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Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

La tecnologia del DNA ricombinante


rDNA is NOT Whole Animal Cloning

Recombinant DNA is a tool in understanding the structure,

function, and regulation of genes and their products


•  The objectives of Recombinant DNA technology include: –  Identifying genes –  Isolating genes – Modifying genes – Re-expressing genes in other hosts or

organisms


•  These steps permit scientists and clinicians to: –  Identify new genes and the proteins they

encode – To correct endogenous genetic defects – To manufacture large quantities of specific

gene products such as hormones, vaccines, and other biological agents of medical interest


restriction animation.exe


Sebbene esistano enzimi di restrizione con siti di riconoscimento degenerati (per es. BsiEI riconosce la sequenza 5'-CGPuPyCG-3' dove Pu e Py rappresentano "qualunque purina" e "qualunque pirimidina“), la maggior parte degli enzimi di restrizione utilizzati nell'ingegneria genetica riconoscono sequenze specifiche che tagliano in tre modi diversi:

5'-CCC-3' 5'-GGG-3' 3'-GGG-5' 3'-CCC-5'

5'-G-3' 5'-AATTC-3' 3'-CTTAA-5' 3'-G-5'

5'-CTGCA-3' 5'-G-3' 3'-G-5' 3'-ACGTC-5'

• Generando estremità piatte (blunt) Es. SmaI

5'-CCCGGG-3' 3'-GGGCCC-5'

• Generando estremità coesive (sticky) sporgenti al 5' (5' protuding)

Es. EcoRI 5'-GAATTC-3'

3'-CTTAAG-5' • Generando estremità coesive (sticky) sporgenti al 3' (3' protuding) Es. PstI 5'-CTGCAG-3'

3'-GACGTC-5'

↓

↓

↓

↑

↑

↑


Estrazione di frammenti di DNA da gel Dopo aver digerito un DNA con enzimi di restrizione ed averne separato i frammenti risultanti su gel di agarosio, il passo seguente di solito consiste nell’excidere dal gel, con un bisturi, specifiche bande corrispondenti a geni o porzioni di DNA di nostro interesse e purificarle da gel.

Esistono molti sistemi per purificare bande da gel, tra cui:

•  elettroeluizione •  colonne a scambio ionico •  gel-filtration •  ultrafiltrazioni •  agarosio a basso punto di fusione •  ecc. ecc.


VETTORI DI CLONAGGIO Dai plasmidi batterici naturali sono derivati i vettori di clonaggio, le cui caratteristiche essenziali sono •  Origine di replicazione

•  Marcatore selezionabile •  Siti di restrizione unici


vettore inserto

CCCCCC3'OH

5'-P HO-3'CCCCCCCC

5'-P inserto

Terminal transferasi + dGTP

Terminal transferasi + dCTP

Sottoponendo il vettore e l’inserto a trattamento con terminal transferasi con due deossiribonucleotidi diversi le due molecole diventano complementari tra loro e possono essere ligate.

GGGGGG3'OH

5'-P HO-3'GGGGGG

5'-P vettore


Nel corso dei clonaggi può capitare di dover trasformare estremità coesive sporgenti al 5' o al 3‘ in estremità piatte, sintetizzando le basi mancanti nel filamento incompleto al 5' (filling in), oppure eliminando quelle sporgenti al 3' (trimming)

Filling in

Esempio 1: estremità “sticky” 5' protuding (es.EcoRI) In questo caso la tecnica d’elezione consiste nel cosiddetto “ filling in” che consiste nel “riempire” una estremità sporgente al 5' con la Klenow

G C AATTC

5'P

5'P 3'OH

3'OH

dTTP dATP dGTP G TTAAG

C AATTC 5'P

5'P 3'OH

3'OH


T/A cloning di prodotti di PCR La maggior parte delle polimerasi termostabili utilizzate nella PCR, possiedono una debole attività di tipo terminal trasferasico e aggiungono un residuo di adenosina alla estremità 3' dei propri prodotti di amplificazione

5'-P HO-3 A 5'-P A-3'OH

Sebbene questa caratteristica ostacoli il clonaggio dei prodotti di amplificazione, è stata vantaggiosamente sfruttata in una serie di vettori commerciali, i cosiddetti vettori T/A, che vengono forniti già linearizzati e che possiedono un residuo di timidina alle loro estremità 3'. I residui 3' terminali di T del vettore si appaiano con le A dei prodotti di amplificazione rendendo così possibile il clonaggio dei prodotti di PCR.


- Inserto fino 500 Kb


Vettori di clonaggio. Gran parte degli straordinari progressi ottenuti dalla biotecnologia e dalla biologia molecolare, dipendono dall'acquisizione della capacità di amplificare e propagare indefinitivamente i geni. Clonare un gene significa isolarlo da un genoma ed inserirlo in un vettore capace di replicarsi in un certo ospite (di solito E.coli o lievito). Esistono diversi tipi di vettori di clonaggio, ciascuno con vantaggi e svantaggi. La principale considerazione da fare é relativa alle dimensioni dell'inserto di DNA che ogni vettore può accettare.

PLASMIDI da 0,1 a 10 Kb

FAGI da 8 a 22 kb

COSMIDI da 32 a 45 kb

BAC da 75 a 300 kb

YAC da 100 a 2000 kb


Batteri Elettroporazione trasformazione chimica con CaCl2 coniugazione batterica Piante elettroporazione trasferimento mediato da Agrobacterium cannoncino balistico fusione di protoplasti

Lieviti PEG Elettroporazione DEAE-destrano

Tavola riassuntiva dei principali metodi di trasferimento genico

Protoplasti Elettroporazione fusione di protoplasti

Celule animali PEG Elettroporazione DEAE-destrano CaPO4


Libreria genomica e di cDNA

Endoderm

Mesoderm

Ectoderm

Progenitor cells

Totipotent cell Neuron

Hepatocyte

Myoblast

Pancreatic cell

B cell

Epithelial cell Pluristratified

ES cell

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