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La détection des mutations: pourquoi?
fins
diagnostics: - validation du diagnostic chez individu
symptomatique - Pathologie héréditaire (maladie génétique) ou
somatique (cancer)
Déterminer si un gène candidat est responsable de la
pathologie
Etudier les relations structure/fonction du
gène NB: Diagnostic génotypique pas forcément
nécessaire: - En France, dépistage néonatal systématique de 3 maladies
génétiques (phénylcétonurie, mucoviscidose, et
drépanocytose) par des approches biochimiques
LA DÉTECTION DES MUTATIONS: COMMENT?
Deux situations
différentes:
Mutations
connues:
criblages
(screening)
Mutations
inconnues:Balayage
(scanning) Un seul gène ou plusieurs
gènes
-Mutation unique (très rare)
-Mutations prédominantes
par effet fondateur
-Points chauds de mutations
-Spectre bien défini avec
fréquences allèliques dans la
population
Un gène ou plusieurs gènes
candidats
recherche sur la totalité du gène
Maladie Gène Mutation Remarque
Drépanocytose HBB Un seul codon (6), un seul faux-sens (Glu->Val), une seule mutation (GAG ->GTG)
Monoallélisme stricte
Achondroplasie FGFR3 Un seul codon (380), un seul faux-sens (Gly->Arg), deux mutations nt1138 (G->A; G->C)
Monoallélisme par récurrence en un point chaud
Mucoviscidose CFTR Del508>1300 autres
66% des allèles30% des allèles
Myopathie de Duchenne DMD Délétion de 1 ou plusieurs exonsDuplication de 1 ou plusieurs exonsMutation ponctuelle variable
65% des allèles10% des allèles25% des allèles
Neurofibromatose de type 1
NF1 >250 mutations différentes(74% petites mutations)
Taux de néomutations élevé (10-4)
LA DÉTECTION DES MUTATIONS: COMMENT? (SUITE)
LES AUTRES FACTEURS INFLUENÇANT LA
STRATÉGIE: - La nature attendue des mutations
- La taille et la structure du locus
exploré
- Le matériel disponible (ADN, ARNm)
- Le degré de sensibilité nécessaire
LA DÉTECTION DES MACROMUTATIONS
- 1) Cytogénétique classique et cytogénétique moléculaire-2) Southern blot
-3) PCR fluorescente
-4) RT-PCR
ADN
ARN
Grandes délétions, insertions, duplications, inversions et translocations
plusieurs centaines de pb voir des milliers
1) CYTOGÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)
Principe: l’ADN est visualisé grâce à une sonde qui est soit un haptène ( ex: digoxigénine) révélé par un anticorps fluorescent ou directement par un fluorochrome
Cibles: uniques de l’ordre de quelques Kb mais aussi des cosmides, YAC.
Applications du FISH:- cartographie des marqueurs (Bac ou Yac) sur des chromosomes
métaphasiques (l’une des phases de la mitose) et en particulier les bac chimères- identification des chromosomes en particulier dans les hybrides
somatiques surtout après irradiation qui fragmente les chromosomes- identification de petits fragments chromosomiques remaniés- hybridation in situ en interphase permettant d’identifier sur de la
chromatine des séquences distantes de 100kB seulement ainsi que des chromosomes remaniés
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FISH ciblée
FISH locus spécifique
Sonde spécifique de gènes ou loci
Peinture chromosomique
Sonde de peinture d’un chromosome entier
Ex: Détection t(9;22) dans les LMC
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Ex: t(8;21) dans une LMA
Méthodes de FISH global
CGHComparative Genome
Hybridization)
M-FISH (multi-FISH)SKY (Spectral karyotyping)
24 sondes de peinture chromosomiques spécifique des 22 autosomes et X/Y. Utilisation d’un mélange de sondes dont la composition est spécifique d’un chromosome donné.
-ADN génomique testé et ADN génomique témoinMéthode permettant de quantifier et de localiser des microremaniements d’ADN- La résolution est maximale car elle ne dépend que de l’objet à analyser- Très utilisée pour les remaniements dans les cancers- Shéma expérimental (diapo suivante)
Ex: translocation (7p;12q)(Dupont JM, Cochin)
LA MÉTHODE DE CGH
CGH sur chromosomes
CGH sur microarray
Résolution 5-10Mb
Résolution dépend du matériel génomique utilisé. Permet de descendre à l’échelle de l’exon
Numérisation du signal -> lecture quantitative
2) LE SOUTHERN BLOT
-Permet de visualiser une portion du génome par hybridation d’une sonde marquée sur des fragments de restriction d’ADN séparés par électrophorèse.
-Limite supérieure de résolution: ≈ 20 kb.
-Pour l’analyse de plus grand fragment d’ADN génomique, electrophorèse en champs pulsés résolution max 1Mb)
Modifications de la carte de restriction si macromodification
Inconvénients:Difficultés de détection des anomalies quantitatives hétérozygotes: saturation du signal lors de la détection
3. Les dérivées de la PCR
=Amplification au cours d’une même PCR de plusieurs régions différentes
-taille de chaque amplicon différente-oligonucléotides de Tm proches
Analyse de l’ADN
La PCR multiplex
Mise au point assez complexe
ATG
TAATAGTGA AATAAA
Amplicon 1 Amplicon 2 Amplicon 3 Amplicon 4
3) LA PCR FLUORESCENTE
-Amorce ou dNTP marqués par un fluorochome et analyse du produit d’amplification sur un séquenceur
-Optimisation 1: PCR multiplex (amplification de plusieurs régions différentes)
-Optimisation 2: PCR semi-quantitative (faible nombre de cycles et analyse quantitative de la fluorescence)
Pertes ou gains d’amplicons entiers visualisés par absence de l’amplicon ou variation d’intensité (si hétérozygotie)
4) La RT-PCR
-Amplification des ARNm après étape de synthèse de cDNA simple brin
Permet de détecter: - Perte ou gain de matériel visualisé par une anomalie de longueur de l’amplicon
-Transcrit ampliflié en un seul ADNc ou plusieurs fragments chevauchants
- des ARNm chimères avec des amorces spécifiques
-Amplification des ARNm après étape de synthèse de cDNA simple brin
-Transcrit amplifié en un seul cDNA ou plusieurs fragments chevauchants
Permet de balayer la totalité de la séquence codante en un petit nombre de fragments chevauchants
Analyse de l’ARN
1. La RT-PCR
OMGP EVI2A
ADNc NF1
250 bp
Exons EVI2B27b 492 28
17
2 6 84
2 7 13 19a 23-1 28 31 36 43 49
1 3 5 7 9
Exemple de l’amplification de l’ADNc NF1 en 9 fragments chevauchants couvrant les 9000pb de séquence condante
Cas particulier: LES AMPLIFICATIONS DE TRIPLETS
- Catégorie de maladies dues à des amplifications de triplets CAG, GCG,CTG
- dans un exon codant: CAG (maladie de Huntington)- dans la région 3’UTR: CTG (maladie de Steinert)- dans la région promotice: CGG (Syndrome du x fragile)- dans un intron: FAA (maladie de Freidrich)
-Analyse par Southern blot
- Analyse génotypique par PCR
-Problèmes méthodologiques si expansion trop importante
DETECTION DES SUBSTITUTIONS
Inconnues (Scanning)
-Clivage spécifique (chimique, enzymatique)
-SSCP (Single strand Conformational Polymorphism)
-DGGE (Denaturing gradient Gel Electrophoresis)
-PTT (Protein Truncation Test): détection spécifique des codons STOP
Connues (Screening)
+ séquençage
-Southern ou PCR-hydrolyse pour mutations modifiant un site de restriction
-Séquençage
-PCR-ASO (Allele Specific Oligoprobe)
-PCR-OLA (Oligonucleotide Ligation Assay)
-PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System)
-PCR suivie d’hybridation sur puces
MÉTHODE SSCP
Principe:
La perturbation de séquence induit un changement de conformation du DNA simple brin
-Sensiblité: 60-80% de mutations détectées
Mise en évidence
Conformation des brins
électrophorèse en gel d’acrylamide non dénaturant
Méthode DGGE (Denaturated Gradient Gel Electrophoresis)
- La perturbation de séquence induit un modification de la température de fusion
-Bonne sensiblité
-Mis en évidence par electrophorèse en gel d’acrylamide en gradient dénaturant
-Choix des amplicons doit tenir compte des domaines de fusion de la séquence
-Amplicons de 100-300 pb
LE PROTEIN TRUNCATION TEST (PTT)
-Mise en évidence d’une protéine tronquée due à la présence d’un codon STOP prématuré
-Promoteur T7 ajouté à l’amorce 5’
Système de transcription/traduction in vitro
Analyse des polypeptides sur SDS-PAGE
Méthode de PCR-ASO
- Mésappariements dans un court fragment diminuent la température de fusion de l’ hybride
- Synthèse de 2 oligosondes:Séquence normaleSéquence mutée
- Hybridation avec produit PCR de la région à étudier: conditions ne permettant que les appariements parfaits
- Visualisation par dot-blot
Nécessité d’étudier des témoins en parallèle
Techniques basées sur une extension différentielle d’amorce
MALDI-TOF:
Miniséquençage:
Allèle normal Allèle muté
T
A
C
G
Extension d’amorce(Taq Pol) + F1-ddTTP
+F2-ddCTP
TA
CG
Elimination des ddNTP et analyse du produit d’extension
+ ddNTP
Miniséquençage: analyse de fluorescence sur séquenceur d’ADN
MALDI-TOF: analyse de masse moléculaire de l’oligo