UE5 ImmunologieDr David Boutboul23/11/2018 de 10h30 à 12h30Ronéotypeur : Sarah MchirihatRonéoficheur : Rosaline Nguyen

Cours n°8 :Diversité des immunoglobulines : Mécanismes génétiques et

implications pathologiques.

Lexique :Ig : immunoglobulineLB : lymphocyte BLT : lymphocyte TGR : globule rougeAg : antigèneMo : moelle osseuse

Le professeur a changé, la structure du cours est assez similaire à celle de l’an passé. Le professeur a également accepté de relire la ronéo.

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Introduction

I. La diversité des immunoglobulines durant la lymphopoïèse dans la moelle osseuse 1. La diversité combinatoire 2. Diversité jonctionnelle

II. Lymphopoïèse   : le développement du lymphocyte B et des Ig 1. De la cellule souche au stade pro-B 2. Du stade pro-B au stade pré-B 3. Du stade pré-B au LB naïf immature 4. Du LB naïf immature au LB naïf mature 5. Le devenir des immunoglobulines

III. La diversité des immunoglobulines est augmentée dans le centre germinatif 1. Activation et maturation des LB dans les centres germinatifs du ganglion 2. Mutations somatiques et commutations isotypiques 3. Molécules de la réparation et pathologies associées 4. Devenir des lymphocytes

a) En réponse aux antigènes T dépendant b) En réponse aux antigènes T indépendant

5. Pathologies générales

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L’objectif de ce cours est d’arriver à comprendre comment on peut arriver à fabriquer des Ig (immunoglobulines) à partir de plasmocytes. Cette production a lieu dans la moelle osseuse et peut être dosée à l’aide de l’électrophorèse, permettant ainsi d’identifier des défauts ou des excès de production pouvant être la cause de diverses pathologies qui seront détaillées dans ce cours.

Introduction

Les Ig sont des protéines composées de deux chaînes légères (CL) et de deux chaînes lourdes (CH, H pour heavy en anglais). Comme toutes protéines, elles sont codées par des gènes se situant sur trois chromosomes différents : chromosome 14 pour les chaînes lourdes, chromosome 2 pour les chaînes légères κ et chromosome 22 pour les chaînes légères λ. De plus, la chaîne légère est soit κ, soit λ, il existe un équilibre entre ces deux chaînes au sein des différents Ig créées, c’est pourquoi lorsqu’il y a changement majeur des proportions, on peut s’interroger sur une pathologie maligne des lymphocytes B.

Par ailleurs, les chaînes lourdes sont plus longues et permettent ainsi dans leur partie C terminale (partie constante) d’interagir avec les récepteurs et d’augmenter, par conséquent, la réponse par phagocytose. Du côté N terminal, on retrouve la partie variable des Ig ayant pour rôle la reconnaissance des Antigènes.

Les lymphocytes B (LB) sont formés dans la moelle osseuse, il existe des cellules immatures, les CSH (cellules souches hématopoïétiques), qui vont former des précurseurs qui se différencieront en LB naïfs. Ces derniers sortiront dans le sang et termineront leur maturation dans les ganglions et organes lymphoïdes secondaires.

I. La diversité des immunoglobulines durant la lymphopoïèse dans la moelle osseuse

1. La diversité combinatoire

Le gène de formation des Ig est assez particulier. En effet, la partie variable de la chaîne légère est codée par les gènes V et gènes J. Il existe n gènes V et n’ gènes J, permettant ainsi de créer différentes combinaisons et d’augmenter la diversité.

On observe sur le schéma ci dessus qu’à partir de l’ADN réarrangé, qui a subi un réarrangement du au signal de différenciation en LB, on obtient un pré ARNm composé de différents exons V et J, d’introns ainsi que de la partie constante. Ce dernier va subir un épissage alternatif qui aboutira à un ARNm mature composé d’un seul exon V, un seul exon J et de l’exon C pour la partie constante. Ce processus étant aléatoire, un nombre important de recombinaisons sont donc possibles. C’est ce qui crée la diversité.

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On retrouve un phénomène similaire pour les chaînes lourdes. La différence réside dans le fait qu’il y ait un segment complémentaire qui augmente encore plus la diversité. Il s’agit d’exons supplémentaires appelés exons D. Chaque LB est unique grâce aux réarrangements des CL et CH, et à leurs assemblements aléatoires permettant ainsi d’avoir une structure unique qui reconnaît un antigène en particulier.

Il s’agit d’une question pouvant être posée selon le prof. Il faut distinguer les réarrangements VDJ pour les chaînes lourdes et VJ pour les chaînes légères.

Lors de ces réarrangements, certaines parties d’ADN sont supprimées. Cependant ce phénomène est extrêmement régulé car peut entraîner des mutations avec un risque oncogène. Il existe donc un système qui va permettre de casser l’ADN. Ces cassures ont lieu sur des séquences particulières  : les RSS à 23pdb et 12 pdb. Elles se situent au niveau des exons V, D et J selon les chaînes. Elles permettent la fixation de RAG qui va couper l’ADN.

En l’absence de séquence RSS, RAG ne peut pas fonctionner. Une modification du nombre de paire de bases de RSS affecte également la fixation de RAG et son rôle.

RAG1 et RAG2 sont donc des protéines qui se fixent de part et d’autre de V, D ou J, le site de liaison est reconnu par la présence des séquences RSS. Elle forme une sorte de boucle permettant d’exciser la séquence d’ADN. D’autres molécules, comme Artémis, viendront par la suite résoudre l’ADN. De nombreuses pathologies sont associées à des mutations de ces gènes, de plus il faut qu’il y ait un timing précis. Ce système est spécifique du système lymphoïde, RAG est uniquement retrouvée dans le système lymphoïde B et T. Si on forçait l’expression de RAG dans des fibroblastes, il y aurait des cassures qui pourraient entraîner des cancers. Concernant le système T, les lymphocytes T (LT) se développent dans le thymus, ils sont au départ double négatif (CD4- et CD8-) puis double positif (CD4+ et CD8+) puis single positif (soit CD4+, soit CD8+). RAG est également utilisé dans la formation des récepteurs aux LT (TCR).

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Exemple des enfants bulles : il s’agit d’un déficit combiné (absence de LB) sévère (absence de LT). C’est une mutation dans le gène codant pour RAG (1 ou 2), étant donné qu’il s’agit d’une maladie autosomique, les deux allèles sont touchés (par la même mutation, ou par des mutations différentes). RAG étant inactif, les enfants naissent sans LB ni LT. Durant les six premiers mois, ils auront encore les IgG de la mère, transmis par le placenta, mais pas de lymphocytes B durant cette courte période. Après 6 mois, des infections opportunistes sévères apparaîtront car il n’y a ni LT, ni LB,. Souvent le diagnostic peut être loupé car la norme inférieure d’un enfant concernant son taux de LT est de 4000 G/L, or il s’agit de la limite supérieure de l’adulte. Ainsi un taux de LT de 1500 G/L est pathologique chez l’enfant, c’est donc un déficit majeur chez le nouveau-né. Des thérapies géniques sont développées, mais le traitement le plus efficace est la transplantation de moelle (frère, sœur, fichiers de donneurs).

En résumé, les enfants bulles avec mutations de RAG sont B-, T- mais NK+. Ils ont des troubles du système immunitaire majeures corrigées majoritairement par transplantation de moelle. On les appelle enfants bulles car ils sont placés dans des « bulles » pour éviter toute contamination par un agent pathogène et préserver leur immunité.

Tableau illustrant les combinaisons possibles grâce aux réarrangements combinatoire. Rappel : cette diversité apparaît dans la moelle et conduit à plus de 2 millions de cellules B différentes.

2. Diversité jonctionnelle

Une fois l’ADN cassé par la RAG, puis le fragment retiré, une soudure arrive : il s’agit de la protéine TdT.Il y aura une insertion de nucléotides dans la région N (extra-nucléotide). Cela crée une imprécision qui permet d’augmenter la variabilité entre les différents Ig, de plus elle amplifie la diversité combinatoire.

Ce phénomène d’insertion/délétion peut dans 9 cas sur 10 causer des ruptures du cadre de lecture. Au bout de l’ajout, après 10/15 acides aminés, on retrouve un codon stop conduisant à la formation de protéine tronquée et ainsi à l’absence de formation d’Ig. Cependant, ce gaspillage est relatif car on possède deux allèles et donc deux possibilités. Si le premier allèle n’est pas réussi, il reste toujours le deuxième. Parfois, les deux peuvent être incompatibles avec la formation de l’Ig, il existe donc un mécanisme de réarrangement secondaire.

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II. Lymphopoïèse   : le développement du lymphocyte B et des Ig

1. De la cellule souche au stade pro-B

Les lymphocytes B se forment dans la moelle osseuse qui est une partie creuse de l’os, majoritairement au niveau des os longs et un peu au niveau des os du crâne. Il y a la présence de cellules souches hématopoïétiques qui vont se différencier en LB à partir d’un précurseur B.

Il y a un progéniteur qui n’a pas arrangé ses chaînes lourdes et ses chaînes légères. Il est destiné par un signal de la moelle osseuse à devenir un lymphocyte B : c’est ce qu’on appelle un lymphocyte au stade pro-B.

2. Du stade pro-B au stade pré-B

Dans les cellules pro-B, ce sont les chaînes lourdes qui se réarrangent en premier. Il y a une association des exons D-J qui se fait dans un premier temps, puis une différenciation en VDJ par ajout de l’exon V. On arrive avec une cellule pro-B dans laquelle il y a une chaîne lourde qui est réarrangée et une chaîne légère qui ne l’est pas encore. Avant de réarranger la chaîne légère il y a une étape intermédiaire. Afin de stabiliser les chaînes lourdes, on rajoute des pré BCR qui sont des pseudos chaînes légères qui pénètrent tous les lymphocytes. Quand on différencie les lymphocytes il y a : la chaîne lourde réarrangée qui ne tient pas, donc l’ajout d’un pré BCR qui a un rôle de « tuteur » pendant le temps nécessaire pour réarranger la chaîne légère. Toutes les cellules pré-B ont une chaîne lourde différente mais le même tuteur.

3. Du stade pré-B au LB naïf immature

Le récepteur pré-B à surface des cellules pré-B est constitué par : les chaînes lourdes (chaîne μ) + les pseudo chaînes légères invariantes (molécules Vpré-β et λ5). Dans la moelle, il existe des signaux qui arrivent et qui sont transmis dans la cellule pour sélectionner les pré-B conformes (c’est à dire avec un récepteur fonctionnel). Ces signaux dits « signaux de survie » Ig α et Ig β sont extrêmement importants et permettent de sélectionner les récepteurs conformes. Si la chaîne lourde reçoit ce signal, elle va survivre et inversement.

Il existe des déficits chez les enfants qui n’ont pas de λ5 et pas d’Ig α et Ig β donc pas de signaux. Il existe une kinase très importante la BTK (Bruton Tyrosine Kinase) qui peut être mutée chez les garçons car maladie transmise par l’X. Il n’y aura donc pas de signalisation et absence de LB et sans anticorps.

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Ces bébés vont avoir les anticorps de la mère pendant 6 mois puis seront exposés à des risques d’infections respiratoires très graves. La perfusion d’Ig est le traitement choisi habituellement.

4. Du LB naïf immature au LB naïf mature

À la suite des réarrangements des chaînes lourdes puis légères, on obtient une immunoglobuline de surface qui est formée. Cette Ig est de type IgM, c’est le stade de lymphocyte B naïf immature.

Or, il est également possible d’avoir à la fois des IgM et des IgD à la surface des lymphocytes naïfs. Cela est possible par 2 sites d’épissage alternatif. Pour la chaîne constante soit on l’arrange avec la Cμ et on obtient une IgM soit on arrange Cδ et on a une IgD. L’exclusion allélique des chaînes légères ne s’applique pas ici, il est possible d’avoir à la fois des IgM et des IgD dans la même cellule LB naïf mature. Donc, à la surface du lymphocyte mature il y a donc une chaîne λ ou κ et en plus du μ et du δ.

5. Le devenir des immunoglobulines

Les Ig sont dirigées vers la surface des LB. Cependant il est également nécessaire d’en avoir dans la circulation sanguine par sécrétion.

Le système immunitaire va alors soit :- Rajouter au bout une séquence qu’on appelle M1

et M2 qui va alors ancrer les Ig à la membrane. - Ne pas du tout réarranger cette structure, l’Ig va

alors dans le réticulum endoplasmique et être sécrété.

Il est ainsi possible que des Ig soient envoyées dans le sang où les pathogènes s’y trouvent. Ce mécanisme aléatoire (M1/M2 se fixe ou non de manière aléatoire) permet à la cellule d’avoir des anticorps mais aussi de les sécréter.

Schéma de la voie de signalisation entière qui n’est pas à apprendre en détail.

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Retenir juste que nous avons le BCR (B-Cell Receptor) qui est lié à Ig α et Ig β et activant après stimulation Btk, une kinase très importante. Quand ces signaux sont absents le LB meurt, ce qui explique les maladies liées aux mutations possibles dans la voie de signalisation.

Le lymphocyte B naïf ainsi formé est mature, il est conforme et a été sélectionné pour sortir dans la circulation. Lorsqu’il y a une menace, son rôle est d’aller dans les ganglions, de s’activer et de former des LB mémoire et des Ig.

III. La diversité des immunoglobulines est augmentée dans le centre germinatif

1. Activation et maturation des LB dans les centres germinatifs du ganglion

Le lymphocyte B naïf suite à sa reconnaissance avec l’Antigène (Ag) est activé. Il va ensuite rentrer dans le ganglion de manière régulée. Dans ce ganglion, il y aura une sélection de nos LB. Ceux qui sont trop réactifs seront dégradés car peuvent causer de l’auto immunité. De plus, des mutations auront lieu pour augmenter la partie variable pour qu’il y ait une augmentation de la reconnaissance. Ceux qui après mutations perdent de l’affinité avec le récepteur mourront par apoptose (défaut de signal de survie).

Dans un premier temps, dans la zone sombre a lieu la prolifération des LB. Ensuite après amplification et certaines mutations somatiques et commutations isotypiques (expliqués plus loin), ils vont former des follicules lymphoïdes secondaires et donner des plasmocytes ou des cellules B mémoires. Ce sont les cytokines présentes dans les ganglions qui vont décider de l’avenir des LB.

De plus, l’activation des LB nécessitent les LT qui eux-mêmes ont besoin d’antigènes dégradés par les cellules dendritiques (différentes des cellules folliculaires dendritiques du ganglion). C’est un peu comme un ménage à 3, chaque cellule a besoin d’une autre pour s’activer et jouer son rôle. La liaison entre les LB et les LT se fait grâce au CD40 du LB et CD40L du LT. Cette costimulation va permettre au LB d’envoyer des signaux qui vont induire la protéine AID, équivalent de RAG dans le ganglion.

Il existe des antigènes T dépendant (tétanos, diphtérie…) et d’autres qui ne sont pas T dépendant et activent directement les LB.

Naître sans CD40 et CD40L induit l’incapacité de former le « ménage à trois », il n’y a donc pas de LB mémoire conventionnel, donc de nombreuses infections. Cependant, il y a quand même présence d’IgM mais pas d’IgG, ni d’IgA car pas capable de réaliser les commutations isotypiques. Il y aura donc une surexpression d’IgM Ronéo 9 - UE5 - Cours n°8 8/10

pour compenser l’absence des autres Ig. Appelée syndrome d’Hyper-IgM, c’est soit une maladie autosomique (mutation d’AID), soit une maladie qui ne touche que les hommes dans le cas d’un défaut en CD40L car transmise par l’X.

2. Mutations somatiques et commutations isotypiques

Des petites mutations ponctuelles vont avoir lieu dans la partie variable pour augmenter l’affinité avec l’antigène. Toutes les erreurs, dès lors qu’elles ne confèrent pas d’anomalie, ne sont pas corrigées car permettent la diversité. Ensuite, les LB sélectionnés vont subir une modification au niveau de la partie constante. Le LB reçoit un signal lui indiquant de produire des IgA, des IgG … qui sont plus performants et reconnaissent et fixent plus facilement les récepteurs. Il va donc y avoir une coupure au niveau des Sμ et Sα. Ainsi la partie constante μ sera retirée et le VDJ de l’Ig sera en contact avec la partie constante α, etc…. Permettant ainsi d’obtenir des IgA, des IgG …. C’est la commutation isotypique qui est primordiale pour la sécrétion d’Ig spécifique de l’antigène (IgA, IgD, IgE…)

3. Molécules de la réparation et pathologies associées

Il y a des molécules comme Ku70, Ku90, Artemis (pas à retenir) qui entrent en jeu dans la réparation. D’abord les cassures de l’ADN sont médiées par RAG dans la MO et AID dans les ganglions. Puis il y a des molécules qui stabilisent la synapse et d’autre qui la réparent.

Les enfants qui ont un déficit de ces molécules ont un défaut de réparation de l’ADN et donc ils n’ont pas de LB et de LT. Malheureusement, ces systèmes de réparations ne sont pas tous situés que dans le système lymphoïde. Ils se trouvent également au niveau de la peau, du cerveau et des os. Il y aura des gros problèmes de réparations partout et non seulement dans le système lymphoïde.

Il existe donc de nombreuses anomalies : ex : défaut de DNA L ligase 4, les individus présentent des têtes particulières à cause d’un défaut de morphogénèse du crâne, microcéphalie mesurable par le périmètre crânien diminué. Ce sont des maladies très graves car une greffe de moelle va seulement remédier au système immunitaire, mais pas protéger les anomalies de réparations dans la peau etc. Dans des formes extrêmement graves, les enfants naissent avec un retard psychomoteur cela dépend des gènes et la gravité des mutations.

4. Devenir des lymphocytes

a) En réponse aux antigènes T dépendant

On retrouve la diphtérie, le tétanos. Le LB mature sort du ganglion, va dans la circulation sanguine, reconnaît l’antigène sous forme 3D et s’active pour permettre la réponse. Cette activation est permise grâce au LT. Elle est assez affine, durable, intense et rapide.

b) En réponse aux antigènes T indépendant

Ce sont des antigènes qui peuvent directement activer les LB mais ne peuvent réaliser de commutations isotypiques et de mutations somatiques. C’est pour ça qu’ils interagissent essentiellement avec les IgM. Prenons l’exemple du pneumocoque. C’est une bactérie qui possède un motif répété qui permet d’activer le récepteur aux LB. En effet, la présence d’épitopes répétitifs permet d’englober un grand nombre de récepteurs et permettre l’activation directe d’IgM.

Certains LB particuliers avec IgM auraient une origine fœtale (foie) puis ensuite auraient circulé vers la rate. Ils se trouvent donc dans une zone appelée la zone marginale (LB de la zone marginale). Ces IgM sont un peu mémoires car elles ont quelques mutations somatiques et réagissent extrêmement rapidement au pneumocoque. C’est important pour les enfants car ils n’ont pas encore de lymphocytes mémoires et elles permettent de contenir les infections. Si ces IgM sont absentes, il y a risque d’infection mortelle.

Il faut savoir que la rate est le « cimetière » des globules rouges (GR) puisque c’est là où a lieu l’hémolyse des GR en fin de vie. On peut réaliser un frottis sanguin pour savoir s’il y a une absence de rate (asplénie,

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splénectomie…), qui sera confirmée par la présence de corps de Jolly dans le sang (« cadavre des GR »). Mais également, l’absence de rate induit donc une baisse des IgM mémoires et donc un risque infectieux fulminant, c’est une des causes majeures de décès post splénectomie. C’est pourquoi avant toute splénectomie, on essaye de vacciner les patients contre le pneumocoque : une première fois avec des antigènes T dépendants et une deuxième avec des T indépendants. De plus, on peut leurs prescrire des antibiotiques quotidiennement. Cependant, il est plus conseillé de prescrire un thermomètre et des antibiotiques qui ne seront à prendre qu’en cas de fièvre. Le déficit immunitaire étant très important en absence de rate, il faut que le patient soit concerné et impliqué car la mort peut survenir brutalement par septicémie.

La drépanocytose peut également causer une perte de la rate, la détruisant d’années en années jusqu’à sa disparition. Les risques infectieux sont également majeurs.

5. Pathologies générales

Lorsqu’il y a un excès ou un déficit engendre souvent des mutations des LB. Le AID est dérégulé, cela cause un lymphome au niveau des ganglions. Une mutation de RAG peut favoriser une leucémie aigue de la moelle et des défauts au niveau des plasmocytes provoquent un myélome.

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