i o l .C h e m . 2 3 4 , 9 7 9 .T a l a l a y , P . & H u r l o c k , B . ( 1 9 5 8 ) . J . b i o l . C h e m . 2 3 8 ,8 8 6 .U m b r e i t , W. W . , B u r r i s , R . H . & S t a u f f e r , J . F . ( 1 9 5 7 ) .M a n o m e r i c T e c h n i q u e s a n d T i s s u e M e t a b o l i 8 m , p . 3 0 1 .M i n n e a p o l i s : B u r g e s s P u b l i s h i n g C o .V i g n a i s , P . V . & V i g n a i s , P . M . ( 1 9 5 7 ) . J . b i o l . C h e m . 2 2 9 ,2 6 5 .V i g n a i s , P . V . , V i g n a i s , P . M . & B a r t l e y , W. ( 1 9 5 7 ) .B i o c h e m . J . 6 5 , 3 9 6 .W e n n e r , C . E . ( 1 9 5 9 ) . J . b i o l . C h e m . 2 3 4 , 2 4 7 2 .W e n n e r , C . E . & H a c k n e y , J . ( 1 9 5 9 ) . P r o c . A m e r . As .C a n c e r R e . . 3 , 7 2 .W e n n e r , C . E . , H a c k n e y , J . & H e r b e r t , J . ( 1 9 5 7 ) . P r o c .A m e r . A 8 8 . C a n c e r R e . . 2 , 2 5 9 .W e n n e r , C . E . , H a c k n e y , J . & M o l i t e r n o , F . ( 1 9 5 8 ) .P r o c . A m e r . A . . . C a n c e r R e 8 . 2 , 3 5 6 .W e n n e r , C . E . & W e i n h o u s e , S . ( 1 9 5 3 ) . C a n c e r R e . . 1 3 , 2 1 .W i l l i a m s - A s h m a n , H . G . ( 1 9 5 3 ) . C a n c e r R e . . 1 3 , 7 2 1 .W o j t c z a k , L . & W o j t c z a k , A . B . ( 1 9 5 9 ) . B i o c h i m . b i o p h y 8 .A c t a , 3 1 , 2 9 7 .

B i o c h e m . J . ( 1 9 6 1 ) . 7 9 , 2 4 6A D e t e r m i n a t i o n o f K s , t h e S u b s t r a t e C o n s t a n t ,f o r Serum C h o l i n e s t e r a s e

BY A . R . MAINO c c u p a t i o n a l H e a l t h D i v i 8 i o n , D e p a r t m e n t o f N a t o n a l H e a l t h a n d W e l f a r e ,4 5 S p e n c e r S t r e e t , O t t a w a , O n t a r i o , C a n a d a( R e c e i v e d 1 3 J u n e 1 9 6 0 )

K t , , t h e s u b s t r a t e c o n s t a n t ( D i x o n & W e b b ,1 9 5 8 ) , h a s n o t p r e v i o u s l y b e e n d e t e r m i n e d f o re s t e r a s e s . S l a t e r ( 1 9 5 5 ) h a s s u g g e s t e d t h a t i f t h ec o n s t a n t k s , g o v e r n i n g t h e r a t e o f b r e a k d o w n o f t h ee n z y m e - s u b s t r a t e c o m p l e x , c a n b e v a r i e d i n d e -p e n d e n t l y o f K , t h e n t h e p l o t o f Km a g a i n s t V , t h emaximum r e a c t i o n v e l o c i t y , w i l l g i v e K , on e x t r a -p o l a t i o n t o t h e Km a x i s . I n t h i s p a p e r t h e a l c o h o l -

a c t i v a t i o n an d r e v e r s i b l e i n h i b i t i o n o f t h e h y d r o -l y s i s o f c e r t a i n n i t r o p h e n y l c a r b o x y l i c e s t e r s byhuman serum c h o l i n e s t e r a s e h a v e b e e n e m p l o y e dt o e v a l u a t e K , by t h e u s e o f t h e s u g g e s t i o n s , b u tn o t t h e p r o c e d u r e , o f S l a t e r ( 1 9 5 5 ) .Knowledge o f K, i s p a r t i c u l a r l y i m p o r t a n t whene v a l u a t i n g t h e s u b s t r a t e - s p e c i f i c i t y p a t t e r n o fe s t e r a s e s s i n c e i t i s K, an d n o t K . , t h a t i s a


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DETERMINATION OF K , FOR SERUM CHOLINESTERASEmeasure o f t h e a f f i n i t y o f t h e enzyme f o r t h e s u b -s t r a t e . Knowledge o f K , i s a l s o d e s i r a b l e whend e t e r m i n i n g a c t i v a t i o n e n e r g i e s , s i n c e K , i s at r u e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t w h e r e a s Km i n c l u d e s ar a t e c o n s t a n t k 3 a s w e l l a s t h e e q u i l i b r i u m c o n -s t a n t K , .

EXPERIMENTALA c t i v i t i e s w e r e m e a s u r e d i n m o s t i n s t a n c e s w i t h aBeckman DK-2 r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r e q u i p p e dw i t h a t i m e d r i v e a n d a t e m p e r a t u r e - r e g u l a t e d c e l l - h o l d e r .U s u a l l y , human s e r u m w a s u s e d a s a s o u r c e o f c h o l i n -e s t e r a s e . A s o b s e r v e d b y A l d r i d g e ( 1 9 5 3 ) , human s e r u md o e s n o t c o n t a i n m e a s u r a b l e B - o r a l i - e s t e r a s e a c t i v i t y .T h e o n l y e s t e r a s e s h y d r o l y s i n g o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e , p -n i t r o p h e n y l b u t y r a t e a n d s i m i l a r e s t e r s w e r e t h e r e f o r ec h o l i n e s t e r a s e a n d A - e s t e r a s e s .T h e DK-2 c a n b e made t o r e c o r d t h e d i f f e r e n c e i ne x t i n c t i o n b e t w e e n t h e c o n t e n t s o f a r e f e r e n c e c e l l a n d a nunknown c e l l a s a f u n c t i o n o f t i m e . T h e r e f e r e n c e s o l u t i o nc o n t a i n e d 0 . 1 m M - d i i s o p r o p y l p h o s p h o r o f l u o r i d a t e ( D F P )

b u t o t h e r w i s e w a s i d e n t i c a l w i t h t h e u n k n o w n s o l u t i o n .T h e D FP c o m p l e t e l y a n d q u i c k l y i n h i b i t e d t h e c h o l i n -e s t e r a s e , b u t l e f t t h e A - e s t e r a s e s u n a f f e e t e d . T h e r a t e o fc h a n g e o f e x t i n c t i o n b e t w e e n t h e r e f e r e n c e a n d unknownc e l l s w a s t h e r e f o r e a m e a s u r e o f t h e c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y .T h e A - e s t e r a s e a c t i v i t y t o w a r d s o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e w a sn e g l i g i b l e ( M a i n , M i l e s & B r a i d , 1 9 6 1 ) , b u t w a s o f t h e s a m eo r d e r a s t h e c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y t o w a r d s p - n i t r o p h e n y lb u t y r a t e , p - n i t r o p h e n y l a c e t a t e a n d o - n i t r o p h e n y l a c e t a t e .o - N i t r o p h e n y l b u t y r a t e w a s p r e p a r e d a n d p u r i f i e d a c c o r d -i n g t o t h e m e t h o d o f M a i n e t a l . ( 1 9 6 1 ) . o - N i t r o p h e n y la c e t a t e w a s p u r c h a s e d f r o m t h e E a s t m a n Kodak C o .( R o c h e s t e r , N . Y . , U . S . A . ) . p - N i t r o p h e n y l a c e t a t e a n d p .n i t r o p h e n y l b u t y r a t e w e r e p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h em e t h o d o f A l d r i d g e ( 1 9 5 3 ) . T h e p - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e w a sp u r i f i e d i n a m a n n e r s i m i l a r t o t h a t u s e d f o r o - n i t r o p h e n y lb u t y r a t e .S t o c k s o l u t i o n s ( 0 . 5 M ) o f t h e s e e s t e r s w e r e p r e p a r e d b yw e i g h i n g o u t t h e a p p r o p r i a t e a m o u n t a n d d i s s o l v i n g i ns l i g h t l y a c i d m e t h a n o l ( e . g . 1 - 0 4 6 g . o f o - n i t r o p h e n y lb u t y r a t e t o 1 0 m l . w i t h m e t h a n o l ) .S u b s t r a t e s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d b y p i p e t t i n g a p p r o -p r i a t e v o l u m e s o f s t o c k s o l u t i o n i n t o 5 0 m m - s o d i u m p h o s -p h a t e b u f f e r s , pH 7 - 6 . The s o l u b i l i t y o f o - n i t r o p h e n y lb u t y r a t e a t 2 5 0 u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s w a s a b o u t 1 - 5 mm.A m M - o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e s o l u t i o n w a s p r e p a r e d b yp i p e t t i n g 0 - 2 0 m l . o f s t o c k i n t o 1 0 0 m l . o f b u f f e r . L o w e rc o n c e n t r a t i o n s w e r e p r e p a r e d b y d i l u t i n g t h e m M - o - n i t r o -p h e n y l b u t y r a t e s o l u t i o n .T h e a l c o h o l s w e r e r e a g e n t - g r a d e c o m m e r c i a l p r o d u c t s .A p p r o p r i a t e v o l u m e s w e r e d i l u t e d w i t h p h o s p h a t e b u f f e r t oo bt a i n t h e f i n a l a l c o h o l c o n c e n t r a t i o n ( v / v ) d e s i r e d .Human s e r u m w a s o b t a i n e d f r o m t h e b l o o d o f v o l u n t e e r s .No a n t i c o a g u l a n t s w e r e u s e d . To o b t a i n c o m p a r a b l e r e s u l t si t w a s i m p o r t a n t t o u s e f r e s h s e r u m w h i c h h a d n o t b e e nf r o z e n n o r s t o r e d f o r p e r i o d s l o n g e r t h a n a w e e k . T h e K mw i t h o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e d e c r e a s e d g r a d u a l l y f r o m a b o u t0 - 1 4 mm f o r f r e s h s e r u m t o v a l u e s a s l o w a s 0 - 0 6 mm. T h i ss t o r a g e e f f e c t h a d n o r e l e v a n c e t o t h e e f f e c t o f a l c o h o l s ,w h i c h w i l l b e d i s c u s s e d . H o w e v e r , t h e r e s u l t s o b t a i n e df r o m s t u d i e s w i t h a l c o h o l s a n d s e r u m o f d i f f e r i n g a g e ss u g g e s t e d t h a t t h e s h i f t i n Km w a s a s s o c i a t e d w i t h K , . T h e

p o s s i b i l i t y i s s u g g e s t e d t h a t a n a t u r a l l y o c c u r r i n g i n h i b i t o ri s a s s o c i a t e d w i t h c h o l i n e s t e r a s e i n f r e s h s e r u m a n d t h a tt h i s i n h i b i t o r g r a d u a l l y f a l l s away d u r i n g s t o r a g e .T h e s e r u m w a s d i l u t e d w i t h b u f f e r c o n t a i n i n g t h e a p -p r o p r i a t e a l c o h o l , 0 . 1 % i n a c a c i a , s o t h a t t h e c o n c e n t r a t i o no f t h e a l c o h o l i n t h e e n z y m e s o l u t i o n w a s i d e n t i c a l w i t ht h a t o f t h e s u b s t r a t e s o l u t i o n . T y p i c a l l y 1 0 m l . o f s e r u mw a s d i l u t e d t o 1 0 0 m l . w i t h a p p r o p r i a t e b u f f e r a n d 1 m l . o ft h i s d i l u t i o n c o n t a i n i n g 0 * 0 1 m l . o f s e r u m w a s u s e d f o r ana c t i v i t y d e t e r m i n a t i o n . T h e d i l u t i o n w a s s t o r e d c o n t i n u o u s l yi n c r u s h e d i c e .T h e r e f e r e n c e e n z y m e d i l u t i o n w a s p r e p a r e d b y t a k i n g2 5 m l . o f t h e i n i t i a l d i l u t i o n a n d a d d i n g 0 1 0 m l . o f a2 5 mM-DFP s o l u t i o n made w i t h p r o p a n - 2 - o l .A t y p i c a l d e t e r m i n a t i o n w a s p e r f o r m e d a s f o l l o w s :1 0 m l . o f a s u i t a b l e s e r u m d i l u t i o n w a s p i p e t t e d i n t o ac l e a n , d r y 2 5 m l . c o n i c a l f l a s k ( A ) . S i m i l a r l y , 1 0 m l . o f t h ec o r r e s p o n d i n g r e f e r e n c e d i l u t i o n ( 0 . 1 mm i n DFP) wasp i p e t t e d i n t o f l a s k ( B ) . B u f f e r e d s u b s t r a t e ( 5 . 0 m l . ) wasp i p e t t e d s i m u l t a n e o u s l y i n t o e a c h o f t h e t w o f l a s k s . A f t e rm i x i n g , a n d a s q u i c k l y a s p o s s i b l e , a s u i t a b l e a m o u n t o f Aw a s p o u r e d i n t o - t h e ' u n k n o w n ' c e l l a n d a s u i t a b l e a m o u n to f B i n t o t h e ' r e f e r e n c e ' c e l l . The r a t e o f c h a n g e o f e x t i n c -t i o n w a s p l o t t e d f o r a t l e a s t 1 0 m i n . A s t r a i g h t l i n e , w h o s es l o p e w a s a m e a s u r e o f t h e a c t i v i t y , c o u l d t i s u a l l y b e o b -t a i n e d o v e r t h e m a j o r p a r t o f t h i s i n t e r v a l f o r e a c h s u b -s t r a t e c o n c e n t r a t i o n w i t h s u i t a b l e v a r i a t i o n s o f e n z y m ec o n c e n t r a t i o n . J u s t b e f o r e e v e r y d e t e r m i n a t i o n , t h e r a t i o -r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r w a s c a l i b r a t e d w i t h r e s p e c t t o0 a n d 1 0 0 % t r a n s m i t t a n c e w i t h a f r e s h l y p r e p a r e d r e a c t i o nm i x t u r e c o r r e s p o n d i n g t o t h e f i n a l c o n t e n t s o f f l a s k B .T h e e x t i n c t i o n o f o - n i t r o p h e n o l w a s m e a s u r e d a t 4 1 4 m i z( M a i n e t a l . 1 9 6 1 ) a n d t h a t o f p - n i t r o p h e n o l a t 4 0 0 m , u .T h e t e m p e r a t u r e w a s c o n t r o l l e d b y c i r c u l a t i n g t h e w a t e rf r o m a t e m p e r a t u r e - c o n t r o l l e d b a t h t h r o u g h t h e c e l l -h o l d e r . T h e c o n s t a n t - t e m p e r a t u r e b a t h w a s k e p t a t 2 4 . 5 0t o m a i n t a i n t h e t h e r m o m e t e r i n t h e r e g u l a t o r a t 2 5 - 1 l .T h e a c t i v i t y w a s c a l c u l a t e d i n t e r m s o f , u m o l e s o f n i t r o -p h e n o l l i b e r a t e d / m l . o f s e r u m / m i n .O c c a s i o n a l l y a c t i v i t i e s w e r e d e t e r m i n e d w i t h t h e H i l g e rU v i s p e k s p e c t r o p h o t o m e t e r a s f o l l o w s . B u f f e r e d s u b s t r a t e( 5 . 0 m l . ) w a s p i p e t t e d i n t o two o r more v o l u m e t r i c f l a s k s Aa n d B . To B w a s a d d e d 0 . 0 5 m l . o f 2 5 mM-DFP. The f l a s k sw e r e p l a c e d i n a b a t h a t 2 5 0 a n d 0 2 - 1 0 m l . o f e n z y m ed i l u t i o n c o n t a i n i n g a s u i t a b l e amount o f s e r u m ( 0 . 0 0 4 -0 . 0 5 m l . , d e p e n d i n g o n t h e s u bs t r a t e a n d a l c o h o l c o n c e n t r a -t i o n ) w a s p i p e t t e d i n t o b o t h f l a s k s A a n d B a n d t h e t i m ewas n o t e d . A f t e r a s u i t a b l e d i g e s t i o n t i m e ( 1 0 - 3 0 m i n . ,a g a i n d e p e n d i n g o n c o n d i t i o n s ) 0 0 5 m l . o f D FP was a d d e dt o f l a s k A . F l a s k s A a n d B w e r e t h e n i m m e d i a t e l y made u pt o t h e 1 0 m l . mark w i t h 40% ( v / v ) e t h a n o l s o l u t i o n . Thee t h a n o l t e r m i n a t e d t h e A - e s t e r a s e a c t i v i t y . The c o l o u r w a ss t a b l e f o r a t l e a s t 1 h r . a n d c o u l d b e r e a d a t a n y c o n v e n i e n tt i m e o n t h e H i l g e r U v i s p e k i n s t r u m e n t .

RESULTSThe a c t i v i t i e s a t f i v e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f

o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e were determined i n 0 , 0 5 ,1 , 2 . 5 an d 3 * 5 % b u t a n o l . The r e s u l t s were p l o t t e da c c o r d i n g t o t h e Dixon ( 1 9 5 3 ) m o d i f i c a t i o n o f t h eL i n e w e a v e r & Burk ( 1 9 3 4 ) p l o t . As shown i nF i g . 1 , t h e e x t r a p o l a t i o n s o f t h e e x p e r i m e n t a l

V o l . 7 9 2 4 7


3/7

A . R . MAINp o i n t s w e r e c a r r i e d b e l o w t h e 1 / 8 a x i s i n t o t h el o w e r l e f t - h a n d q u a d r a n t , w h e r e t h e s y s t e m o fl i n e s o b t a i n e d a p p r o x i m a t e d a c o m m o n p o i n t o fi n t e r s e c t i o n ( P ) . I n t e r p r e t a t i o n o f t h e p o i n t P l e dt o a n ew method f o r e v a l u a t i n g K 8 .Each l i n e c o r r e s p o n d e d t o t h e a c t i v i t i e s a t as i n g l e b u t a n o l c o n c e n t r a t i o n . The i n t e r c e p t on t h ev e r t i c a l a x i s g a v e t h e r e c i p r o c a l o f V , t h e m a x i -mum v e l o c i t y . The i n t e r c e p t on t h e h o r i z o n t a l a x i sg a v e t h e n e g a t i v e r e c i p r o c a l o f K m . w h e r e Km h a st h e B r i g g s & H a l d a n e ( 1 9 2 5 ) m e a n i n g :

Km = ( k 2 + k 3 ) / k 1 = K 8 + 1 k 3 / 1 k l * ( 1 )The i n d i v i d u a l r a t e c o n s t a n t s a r e t h o s e u s e d t o

d e s c r i b e t h e r e a c t i o nk 1 k 3

E + S =ES - E + p r o d u c t s ,k 2w h e r e E i s t h e e n z y m e , S i s t h e s u b s t r a t e an d ES i st h e e n z y m e - s u b s t r a t e c o m p l e x .The p o i n t P r e p r e s e n t s t h e a v e r a g e - 1 / 8 v a l u e so f t h e p o i n t s o f i n t e r s e c t i o n . I f a l i n e i s drawnf r o m P p e r p e n d i c u l a r t o t h e 1 / 8 a x i s , t h e i n t e r c e p ti s e q u a l t o - 1 / K 8 .T h i s c o n c l u s i o n was r e a c h e d by c o n s i d e r i n g t h el i m i t i n g v a l u e o f - 1 / K m when 1 / V i s e q u a l t oi n f i n i t y .I f P i s j o i n e d t o t h e l / v a x i s a t i n f i n i t y , t h e l i n ew i l l b e p a r a l l e l t o t h e l / v a x i s s i n c e p a r a l l e l l i n e smeet a t i n f i n i t y .

On t h e I / v a x i s , 1 / 8 = 0 , an d by s u b s t i t u t i n g i n t o1 Km 1 + 1 ( 2 )v V 8V(2

t h e n l / v = 1 / V a n d , a t i n f i n i t y , V = 0 . S i m i l a r l y ,on t h e 1 / 8 a x i s , 1 / 8 = - 1 / K m . The i n t e r c e p t on t h e1 / 8 a x i s o f t h e l i n e j o i n i n g P t o i n f i n i t y on t h e l / va x i s i s t h e r e f o r e - 1 / K m . But V = 0 f o r t h i s l i n e ,a n d s i n c e e , t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n , i s c o n s t a n t ,i t f o l l o w s f r o m t h e r e l a t i o n s h i p

V = k s . e ( 3 )t h a t k 3 = 0 . S u b s t i t u t i n g i n t o ( 1 ) , K m = K 8 an d- 1 / K m =- 1 / K . S i m i l a r l y i t c a n b e s h o w n t h a tt h e i n t e r c e p t o n t h e l / v a x i s o f t h e l i n e j o i n i n g Pt o 1 / 8 a t i n f i n i t y i s - 1 / k 2 . e . The s l o p e o f t h e l i n ej o i n i n g P t o t h e o r i g i n i s t h e n l / k , . e .The f i v e l i n e s o f F i g . 1 i n t e r s e c t a t t e n d i f f e r e n tp o i n t s . The d e v i a t i o n f r o m a c o m m o n p o i n t o fi n t e r s e c t i o n a p p e a r s t o b e r a n d o m , s u g g e s t i n g t h el i m i t s o f e x p e r i m e n t a l p r e c i s i o n , r a t h e r t h a n ap r o g r e s s i v e s h i f t i n KJ w i t h i n c r e a s i n g b u t a n o lc o n c e n t r a t i o n . Summing t h e v a l u e s a t e a c h i n t e r -s e c t i o n an d d i v i d i n g by 1 0 g a v e K , 0 - 0 7 2 + 0 - 0 2 6 mm.But t h i s method d i d n o t a p p e a r t o b e e n t i r e l ys a t i s f a c t o r y s i n c e e q u a l w e i g h t was g i v e n t o t h ev a l u e a t e a c h i n t e r s e c t i o n r e g a r d l e s s o f t h e a n g l e o fi n t e r s e c t i o n . The p r e c i s i o n a p p e a r s t o d e p e n d ont h e a n g l e o f i n t e r s e c t i o n , w i t h t h e w i d e r a n g l eg i v i n g t h e h i g h e r p r e c i s i o n . T h i s was shown whenK 8 v a l u e s w e r e g r o u p e d i n d e s c e n d i n g o r d e r o fi n t e r s e c t i n g a n g l e s a s i n T a b l e 1 .

E0C

- cQ-0. _ j1 / V ' ra1 v ' 00E

-1 I K s -8 -6-14 : - 1 2 -10

I vf-- -- --ep ~ ~ [ t 2 4 6 8 1 0 1 21 / s ( 1 / m M - o - N i t r o p h e n y l b u t y r a t e )- 1 / k 2 e

F i g . 1 . k 3 - A c t i v a t i o n p l o t . The L i n e w e a v e r & Burk ( 1 9 3 4 ) p l o t o f r e c i p r o c a l a c t i v i t i e s a g a i n s t c o r r e s p o n d i n gr e c i p r o c a l o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n s . Each l i n e i s t h e p l o t a t t h e g i v e n b u t a n o l c o n c e n t r a t i o n .I n t e r c e p t s o n t h e 1 / s - a c t i v i t y a x i s g i v e 1 / V a n d o n t h e 1 / m m - o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e a x i s , - 1 / K m . The v a l u e so f t h e s e i n t e r c e p t s o b t a i n e d f r o m a p l o t o n 1 6 i n . x 1 0 i n . g r a p h p a p e r a r e g i v e n i n T a b l e 2 .

1 9 6 14 8


4/7

DETERMINATION OF K . FOR SERUM CHOLINESTERASEI t i s e v i d e n t t h a t more c o n f i d e n c e m ay b e

i n t h e K8 v a l u e s o b t a i n e d a t t h e w i d e rn g l e s o f i n t e r s e c t i o n . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s tt h e p r e c i s i o n o f t h e method may be somewhatt h a n t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n 0 0 2 6 mMK 8 m ay a l s o b e e v a l u a t e d by p l o t t i n g V a g a i n s tm by t h e method o f S l a t e r ( 1 9 5 5 ) . Each b u t a n o lo n c e n t r a t i o n was a s s o c i a t e d w i t h c h a r a c t e r i s t i c

an d p a r t i c u l a r v a l u e s o f Km an d V . T h e s e w e r ec a l c u l a t e d from t h e i n t e r c e p t s on t h e l / v an d 1 / 8a x i s a s s u g g e s t e d by F i g . 1 . I n p r a c t i c e Km an d Vw e r e o b t a i n e d f r o m a p l o t on 1 0 i n . x 1 6 i n . g r a p hp a p e r an d a r e g i v e n i n T a b l e 2 .

I f t h e p l o t o f V a g a i n s t Km g i v e s a s t r a i g h t l i n e ,t h e n a c c o r d i n g t o S l a t e r ' s ( 1 9 5 5 ) e q u a t i o nKm = V +K(k l e

T a b l e 1 . K 8 v a l u e s g r o u p e d i n d e s c e n d i n g o r d e ro f i n t e r s e c t i n g a n g l e sN o . o f A v e r a g e a n g l ep o i n t s o f o f i n t e r s e c t i o ni n t e r s e c t i o n ( d e g r e e s )

12341 4 . 28 - 3 + 2 * 35 - 5 2 - 03 ' 4 2 * 1

K 8 + d e v i a t i o n( m m )0 * 0 7 20 - 0 6 9 + 0 0 0 30 * 0 7 3 0 - 0 2 10 * 0 8 1 4 0 - 0 4 0T a b l e 2 . E f f e c t o f b u t a n o l o n t h e o - n i t r o p h e n y l b u t y -r a t e K m a n d V o f human s e r u m c h o l i n e s t e r a s eK m a n d V w e r e o b t a i n e d b y e x t r a p o l a t i o n a c c o r d i n g t o

t h e D i x o n ( 1 9 5 3 ) m o d i f i c a t i o n o f t h e L i n e w e a v e r & B u r k( 1 9 3 4 ) p l o t . F o r e a c h b u t a n o l c o n c e n t r a t i o n t h e a c t i v i t i e sw e r e d e t e r m i n e d a t 1 , 0 3 3 , 0 - 2 , 0 - 1 5 a n d 0 . 1 m M - o - n i t r o -p h e n y l b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n s , w i t h 1 . 0 m l . o f d i l u t e ds e r u m c o n t a i n i n g 0 - 0 1 m l . o f t h e p o o l e d s e r u m f r o m f o u ri n d i v i d u a l s .B u t a n o l( % , v / v )00 - 51 . 02 - 53 . 5

V m a z .( , u m o l e s o fo - n i t r o p h e n o l / m l .o f s e r u m / m i n . )3 * 0 15 - 1 87 * 6 41 1 - 11 8 - 2

K m( m M )0 - 1 3 90 - 1 7 30 - 2 5 00 - 3 1 80 - 4 5 5

Km w i l l e q u a l K 8 when V i s e q u a l t o 0 . As shown i nF i g . 2 , t h e p l o t o f V v e r s u s Km d i d a p p r o x i m a t e as t r a i g h t l i n e , f r o m w h i c h K8 c o u l d b e e v a l u a t e d .E v a l u a t i o n o f K8 f r o m t h e p o i n t o f i n t e r s e c t i o n( P ) , F i g . 1 , h a s a d v a n t a g e s o v e r t h e u s e o f S l a t e r ' s( 1 9 5 5 ) Km v e r s u s V p l o t . E v a l u a t i o n f r o m t h ep o i n t o f i n t e r s e c t i o n i s more d i r e c t , making u s e o fp r i m a r y a c t i v i t y d a t a , w h e r e a s t h e S l a t e r ( 1 9 5 5 )method u s e s s e c o n d a r y d a t a . The i n t e r s e c t i o nmethod a l s o s u g g e s t s t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n sw h i c h w i l l g i v e t h e most p r e c i s e K8 e v a l u a t i o n ,w h e r e a s t h i s i s n o t r e a d i l y a p p a r e n t f r o m t h e p l o to f Km a g a i n s t V .Both V an d Km i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n gb u t a n o l c o n c e n t r a t i o n ( T a b l e 2 ) . The i n c r e a s e i n Vw i t h b u t a n o l c o n c e n t r a t i o n a p p r o x i m a t e d a p o s i -t i v e l i n e a r f u n c t i o n , a s shown i n F i g . 3 . The r e -l a t i o n s h i p c o u l d b e e x p r e s s e d by t h e e q u a t i o nV = V o + k B , w h e r e V i s t h e maximum v e l o c i t y a tb u t a n o l c o n c e n t r a t i o n B , V 0 i s t h e maximumv e l o c i t y i n w a t e r an d k i s t h e s l o p e o f t h e l i n e .A c c o r d i n g t o ( 3 ) V i s a f u n c t i o n o f k 3 , t h e r a t ec o n s t a n t g o v e r n i n g t h e b r e a k d o w n o f t h e enzyme-s u b s t r a t e c o m p l e x . S i n c e t h e enzyme c o n c e n t r a -t i o n was c o n s t a n t , t h e i n c r e a s e i n V w i t h i n c r e a s e db u t a n o l c o n c e n t r a t i o n s u g g e s t e d t h a t b u t a n o l wasi n c r e a s i n g k 3 .

0 - 50 @ 4

0 - 20 - 1

0

. d 2 0A1 50

-

0- 500 l o

o 40

5 . 4 $4 04.0

1 0 1 5 2 0V ( , u m o l e s o f o - n i t r o p h e n o l / m l . o f s e r u m / m i n . )

F i g . 2 . P l o t o f V a g a i n s t Km w i t h e x t r a p o l a t i o n t o t h e Kma x i s g i v i n g K 8 . ( F o r c o n d i t i o n s s e e T a b l e 2 . )

.

2 3B u t a n - l - o l ( % , v / v ) 4

F i g . 3 . E f f e c t o f b u t a n o l o n V , s h o w i n g t h e l i n e a r i t y o f t h er e l a t i o n s h i p . ( F o r c o n d i t i o n s s e e T a b l e 2 . )

2 9 . Ao l . 7 9

( 4 )


5/7

5 A . R . MAINT a b l e 3 . E f f e c t o f b u t a n o l o n t h e p - n i t r o p h e n y l b u t y -r a t e Km a n d V o f human s e r u m c h o l i n e s t e r a s eK m a n d V w e r e o b t a i n e d b y e x t r a p o l a t i o n a c c o r d i n g t ot h e D i x o n ( 1 9 5 3 ) m o d i f i c a t i o n o f t h e L i n e w e a v e r & B u r k( 1 9 3 4 ) p l o t . T h e a c t i v i t i e s w e r e d e t e r m i n e d w i t h t h eB e c k m a n DK-2 r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 1 , 0 - 3 3a n d 0 - 2 m M - p - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n s i n d u p l i -c a t e f o r e a c h b u t a n o l c o n c e n t r a t i o n . W i t h w a t e r , 0 - 0 2 m l .o f t h e p o o l e d s e r u m f r o m f o u r i n d i v i d u a l s w a s u s e d f o re a c h d e t e r m i n a t i o n b u t t h i s w a s i n c r e a s e d t o 0 - 0 5 m l . f o rt h e a c t i v i t i e s d e t e r m i n e d i n b u t a n o l .

B u t a n o l( % , v / v )

00 - 20 - 5. 1 - 0

V( u m o l e s o fp - n i t r o p h e n o l /m l . o f s e r u m / m i n . )1 - 0 60 - 8 30 - 6 30 - 4 0

Km( m m )0 - 8 00 - 7 20 - 6 30 - 5 0T a b l e 4 . E f f e c t o f a l c o h o l c h a i n - l e n g t h o n t h e a c t i v a -t i o n o f o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e h y d r o l y s i s b y humans e r u m c h o l i n e s t e r a s e

S u b s t r a t e s o l u t i o n s w e r e 0 - 2 0 x w i t h r e s p e c t t o e a c ha l c o h o l . A c t i v i t i e s w e r e d e t e r m i n e d a t pH 7 - 6 a n d 2 5 0 i nt h e DK-2 r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r . K m a n d V w e r ed e t e r m i n e d w i t h 1 , 0 - 3 3 a n d 0 - 2 m M - o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t ec o n c e n t r a t i o n s a n d 0 - 0 1 0 m l . o f s e r u m f r o m f o u r i n d i v i -d u a l s i n a s u i t a b l e d i l u t i o n .

W a t e rM e t h a n o l ( 0 - 7 4 m )E t h a n o lP r o p a n - l - o lB u t a n - l - o l

( , a m o l e s o fo - n i t r o p h e n o l / m l .o f s e r u m / m i n . )3 - 2 83 - 6 04 - 0 05 - 8 88 - 5 0

Km( m m )0 - 1 3 50 - 1 4 10 - 1 5 10 - 2 0 20 - 2 4 4

A c t i v a t i o n o f e n z y m e - c a t a l y s e d e s t e r h y d r o l y s i sby a l c o h o l s i s n o t common, b u t i n h i b i t i o n bya l c o h o l s h a s b e e n w i d e l y o b s e r v e d ( e . g . H u g g i n s &L a p i d e s , 1 9 4 7 ) . I t was t h e r e f o r e o f i n t e r e s t t od e t e r m i n e w h e t h e r a l c o h o l i n h i b i t i o n o f e n z y m e -c a t a l y s e d e s t e r h y d r o l y s i s w a s a l s o a k l - d e p e n d e n te f f e c t .B u t a n o l i n h i b i t e d t h e h y d r o l y s i s o f p - n i t r o -p h e n y l b u t y r a t e by c h o l i n e s t e r a s e . B o t h K m a n d Vd e c r e a s e d , a s s h o w n i n T a b l e 3 . C o m p e t i t i v e i n -h i b i t i o n t y p i c a l l y r e s u l t s i n a n i n c r e a s e d K m .With n o n - c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n K m r e m a i n s u n -c h a n g e d w h e r e a s V d e c r e a s e s w i t h d e c r e a s i n ge f f e c t i v e e n z y m e c o n c e n t r a t i o n , k s r e m a i n i n g u n -c h a n g e d . M i x e d c o m p e t i t i v e - n o n - c o m p e t i t i v e i n -h i b i t i o n r e s u l t s i n i n c r e a s e d K m a n d d e c r e a s e d V .The b u t a n o l i n h i b i t i o n o f p - n i t r o p h e n y l b u t y r a t eh y d r o l y s i s by c h o l i n e s t e r a s e w h e r e b o t h V a n d K md e c r e a s e i s t h e r e f o r e u n i q u e a n d c h a r a c t e r i s t i c o fk 1 i n h i b i t i o n . The L i n e w e a v e r - B u r k p l o t s a p p r o x i -

mated acommon p o i n t o f i n t e r s e c t i o n when e x t r a -p o l a t e d t o t h e l o w e r l e f t - h a n d q u a d r a n t , f r o mw h i c h t h e p - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e K , was 0 - 3 8 m m .B u t a n o l i n h i b i t i o n o f c h o l i n e s t e r a s e p - n i t r o p h e n y lb u t y r a t e h y d r o l y s i s a p p e a r e d t h e r e f o r e t o b e a k 1 c -d e p e n d e n t e f f e c t s i m i l a r t o o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t ea c t i v a t i o n , b u t i n r e v e r s e . A c o m p a r i s o n o f t h e K ,f o r o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e w i t h t h e K , f o r p -n i t r o p h e n y l b u t y r a t e s u g g e s t e d t h a t t h e a f f i n i t y o fs e r u m c h o l i n e s t e r a s e f o r o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t ewas f i v e t i m e s a s g r e a t as f o r p - n i t r o p h e n y lb u t y r a t e .The e f f e c t o f b u t a n o l on t h e h y d r o l y s i s o f o -n i t r o p h e n y l a c e t a t e a n d p - n i t r o p h e n y l a c e t a t e c a t a -l y s e d b y human s e r u m c h o l i n e s t e r a s e was a l s oe x a m i n e d . With o - n i t r o p h e n y l a c e t a t e an a c t i v a -t i o n s i m i l a r t o t h a t w i t h o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e waso b s e r v e d , w h e r e a s w i t h p - n i t r o p h e n y l a c e t a t e ani n h i b i t i o n c o r r e s p o n d i n g t o t h a t o f p - n i t r o p h e n y lb u t y r a t e o c c u r r e d .The e f f e c t o f b u t a n o l o n t h e h y d r o l y s i s o f p -n i t r o p h e n y l b u t y r a t e a n d p - n i t r o p h e n y l a c e t a t e b ya S t r e l i t z ( 1 9 4 4 ) S t a g e - 2 p u r i f i e d h o r s e - s e r u mc h o l i n e s t e r a s e p r e p a r a t i o n was a l s o i n v e s t i g a t e db r i e f l y . B u t a n o l a c t i v a t e d t h e o - n i t r o p h e n y lb u t y r a t e h y d r o l y s i s s t r o n g l y . H o w e v e r , t h e p -n i t r o p h e n y l a c e t a t e h y d r o l y s i s r e s u l t s were d i f f i c u l tt o i n t e r p r e t b e c a u s e t h e p - n i t r o p h e n y l a c e t a t e K mwas i n t h e o r d e r o f 6 0 mM w h e r e a s t h e a c t i v i t i e swere d e t e r m i n e d a t s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s o f1 mM a n d l e s s . The a c c u r a c y o f K m an d V d e t e r -m i n e d b y e x t r a p o l a t i o n u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s i sn e c e s s a r i l y t o o l o w t o make measurement o fd i f f e r e n c e s m e a n i n g f u l . T h i s i m p a s s e m ay b eT a b l e 5 . E f f e c t o f t h e i s o m e r i c c o n f i g u r a t i n o fb u t a n o l a n d o f a c e t o n e on t h e a c t i v a t i o n o f o - n i t r o -p h e n y l b u t y r a t e h y d r o l y i s b y human s e r u m c h o l i n -e s t e r a s e

A c t i v i t i e s w e r e d e t e r m i n e d w i t h m M - o - n i t r o p h e n y lb u t y r a t e i n 5% ( v / v ) s o l u t i o n s o f b u t a n o l a t pH 7 - 4 , 2 5 0 ;0 - 2 0 m l . o f a 1 : 2 0 s e r u m d i l u t i o n , e q u i v a l e n t t o 0 - 0 1 m l . o fserum f r o m one i n d i v i d u a l , was a d d e d t o 5 m l . o f b u f f e r e ds u b s t r a t e c o n t a i n i n g t h e b u t a n o l , a c c o r d i n g t o t h e m e t h o dd e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n w i t h t h e H i l g e rU v i s p e k .

IsomerC o n t r o l ( n o b u t a n o l )B u t a n - l - o l2 - M e t h y l p r o p a n - l - o l2 - M e t h y l p r o p a n - 2 - o lB u t a n - 2 - o lB u t y r i c a c i dA c e t o n e *

A c t i v i t y( , & m o l e s o fo - n i t r o p h e n o l / m l . P e r c e n t a g eo f s e r u m / m i n . ) o f c o n t r o l2 - 8 2 1 0 08 - 4 5 2 9 84 - 8 1 1 7 14 - 6 4 1 6 43 - 1 5 1 1 22 - 9 0 1 0 34 - 2 6 1 5 1* 3% ( v / v ) A c e t o n e b y DK-2 r a t i o - r e c o r d i n g s p e c t r o -p h o t o m e t e r .

2 5 0 1 9 6 1


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DETERMINATION OF K . FOR SERUM CHOLINESTERASEv e r c o m e by u s i n g h i g h e r a l c o h o l c o n c e n t r a t i o n s ,w i l l p e r m i t t h e u s e o f h i g h e r s u b s t r a t eo n c e n t r a t i o n s .I n v e s t i g a t i o n o f t h e e f f e c t o f o t h e r a l c o h o l s onh e h y d r o l y s i s o f o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e showedt h a t e a c h a l c o h o l a c t i v a t e d . At e q u i v a l e n t c o n -c e n t r a t i o n s , t h e a c t i v a t i o n i n c r e a s e d w i t h i n -c r e a s i n g c h a i n l e n g t h ( T a b l e 4 ) . A c o m m o n p o i n t o fi n t e r s e c t i o n was a p p r o x i m a t e d when t h e a c t i v i t i e sw e r e p l o t t e d by t h e method u s e d i n F i g . 1 . The K ,v a l u e c a l c u l a t e d was 0 0 7 7 + 0 - 0 1 0 mm an d wash u s w i t h i n t h e e x p e r i m e n t a l l i m i t s o f t h e K , v a l u eo b t a i n e d by v a r y i n g t h e b u t a n o l c o n c e n t r a t i o n( 0 . 0 7 2 0 - 0 2 6 m M ) .P e n t a n - l - o l was a l s o t e s t e d an d a c t i v a t e d moret h a n b u t a n o l a t e q u i v a l e n t c o n c e n t r a t i o n s . T h e s eo b s e r v a t i o n s s u g g e s t e d t h a t t h e a c t i v a t i n g e f f e c t o fa l c o h o l s i s t h r o u g h k 3 i .The e f f e c t o f i s o m e r i c c o n f i g u r a t i o n a n d o fa c e t o n e i s g i v e n i n T a b l e 5 . B u t a n - l - o l a c t i v a t e dore t h a n i t s i s o m e r s , b u t a l l i s o m e r s an d a c e t o n ed i d a c t i v a t e . B u t y r a t e i o n d i d n o t a c t i v a t e .

DISCUSSIONThe r e s u l t s d e s c r i b e d h a v e b e e n i n t e r p r e t e d t os u g g e s t t h a t K . was c o n s t a n t w h e r e a s k 3 v a r i e d .a r i a t i o n i n k 3 h a s b e e n i n f e r r e d f r o m t h e e x p e r i -m e n t a l l y o b s e r v e d s i m u l t a n e o u s i n c r e a s e o r d e -r e a s e i n K m an d V . The a p p r o x i m a t i o n t o ac o m m o n p o i n t o f i n t e r s e c t i o n o f t h e L i n e w e a v e r -Burk p l o t s s u g g e s t e d t h a t K , was c o n s t a n t .The c a s e o f s i m u l t a n e o u s c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o nn d k 3 a c t i v a t i o n o r i n h i b i t i o n h a s b e e n i n v e s t i g a t e dy M. D i x o n & E . C . Webb ( p e r s o n a l c o m m u n i c a -i o n ) . A n a l y s i s o f t h e i r h y p o t h e s i s by t h e a u t h o ru g g e s t e d t h a t K m w o u l d n o t b e a l i n e a r f u n c t i o n o f

V s h o u l d s i m u l t a n e o u s v a r i a t i o n o f K , an d k ,o c c u r . The p l o t o f K m a g a i n s t V i n F i g . 2 w o u l d b ec u r v e d l i n e c o r r e s p o n d i n g t o a p r o g r e s s i v e s h i f tn t h e l i n e s o f i n t e r s e c t i o n . The o b s e r v a t i o n t h a ti f f e r e n t a l c o h o l s y i e l d e d a s i m i l a r K , v a l u e waso n s i s t e n t w i t h t h e i n t e r p r e t a t i o n t h a t s i m u l -c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n an d k i a c t i v a t i o nd n o t o c c u r r e d . T h i s f o l l o w e d f r o m t h e l i k e l yt h a t d i f f e r e n t a l c o h o l s w o u l d h a v eh y p o t h e t i c a l K i v a l u e s .T h e r e i s a t l e a s t o n e h y p o t h e t i c a l c a s e w h e r eK , an d k , c o u l d v a r y s i m u l t a n e o u s l y an d g i v es t r a i g h t - l i n e p l o t o f K m a g a i n s t V . T h i s l i n ep a s s t h r o u g h t h e o r i g i n , i m p l y i n g t h a t k 2 i s 0 .t t h i s w o u l d n o t n e c e s s a r i l y b e t r u e s i n c e t h ewould b e o b t a i n e d by a s i m u l t a n e o u s v a r i a -o f K , ( k 2 / k l ) w i t h k 3 . The L i n e w e a v e r - B u r kf o r t h i s w o u l d r e s u l t i n a s e r i e s o f p a r a l l e ll i n e s . S i n c e no p o i n t o f i n t e r s e c t i o n w o u l d

no K, c o u l d b e d e r i v e d .The c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e a c t i v a t i o n an d i n h i b i -

t i o n d e s c r i b e d i n t h i s work a r e n o t r e a d i l y i n t e r -p r e t e d by t h e u s u a l c o n c e p t s o f s p e c i f i c i n t e r a c t i o nb e t w e e n t h e enzyme a c t i v e c e n t r e an d t h e a c t i -v a t o r o r i n h i b i t o r .The v a r i e t y o f s o l v e n t s w h i c h a c t i v a t e d , r a n g i n gf r o m m e t h a n o l t o a c e t o n e , d o e s n o t s u g g e s t ap a r t i c u l a r a f f i n i t y f o r t h e a c t i v e c e n t r e .I f i t i s p o s t u l a t e d t h a t b u t a n o l m i g h t h a v e ana f f i n i t y f o r t h e a c t i v e c e n t r e on t h e b a s i s o f i t ss i m i l a r i t y t o t h e s u b s t r a t e , i t must a l s o b e r e -membered t h a t b u t y r a t e i o n had no e f f e c t . M o r e -o v e r b u t a n o l h a s a d u a l r o l e d e p e n d i n g on t h es u b s t r a t e , a c t i v a t i n g o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e h y d r o -l y s i s an d i n h i b i t i n g p - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e h y d r o -l y s i s . F i n a l l y when i t i s remembered t h a t o t h e rq u i t e d i f f e r e n t a l c o h o l s an d a c e t o n e a l s o a c t i v a t e d ,t h e c o n c e p t o f d i r e c t i n t e r a c t i o n a p p e a r s moreu n l i k e l y .T h i s i s n o t t o s a y t h a t t h e s e s o l v e n t s d o n o te x e r t t h e i r i n f l u e n c e i n t h e r e g i o n o f t h e a c t i v e

c e n t r e . The enzyme p r o t e i n i s n o r m a l l y s u r r o u n d e dby w a t e r , w h i c h p l a y s two r o l e s d u r i n g h y d r o l y s i s .I t i s t h e s u p p o r t i n g medium an d i t i s a r e a c t a n t .I t i s s u g g e s t e d t h a t t h e p r o p e r t i e s o f t h i s e n v i r o n -ment a f f e c t k , , g o v e r n i n g t h e r a t e a t w h i c h t h ee n z y m e - s u b s t r a t e c o m p l e x b r e a k s d o w n . A d d i t i o no f s o l v e n t s d i s p l a c e s w a t e r an d t h u s m ay a l t e r t h ep r o p e r t i e s o f t h e e n v i r o n m e n t on w h i c h k , i sd e p e n d e n t .T h i s k 3 e f f e c t m ay b e t e r m e d an ' e n v i r o n m e n t a l 'e f f e c t t o d i s t i n g u i s h i t f r o m t h e s p e c i f i c - i n t e r a c t i o ne f f e c t s w h i c h a r e c h a r a c t e r i s t i c o f c o m p e t i t i v e an dn o n - c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n s an d a c t i v a t i o n .The p r o p e r t y o f t h e e n v i r o n m e n t w h i c h t h ea l c o h o l s c h a n g e and on w h i c h k 3 i s d e p e n d e n t i s n o tk n o w n . H o w e v e r , i t s e e m s p o s s i b l e t h a t t h e d i -e l e c t r i c c o n s t a n t may b e c o n c e r n e d . L a i d l e r ( 1 9 5 5 )h a s s t a t e d t h a t : ' A r e a c t i o n i n w h i c h t h e a c t i v a t e dc o m p l e x i s more p o l a r t h a n t h e r e a c t a n t s w i l l b ea c c e l e r a t e d by an i n c r e a s e i n ' t h e d i e l e c t r i c c o n s t a n t ;c o n v e r s e l y o n e i n w h i c h t h e c o m p l e x i s l e s s p o l a rw i l l b e s l o w e d d o w n ' . A d d i t i o n o f a l c o h o l s t ow a t e r d e c r e a s e s t h e d i e l e c t r i c s t r e n g t h , an d t h ed e c r e a s e i s p r o p o r t i o n a l t o t h e c h a i n l e n g t h o f t h ea l c o h o l . H o w e v e r , a t t h e a l c o h o l c o n c e n t r a t i o n su s e d , t h e c h a n g e i n d i e l e c t r i c s t r e n g t h d o e s n o ta p p e a r t o b e s u f f i c i e n t l y l a r g e t o a c c o u n t f o r a c t i -v a t i n g a n d i n h i b i t i n g e f f e c t s . The a c t i v a t i o n o fo r t h o - o r i e n t a t e d n i t r o p h e n o l e s t e r s an d t h e i n h i -b i t i o n o f p a r a - o r i e n t a t e d n i t r o p h e n o l e s t e r s m ay b er e l a t e d t o t h e r e l a t i v e p o l a r i t y o f t h e s e c o m p o u n d s .o r t h o - C o m p o u n d s may f o r m r i n g s w i t h a d j a c e n tg r o u p s , t h u s making them l e s s p o l a r t h a n p a r a -c o m p o u n d s .The e x p e r i m e n t a l method d e v i s e d b y S l a t e rd e p e n d e d on v a r y i n g t h e r a t e o f breakdown o f t h ee n z y m e s u b s t r a t e c o m p l e x i n t o p r o d u c t s byv a r y i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f a s e c o n d s u b s t r a t e

2 5 1


7/7

2 5 2 A . R . MAIN 1 9 6 1n e c e s s a r y f o r t h i s b r e a k d o w n . C o n s e q u e n t l yh y d r o l y t i c e n z y m e s c o u l d n o t b e s t u d i e d s i n c e t h er e a c t i o n s c o u l d n o t b e c a r r i e d o u t i n t h e a b s e n c e o fw a t e r . I t s e e m s most u n l i k e l y t h a t t h e e f f e c t o fa l c o h o l s i s i n an y way r e l a t e d t o t h e c o n c e p t i o n o f as e c o n d s u b s t r a t e . C o n s e q u e n t l y S l a t e r ' s ( 1 9 5 5 )e x p e r i m e n t a l t r e a t m e n t i s r e l a t e d t o t h e p r e s e n tp r o c e d u r e o n l y by t h e f a c t t h a t b o t h m e t h o d sd e p e n d on v a r y i n g k 3 i n d e p e n d e n t l y o f K 8 . S l a t e r ' s( 1 9 5 5 ) method a p p e a r s t o a p p l y o n l y when k 3 i s af i r s t - o r d e r r e a c t i o n c o n s t a n t , d e p e n d e n t o n l y ont h e c o n c e n t r a t i o n o f E S . T h i s c o n d i t i o n i s s a t i s f i e di n t h e p r e s e n t p r o c e d u r e s i n c e b u t a n o l ( e t c . )e v i d e n t l y d o e s n o t a c t a s a s e c o n d s u b s t r a t e , n o rd o e s i t a p p e a r t o i n t e r a c t d i r e c t l y w i t h t h e a c t i v ec e n t r e .

I f t h e r e v e r s i b l e e f f e c t o f a l c o h o l s on o t h e rh y d r o l y t i c e n z y m e s i s t h e same a s t h a t f o r c h o l i n -e s t e r a s e , t h e n t h i s e f f e c t m ay p r o v i d e a u s e f u lmeans o f d e t e r m i n i n g t h e K 8 f o r t h e s e e n z y m e s .When t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e enzyme i s a l s ok n o w n , t h e n t h e i n d i v i d u a l r a t e c o n s t a n t s k l , k 2an d k 3 may a l s o b e c a l c u l a t e d . The r e l a t i v e m a g n i -t u d e s o f t h e i n d i v i d u a l r e a c t i o n c o n s t a n t s c a n b ee s t i m a t e d an d t h i s i n f o r m a t i o n m ay p r o v i d ev a l u a b l e i n s i g h t s i n t o t h e r e a c t i o n m e c h a n i s m . I ts e e m s l i k e l y t h a t a l c o h o l s w i l l a l s o a f f e c t K 8 , b u te v i d e n t l y t h e e f f e c t on k 3 i s m u ch g r e a t e r t h a n t h ee f f e c t t h e y m i g h t h a v e o n K 8 ,SUMMARY

1 . The h y d r o l y s i s o f o - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e byhuman s e r u m c h o l i n e s t e r a s e was a c t i v a t e d bya l c o h o l s an d a c e t o n e .2 . L i n e w e a v e r - B u r k p l o t s o f t h e a c t i v i t i e s a t anumber o f b u t a n o l c o n c e n t r a t i o n s g a v e l i n e s ,w h i c h , on e x t r a p o l a t i o n i n t o t h e l o w e r l e f t - h a n dq u a d r a n t , a p p r o x i m a t e d a c o m m o n p o i n t o f i n t e r -s e c t i o n . The p o i n t o f i n t e r s e c t i o n c o u l d b e u s e d t od e t e r m i n e K 8 , k 2 e and k , e d i r e c t l y f r o m t h e p l o t . I t i ss u g g e s t e d t h a t t h i s p l o t i s t y p i c a l o f k 3 a c t i v a t i o n .3 . The a c t i v a t i o n w a s d e p e n d e n t o n t h e c h a i nl e n g t h , m e t h a n o l a c t i v a t i n g l e a s t a n d p e n t a n - l - o lm o s t . B u t a n - l - o l a c t i v a t e d more t h a n i t s s t e r e o -i s o m e r s .4 . The h y d r o l y s i s o f p - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e wasi n h i b i t e d by b u t a n - l - o l . L i n e w e a v e r - B u r k p l o t s o f

t h e a c t i v i t i e s a t a number o f b u t a n - l - o l c o n c e n t r a -t i o n s a p p r o x i m a t e d a c o m m o n p o i n t o f i n t e r s e c t i o ni n t h e l o w e r l e f t - h a n d q u a d r a n t i n a manner s i m i l a rt o t h e a c t i v a t i o n p l o t . T h i s p l o t i s p r o b a b l yt y p i c a l o f k 3 i n h i b i t i o n .5 . The human s e r u m c h o l i n e s t e r a s e o - n i t r o -p h e n y l b u t y r a t e K , was 0 - 0 7 2 mm, c o m p a r e d w i t hKm 0 - 1 3 9 mm, an d t h e p - n i t r o p h e n y l b u t y r a t e K ,w a s 0 - 3 8 mm, c o m p a r e d w i t h Km 0 - 8 0 mm. Thes e r u m c h o l i n e s t e r a s e K m o f t h e s e s u b s t r a t e s h a st h e r e f o r e a mixed m e a n i n g , b e i n g b o t h k 3 - an dK , - d e p e n d e n t .6 . o - N i t r o p h e n y l b u t y r a t e h y d r o l y s i s by a p a r t i -a l l y p u r i f i e d h o r s e - s e r u m c h o l i n e s t e r a s e p r e p a r a -t i o n was a l s o a c t i v a t e d by b u t a n - l - o l .7 . o - N i t r o p h e n y l a c e t a t e h y d r o l y s i s by humans e r u m c h o l i n e s t e r a s e was a c t i v a t e d by b u t a n - l - o lan d p - n i t r o p h e n y l a c e t a t e h y d r o l y s i s was i n h i b i t e d .8 . I t i s s u g g e s t e d t h a t a l c o h o l s a f f e c t t h e a c t i v i t yo f h y d r o l y t i c e n z y m e s by c h a n g i n g some a s p e c t o ft h e e n v i r o n m e n t o n w h i c h k 3 i s d e p e n d e n t . Thee f f e c t h a s b e e n c a l l e d ' e n v i r o n m e n t a l ' t o d i s -t i n g u i s h i t f r o m s p e c i f i c i n t e r a c t i o n . On t h e b a s i so f an e n v i r o n m e n t a l e f f e c t a l c o h o l s m ay p r o v i d e au s e f u l method f o r d e t e r m i n i n g t h e K , o f manyh y d r o l y t i c e n z y m e s .

T h e a u t h o r i s p a r t i c u l a r l y g r a t e f u l t o Dr M . D i x o n a n dDr E . C . Webb f o r t h e i r i n t e r e s t a n d v a l u a b l e c r i t i c i s m o ft h e w o r k . He a l s o t a k e s p l e a s u r e i n a c k n o w l e d g i n g t h ee x p e r t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e o f M r s K a t h l e e n M i l e s . I na d d i t i o n , t h a n k s a r e g r a t e f u l l y e x t e n d e d t o Dr P . E . B r a i df o r h i s i n t e r e s t a n d p a t i e n c e d u r i n g o u r n u m e r o u s c o n v e r -s a t i o n s .

REFERENCESA l d r i d g e , W. N . ( 1 9 5 3 ) . B i o c h e m . J . 5 3 , 1 1 0 .B r i g g s , G . E . & H a l d a n e , J . B . S . ( 1 9 2 5 ) . B i o c h e m . J . 1 9 ,3 3 8 .D i x o n , M . ( 1 9 5 3 ) . B i o c h e m . J . 5 5 , 1 7 0 .D i x o n , M . & W e b b , E . C . ( 1 9 5 8 ) . E n z y m e s . L o n d o n :L o n g m a n s , G r e e n a n d C o . L t d .H u g g i n s , C . & L a p i d e s , J . ( 1 9 4 7 ) . J . b i o l . C h e m . 1 7 0 , 4 6 7 .L a i d l e r , K . J . ( 1 9 5 5 ) . D i s c . F a r a d a y S o c . 2 0 , 8 3 .L i n e w e a v e r , H . & B u r k , D . ( 1 9 3 4 ) . J . A m e r . c h e m . S o c . 5 6 ,

6 5 8 .M a i n , A . R . , M i l e s , K . E . & B r a i d , P . E . ( 1 9 6 1 ) . B i o c h e m . J .7 8 , 7 6 9 .S l a t e r , E . C . ( 1 9 5 5 ) . D i s c . F a r a d a y S o c . 2 0 , 2 3 1 .S t r e l i t z , F . ( 1 9 4 4 ) . B i o c h e m . J . 3 8 , 8 6 .

ks determination

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