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LE POINT SUR L'EVOLUTION DES PERX'ORMANCES IDE REPRODUCTIONDU CANARD DE BARBARIE
Retailleau Bernard
GRMAUD Frères S.A., Ia Coôière, 49450 Roussay
Résumé
L'analyse des performances de reproduction de près de 500 cheptels de canards de barbarie nés entre 19E5 et1995 à la S.A. GRIMAT D Frères met en évidence une progression de pres de l0 oeufs par femelle en lèreponte et une relative stagnation du nombre d'oeufs pondus en 2ème ponte. La fertilité régresse légèrement (- 2à 3 points) alors que I'eclosabilité s'améliore de 3 à 4 points.Cette evolution contrastée des performances s'inscrit dans un contexte de forte evolution du poids vif du produitfinal : + 7 %o à + 20 %o selon les croisements.
Les croisements blancs médium obtiennent les meilleures performances de reproduction et à l'opposé, les moinsproductifs sont les croisements gris-banés.Une précocité accrue peut perturber le comportement des mâles mais ne modifie pas les résultats globaux.
Introduction
Il y a l0 ans le canard de barbarie était en fortecroissance et le contexte économique était favorable,mais depuis les choses ont bien changé et il doit,aujourd'hui faire face à la même pressionéconomique que les âutres volailles.
Dans le même temps. la demande d'un barbarie auplumage blanc s'est affirmee et la decoupe a confirméI'intérêt d'un canard toujours plus lourd et plusmalgre.
C'est en prenant en compte ces diftrentescontraintes que nous allons analyser l'évoluûon desperformances de reproduction depuis 1985.
Matériels et méthodesL'effectif moyen d'un cheptel est d'environ 3 000
Cette étude a été réalisee à partir des cheptels de femelles.reproducteurs parentaux mis en place par la s.A.GRIMAITD pour la production de canetons de Résultats - Commentairesbarbarie de chair.
1. Évohtion dans le temps
Voir tableaux I et 2.
Ces rés,ultats sont des moyennes de 4 croisements : 2au plumage gris et 2 au plumage blanc. Pour chaquecoulew il y a un croisement lourd et un croisementmédium.
Les années de références sont toujours les années denaissance des re,producteus. Il s'agit des moyennes arilhmétiques des
performances de chaque croisement ce qui élimineLes 6 critères retenus sont : toute variation liee aux effectifs par croisement.
l. La mortalité des mâles en reproduction.2.Lanoftalité des femelles en reproduction.
3. Le pourcentage de nrâles éliminés pour raison demutlaton du penis par les femelles.4. La ponte exprimee en oeufs pondus par femelleprésente au début de la ponte (lère de semaine deponte = taux de ponte > à8Vù.5. Le taux d'oeufs mis en eclosoir (oeufs MEE) : ils'agit de tous les oeufs gardés après mirage à l7-lEjours. Iæs oeufs non-fecondes et les e[ùryons mortsprécocement ont été retirés. Ce taux est très lié à lafertilité vraie. I"a mortalité embryonnaire précoce n'aété enregistree que depuis 1993 : elle est en mo'yennede 3 o/o.
6. Le taux d'éclosabilité exprimé en canetons eclossur oeufs mis en éclosoir.
Les résultats sont des moyennes arithmétiques desdifférents cheptels.
Le cycle théorique de production est le suivant :
- duree d'élevage : 29 semaines- dwee lère ponte : 22 semaines- durée mue : 13 semaines- duree 2ème ponte : 2l semaines
Deuxièrncs Iournéæ de Ia Recherche Avbolc, Tours, &10 aûil 1997
an%
mâlesmorts
tÂ
fem.mortes
Yomâlesélim.
Nboeufs/fem.
%oeufsMEE
%éclos
85 t .73 t.23 0.92 99-6 89.9 86.586 2.94 1.36 l . l 5 104.1 88.3 87.087 2_7 | t .57 0.56 102. I 86.2 88. I88 3 . l 8 1.88 1.54 106.4 87.9 89.489 1,69 1,70 3.02 t07.6 87.9 88.890 3.2s r,57 3,26 105.3 86,0 87,89 l 3 .41 1.82 3.33 104.5 86,3 89.492 5 . 1 I t .75 4.99 104.0 81.7 89.393 2.87 2.30 4.57 106.9 86.4 87.794 5.00 2.20 3.28 107.8 87.0 87.895 3 . 2 1 t.74 4. l0 109.5 87,7 9 1 . 6
TABLEAU I : Evolution dans le temps - lère ponte- 489 lots
TABLEAU 2 :Evolution dans le temps - 2ème ponte- 430 lots
Commentaires
La mortalité des femelles est faible et relativementstable dans le temps, aussi bien en lère ponte qu'en2ème ponte.En revanche, pour les mâles la mortalité et le tauxd'éliminés varient de 1,7 o à 6 oÂ. Les taux les plusélevés correspondent aux fertilités les plus faibles. Onpeut attribuer ces mauvais résultats à deschangements techniques défavorables : augmentationde la densité, extension de la reproduction surcaillebotis et développement de I'abreuvement parplpettes.
a ponte a bien progressé jusqu'en 88-89, tant en lèrephase qu'en 2ème phase, pour ensuite diminuernettement. Cette chute des performances est à relieraux changements techniques évoqués cidessus.
La fertilité à plutôt tendance à se dégrader dans letemps en raison probablement de l'évolution du poidsvif des différents croisements et ce, malgré uneréduction du nombre de femelles par mâle (cf. 6.).
A titre d'information, le poids vif des mâles de chairà 84 j. en 1985 était de 4,0 kg à 4,2 kg alorsqu'aujourd'hui au même âge les croisements médiumatteignent 4"4kg et les croisements lourds dépassentles 5,0 kg.L'écart entre la lère ponte et la 2ème ponte àtendance à se creuser par rapport aux réferencesprécédentes @etailleau, l9E6 - Sauveur, 1988).
2.L'effet type de croisements
TABLEAU 3 : lère ponte 85 à 95
1t; Il s'agit de la couleur du plumage du canetoncommercial desûné à I'abattoir.
TABLEAU 4 : 2ème ponte 85 à 94
Il apparaît clairement que, pour une même couleur deplumage les croisements médium sont nettement plusproductifs. L'effet négatif du poids n'est pas unesurpnse.A poids égal, sur I'ensemble des 2 pontes. lescroisements blancs et gris-barré obtiennent desrésultats comparables en production d'oeufs et enfertilité. En revanche. les croisements blancs sontnettement meilleurs en eclosabilité.
3. L'effet saison
TABLEAU 5 : Résultats par trimestre de naissanceen R5l (croisement blanc-lourd) de 85 à 95 - lèreponte
Croisements blancs( l )
Croisements grisbarré frl
Médium Lourd Médium LourdOeufs/fem. t08.1 103.6 107.5 1 0 1 . 9
oÂl\EE 86.8 86.1 87.4 86.'7o/o Eclos. 90.4 89.0 89. I 85.2
an%
mâlesmorts
V"fem.
mortes
v,mâlesélim.
Nboeufslfem.
YooeufsMEE
%éclos
85 2.22 r .37 o.4'7 90.2 90.4 87, I86 4.04 1.53 0.95 90.6 88,2 89,08',7 3.08 t.94 0.53 92.8 87,0 89.788 2.35 0.80 93,3 88,4 89,289 J . J J 2-44 0.95 94,1 89,1 88.790 5.63 2.51 I.73 90. I 86.7 89.59 l 5.08 2. t3 2_9',1 9t.2 83.8 88.692 6.00 2. r5 3.82 90.5 84.5 89.093 4.93 4.26 1,80 88.2 88.4 89.294 5,33 2.6',7 3 , 3 1 9 1 , 5 86.3 90,0
Croisements blancs Croisements grisbané
Médrum Lourd Medium LourdOeufs/fem, 94.5 88,7 92"6 90.8
YolvfE,E 88,s 87.0 87.4 85.77o Eclos. 90.8 89.3 89.7 85.9
Nblotsler
Trim44
2àneTrim46
3èmeTrim45
4èmeTrim6 l
Age entree en ponte 29.2 30.2 30.4 30.27o mâles morts 3"82 3.61 3,85 4.05o/o femelles mortes 1.88 l.6l l ,6 l 2. t3o% miâles éliminés 2.94 r.20 0.82 r.27Oeufs ponduVfem. 103.4 103.4 104.9 104.8% Oeufs MEE 83.8 87.0 86.8 85.3% Eclosabilité 89.5 90.1 89,3 88.0CanetonVfem.(avec967o d'oeufs incub.) 74.s 77.9 78.0 75,5
La saison de naissance des reproducteurs et donc laperiode à laquelle ils vont reproduire n'engendre pasd'effets spectaculaires. Compte tenu de la maîtrise dela température et des prograrnmes lumineux cesrésultats sont logiques et bien sûr différents de lareproduction en plein air (Sauveur et al. 1990).Toutefois, signalons quelques différences pourcertains critères :
Le taux de m.âles éliminés est plus importânt pour lescheptels nés en Janvier - Fevrier - Mars.L'explicaûon n'est pas évidente mais on peut penserque I'entree en ponte plus precoce traduit unepréparation inadaptee entraînant des problèmes decomportement sexuel.
Bien que les différences soient non significatives. laponte semble plus élevee pour les animauxcommençant à reproduire avec des jours croissants.Cette observation n'est pas très cohérente avecl'élwage en bâtiment obscur mais les animaux nesont peut.être pas complètement soustraits à I'effetsaisonnier, notamment pour la température.
Les cheptels nés aux ler et 4ème trimestres, ont untarrx d'oeufs mis en eclosoir et une eclosabilité plusfaible en raison de I'effet négatifde la chaleur sur lafertilité et I' eclosabilité
4. L'effet âge de début de ponte
TABLEAU 6 : Productivité par âge de début deponte - R5l - lère ponte - 85 à 95
Age en sem. < 2 8 s 29 s. 30 s. 31 s . > 3 2 sZo mâles morts 3 .10 4. t2 3.84 4.t4 3.57t/ofem. mortes 1.66 1.88 I . 7 l 2. t6 t.E0Zo rnâles élim. 3.57 2.09 t-45 0.47 0.58Nb oeufVfem. 106.0105. I 106.4104.695.E/o oeufs MEE 86.2 85.2 84.9 87.2 86,8Zo Eclosabilité 89.0 89.5 89.6 89.2 87.4lanetonVfem.avec 967o oeufsncubables)
78,1 77,0 77,7 78,0 69,8
L'âge de début de ponte n'influence p:ts la mortalitédes mâles et des femelles mais, il semble que laprecocité soit défavorable pour le taux de m.âleséliminés.
Jusqu'à 3l semaines l'âge d'entrée en ponte à peud'effet sur la productivité globale exprimée encanetons par femelle.
En revanche, une entrée en ponte tardive (32 sem. etplus) se traduit p:u une perte de production très netteessentellement en nombre d'oeufs par femelle(10 oeufs de moins par femelle).
Sauveur et De Carville (1995) n'avaient pas trouvéde difrérence de ponte lorsque l'âge au ler oeuf étaitretardé, mais il s'agissait de programmes lumineuxdifférents.
5. Intérôt des reproducteurs parentaux croisés
TABLEAU 7 : Comparaison lignees - croisementR5l - lère ponte - années 93-94-95
La stratégie de croisement est un moyen important àla disposition du sélectionneur pour optimiser lesperformances. Pour un produit final défini. il luirevient donc de choisir la meilleure combinaisonenre les lignees dont il dispose.
Dans notre cas I'intérêt du croisement se manifestesur les 3 critères (ponte, oeufs mis en éclosoir etéclosabilité) mais c'est le second critère et plusparticulièrement la fertilité qui benéficie de I'effetd'hérérosis.
3.6. L'effet sex-ratio
TABLEAU 8 : Relation performanceVsex-ratio R5l- lère ponte
Annees 8 5 - 8 8 89 -92 9 3 - 9 5Nombres fem./m.âle 3.E9 3,48 3 . 3 17o mâles morts 3,54 4.24 3.687o femelles mortes 1,56 1.69 2.20o/o miâIes éliminés 0.38 2.15 1.75Oeufs/femelle 98.3 104,6 108.5%oeufs MEE 86.2 83.9 87 -4% Eclosabilité 87.2 90.0 89.7
Le nombre de femelles par mâle a evolué au fil desans et il faut distinguer 3 periodes :
85 - 88 ) objectifs 4 femelledmâle89 à 92 ) objectifs 3,5 femelles/mâle93 à 95 à objectifs 3.3 femelleVmâle
L'effet sur la ponte et l'éclosabilité ne peut êtreinterprété car il y a superposition de plusieursfacteurs de variation, notamment I'effet génétique surla ponte.
La réduction du nombre de femelleVmâle en 89 - 92(- lI o/o environ) n'a pas permis de compenser lesefrets négatifs de certains changements techniques.
Moyennes deslimées de base
Parentauxcrorsés
Oeufs ponduVfem. 105.6 108.5% Oeufs MEE 79.4 87.1% Eclosabilité 85.7 89.7
La modification du sex-ratio ne semble pas résoudretotalement les problèmes d'activité sexuelle eUou dequalité de semence.
7. Relation lère ponte - 2ème ponte
TABLEAU 9 : Conélations entre performances delère ponte et de 2ème ponte - R5l
8 5 à 9 4142 lots
7o N{âles morts + 0.477o Femelles mortes + 0.27o/o Mâles éliminés + 0.40Nb oeufVfemelle + O,44% Oeufs MEE + 0.73%o Eclosabilité + 0.23
il ne s'agit que d'une courte analyse ayantsimplement pour objectif de dégager quelquesinformations sur la productivité comparée descheptels en lère et 2ème ponte.
Mêmes si elles ne sont pas très élevées. lescorrélations sont toutes positives et sigmficatives ettendent à montrer que les performances de 2èmeponte vont dans le même sens que celles de lèreponte. Ces résultats conlirment ceux obtenus lorsd'une précedente étude @etailleau, 1986).
On peut aussi en déduire qu'une bonne lère ponten'entraîne pas obligatoirement une mauvaise 2èmeponte. Toutefois, il existe une corrélation négativeG 0,19) entre le nombre d'oeufs pondus en lère ponteet l'âge d'entrée en 2ème ponte. Ceci tend à montrerqu'une bonne lère ponte a pour effet d'allonger ladurée de la mue bien que cette dernière soitartrfi ciellement contrôlee.
L'origine de la liaison entre les 2 periodes dereproduction n'est pas clairement établie : elle peutêtre génétique car au fil des ans le potenûel aprogresse, mais I'effet milieu compte aussi. Debonnes conditions d'élevage en lère ponte ont defortes chances de se retrouver en seconde ponte.
Conclusion
Les performances de reproducton du canard debarbarie continuent de progresser en ponte et enéclosabilité alors que la fertilité stagne voire régresse.Touæfois les progrès sont baucoup plus lentspendant cette decennie que pendant la precédente etce, ponr 2 raisons principales :
- La productivité numérique est d'un bon niveau pourune reproductrice chair, et il est plus difficile de lafaire progresser (le taux moyen de ponte sur les 2periodes atteint 65 %o c;es dernières années).
- La 'bourse" au poids contnue et elle a pour effetd'attenuer I'amélioration des performances dereproduction.
La reproduction du baôarie est de mieux en mieuxmaîtrisee mais elle est étoitement liee à la demandedu marché et plus precisement au potds vif du produrtfinal.
La production d'un canard très lourd entraînera uneaugmentation zubstantrelle du coût de production ducaneton d'un jour et peut occasionner de profondschangements dans les techniques de production. Parexemple, l'insémination artificielle peut, danscertains cas, être economiquement intéressante.
Refércnces
Retailleau B., 1986 - Conférence WPSA - SIMAVIPcahier N"3, p.17 à23.Sauveur 8., 1988 - Reproduction des volailles, p.72Sauveur B., De Carville H., 1990 - Le canard debarbarie - Du labo au terrain - INRA.Sauveur B., De Carville H., 1995 - lères Journées dela Recherche Avicole 286-288.
ENGRAISSEMENT ET RENDEMENT EN VIANDE CHEZLE CANARD DE BARBARIE :COMPARAISON DE DETIX GENERATIONS DE SELECTION DIT'FERENTES
B.aézz Elisabeth, Salichon Marie-Rose, Marché Georges, Leclercq Bernard
Staûon de Recherches Avicoles, CR INRA de Tours, 37380 Nouzilly, France
Résumé
Deux experiences ont permis d'analyser les effets d'une sélection visant I'augmentation du rendement enviande et la diminuton de I'engraissement des carcasses du canard de Barbarie. Deux générations différentes(génération témoin, N - génération expérimentale. N+3 ou N+4) d'une même souche lourde ont été éleveesdans les mêmes condiûons et nous avons comparé les performances de croissance, les caractéristiques decarcasse et la composition biochimique des filets.
Abstract
Effects of selection on meat yield and fatness in Muscovy ducks :direct comparison between two different generations
Two experiments were undertaken to analyse the effects of selection for lowering carcass fatness and improvingmeat yield of Muscovy ducks. Two different generations (control generation, N - experimental generation, N+3or N+4) of a same heavy line were reared in the same conditons and we compared growth performances,carcass characteristics and biochemical composition of breasts.
Introduction
La France est le premier producteur europeen deviande de canard (177 500 toûles en 1995) dontI'essentiel provient de l'élevage du canard deBarbarie. Pour cette espèce, la sélection a porté enpriorité sur I'augmentaûon du poids à I'abatttage, durendement en viande et sur la diminution del'engraissement des carcasses. Dans la sociétéGnmaud Frères, cette sélection est basée surl'analyse directe de la composiûon anatomique aprèsdissection de collatéraux (Retailleau, 1986). Engénéral, les études de selectron cornparent desrésultats obtenus avec différentes lignees élwees enmême temps et dans les mêmes conditions. Parcontre, au sein d'une même lignee, les comparaisonssont effectuês avec les résultats de chaquegénération. Mais, dans ce cas, les performances desanimaux sont influencês par les facteursenvironnementaux (saison, temSrature, lumière, ...).Aussi, pour eviter ces effets, nous avons réalisé deuxexpériences comparant derx génératons différentes(N - N+3 et N - N+4) de la même lignee et élwêsdans les mêmes conditons. Nous avons donc analyseles effets de la sélection sur les performances decroissance et les caractéristiques de carcasse après 3et 4 génératons.
Matériels et méthodes
La sociéæ Grimaud a selectionné une souche lourdede canard de Baôarie sur un rendement élelvé en
viande et un faible engraissement des carcasses. Læscritères de selection sont : le poids vifà I'abattage, lepoids et la proportion de filets avec ou sans peaq decuisses + pilons et de gras aMominal. Cette selectiona cessé I'annee N pour un goupe de familles(génération témoin) qui a été maintenu au mêmeniveau de performances jusqu'en N+4. Les critères desélection ont été appliques normalement, chaqueannée, aux autres familles. Nous avons réalisé deuxexpériences : I'expérience I qui a permis lacornparaison des générations N et N+3 etl'expérience 2, une annee plus tard, qui a permis lacomparaison des génératons N et N+4. Pour chaqueexpérience, 96 canards de Barbarie rnâles répartis endeux lots (ot N et lot N+3 ou N+4) ont éte élevés surcaillebots intégral (12 h de lumière/jour ; 5 lux ;20"C>. Chaque lot comprenait 6 parquets de 8canards qui ont consommé de I'aliment croissance de0 à 8 semaines (12,46 MJ EIvI/kg et 187,5 g PB/kg) etde l'aliment finition de 8 à 12 semaines (13,01 MIEN{/lcg et 168,9 g PB/kg).
Tous les canetons ont été peses à l'âge de 1,2,4,8,l0 et 12 semaines. La consommation alimentaire etI'indice de consommation ont été mesures parparquet. A 12 semaines,20 canetons par lot ont étéabatnrs et dissequés (Ricard, 1987). Nous avons peséles cuisses + pilons, les filets avec ou sans peau et legras abdominal.
Deuxiàrnes loarnées dc b Recherche Avîcolc, Tours, &10 avrûl 1997
Sur un échantillon de filet, nous avons mesuré lateneur en eau (AOAC, 1984), en protéines (Kjedhal ;AOAC, 1984) et en lipides @olch et al. 1957). Lesclasses de lipides ont été déterminees au Iatroscan(TLC-FID) selon la méthode de Christie et Hunrer(re7e).
Les résultats ont été comparés par analyse devariance. Pour les courbes de croissance, nous avonsutlisé le modèle de Gompertz. Nous avons réaliséune analyse de covariance entre la compositionanatomique et le poids vif à I'abattage.
Résultats et discussion
Les performances de croissance sont présentées dansles TABLEAUX I et 2. Les générations N+3 et N+4ont un poids vif significativement plus élevé à partirde l'âge de 8 ou 4 semaines respecûvement.L'utilisation du modèle de Gompertz confirme cerésultat. Mais, l'âge au point d'inllexion de la courbede croissance est plus tardif pour les générationssélecûonnées : * 1,3 et + 1,8 jours. Leclercq et al.(1989) ont observé le même phénomène chez deslignées de poulets sélectionnées de façon divergentesur la quantitié de gras abdominal dans la carcasse.La vitesse de croissance était plus lente pour la lignéemaigre. La sélection a amélioré également l'indice deconsommaton. Pour la première expérience. cetteamélioration a porté sur les periodes 4-8, 10-12 et 0-12 semaines. Pour la deuxrème expérience, seule lapériode l0-L2 semaines était concernée. Lescaractéristiques de carcasses sont reportées dans letableau 3. Le poids et la proportion de filets avec ousans peau, de cuisses + pilons et de peau des filetssont plus élevés pour les canetons de la générationN+3 par comparaison avec ceux de la génération N.Pour la génératon N+4, seul le poids des morceauxpré-cités et le rendement en cuisses + pilons sont plusimportants. Nous avons obtenu des corrélationspositives élevees entre I'engraissement, le poids descuisses + pilons et le poids à l'abattage(TABLEAU 3). L'analyse de covariance a mis enevidence un effet significatrf de la selecûon sur legras aMominal, les cuisses + pilons et les filets sanspeau. Dans la bibliographie, les travaux realisés enselection concernent plutôt le canard Pékin. Pingel etHeimpold (1983) ont selectionné des canards de cetteespece sur 7 générations pour un poids vif élevé etune épaisseur de filets accrue. A l'âge de 8 semaines,I'augmentaton du poids vif était ds + 18,2 o/o, cellesde l'épaisseur et du rendement en filet de + 17,2 o et+ 9,4 o respectivement. L'analyse de la composiûonbiochimique des filets (TABLEAU 4) est proche decelle retrouvee dâns la littérature @aézz, 1995). Lesteneurs en eau, protéines et lipides sont généralement
comprises entre 74 et76,6 Vo; 19,5 et23,3 o/o; 1,5 et2,5 % respectivement. Par comparaison avec le filetde poulet (1 à 1,5 % de lipides selon Gandemer etKim, 1993), le filet de canard de Baôarie est plusgras. Les lipides de stnrcture, phospholipides etcholestérol représentent un part importante (environ68 '/ù. Dans notre étude, la sélection contreI'engraissement a induit une diminution de la teneuren lipides ; en particulier de la teneur en triglycérides(- 14 à - 15'/ù et en phospholipides G 9 à - 2.2 %\Powell (1992) a déjà observé chez des canards Pékinssélectionnés contre l'engraissement une diminutronde la teneur en lipides intramusculaires.
Conclusions
Après 3 et 4 générations, la sélection a induit uneaugmentation du poids vif (+ 8 à + l0 %o à l'àged'abattage), une dimrnution du pourcentage de grasabdominal C l0 W et une amélioration durendement en filet 1+ 3 à + 7 yù et en cuisses +pilons (+ 4 %1. La teneur en lipides des filets adiminué (- 14 à - 20 %) et cela concerne à la fois lesphospholipides et les triglycérides.
Remerciements
Nous remercions le Ministère de la Recherche et dela Technologie pour son soutien financier et la S. A.Grimaud Frères pour la fourniture des canetons et sacollaboration technique (H. Raud, B. Retailleau).
Références
AOAC, 1984. Offrcial methods of analysis, l4th edn.(Arlington, VA, Association of Official Chemists).Christie W.W., Hunter M.L.. 1979. J. Chromatogr..17l , 517-518BaézaE., 1995. INRA Prod. Anim.. 8. I 17-125Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H.. 1957. J. Biol.Chem.. 226- 497-509Gandemer G., Kim E.K., 1993. In : Proceedings I lthEuropean Symposium on Poultry Meat Quality(Tours, France, WPSA), pp.Il9-127Leclercq B., Guy G., Rudeaux F., 1989. Gén. Sé1.Evol., 21,69-80Pingel H., Heimpold M., 1983. Arch. Tierz., 26, 435-444Powell 1.C., 1992. In : Proceedings lfth WorldPoultry Congress (Arnsterdam, Netherlands, WPSA),pp. 106-108Retailleau B., 1986. In : Acquisitons récentesintéressant la production et la commercialisation ducanard, (WPSA, French group edit.), pp. 17-23Ricard F.H., 1987. Ann. de Zootech., 36, 109-120
TABLEAU I : Performances de croissance de deux générations de sélection d'une souche lourde de canard deBarbarie (moyenne + ecart-type)
Expérience 1 Expérience 2
Générations
Poids vif (g)(n = 48)
I semaine2 semaines4 semaines8 semaines10 semainesl2 semainesIndice de
consommation( n = 6 )
24 semaines4-8 semaines8-10 semaines10-12 semaines0-12 semaines
l0 l + 14288+ 42
1 1 5 7 + 1 3 33538 + 293*4350 + 369*4607 + 436*
1,72 + 0,082,56 + 0,06*3,89 + 0.189,70 + 1,89*2,99 + 0,04*
N+3
9 5 + t 2282 + 36
tt44 + lo23789 + 2654735 + 2785075 + 324
l,1t + 0.022,34 + O,l33,67 + 0,247.80 + 0.542,84 + 0,10
1 3 3 + l 5 *289 + 34
1220 + IO4*3705 + 368*4585 + 417*4734 + 504*
l ,6l + 0,032.38 + 0 .1 I4 .18 + 0 ,51
13,36 + 3,52*2,86 + 0,13
122 + 12292 + 2l
126l + 973936 + 2524801 + 4585123 + 526
1,59 + 0.042.4 t + O. l24-20 + 0.209.t2 + 2.O12,87 + 0 .11
N
* : moyennes, pour un critère donné et une même expérience, significatvement différentes (P < 0,05)
TABLEAU 2 : Caractéristiques de croissance de deux générations de selection d'une souche lourde de canardde Barbarie estimées avec le modèle de Gompertz (n =20) (moyenne + écart-type)
Expérience I
N N+3
Expérience 2
N
5184 + 601*
34,6 + 2,0
Générations
Poids adultemaximum (P-*) (g)
Age au pointd'inflexion de la
courbe (h^J (ours)Constante pConstante D
5162 + 369*
35,4 + 2,5r
57tl + 314
37,2 + 2,3
N+4
5968 + 741
35,9 + 3,0
0,3157 + 0,0682 0,3312 + 0,06330,0512 + 0,0059 0,0505 + 0,0051
0,3020 + 0,0590 0,3117 + 0, l13l0,0512 + 0,0052 0,0504 + 0,0085
* : moyennes, pour un critère donné et une même expérience, significativement difrérentes (P < 0,05)
Modèle de Gompertz : P : Pq * EXP (tr (1 - E)G C D * 0) / D)p et D sont des constantes. P0 = poids à I'eclosion. p = poids à l'âge de tjours.Pmo = Ps * EXP (F/D) - h,*= (LOG (F/D))iD
TABLEAU 3 : Caractéristques de carcasse et corrélations avec le poids vif à 12 semaines de deux génératonsde sélection d'une souche lourde de canard de Barbarie (n = 20) (moyenne t écart-typ€) (corÉlation)
Générations
Poids vif à 12 semaines (g)
Gras abdominal (g)
Gras abdominal (%o)"
Filets avec peau (g)
Filets avec peau (%) u
Filets sans peau (g)
Filets sans peau (o%) u
Cuisses + pilons (g)
Cuisses + pilons (%) '
Peau des filets (g)
Peau des filets (%) o
Expérience 2
N N+4
4754+457* 5407+400
148,1 + 49,4 153,1 + 56,6(0,56) (0,70)
3,09 + 0,86 2,79 + 0,91(0J3) (0,71)
863,4+96,3 * 1004,6+ 104,8(0,91) (0,97)
18,15 + 0,82 18,57 + 1,22(0,13) (0,92)
64I,2 + 66,6* 154,0 +76,1(0,79) (0,93)
13,50 + 0,87 13,97 + 1,30(-0,21) (0,84)
807,6+83,3 * 955,8+77,6(0,87) (0,99)
17,00+0,90 * I7 ,68+0,74(4,10) (0,95)
222,2 + 41,4 250,6 + 49,6(0,85) (0,90)
4,65 + 0,54 4,60 + 0,60(0,53) (0,95)
Expérience I
N
4676 + 243 *
146,4 + 27,4(0,74)
3.12 + 0,47(0,58)
826.0 + 57.4 *(0,80)
17,66 + 0,75 *(0,06)
615,0 + 36.5 *(0,82)
13.15 + 0 ,45 *(-0,10)
841.7 + 66.5 *(0,71)
18.00 + 1.02 *(0,08)
2t1.0 + 25.4 *(0,62)
4.51 + 0.44 *(0,21)
N+3
5 1 1 9 + 1 5 0
144,3 + 29,8(055)
2,81 + 0,54(044)
974.4 + 66,I(0,09)
19,05 + 1,35(4J2)
718,9 + 66,9({,02)
14,06 + 1,39(-0,32)
960,0 + 57,8(0,66)
18,75 + 0,87(02r)
255,5 + 36,1(0,21)
4,99 + 0,69(0,02)
* : moyennes, pour un critère donné et une même expérience. significativement différentes (P < 0,05)
a : pourcentages par rapport au poids vifà I'abattage
TABLEAU 4 : Analyse biochimique des filets (/kg) de deux générations de selection d'une souche lourde decanard de Barbarie (n = 20) (moyenne t ecart-type)
Expérience I Expérience 2
Générations
Ë"rtProtéinesLipidesCholestérol estérifiéCholestérol libreAcides gras libresTriglycéridesPhospholipides
N
760,9 + 6,50210,7 + 6,80
19,1 + 4,50 *0,04 + 0,080,64 + 0,180,16 + 0 ,156,08 + 4,41
12,57 + 2,I3 *
N+3
762,5 + 7,8o210,2 + 5,40
15,3 + 3,200,02 + 0,020,64 + O,L40,14 + 0,055,19 + 2 ,3 t9,80 + 2,L4
N
753,8 + 7,90 *221,0 + 1,ffi22,1 + 5,L0 *
0,15 + 0,100,86 + 0,230,21 + 0 ,136,90 + 4,90
13,65 + l ,E7
N+4
761,I + 9,20217,8 + 8,30
19,1 + 3,300,13 + 0,060,84 + 0,230,19 + 0,145,95 + 3 ,13
12,38 + l ,8l
* : moyennes, pour un critère donné et une même expérience, significativement différentes (P < 0,05)
ET'FET DU SE)(E SUR II\ CROISSANCE OSSEUSE DU FOULET DE CIIAIR
Letemier Christine, Rose Nicolas, Constantin Paul
I.N.R.A., Station de Recherches Avicoles, 37380 Nouzitly, France
Résumé
I-a croissance osseuse du cortex osseu:( du tibiotase a été étudiée chez des porlets de chair de 0 à 42 jours. Cettecroissarce est ûès diftrenæ chez les mâle.s et les ferelles. Chez les femelles, la finesse de la diaphyse estcont6alanéepardes modifications de la coryosition osseuse et de la stnrctue hisùologi$e du cortex, ce quicoduit à des propnétes mécâniques similaires de.s tibiotarses chez les enimau:r des deux sexæ.
Abstract
Sex differences in bone growth of broiler chickensThe growth of cortical bone is very different in male and female broiler chickens. In female broilers, the thinnessof the tibial diaphysis is counterùalanced by modifications in the coryosition of the bone mtrix and in theporosity of the cortex, leading to equal biomechanical characteristics of tibiotarsi in both sexes.
Bien que les femelles aient souvent un squelette plusléger que celui des mâles,les femelles des poulets &chair soil moins sensibles aux déformations osseusesque les mâles (Iæterrier & Nys, l99|2L). Afin de mieuxcoryredæ ce pradoxe, nous avons coryu,é lacroissarce du cortex osseux chez des poul€ts de chairmâles et femelles.
Matériels et Méthodes
270 poulets de chair mâles et l8l femelles sont élevésau sol jusqu'à 42 jours.avec I'aliment suivant :l33lMJ.EM lke; 23 A%CE l,l6%Cu 0,45% Rtisp.;CaIÈ258. Leprogramre lumineux ex',tdez3UlD etladensitéestde 18 kgnz à 5 semaines. 15 nnimquxde cha4rc ssre, lnns déformation os{prxre, sontprélevés à l,12,26 et 4Zjorus. Iæs tibiotarses droitssont amlysés pr des techniqueshistomorphométriques. Iæs tibiotarses gauches sontsoumis à un test de flexion et minératisés pornconmîte lern pûucemage decendres.
Résultats
La qtantié de tissu osseux du tibiotarse (poids,volure; Tableau l; diamètres de la diaphyse, srrûceôr coræx) est inftieurc cbs les ferelles Letibiot$e d€wieÉ significativeænt phrs cornt chez lesfeælles à 42 jours seulffi. læs diffiæ auniveaudupoidsettrolre du tibir sod arylifié€sà 42 jors égdcænt, alcs que l,es sectiom
Eanwersales sont plus petit€s chez les feælles èl'éclosion En con@uence, les tibiotarses sont plusfins chez les femelles.Le pornce,mage de matiàe sèche du tibia et leporrc€ûagp & cedes (cendrcs/n*iùe sècb) sonplus élwés chez les femelles (Tableau 2).A partir de 12 jons, le cortex di@ysaire du tibioesedes femelles est moins pûeux (Tableau 3). La vit€.ssed'apposition minérale est égÊl€med s@ieure chezles femelles jusquh 26 jours, mais devien stpériarechez les mÂles à 42 jours (Tabteau 3).Iâ rigidité de la diaphyse Ësurée lors du test deflexion" s'arràe égale.lçns les deux sexes tûrt au longde la croissance Clableau 3).
Discussion-Conclusion
La cfoissance du cutex osseux est tnès différrenûe cbezles poulets de chair mâlæ et femelles. Chez lesfemelles, la diaphyse est plus fine nnis le ooræxosseux a urepmosité É&ite€û lr mtrice osseuse estmieux minÉralisée. II en ésulte q,t'à ôge égrl, lesprqriéÉs mécaniqræs des tibiotrss sont égales daosles deux sexes. Ces observatiom perffiteNltd'eryliquer en prtie la mrndle pÉdisposition d€sferellesaux déMions osseuses (Leterrier & Nys,1992a'). Chez les mâles, plus lourds (fableau l), lestibiotrses soû satrs &ute plus sollicitésmécaniqrrmed- Fr cméçær, la diryhyse osseusefléchixr d&'aûgp que cùez les feælles fisste l8rigidié diryhysdrc n'es p.sEoryho$nèse de I'c esl d@daæ de cæ micrcdéfqnatios de ta diaphyse (Rubin et 81., 1995), h
Deuxiùnes .Iutnées dc Ia Reùerdp Avirrilc, Toun, &10 avril 1997
TABLEAU I : Poids vif et caractéristiques no'rphologiques ôr tibiotrse
Titriotarces
Aæ(D Sexe
1MF
L2MF
26MF
42MF
ProbabilitéageSexeAge I Scxe
Age() So(e
1 MF
T 2 MF
2 5 MF
4 2 MF
ProbabilitéageSexeAge t Sexe
ProbabilitéageSexeAge . Sexe
Foids vif (g)
46,ùt3,045,ûj1,0283t20267t3o1039j80a*vtTtxb216&Eqrl902rElb
<0,001<0,001<0,001
Matiàesèche(%\
22,9ÈLPa25,1tl,Ob30,5t05a31,8t0,9b362t0,836,9t1,136,7fr9a37,gtl,lb
<0,001<0,0010,017
Poids (g)
0,3510,02034*0,032,8fr,32,6fl295f't2a8,71O,4b19,6129a15,ùt1,0b
<0,(x)1<0,001<0,001
3,9t:12^4,7tt5b39xrPt4,311,4b4,4ttJt3,9t1,3b
0,u20,016<0,001
0,35t0,010351f,012,4fr,222fr,28,0t1,27,4fr416,6ùl5a12,sfr,7b
<0,001<0,001<0,001
32,1fr,932,5+-t,154,312,156,2t1,881,81s,9E5,0È1,01145t1,9a109,0t3,3b
<0,001<0,001<0,001
Voluæ(cm3) Iongueur(nm)
(r.): I-es let6as signent une différence sipificative entre moyennes de la dme Eanche d'âge (p<0O5)
TABLEAU 2 : Coryosition et densité minÉrale des tibiotarses
Cendres/P.sec(%)
215X3,821,9t3,840,6ûO,8a42,7tr,4b44,110,845,OtI,645,4*'1,3t46,9t1,2b
Densité minérale(Cedres/vol vre,mgl cfr3)
1,00to,0Eo,9610,07I,18t0,05a1,171o,04b1,1910,03I,l7lo,031,18f0,05al2ûto,03b
<0,001<0,001NS
<0,0010,004NS
TABLEAU 3 : Caractéristiques histomorphffiiques e biomécaniques du cortex tibial
Aæ(i) Sexe Vitessed'çGition RigidiÉminérale (Udj) N/m)
1 2 MF
2 6 MF
4 2 MF
Forositéooticale(%)
t6,0t3JaB2r22b12,4+.4,18,8t2,39,8t2,8a7,*p,Ob
<0,001<0,001NS
50r55lr5tt2+16l04rl613cil0t33+,t2
<0,001NSNS
t0
diAhyse des dles aura donc davatage t€rrlare àpésffi des défuoations pathologiqm. Cesdifférences sont égalemt celles qræ I'on rpfioweeûÊ poul€ts de chair à croissance lede €û poulets àcloissare rapide (Leterrier & Nys, l99b).Ce dimorphisme *xuel de la crcissarce osseuse estégalement présente chez le nt (Lruyo'n, 1996). Soncigire Éessite ffi€ de nombreuses imrestigations,enputiailierdansle cas prése'nt où les enimeu:r sofllSeXrællemed immntrrnes, CgtAfueûpd .uX mtséûdiés jusqu'ici, chez qur I'inÉaction €nfiesollicitations mécaniquÊs et stéroides sexuels estdéterminame (-anyon, 1996).
Références bibliographiques
Lanyon LE. 1996. Bone, l8(1): 37S43S.Iæterrier C., Nys Y. lW?a. Avian Parhol., 2I, 09-u2.Leterier C., Nys Y.1992b. Brit. Poult. 5c.,33,125'939.Rose N., Constamin P., l-eûemier C. 196. Grou/lù,Dwtr & Agng, @,49-59.Rubin C.T., Cross, T.S, Mcleod" KJ. & Baln, S.D.1995. J. Bone Min Res., 10,488495.
l l
ANALYSE GENETIQUE DE LA FERTILITE ETDE L'ECLOSABILITE CIilEZ LA POULE PONDEUSE
Besbès Badi. Protais Michel
Insûtut de Sélection Animale. B P 27. 35220 Châteaubours
Résumé
La fertilité et l'éclosabilité, exprimées en pourcentage d'æufs fertiles ou éclos, sont généralement considéréescornme des caractères 'repro' mâle, pour le premier, et femelle. pour le second. Cette approche négligeI'interaction entre les gamètes mâles et femelles pour produire un zygote viable et le potentiel de celui-ci à sedévelopper. Nous proposons une nouvelle approche d'analyse qui les traite comme des caractères de I'embryonavec une composante maternelle Cette approche utilise I'informaûon de base qui est de nature binaire grâce àI'emploi du modèle à seurls Une application sur des données de ponte est présentée
Abstract
Genetic analysis of fertility and hatchability in laying hens
Fertility and hatchability. expressed in percent of fertile or hatched eggs. are generally considered as traits ofthe parents. This approach ignors the interaction of a male and a female gamete to produce a viable zygote andthe potential of the latter to develop. We propose a new approach that considers these traits as traits of theembryo with maternal effect. Tlus approach uses a binary type informaûon. based on the threshold model. Anapplicaûon to laying hens data is presented
Introduction
L'objectrf de la sélection ponte est de produire desæufs de qualité au moindre coût. Plusieurs critèressont donc considérés. Les plus importants sont: laproductvité numérique, le poids de l'æuf, lasolidité de la coquille, I'indice de consommation.Mais, le succès d'une souche dépend aussi desniveaux de fertilité et d'éclosabilité, notammentchez les parentales et grand-parentales. Malgréleur importance, ces caractères de "fitness" ont étépeu étudiés et les esûmaûons de leurs paramètresgénéûques sont plutôt rares. Ceci s'explique par:
l. Une complexité génétique
La fertilité est étudiee essentiellement pouraméliorer le comportement sexuel des coqs. Pourles poules, I'analyse de la fertilité doit tenir comptede l'interacton entre les gamètes mâles et femellespour produire un zygote viable. L'eclosabilité, oudéveloppement de ce zygole, est un caractère deI'embryon avec une forte composante maternelle(Gowe et al., 1993).
Les effets de la consanguimté et du croisement surces deux caractères sont bien conmrs par lesselectionneurs et indiquent vraisemblablement uneffet de dominance non négligeable. Enfin, desgènes majeurs affeaant ces caractères ont étéreportés par Mérat (1990) et Froman et al. (1992).
2. Une complexité statistique
La donnée de base est de nature binaire mais leplus souvent, on uûlise le pourcentage d'ceufsfertiles ou éclos dont la distribution est fortemenldissymétrique. Dals les deux cas. les méthodesd'évaluation et d'estimation des paramètresgénétiques basées sur le modèle linéaire gaussienpeuvent être baisees.
Nous proposons d'estimer les paramètresgénétiques de la fertilité et de l'éclosabilité à I'aidedu modèle à seuils appliqué au.x données binaires.Pour ce faire. deux modèles d'analyse sont testés.Nous discuterons ensuite l'intérêt de cette approchepar rapport à la méthode classique basée surI'utilisation du modèle linéaire et des donnéesexprimées en pourcentage.
Materiel et méthodes
Données
Les données de 7 gén&ations ont été utilisees. soitau total L29450 æufs mis en incubation. issus de2400 mères et 520 pères, et réparties sur 100 lotsd'eclosion.La fertilité et I'eclosabilité sont traitees comme descaractères "tout-ou-rien"; les deux catégories dereponse sont fertile vs non fertile et éclos vs nonéclos. On defrnit cornme non fertile tout æuf clair à
l 3Deuxièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, E-10 avrtl D97
l8 jours d'incubation. Il s'agit donc d'une infertilitéapparente car elle inclut la mortalité embryonnaireprécoce. Pour l'éclosabilité. on ne considère que lesæufs mis en éclosoir. donc fertiles.
Modèles d'analyse
Le concept du modèle à seuils est très simple: onsuppose que la réponse observée. æuféclos (fertile)ou non. dépend d'une variable sous-jacentecontinue- distribuée selon une loi normale et murued'un seuil: selon la valeur de la variable sous-iacente par rapport au seuil. la réponse observéeappartient à l'une ou à I'autre des catégories. Deuxmodèles de complexité croissante ont été utiliséspour décrire la variable sous-jacente v.
Modèle I
Modèle IIYijl = xljlp + si + tj + eiil
)'iikr = \ iktfl
+ $ + tj +djk + Eiikr
R est le vecteur des effets fixes lot d'éclosion dupoussin et âge de la mère. Ce dernier a 2 nireauxet permet de corriger I'effet de l'âge de la poule surla qualité de l'æuf (poids. coquille. etc...) et parconséquent sur la fertilité et l'éclosabilitéq est l'effet aléatoire du père du poussin ou "coq de
sef ice" tel que s:{ s; = }O., }- N(o, lo ? ) .
t; est l'effet aléatoire du grand-pere maternel dupoussin ou "père de poule" tel que 1={tj:
I R.,, + je-1 )-N( o,,1, o. | ) et cov(s. t'): Ao ,1 .
diç est l'effet aléatoire de la poule k intra père i telque r l= {$1 : ( *e .u - iA" i ) + (A- r - }A- i ) *
ep) - N (0.Iol). en est l'effet d'environnement
permanent affectant les performances successivesd'une poule. Les deux premiers termes de dlg sontles pans des effets directs et maternels transmis parla mère non expliqués par I'effet grand-pèremâternel.
A est la matrice de parenté entre mâles. o?, o?
ol sont les variances relatives aux effets s;. ti et
d;g et ost la covariance entre les effets "coq deservice" et "père de poule" d'un même rn"'âle. Cescomposantes sont estimees par la méthode demaximum de waisemblance marginale. Leprogmrnme GFCAT (Manfredi, 1990) est utilisé.
L'effet coq de service représente à la fois un effetpaternel et un effet embryonnaire alors que legrand-pere maternel désigne l'effet des gènes de lapoule transmis à I'embryon (effet direct) et l'effetdes gènes de la poule conditonnant la qualité del'æuf (effet maternel). L'effet mère traduit lephénomène de repétabilité.
Paramètres génâiques à eûimer
Avec le modèle à seuils, les paramètres génétquessont exprimés dans I'unité d'écart-type résiduel dumodèle considéré et sont donc non comparables.Pour pouvoir les comparer, on les exprime dansl'unité du modèle le plus complet (modèle II). Cesmodèles permettent d'estimer les (co)variances des
effets généûque additif direct et maternel (oI".
o2o-, oAom ). De plus,
d'estimer la variancepermanent maternel olp .
Les héritabilités directe
Le modèle II permet
de I'environnement
et maternelle et larépétabilité I'echelle observee
sont obtenues selon la( h;1,,. ,1 ' hi, 10. ,1 "[,,. r]
)
relation de Dempster et Lerner (1950).
Résultats
Comparaison entre les modèles d'analyse
L'introduction de l'effet mère dans le modèle aentraîné une baisse sensible de la composantegrand-père maternel. surtout pour la fenilité. Ceteffet mère s'avère une sortrce de variationimportante (tableau l). Les variances totales étantsimilarres pour les deux modèles, il apparaîtclairement que le modèle II explique mieux lavariabilité génétique de ces caractères. Parconséquent. seuls les résultats correspondant à cemodèle seront présentés par la suite.
TABLEAU 1: Les composantes de la variancerelatives aux deux modèles d'analyse I et II.
Caractère o3 ost ol c! ol
Fertilité 0.29 0,04 0,17(0,33) (0,04) (0,1e)
t.46
0,27 0,04 0,33 1,64
Eclosabilité I 0,04 0,01 o,o7(0,04) (o,01) (0.07)
II 0.02 0.00 0.03 0,13 l.L1
Les paramèhes en caractères italiques sont exprimés enunité d'ecart-type résiduel du modèle II alors que lesparamètres en caractères standards sont exprimés enunité d'écart-t)?e résiduel du modèle correspondant
Estimation des paramètres génétiques
Le tableau 2 montre que les héritabilités sontnettement plus élevees sur I'echelle sous-jacente.Sur l'echelle observée, ces héritabilités sontcomprises entre 2 et 27Yo et se trowent dans lagaflrme des valeurs déjà publiees (Kinney. 1969;Liljedahl et al., 19791' Chaudhaury et al., 1984).
I , l l
Cependant, contrairement à ces dernières, lafertilité apparaît nettement plus héritable queI'eclosabilité.
Ce tableau montre également un effet maternel nonnégligeable, mais surtout une forte répetabilité qui,dans le cas de l'éclosabilité, compense la faiblehéritabilité. Plusieurs auteurs ont fait allusion à laprésence d'effet maternel pour ces caractères mais.à notre connaissance. ce dernier n'a jamais étéestimé.
TABLEAU 2: paramètres génétiques esûmés surl'échelle sous-iacente et l'échelle observée
Paramètres Caractèresgénétques Fertilité Eclosabilité
fréquence et la variance (Gianola, 1982; Foulley etal., 1990), d'où le recours au modèle à seuils(Gianola et Foulley, 1983).
Lorsque l'incidence du caractère est homogèneentre les différentes classes (combinaison des effetsfrxes) et voisine de 5O%",Ie modèle linéaire et lemodèle à seuils donnent des résultats similaires. Enrevanche, lorsque I'incidence est extrême (<0.20) etI'héritabilité observée est faible, comme c'est le casdans cette étude, le modèle à seuils doit être utilisé(Meijering et Gianola, 1985).L'effet mère représente une source de variatonimportante, son inclusion s'avère donc primordialepour une analyse adequate de la variabilitégénétrque Ce résultat est plus lié à la structure dela population avicole (grandes familles de pleinsfrères) qu'au caractère analysé. Le modèle retenu(II) permet de se rapprocher d'un modèle animalclassique en ce qui concerne la structure deparenté, mais le dépasse par la prise en compted'une contribution asymétrique des deux parents(effets fætaux et maternels).
L'infertilité est l'échec de l'union des gamètesmâles et femelles. Comme les poules sontreproduites par insemination artificielle, I'infertilitéest attribuée à 1) une mauvaise qualité du sperme,2) une mortalité ernbryonnaire précoce (effetdirect) etlou 3) une mauvaise qualité de l'æuf (effetmaternel). Or, le modèle génétique décrit cidessusne prend pas en compte la première composante, cequi explique la suresûmaûon de la variance père etpar voie de conséquence des paramètres génétiquesde la fertilité. Il faudrait donc soit mettre au pointun test de qualrté de sperme, soit réaliser un mirageen début d'incubation, le plus précocementpossible.
L'asymétrie de la distribution des soluûons deI'effet père ou "coq de service" (figure 2) confirmeI'idee que cette surestimation est due à un problèmede fertilité de certains coqs qui de surcroît sontapparentés enEe eux. Certains auteurs (Gowe etal., 1993, Frakham, 1990, Schmidt et al., 1994)attribuent cette asymétrie à la présence de gènesmajeurs récessifs, ségrégeant à une faible fréquenceet affectant négatvement ce câractère. Mais, laquasi-normalité des solutions de I'effet grand-perematernel d'une part et de celles de I'effet pere dansle cas de l'éclosabilité d'autre part, ne confirme pascene hypothèse.
Généralement, la selection pour la fertilité etl'éclosabilité est basee sur l'éliminaûon des famillesayant les plus mawaises performances. D'apres lesrapports publiés (Gowe et al., 1993, Frakham,1990, Schmidt et aI., 1994), cette approche permetde les maintenir à un niveau adequat sans réduirela pression de selection exercée sur les canctères
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Discussion
La plupart des estimations des paramètresgénétiques sont basées sur les hypothèsesclassiques et fondamentales de la génétiquequanûtative pour les caractères polygéniques àdéterminisme purement additif via un modèlelinéaire à erreur distribuee normalement. Or, cecin'est pas le cas des pourcentages d'æufs fertiles ouéclos (voir figurel). Afin de mieux les saûdaire. ona eu recours à des transformations de q'pe arcsin(Chaudhaury et al., 1984) ou box+ox (Beaumont,1992). Ces dernières ont permis de se rapprocherde la situaton normale mais sans modifier lesestimations des paramètres génétiques.De même, ces différentes analyses considèrent lafertilité et l'éclosabilité comme des caractères'repro', négligeant ainsi les effets de I'intéractionentre les gamètes nriâles et femelles ainsi que leseffas direcs et maternels qul conditionnentl'évoluûon de læuf en poussin. A notre avis, seulela donnee de base, de nahrre binails, permet dedissocier ces difrérents effets. Or, là aussi,I'applicaton de méthodes statstiques basees zur lemodèle lineaire telles que le BLUP ou le REML,pose des difficultés liees à la dépendanoe entre la
principaux. L'élimination des animaux situés enqueue de distribution en se basant non pas sur leurvaleur phénotypique mais sur leur index sous-jacent permetterait d'espérer un progrès génétiqueplus important grâce à une meilleure précision del'évaluation et donc une meilleure efficacité de lasélection
Conclusion
Les caractères de "fitness" (fertilité, éclosabilité)peuvent être améliorés par un choix adéquat desreproducteurs. L'approche proposée dans cetteétude permet de satisfaire les conditionsnécessaires pour réaliser un tel choix. D'un pointde rue génétique, l'hypothèse de normalité surl'échelle sous-jacente s'accorde bien avec celle d'undéterminisme polygénique, classiquement adoptéedans l'étude des caractères quanttatifs. Lesrésultats obtenus ne remettent pas en cause cettehypothèse.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier J.L. Foulley et EManfredi pour leur contribution dans la réalisationde cette étude.
Références
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F IG U R E I D i s t r i bu t i on de l a f ' e r t i l i t é e t del ' é c l o s a b i l i t é f e m e l l e s e x p r i m é e s e n
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RESISTANCE GENETIQUE A L'TNFECTION PAR LES SALMONELLES.
Beaumont Catherinet Berthelot F-lorence2, Colin Pierre3, Duchet-Suchaux Marion2,Elsen Jean-Michel4, Girard-Santosuosso Odile2, Guillot Jean-Françoiss, Lantier Frédéric2,
Protais Jocelyne3, et Pardon Pierre'.
tINRA, Station de Recherches Avicoles, 37380 Nouzilly, 2 Station de Pathologie Infectieuse et Immunologie,37380 Nouzilly, 3 CI.IEVA, Zoopô\e,22440 Ploûragan,' INRA, Station d'Amélioration Génétique des
Animaux, 31326 Castanet-Tolosan. 5 INRA, Station de Pathologie Aviaire et Parasitologie, 37380 Nouzilly,
Résumé
L'importance de la génétique dans la résistance du Poulet à la mortalité après infection par Salmonelln GallinarumPullorum ou par Salmonella Typhimurium a été démontrée il y a plusieurs années. Au moins un gène majeurde résistance serait impliqué, ce qui pourrait faciliter beaucoup la sélection. Mais actuellement il serait trèsimportant d'améliorer également la résistance vis-à-vis de l'infection par Salmonel/a Enteritidis, sérotyperesponsable de nombreuses contaminations humaines. Des resultas récents indiquent que la génétique intervient.Un marqueur ayant un effet significatif sur la résistance à treize semaines vis-à-vis de l'infection systémique aété identifié. De nombreux travaux restent à réaliser avant toute application mais l'ensemble des résultatspermettent d'envisager à terme une sélection des animaux pour la résistance vis-à-vis des salrnonelles.
Abstract
Genetic resistance to infection by Salmonella enteritidis in poultry.
The importance of genetics in resistance of poultry to mortality after infection by Salmonella galtinarum pullorumor by SalmoneUc typhimurium has been demonstrated several years ago. At least one major gene of resistancewould be involved which could facilitate the selection much. But at the present time, it would also be veryimportant to improve resistance to infection by Salmonella enteritidis (which is responsible for human toxi-infections). Recent results indicate that genetics is involved in resistance to systemic infection and to carrier-state.A significant effect of a marker gene on resistance to systemic infection at 13 weeks af age has been evidenced.Moré work is needed before practical applications but all these results suggest that a selection for increasedresistance to Salmonella could be envisiormed
Introduction
Les salmonelloses representent depuis toujours l'unedes principales causes de maladies et de mortalité desespèces avicoles, les sérotypes les plus pathogènesétant Salmonellc Gallinarum Pullorum et SalmonellaTyphimurium. L'idée d'augmenter la resistance desanimzg;1 à la mortalité est donc ancienne. Dès 1941,Hutt et Scholes monhent, daprès les résultaûsd'expérimentation "naturelle" que certaines souchesaviaires présentent un pourcentage de survie plusimportant. En 1988, Bumstead et Barrow comparentdans différentes lignées aviaires consanguines les tauxde mortaliæ après infection expérimentale de poussinsd'un jour par Salmorclla Typhimruium.Ils notent desdifférences notables. Mais selectionner sur laresistance soulève deux principales difficulte.s. Il fautdisposer d'installations expérimentales réservées àIinoculation de bactéries potentiellement pathogènes.ls5 animau( infectes pouvant contaminer les auEes,il est de plus necessaire de réaliser une sélection "surcollatéraux" en testant les frères et soeurs des
candidats à la reproduction. La selection pourrait doncêtre grandement facilitée si l'existence d'un ouplusieurs genes majeurs de resistance était démontrée.Dans ce cas il "suffirait" de retenir pour la selectionles animaux porteurs de l'allèle conférant cetteresistance. Ceci implique d'avoir identifié la mutationcausale responsable de la différence entre animaslsensibles et rcsistants. A défaut, il serait déjà très utilede disposer d'un marqueur de ce gène, c'est-à-dired'un locus tès proche et présentant un fortpolymophisme. Cela pennettrait de suiwe laségrégation des allèles du marqueur et d'en déduire(au taux de recombinaison près) celles des allèles dugène de resistance ; c'est la selection assistée parrnarqueur qui réduit voire annule le nombred'inoculations expérimentales nécessaires. Lescroisements enûe lignées sensibles et resistantesréalises par Bumstead et Banow (1988) suggèrentfortement lexistence d'un tel gène "majeur" deresistance expliquant une grande partie des différencesde mortalité observées enhe ces lignées.
Detuièmes Journées de Ia Recherche Avicole, Tours, 8-10 ortril 1997
2 l
Mais, depuis la fin des armées 80, ce sont lescontaminations des volailles par Salmonelro Enteritidisqui posent les problèmes les plus préoccupants carelles peuvent être à I'origine de toxi-infectionsalimentaires humaines parfois mortelles. Avec ceserotype l'infection dite "systémique" car propagée parle sang à tout l'organisme ne s'accompagne querarement de mortalité ; elle reste souventasymptomatique. Il est donc impossible de confondremortalité et infection systémique (mise en évidencepar la contamination des organes internes). Il fautégalement considérer les risques de portage desalmonelles darn les caeca. Ce portage peut en effetentraîner non seulement une contemination descarcasses (notâmment lors de l'éviscération) maiségalement des oeufs (par souillure de la coquille) ou,par voie réÉograde, des ovaires. Il peut de pluspersister sans contamination systémique (Duchet-Suchaux et al., 1995). Rien ne perrnet actuellementd'affirmer qr/augmenter la résistance à la mortalité ouà l'infection systémique réduira le portage, d'oùïintérêt de la prise en compte simultanée de ces troisaspects. Plusieurs études conjointes de la résistanceaux Salmonelles ont été menées récemment : cetteprésentation en fait la synthèse.
1. Résistance à la morlalité de poussins d'unjour.
Les premiers résultats de Bumstead et Barrow (1988)avaient été obtenus en inoculant Salmonellatyphimurium à des poussins d'un jour appartenant àdes lignées consanguines. En 1993, les mêmes auteusinoculent lenrs lignées avec Salmonella Typhimurium,Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum ouSalmonella Enteritidis. La sensibilité des lignées variepeu avec le sérovar inoculé ce qui suggère lapossiblité d'augmenter la résistance vis-à-vis del'ensemble de ces Saknonelles. Avec le même testd'inoculation et en utilisant Salmonella Enteritidis,Guillot et al. (1995) mettent en évidence desdifférences de sensibilité entre lignées nonconsanguines. Lhéritabilité de ce caractère, estiméedans la lignée L2, la plus sensible, apparaît trèsélevée : 0.34 +l- 0.1 (Beaumont et al., 1997). Cetteforte valeur montre qu'il serait possible d'améliorer,par sélection, la résistance à la mortalité apresinoculation de poussins d'un jour. Elle est tout-à-faitcompatible avec la présence d'un gène majeursegrégeant dens cette lignée ; identifier ce gène et sesallèles sensibles et résistants faciliterait beaucoup lasélection.Or chez la Souris (dont la génétique moléculaire estparticulièrement bien connue), plusieurs gènes derésistance aux Salmonelles ont été identifies etcertains clones. Tel est le cas du gène dit Ity carresponsable de Ïlnfection à Salmonella tlphimurium(Plant et Glynn, 1976) qui détermine notamment lenombre de Satnonelles retrouvées dans la rate aprèsune injection intraveineuse. Un gene candidat, ditNramp, a été cloné chez la Soruis (Vidal et al., 1993)puis chez le Poulet (Hu et al., 1996). Mais lepolymorphisme de ce gène n'explique qu'une faiblepartie des différences entre lignées observées par
Bumstead et Barrow en 1988 (Barrow et Bumstead,1996). D'autres gènes doivent intervenir ; ilspourraient être identifiés en testant les différents gènesde résistance identifiés chez la Souris. Une auhe voiede recherches consisterait à les localiser sur lecroisement réalisé par Bumstead et Barrow (1988) àI'aide des marqueurs déjà identifiés sur la cartegénique de la Poule (Burt et al., 1995).
2. Résistance au portage dans les caeca chez lejeune
Duchet-Suchaux et al. (1995a) ont mis au point unmodèle d'étude du portage dans les caeca dans lequelils inoculent oralement des poussins d'une semaine.Duchet-Suchaux et al. (1995b) comparent lesfréquences de portâge des lignées précédemmentétudiées par Guillot et al. (1995). Si les fréquences etniveaux de contamination des rates et foies sontsimilaires dans les quaûes lignées, des différencessignificatives sont observées au niveau des caeca.Selon ce demier critère, le classement des lignées estassez comparable à celui obtenu par Guillot et al.(1995). Lteritabilité de la resistance au portage caecala été estinée dans la lignée L2 ; elle estsignificativement supérieure à zéro (Berthelot et al.,1997). Ce résultat démontre une origine génétique dece caractère ainsi que la possibilité de sélectionnerpour cette résistance. Ce résultat acquis, il seraitmaintenant important d'identilier des gènes majeurs etleurs marqueurs. Un protocole de recherche de gènesmajeurs a été optimis$ dens ce but ; il permettraégalement de tester ltffet sur le portage des gènes derésistance déjà identifiés chez la Poule.Par ailleurs, des résultats préliminaires obtenus parBarrow et Bunstead (1996) suggèrent que, dans leurslignées, les gènes déterminant la resistance au portagecaecal diffàent de ceux responsables de la résistanceà la mortalité. Si tel était le cas la sélection pour l'undes caractères n'améliorerait pas le second.
3.Résistance à I'infection systémique de I'adulte.
La sensibilité des adultes diffère également selon leslignées. Lindell et al. (1994) comparent des Leghorncom-erciales de quatre origines différentes, lesinoculent oralement à 45 senaines et suiventl'infection pendant l0 semaines. Des différencessignificatives entre croisements commerciaux sontobservées pendant les 14 premiers jours pour lespourcentages de contamination des oeufs et pendantles 7 premiers pour les matières fécales. Aucunevariation par conEe n'est relevée au niveau desovahes, caeca ou organes systémiques (rate et foie).Protais et al. (1996) comparent les quatre lignéesprécédemment étudiees par Guillot et al. (1995). Ilsinoculent des poulettes au pic de ponte, les abattentquahe semaines plus tard et recherchent lesSalnonelles dans les rates, foies, caeca, intestins,ovaires, oviductes et oeufs. Ils observent que la lignéeL2 est la plus souvent et la plus fortementcontaminée. Dans ce cas aussi ltéritabilité estimee estélevee et superieure à 0.3 +l- 0.2 pour les fréquencesde contamination des rates et des caeca (Beaumont et
al., 1997). A nouveau, une sélection est réalisablemais disposer de marqueurs la simplifierait ; lesliaisons génétiques avec les sensibilité au portage et àl'infection systémique restent à estimer.Pour raccourcir la période d'élevage des poulettes etsurtout se rapprocher des modèles d'étude du gène Ityutilisés chez la Souris, Girard-Santosuosso et al.(1995) inoculent des animaux de heize semaines parvoie intra-veineuse (ce qui réduit les variations derésistance liées au passage de la barrière intestinale).En considérant les lignées précédemment étudiées parGuillot et al. (1995), ils observent une différencesignificative entre lignées pour les niveaux decontamination du foie trois jours après l'inoculation.A nouveau la lignée L2 apparaît sensible. Ilsretiennent donc ce mdèle d'inoculation et l'appliquentà la lignée L2 ; les niveaux de contamination desrates, foies et ovaires apparaissent héritables. De plusGirard-Santosuosso et al. (1996) ont identifié, sur legène Villine, un polymorphisme de restriction aprèsamplification génique. Ce gène, très proche du gèneIty (Hu et al, 1995), peut donc servir de marqueur dugène Ity. L'effet du polymorphisme sur le nombre deSalmonelles retrouvées dans la rate et le foie estsignificatif : le gène Nramp joue donc un rôle sur larésistance mesurée dans ce modèle d'inoculation. Ilconviendrait maintenant de déterminer s'il intervientégalement dans la résistance à la contamination desautres organes et en particulier de l'intestin et desoeufs.
Conclusions
L'ensemble de ces résultats démontrent que lagénétique intervient dans la capacité de la Poule àrésister à l'infection et au portage de Saknonelles. Sices résultats apparaissent prometteurs, beaucoup resteà faire avant toute application. Il reste à détenniner lesens (favorable ou non) des liaisons génétiques entreles différentes mesures de la résistance afin depréciser quel critère de selection pourrait être retenu.Il serait enfin nécessaire destimer les liaisons entre cecritère et les caractàes d'intérêt économique pourprévoir les conséquences de la prise en compte dansla sélection de la résistance aux SaLnonelles etprévenir tout effet indésirable.
Remerciements
Les auteurs ont bénéficié d'un soutien de la C.E.E.dans le cadre du contrat AIR 3-CT94-2433. llstiennent à remercier tous ceux qui ont rendu ce fravailpossible.
Références
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23
PEUT-ON SELECTIONNER DES SOUCHES RESISTANTES A LA CHALEUR ?
Beaumont Catheriner, Guillaumin Solanger, Geraert Pierre-Andrér et Leclercq BernardtrINRA-Station de Recherches Avicoles 37380 Nouzillv
Résumé
l52l descendants mâles issus de 247 familles ont été élevés de 4 à 6 semaines à22'C ou 32oC.l/ Les conélations génétiques entre les mesures réalisées à22 et 32oC sont de 0.73+/-0.12 pour les gains de poidset de 0.73+/-0.08 pour les indices de consommation. Les gènes agissant aux deux températures diffèrent peu.2/ L'héritabilité du gain de poids entre 4 et 6 semaines est très nettement plus faible à32'C qu'à22"C (0.06+/-0.03contre 0. l9+/-0.05) : sélectionner pour le poids vif serait beaucoup moins efficac e à 32" C qu'à 22'C.3/ Pour les indices de consommation, par contre, les héritabilités estimées dans les deux milieux sont voisines(0.24+ I -0.05 à 22" C, 0.29+/ -0.05 à 32 "C).Les résultats confortent, au moins dans les conditions étudiées. le mode de sélection actuel des souches indusrielles.
Abstract
Is it possible to select broilers for heat resistance?.
| 52 I male offpsring issued from 247 fanllies were reared from 4 to 6 weeks of age at 22"C or 32"C.l/ Genetic correlations between measures recorded at22"C and32"C were estimated at0.73+l-0.12 and 0.73 +/-0.08 for weight gain between 4 and 6 weeks of age and feed:gain ratio respectively. The genes which play a roleat the two temperatures are very similar.2/The heritability of weight gain from 4 to 6 weeks was much lower at 32"C than at22"C (0.06+/-0.03 versus0.19+/-0.05) : a selection for increased body weight willbe much less efficient at32'Cthanat22"C.3/ Heritabilities of the feed:gain ratio at the two temperatures were very close (0.24+/-0.05 at 22"C,0.29+l-0.05at32"C) .The results seem to justiff, at least in our experimental conditions, to select the broiler hnes at 22"C.
Introduction
Si la sélection avicole est réalisée dans des paystempérés, les lignées sont aussi utilisées dans les payschauds. Or la température élevée entraîne unediminution de la consommation alimentaire ainsi qu'unralentissement de la croissance et par suite uneaugmentation très nette de I'indice de consommation(Geraert et al., 1996). Cahaner et Leenstra (1992)comparent plusieurs souches dont la vitesse decroissance et I'efficacité alimentaire diftrent ; ils notentque les effets de la chaleur apparaissent d'autant plusmarqués que la vitesse de croissance potentielle est plusrapide. Par contre sélectionner pour I'effrcacitéalimentaire et conte le pourcentage de gras abdominaldiminuerait la sensibilité à la chaleur (Cahaner etLeenstra, 1992 ; Geraert et al., 1993). La sélectioncommerciale portant actuellement sur ces troiscaractères, un risque d'aggravation des pertes liées à lachaleur existe.
Comme I'a bien montré Mérat (1986,1990) à la suiteprincipalement des travaux de son équipe (notammentceux de Monnet et al., 1979), I'introduction du gène
"Cou-nu" permet de réduire considérablement cespertes. Cahaner et al. (1993) démontrent I'intérêt de cegène dans des lignées industrielles de type chair etconcluent sur I'intérêt de réduire I'emplumement desbroilers. Mais comme le note Geraert (1995) au coursdes lères Journées de la Recherche avicole, très peud'études ont été menées sur les possibilités de sélectiond'animaux résistants à la chaleur. ll importe pourtant depréciser dans quelle mesure les gènes déterminant lacroissance diffèrent selon la température d'élevage.Pour répondre à cette question, les poids vifs etefficacités alimentaires ont été mesurés sur deuxgroupes d'animaux apparentés élevés à 22'C ou32'C.Les mesures réalisées à22"C ont été analysées commedes caractères différents de celles relevées à 32"C et lesparamètres génétiques (héritabilités et corrélationsgénétiques) de I'ensemble de ces caractères estimées. Siles deux séries de mesure ont le même déterminisme
Deuxièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 8-10 ovril 1997
25
génétique, les héritabilités estimées sous les deuxtempératures seront les mêmes et la corrélationgénétique sera égale à l.
Matériel et méthodes
Les l52l animaux étudiés, tous mâles, étaient issus de60 mâles et247 femelles choisis au hasard dans deuxgénérations successives de la lignée témoin de typechair créée par Ricard (Ricard et al., 1994). Les(756 au total) à 32'C. Les animaux ont alors été placésen cage individuelle. La consommation individuelle aété relevée jusqu'à 6 semaines et les animaux à nouveaupesés. Les variables mesurées sont donc les poids à 4 et6 semaines, notés respectivement P4S et P6S, le gain depoids entre 4 et 6 semaines (AP46S) et I'indice deconsommation ente 4 et 6 semaines ou IC46S. Pour cesquate variables, les effets de la génération de sélection,de la température, du lot intra génération et deI'interaction entre ce dernier effet et la température ontété testés en utilisant la procédure GLM du logicielSAS. Au vu des résultats, le modèle retenu pourI'analyse génétique prenait en compte les effets
mesures ont été effectuées sur huit lots d'animaux. Achaque lot les descendants de chaque famille ont étérépartis aléatoirement dans quatre pièces. Jusqu'à4semaines, les animaux ont été élevés en batterie (à 2ou 3 par cage) sous 22 heures de lumière et 2d'obscurité. La température a été abaisséegraduellement de 32"C le premier jour à 22"C à 2semaines. A l'âge de 4 semaines, I'ensemble despoussins ont été pesés puis les 247 familles ont étédivisées en deux de façon aléatoire, une premièremoitié (765 au total) étant élevée à22"C et la secondegénétiques de I'individu (supposés normalementdistribués) ainsi que I'effet "lot-génération" supposéfixé. Les paramètres génétiques ont été estimés parMaximum de Vraisemblance Restreint (ou REML) enutilisant le logiciel VCE écrit par E. Groeneveld etinstallé au CTIG par D. Boichard.
Résultats
Les moyennes et écart-types des principales variablesfigurent sur le tableau l.
TABLEAU I : Moyennes (+Ê écaft-type) par lot et température du poids à 4 semaines (P4S), du gain de poids entre4 et 6 semaines (AP46S) et de I'indictde consommation
Génération Lot Température P4S AP46S IC46S
22 892 +/- 90 808 +/- 127 2.1 +l- 0.2
32 928 +/- 73 470 +/-93 2.7 +/- 0.7
22 946 +/- 75 838 +/- 89 2.1 +/- 0.1
32 941 +/- 75 465 +/- 87 2.7 +l- 0.6
22 942 +/- 60 800 +/- 98 2.1 +/- 0.1
32 950 +/- 70 508 +/- 107 2.8 +/- 0.8
22 960 +/- 77 766 +/- 97 2.3 +/- 0.2
32 947 +/- 78 430 +l- 93 2.9 +l- 0.6
22 956 +/- 70 757 +t-95 2.2 +l- 0.1
32 95t +/- 69 455 +/- 8l 2.8 +/- 0.4
22 880 +/_ 73 729 +/- 100 2.2 +l- 0.1
32 884 +l- 64 443 +/- 97 2.8 +/- 0.5
22 887 +/- 69 821 +l- 74 2.t +/- 0.1
32 887 +/- 66 513 +/- 89 2.6 +/- 0.5
22 930 +/- 85 726 +l- 81 2.2 +/- 0.1
32 930 +l- 77 472 +l- 87 2.6 +l- 0.4
Pour ces trois variables comme pour le poids à 6semaines, les effets de la génération de sélection, du lotd'éclosion intra-génération, de la température et deI'interaction entre les deux dernières variables étaient
significatifs (à I'exception bien sûr de l'effet de latempérature sur le poids à 4 semaines). Les paramètresgénétiques de ces variables sont résumés sur le tableau2
TABLEAU 2 : Estimation (+/- écart-type d'échantillonnage) des paramètres génétiques du poids à 4 semaines(P4S), du gain de poids entre 4 et 6 semaines (AP46S) et de l'indice de consommation (IC46S) mesurés à22 ou32"C. Les héritabilités sont sur la diagonale et les corrélations génétiques au-dessus.
P4S AP46S22"C
AP46S32"C
IC46S22"C
IC46S32 'C
P4S 0.59 +/- 0.06 0.47 +/- 0.09 0.63 +/- 0.1 I 0.29 +l- 0.09 0.13 +/ - 0 .10
AP46S22"C
0.24 +/- 0.04 0.73 +/- 0.12 -0.25 +/- 0.11 -0.04 +t- o.l2
AP46S32"C
0.13 +/- 0.03 -0.38 +/- 0.16 -0.48 +/- 0.09
TC46S22"C
0.28 +/- 0.04 0.74 +/- 0.08
IC46S32"C
0.27 +l- 0.04
Discussion
L'héritabilité du gain de poids entre 4 et 6 semaines esttrès nettement plus faible à 32" C. Cette différence estliée à la fois à une réduction de la variance génétique età une augmentation de la variance résiduelle(couramment observée lorsque les conditions d'élevagesont défavorables). De plus la conélation génétiqueentre les deux gains de poids apparalt élevée. Mêmepour des animaux destinés à des régions chaudes, unesélection à 22'C se justifie : du fait de la plus fortehéritabilité à 22o C, elle devrait mener, à des résultatssimilaires à ceux attendus d'une sélection spécialementréalisée à foræ température. Le potentiel génétique desanimaux s'exprimant beaucoup mieux à 22"C qu'à32"C,la différence de performances sera plus marquéepour des animaux à fort potentiel génétique. C'est cequ'ont observé Cahaner et Leenstra (1992). Ce résultatexplique aussi que Picard et Ricard, dans uneexpérience non publiée (citée par Geraert, I 995), aientobservé, sur des animaux issus de la même lignée, uneréponse modérée à une sélection menée à températureélevée.Pour I'indice paf, contre, Ihéritabilité est similaire auxdeux températures ; la corrélation génétique estsimilaire à celle estimée pour le gain de poids. Dans cecas donc la réponse directe à une sélection àtempérature élevée sera supérieure à celle, indirecte,résultant d'une sélection menée à22"C. Les différencesd'indice ente températures ne dépendront pas ou p€u
du niveau génétique comme le notent Cahaner etLeenstra ainsi que Geraert et al. (1993).Enfin il est à noter que la corrélation génétique entregain de poids et indice est plus élevée en valeur absolueà 32"C (-0.48 versus -0.25). Du fait de la liaisonfavorable entre indice et faible engraissement Pym,1990), ce résultat pourrait expliquer que Picard etRicard (données non publiées citées par Geraert, 1995)aient observé un plus faible engraissement des animauxsélectionnés à température élevéeNos estimations ne sont bien évidemment valables quedans nos conditions expérimentales et ilfaut donc se poser la question de leur représentativité.Les animaux ont été exposés à la chaleur de 4 à 6semaines seulement. C'est en effet durant cette phasede croissance que I'effet de la chaleur est le plus élevé.Celle-ci réduit la quantité d'aliment ingéré et affectedirectement le gain de poids (Geraert et al., 1996). C'estdonc très probablement durant cette période que lescorrélations entre mesures à 22 ou 32oC sont les plusfaibles et donc que I'on peut le mieux apprécier lesrisques d'aggravation de la sensibilité à la chaleur liésà une sélection réalisée à22"C.Mais Mathur et Horst (1994\ ont mené une étude surdes animaux adultes et d'un type génétique trèsdifférent. Ils montrent que les résultats obtenus, commeici, sous une température de22"C sont moins corrélésà ceux relevés dans des conditions tropicales de plein-air qu'à ceux mesurés par une température contôlée de32"C. Si tel était le cas pour nos mesures, noûe étude
27
sous-estimerait l'intérêt d'une sélection menée àtempérature élevée.Enfin il reste à préciser I'efficacité d'un programmed'amélioration génétique de la résistance à la chaleurqui combinerait I'intoduction du gène "Cou-Nu" etI'une sélection réalisée à température élevée.
Conclusions
L'ensemble de ces résultats monfie que, au moins dansnos conditions expérimentales, la sélection menée àtempérature modérée ne nuit pas au progrès génétiqueobservé à32'C. Mais sélectionner à température élevéedeviendra nécessaire si I'indice de consommation prendencore davantage d'importance par rapport au poids vif.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier J.M. Brigand, K.Gérard et N. Millet pour leur aide efficace.
Références
Cahaner A. et Leenstra F., 1992, Poult. Sci., 71,1237-1250.Cahaner A., Deeb N et Guûnan M., 1993. Poult. Sci.,72,767-775.Geraert P.A., Guillaumin S. et Leclercq 8.,Poult. Sci., 34, 643-653.Geraert P.A., 1995. lères JRA, 8l-E6.Geraert P.4., Padilha J.C.F. et Guillaumin S., 1996. Br.J. of Nut., 75, 195-204.IN.lathur P.K. et Horst P.,1994.Poult. Sci., 73, 1777 -1784.Mérat P., 1986. WPSJ, 42,124-142.Mérat P., 1990. in: Poultry breeding and genetics(Crawford éd.) Elsevier Scientific Publishers,Amsterdam, pp 429467.Monnet L.E., Bordas A. et Mérat P.,1979. Ann. Génét.Sé1. Anim., 11,397411.Pym P.A.E., 1990. in: Poultry breeding and genetics(Crawford éd.) Elsevier Scientific Publishers,Amsterdam, pp847-876Ricard F.H., Marché G. et Lebihan-Duval 8, 1994.INRA Prod. Anim., 7,253-261.
RESISTANCE GENETIQUE ATIX SARCOMES AVIAIRESRESISTANCE ANTI.VIRALE OU AI\TI.TUMORALE?
Thoraval Pierrick 1., Chaussé Anne'Marie 1, Esnault Evelyne 1, Bouret Danielle 2, Luneau Gillette 2,
Coudert tr'rançoise 1, Dambrine Ginette I
I Laboratoire de virologie et d'oncologie aviaire, Staton de pathologie aviaire et de Parasitologie,INRA, 37380 Nouzilly, France.
2 Unité Poule Histocompatibles, Domaine du lvlagneraud, fNRA, Saint Pierre d'Amilly 17700 Surgères,France.
Résumé
Le virus du sarcome de Rous (RSU est capable de provoquer chez le poulet le dweloppement de tumeurs dutrszu conjonctif. Ce rétrovinrs porte dans son génome à la fois les gènes nécessaires à sa replication (gènes gag,pol et env) et l'oncogène v-src responsable de la cancérisaton. L'évoluton des tumeurs induiæs par le RSV estvariable d'un oiseau à I'autre et cette variabilité est génétiquement contrôlée. Nous avons sélectionné surplusieurs générations deux sous populatons divergentes de poulets, I'une présente le caractère progresseur(augmentation de la rnille de la tumeur et moft possible de I'oiseau), I'autre présente le caractère régresseur(diminuûon de la taille de la tumeur et rejet éventuel). Afin d'analyser les caractères impliques dans lasensibilité ou la résistance génétique au developpement des tumeurs induites par le RSV, nous avons cherché àinduire des tumeurs en présence ou en absence de production virale. Nous avons pour cela mis au pointl'induction de tumeur par inoculation d'ADN ne contenant que les sequences du gène v-src. Puis nous avonscomparé dans nos deux lignees divergentes le devenir des tumeurs induites par le virus ou par I'ADN v-src.Les résultats obtenus montrent que des poulets résistants aux tumeurs induites par le virus peuvent êtresensibles aux tuneurs induites par I'ADN v-src. Ces lignées de poulets constituent un modèle expérimentalparticulièrement intéressant pour identifier les marqueurs génétques associés à ce phénomène et pourrechercher les gènes responsables de la résistance anti-virale.
Introduction
L'infection par les rétrovirus aviaires est unphénomène couramment observé dans les troupeauxde production. La seule prophylaxie que I'on possedeà l'heure actuelle est l'éradication des poulesinfectees. L'introduction de gènes de résistance dansles schémas de selection pourrait constituer unealternative dans la lutte conûe les tumeursrétrovirales. Les sarcomes aviaires consttuent à cetégard un modèle expérimental de choix. Les objectifsde nos travaux visent à la compréhension desmécanismes de résistance aux saroomes aviaires.
Le virus du sarcome de Rous est capable deprovoquer le développement de tumeurs du tissuconjonctif dont l'évolution variable d'un oiseau àl'autre est génétiquement contrôlée. Les gènes duComplexe lvlajeur d'Histocompatibilité (CMII) ainsique les locus rétroviraux endogènes semblent êtreimpliqués dans le contrôle de la resistance auxsarcomes aviaires. Ainsi, certains haplotlpes duCMH ont été associés à la résistance audéveloppement des sarcomes aviaires alors qued'autes haplotypes étaient reliés à un phénotype desensibilité. Le CMH ne semble pas êûe le æul locttsimpliqué dans la résistance ou la sensibilite despoulets au développement des tumeurs viro-induites,
de nombreux phénomènes interviennent dans leconfiôle des réactions immunitaires qui se mettent enplace lors du developpement tumoral. Dans cecontexte, I'expression des protéines viralesendogènes qui rézulte de sequences étroitementapparentees aux génomes rétroviraux aviaires peutmoduler le developpement des tumeurs induites parles virus exogènes. Certains locus rétrovirauxendogènes conduisent en effet à la traductionconstitutive de protéines rétrovirales qui s'exprimentpendant le developpement embryonnaire et induisentun état de tolérance immunitaire vis à vis d'uneinfection rétrovirale exogène, favorisant ainsi ledeveloppement des tumeurs. Ainsi, I'efret des locusendogènes a dejà été décrit dans la progression et larégression des sar@mes dans des ligneescongéniques @lachy et al., 1985).
Description du modèle expérimental
Nous avons selectionné depuis plusieurs générationsdeux sous-populations de poulet d'haplotype Bl9divergentes, I'une présentant le caractère"progresseur" (augmentaton de la taille des tumeurset mort possible de l'animal) appelee lignee P, I'autrele caractère "régresseur" (diminution de la taille de latumeur et rejet eventuel) appelee lignée R.
Dettxièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 8-10 avril 1997 29
La divergence des lignées P et R a été obtenue à lasuite d'une seule opération de sélection @ambrine etal., 1986). Le choix des reproducteurs avait étéeffectué par progeny test, selon les critères suivants :
- pour les pères, le critère retenu avait été lamoyenne du volume maxrmum des sarcomes apparuschez leur descendants. Ainsi, il avart été possible dediscriminer des pères dits "régresseurs" lorsque levolume des sarcomes se situait dans le tiers inférieuret des pères dits "progresseurs" lorsque ce volume sesituait dans le tiers supérieur.
- pour les mères, c'est le cntère "écart de lamoyenne de la mère à la moyenne du père" qui avaitpermis de différencier les mères "régressews" (écartnégatif des mères "progresseurs" (écart positif).
Pour les génératrons ultérieures, le choix desreproducteurs a été effectué parmi les collatéraux dessujets expérimentaux, selon les critèresprécédemment définis (Thoraval etal., 1992)
Rôle du CME dans la résistance ou la sensibilitédes poulets aux tumeurs induites par le R^SV
Les poulets progresseus et régresseurs possédaient lemême haplotype 819, d'après les données fourniespar les réacûons d'hémaggluûnaton dans lesquellessont détectés les antgènes ér1throc5'tarres de classeIV codés par les gènes de la région B-G. De plus,après hybridation des ADN de ces poulets avec unesonde B-G (isolée dans le laboratoire de M. Miller,Davis USA), tous les sqets étudiés présentaient undiagramme de restriction (RFLP) identique,confirmant ainsi les tris sérologiques initiaux.Cependant, I'analyse de I'ADN des mêmes indrvidusà I'aide des sondes B-F (classe D et B-L b (classe II)(isolees dans le laboratoire de C. Auffray, CNRS,Villejurf) nous a conduits à mettre en évidence 3sous-types homozygotes (Hl, H2 et H3) ainsi que lesdragrammes hétérozygotes correspondants (Chausséet al., 1990). Ces trois sous-types étarent égalementrépartis entre les progresseurs et les régresseurs àI'excepton du sous-type Hl mis en évidenceexclusivement chez les progressews. En deuxgénérations, nous avons selectionné des pouletshomozygotes pour chacun des sous types à la foischez les progresseurs et chez les régresseurs.L'analyse par sous-type indique qu'il existe desanimaux P et R pour chacun des sous-types identifiés(à I'exception des poulets Hl qui sont tousprogresseurs). Ces résultats semblent indtquer que larésistance ou la sensibilite aux tumews induites parle lrrus du sarcome de Rous pounait ne pas être, dumoins dans nos lignees P et & directement liée auCMH.
Les locus rétroviraux endogènes
Les locus rétroviraux endogènes sont également desgènes candidats pour expliquer la résistance ou lasensibilité aux tumeurs induites par le virus dusarcome de Rous. Une première analyse avait montréqu'un large polymorphisme (16 diagrammes derestriction différents) pouvaieni être mis en évidenceau sein de la populaûon de poulet B19. La souche depoulets B19 appartient à la race Leghorn blanche quisert de référence en matière d'endogènes rétroviraux.De ce fait, il nous a été possible d'identifier parmitous les fragments revélés par la sonde correspondantau génome du rétrovrrus auxiliaire RAV-2 ceux quicorrespondent à un locus rétroviral exprimé. Pouridentifier ces diftrents locus, nous avons utilisé desADN "dits de référence" obtenus à partir d'animauxdont les locus rétroviraux endogènes ont étéidentifiés. Ces ADN nous ont été fournis par MBoichard (Génétique Factorielle, INRA de Jouy enJosas). Ces ADN de référence et ceux issus despoulets Bl9 ont été digérés par les enzymes Bam HIou Sac I et hybridés après transfert avec la sondeRAV-2 . Les résultats obtenus nous ont permis demettre en évidence au moins 3 locus rétroviraurendogènes au sein de notre troupeau Bl9. Ces locus.ev-l et ev-9 correspondent à des locus soit silencieux(ev-I, gs-chf-) soit partiellement exprimés (ev-9; gs-chf+, exprimant les protéines d'enveloppe). Untroisième locus a également été identifié qui nepossède pas d'analogie avec les locus connus chez lespoulets Leghorn blanc.Toutefois, ces analyses ne nous permettent pas deconclure qunt au rôle des locus rétrovirauxendogènes dans la régression ou la progressions destumeurs induites par le RSV.
Mise au point d'un modèle d'étude de larésistance/sensibilité aux tumeurs en I'absenced' infection rétrovirale
L'infection par le virus du sarcome de Rous induitchez le poulet le développement de réponsesimmunitaires anti-virales et anti-tumorales, d'où lacomplexité des phénomènes de sensibilité ou derésistance aux tumeurs vrro-induites. Ces réponsesimmunitaires peuvent en effet être dirigees contre desantigènes différents (antrgènes rétroviraux qag. pA!et env pour la réponse anti-virale et antigènesproduits lors de la transformaton des cellules parI'oncogène src pour la réponse ant-tumorale). Ilnous a paru important de disposer d'un outilpermettant de déterminer la part de chacune de cesréponses dans le modèle B19 que nous avonsconstruit.
Plusieurs études, rapportées dans la littérature, ontmontré qu'il était possible d'obterur ledweloppement de sarcome chez le poulet aprèsinjection dans le muscle d'un ADN comportant lessé,quences codantes de I'oncogène W, €tr l'absencede toute production virale. Nous avons donc appliqué
30
cette stratégie pour l'étude de la résistance/sensibilitéarD( sarcomes avraires dans les différentes lignées819. A cet effet, 60 poussins Bl9 d'un jourappartenant à un sous-type progresseur (H2P) ont étéinjectés avec des fragments d'ADN comportant lesséquences codantes de I'oncogène v-src dérivées duvirus RSV de la souche Schmidt Ruppin de sousgroupe A. Différentes constructons ont été testéescontenant les sequences src encadrées par desséquences non codantes iszues du RSV de longueurvariable, situées en amont et en aval du gène v-src.Les résultats obtenus nous ont permis d'identifier uneséquence minimale pennettant d'obtenir 100% dehrneur chez les poussins inoculés. Cette séquencecontient outre l'oncogène src une courte séquencenon codante en 5' et en 3' une partie de la région U3de la LTR 3'. Cette dernière qui content uneséquence de type "enhancer" s'avère indispensable àI'induction des tumeurs. Une étude moléculaire apermis de montrer que I'ADN inoculé était retrouvédans le génome des cellules tumorales intégré sous laforme de concatémaires reconstihrant ainsi un pseudovirus constitué de la séquence src encadrée par deuxséquences de la LTR partiellement délétee.
Application du modèle
Nous avons çhqisi rtans un premier temps àI'aide de la s{uence ADN "SIe" (constnrction Acc Idérivée du génome du RSV de la souche SchmidtRupin de sous groupe D : RSV SR D) précedernmentidentifiée d'inoculer des poulets de sous-type H3appartenant aux deux lignees P et R. Parallèlement,des poulets appartenant au même sous-type ont étéinoculés avec le virus RSV SR D. Au total, 80poulets de 4 semaines ont ainsi été inoculés.L'évolution des tumeurs a été mesurée pendant 9semaines. Les résultats obtenus indiquent que lespoulets H3 de la lignee P ou de la lignee Rdweloppent des tumeurs de manière identque aprèsinoculation par I'ADN v-src alors que les poulets H3de la lignée R ne developpent pas de tumeurslorsqu'ils sont inoculés avec le virus RSV SR D. Cerésultat semble donc indiquer que le systèmeimmunitaire des poulets H3 R serait capabled'éliminer les cellules tumorales lorsque celles-cisont induites par le virus (RSV SR D) mais qu'il necontrôlerait pas le dweloppement de tumeurs lorsquecelles-ci sott induites par I'ADN (en absence deproduction virale). Cette réponse immunitaire seraitalors dirigee exclusivement contre des antigènesviraux et non contre des antigènes tumoraux.
Conclusion
Les lignées P et R que nous avons sélectionnêsparmi nos poulets d'haplotype Bl9 représentent unmodèle de choix pour l'étude de la résistance ou de lasensibilité aux tumeurs induites par le virus dusarcome de Rous. Ces lignees sont maintenant
parfaitement caractérisees pour le polymorphisme deleurs gènes du complexe majeur d'histocompatibilité,ainsi que pour leur locus rétroviraux endogènes. Si leCMH ne semble pas directement impliqué dans iaprogression ou la régression des turneurs induites parle RSV, les locus rétroviraux endogènes pourraientquant à euxjouer un rôle. Les expériences que nousavons réalisées vont dans ce sens. En effet, nousavons montré qu'il existait, chez les animaurrégresseurs (H3R), une diftrence lorsque les tumeursétaient induites par un virus réplicatif (RSV SR D)ou en absence de réplication virale (ADN f$O. Lesanimaux H3R qualifiés de régresseur (absence dedweloppement tumoral) lorsqu'ils sont inoculés parle virus deviennent progresseur (développementtumoral) lorsqu'ils sont inoculés par I'ADNconespondant au gène v-src. Les réactionsimmunitaires mises en jeu lors de la réaction de rejetde la tumeur seraient donc plutôt dirigées contre lesdéterminants antigéniques des gènes viraux (produitsdes gènes gag, pg! ou env). Ce phénomène n'estobservé que chez les animaux de la lignée régresseur(H3R), les animaux de la lignées progresseur (H3P)étant sensible au développement tumoral que lestumeurs soient induites par le virus ou par I'ADN v-src. Les animaux H3P seraient donc incapables deproduire une réaction immunitaire dirigée contre lesdéterminants des gènes viraux. Les locus rétrovirauxendogènes pourraient expliquer cette différence.Parmi les locus connus, cefiains sont exprimés(production de protéines g?E ou env). Cetteexpression est mise en place ûès tôt au cours dudweloppement embryonnaire, si bien que lesanimaux dwiennent tolérants à I'expression de cesprotéines. On peut alors imaginer que les poulets dela lignee H3P possedent des locus rétrovirauxendogènes exprimant ces protéines gag ou env et sontdonc tolérants lorsqu'ils sont inoculés avec le virusRSV à I'expression à la surface des cellulestumorales des protéines gaq ou env produites par levirus exogène. Les reactions immunitaires sont alorsfaibles et la tumeur peut se developper. Suivant lamême hypothèse, les poulets de la lignée H3Rposséderaient des locus rétroviraux endogènesn'exprimant pas les protéines gag ou env. Cesanimaux seraient alors capables de reconnaîtrecomme étrangères ces protéines produites par le virusexogène à la surface des cellules tumorales et ainsi derejeter la tumeur. Nous testons actuellement ceshypothèse en analysant la répartition et I'expressiondes locus rétroniraux endogènes au sein des deuxlignées P et R. Nous avons également entreprisd'étudier la ségrégaton à la fois du phénotypeProgresseur ou régresseur et des locus rétrovirauxendogènes lors de croisement entre les lignees H3P etH3R.
Références
3 l
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Thoraval P., Chausse A.M., Coudert F. andDambrine G., Avian Immunology in Progress,collection les Colloques de I'INRA, Paris, no62,t993.2t1-2t7.
CONSERVATION IN WTRO DU SPBRME CHDZ LES OISBAUX DOMESTIQUBS
Blesbois Elisabeth, Seigneurin François
INRA, Station de Recherches Avicoles, 37380 Nouzilly, France
Résumé
Cet article présente une revue des principales mélhodes de conservation du sperme chez les oiseaux domestiques(dindon, coq, canards, oie...). L'intérôt de ces méthodes et les facteurs de variation susceptibles d'influencer lasurvie des gamètes sont discutés. Iæ sperme est conservé à l'état liquide si le délai souhaité est inférieur à 24 h,ou bien congelé et stocké dans l'azote liquide pour des temps plus longs.
AbstractIn vitro storage of semen in domestic birds
This paper presents a review of the most current methods of ùt vitro storage of sperm in domestic birds. Theirinterest and the factors of variation which contribute to the success of. in vitro storage are also discussed. To storesemen up to 24 h, a method of storage upper 0'C is employed. l.onger storages need freezing of semen.
Introduction
Depuis que Shaffner et al. (1947) ont montré que desoeufs fécondés pouvaient être obtenus à partir dcsperme congelé de coq, de très nombreux travaux ontélé entrepris pour améliorer les techniques deconservation du sperme chez les oiseaux domestiques.Très vite, les travaux initiés chez le coq ont étéétendus au dindon puis au canard, au jar et à lapintade mâle.Aujourd'hui, I'utilisation des techniques deconservation du sperme dépend à la fois de la qualitéde la descendance oblenue, et du coût de cettedescendance produite sur un marché très concurrentiel.De ce fait, deux types de méthodes de conservation ilvitro dl sperme ont été mises au point:. l'une principalement liée à la technologie de
I'insemination artificielle (I.4.) est la conservalion"à l'étal liquide" au dessus de 0'C du sperme(temps < 24-48 h).
. l'aufe, plus coûteuse est premièrement développéedans I'optique de conservation des gènes (plusieursmois-années). Il s'agil de la congélation.
Nous allons successivement étudier ces deux famillesde techniques, leur impact et leurs facteurs limitants.
I. Conservation du sperme au dessus de 0"C
Développée pour faciliter I'organisation des I.A.lorsque ce mode de reproduction est utilise, laconservation in vitro du sperme au dessus de 0'C estprincipalement développée chez le dindon. Desméthodes efficaces existent aussi chez le coq et sontutilisée,s à tavers le monde : elles concernent surtoulles souches grand parentales. En revanche peu
d'étudcs ont été menées chez des espèces comme lapintade et le canard, alors que I'1.4. est largementemployée désormais dans ces deux espèces.En règte générale I'objectif est de conserver lesgamètes mâles de 4 à 24 h sans perte de pouvoirfécondant. Cælui-ci a été concrétisé chez le coq (Iakeet Ravie, 1981 ; Blesbois et Hermier, 1990) sommechez le dindon (Thurston, 1994). Cependant, mêmechez ces deux espèces, la réussite de Ia conservationdu sperme dépend d'un grand nombre de facteurs devariations qui sont liés soit aux animaux (qualité dusperne, fertilité de la femelle, âge) soit aux techniquesde collecte, de conditionnement et d'insémination dusPerme.
l. Factcurs liés aux animaux :
La première exigence est de disposer despermatozoïdes de bonne qualité. En effet, laconservation in vitro est susceptible d'amplifier unesubfertilité latente. Par exemple, la présence d'unfaible pourcentage de cellules altérées, peut, parliberation d'enzymes protéolytiques ou de produits deperoxidation,entraîner progressivement la morl desautres cellules.De plus, il est desormais bien établi que la capacitépropre des femelles à conserver in vivo, de façonoptimale les spermatozoÏdes, peut être aussiprépondérante.Enfin, l'âge des animaux est aussi un facleurimportant dans les deux sexes, Ie vieillissementproduisant chez le mâle une chute de la quantité et dela qualité des gamètes (de Reviers et Petitjean, 1973)et chez la femelle une diminution de sa capacité àstocker les spermatozoildes (Brillard, 1993).
Deu,vièmes Journées de la Reclrcrche Avicole, Tours, 8-10 avril 1997
2. Facteurs liés au condilionnement du sperme :
a. La collecte du sperme : Depuis les travaux deBunows et Quinn (1936), les techniques de massagepour recueillir Ie sperme ont été progressivementadaptées et étendues à toutes les espèces d'oiseauxdomestiques. Elles présentent cependant desparticularités d'espèce susceptibles de conditionner laconservation ultérieure des spermatozoildes. Ainsi, chezle coq, il faut éviter de recueillir le fluide transparentqui est néfaste au slockage in vitro des cellules ([:ke,1966). Il faut en revanche, chez toutes les espèces,surveiller les contaminations du sperme par lesmicroorganismes du cloaque (Gale et Brown, 1960) etdans cærtains cas, avoir recours aux antibiotiques quin'excluent pas l'utilisation de systèmes simples defiltration (Brillard, 1995).
b. Milieu de conservation des spermalozoîdes : [.orsdes cinquante années écoulées, de très nombreuxdilueurs de conservation du sperme ont été proposés(revu par Thurston, 7994 ; Surai et Wishart, 1996).Dans la plupart des cas, ces dilueurs donnent, à trèscourt terme, des résultats comparables. Retenons lesfacteurs qui contribuent le plus à I'efficacité d'undilueur : ils sont premièrement d'ordre physico-chimique puisqu'il s'agit de Ia pression osmotique, dupH et du pouvoir tampon. La conservation desspermatozoides est de plus bien meilleure quand leurmétabolisme est abaissé. Cet abaissement est, engénéral, réalisé par une température de stockage infraphysiologique, souvent de 2 à 15'C et d'autant plusbasse que la survie est prolongée. Dans ces conditions,la présence d'oxygène pour Ie maintien d'unmétabolisme aérobie reste très utile chez le coq(Wishart, 1981 ; Blesbois et Mauger,1987 ; Wishart,1989) et impérative chez le dindon (l-ake et al., 7984; Thurston et al., 1994). Dans les deux cas,I'apparition de peroxydes néfastes à la survie desgamètes peut être contrôlée par des antioxydantsadaptés (Blesbois et al., 1993 ; Surai et Wishart,1996). Notons aussi que le plasma séminal aglobalement un effet néfaste sur la conservation dusperme @lesbois, 1986 ; Sexton, 1988). Son effettoxique est concentré dans les molécules de petit poidsmoléculaire (P.M.), Ies fractions de haut P.M. étant aucontraire bénéIiques @lesbois et de Reviers, 1992).
c. Ircémirutiazs : Ia fréquence des I.A. avec spermeconservé au desss de 0'C e$ en général de l/semainechez le dindon oomrne chez le coq. La qualité des I.A.est très importante. Ainsi, pour une dose fixed'insémination de 250 millions de spermatozoides/semaine, Sexton (190) obtenait les meilleurs résultatsquand la dose était répartie en plusieurs inséminationsdans la semaine, sans doute parce qu'une proportionmoins élevée de dindes étaient "ratées" (chez la poule,le pourcentage d'LA "ratées" pour des raisons diversesserait de l'ordre de 3 Vo, Brillard, Clmm. Personnelle).
Il. Congélation du spernre
Le premier intérêt de la congélation est de pouvoirainsi conserver les gènes sans oonserver les animaux.En I'absence de conservation efficace des embryonsou des ovocytes, il n'y a, en effet, pas de méthodealternative chez les oiseaux. Ceci est très important,bien sûr, pour les races en voie de disparition maisaussi pour conserver le polentiel de reproducteurs àhaute valeur ajoutée. L: congélation peut alors, danscertains cas, être envisagée en multiplication. Ellepermet aussi de conserver la diversité génétique dansdes situations difficiies oomme celles rencontrées aucours d'épidémies (biosécurité).[æ sperme est alors congelé plusieurs mois à plusieursannées dans I'azote liquide avant d'être réinséminé.Chez les oiseaux, l:ke et Ravie (1978) et Sexton(1976) ont élé les premiers à proposer des méthodesde congélation du sperme de coq. Iæurs méthodes ontété récemment améliorées respectivement parScigneurin et Blesbois (1995) et par Van Voorst etlæenstra (1996). D'autres méthodes de congélation dusperme de coq mais aussi de dindon, jar et canard,développés en Europe de I'Est sont aujourd'hui plusfacilement disponibles (fselutin et al., 7995 ; revue deSurai et Wishart, 1996).C-omme pour la conservation du sperme au dessus de0"C, de nombreux facteurs conditionnent la réussite dela congélation. En réalité, la plupart des facteurs devariation ayant un rôle dans la conservation du spermeà court terme sont encore plus importants pour lesperme congelé. C'est le cas pour ce qui concerne lesanimaux (qualité du sperme, fertil ité des femelles,âge), les techniques de collecte et d'inséminations. Deplus, les milieux de stockage doivent être tout aussiéquilibrés. Quelques facteurs sont cependant propresà la congélation. II s'agit des cryoprotecteurs, desvitessBs de congélation et décongélation, ainsi que dumode de stockage du sperme.
1. Agens cryoprotecteurs :
Indispensables à la réussite de la congélation desgamètes, de très nombreux cryoprotecteurs perméanlset non perméants ont êlé teslés chez lesspermatozoi:des d'oiseaux. Læ glycérol reste le meilleurd'entre eux (Blesbois et Seigneurin, 1996) mais il aI'inconvénient majeur de devoir être enlevé avantl'insémination. Ceci est réalisé par centrifugation(Lake et Ravie, 1978) ou dialyse (Bush, 1993). Desrésultats encourageants ont aussi été obtenus avec leDMSO (Van Voorst et læenstra, 1996) et le DMA(Tselutin et al., 1995).
2. Vitesses de congélation et décongélation :
Les vitesses de congélation et de décongélationoptimales dépendent du ou des cryoprotecteursemptoyés. Elles visent à rechercher un équilibreadéquat entre (1) les effets osmotiques liés aux
34
mélanges transitoires des phases liquides et solides et(2) la prcsence et la taille des cristaux de glaceintraceUulaires. Pendant longlemps, une vitesse dccongélation lente (< l'Qmn) el une vitesse dedécongélation rapide étaient préconises. L'évolutiondes oonnaissances conduit à proposer des vitesses decongélation de plus en plus rapides.
3. Mode de stockage du sPerme :
Trois modes principaux de stockage du sperme dansl'azote liquide ont été proecxÉs: les billes (pelles)' Iesarnpoules de venp et les paillettes. Iæ conditionnementen billes, largement développé dans les pa;rs del'ancienne URSS, consisæ à plonger direclement desgouttes de sperme dans I'azote liquide. D'un usagesimple, les billes posent pourtant des problèmessanitaires et d'identification majeurs. Leconditionnement en ampoules de vere aprincipalement été employé dans la méthode de [:ke.Il est progressivement remplacé à travers le monde parla paillette qui produit des congélations beaucoup plushomogènes.
Conclusion
Iæs méthodes de conservation du sperme au dessus de0'C sonl maintenant d'un usage couranl chez ledindon. [æs méthodes de congélation du sperme chczles oiseaux onl, quanl à elleE considérablement ér'oluéces dernières années. Elles permettent, à I'heureactuelle d'atteindre des taux de fécondation de 80 à90Vo dans certaines conditions. Il n'en demeure pasmoins que les resultats obtenus sonl d'une variabilitéconsidérable en fonction des animaux (revue deHammersted, 1994). Cette variabilité pounaitd'ailleurs être atténuée si I'on prenait en comptecertains paramètres de reproduction dans les critèresde selection (fuisâh et Buckland, 1983).Dans tous les cas. l'amélioration des méthodes deconservation du sperme avec ou sans congélationconduit à une optimisation du management des mâleset contdbue largement à la diffusion des progrèsgénétiques realises chez les oiseaux domestiques.
Références
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3 5
ETUDE COIVIPAREE DES CARACTERISTIQUES DU SPERME ET DU CHONDRIOME DESSPERMATOZOIDES CHEZLES COQS DES LIGNEES R+ ET R- SELECTIONNEES DE FAÇON
DIVERGENTE SUR LA CONSOMMATION ALIMENTAIRE RESIDUELLE
Morisson Mireillel, Bordas AndréI, P^etit Jean-Michel2, Jayat-Vignoles Chantal2,Julien Raymondz et Minvielle Francisr
r nqRe, Laboratoire de Génétque Factorielle, 7E352 Jouy-en-Josas2 Université de Limoges, Institut de Biotechnologie, 87060 Limoges
Résumé
Deur lignees de poules pondeuses ont été sélectionnées de façon divergente pour leur effrcacité alimentaire.Des réponses associées à la sélectron sont appanres affectant la fertilité et la viabilité embryonnaire. Lors decette étude, nous avons comparé les spermes de 9 coqs R- (à faible consommaûon résiduelle) et de l0 coqs R+(à forte consommation résiduelle). Nous avons mesuré le volume et la concentraûon en spermatozoides deséjaculats, étudié certaines caractéristiques biochimiques du plasma séminal et estimé la moûlitémassale desspermatozoides. Nous avons également analysé I'acûvité mitochondnale des spermatozoides et l'importance deleur chondriome. Les donnees recueillies suggèrent que I'activité mitochondriale des spermatozoides estcomparable dans les deux lignées mais que l'importance du chondriome esl l7o/o plus faible chez les coqs R+comparaûvement aux coqs R- Cette donnée explique certainement la plus faible motilité des spermatozoÏdesdes coqs R+ et le faible taux d'éclosion noté dans cette lignée.
Abstract
Associated effects of divergent selection for residual feed consomption on reproduction, spenncharacteristics and chondriome of spermatozoa
Eighteen generations ofdivergent selecûon for residual feed intake have been completed in two Rhode IslandRed lines of domestic fowl. The high intake R+ line and the low intake R- line cocks used to sire generation 19of the selection experiment have been compared for associated responses on fertility. hatctung and spermquality Evaluations of sperm samples were based on volume, cell concentration, biochimical parameters andon motility and morphology of spermatozoa. Individual spermatozoa were analysed by flow-qtometry to assessoverall mitochondrial activity and overall mitochondnal content. Our results suggest that, in the R+ line. thepoor performance at fertilizaûon and during early embryonic development was associated with lowerproducton of motile spermatozoa, possibly in relation to a lower quantity of mitochondria in spermatozoa from
È+ cocks. These results suggest that selection for residual feed intake may have altered some cellular function
related to the producton of energy in the R+ line' volume de l,éjac'lat. la concenration en
Introduction spermatozoides (spz), leur moûlité et leurmorphologie. Nous avons également noté le pH et
Dans le but d'augmenter le rendement de la les concentraûons en acide urique et en protéines
production d'oeufi en diminuant la prise du plasma séminal et nous avons analysé I'activité
alimentaire, deux lignees de poules pondeuses ont mitochondriale des spermatozo'des et I'importance
été sélectionnées de façon divergente pour leur de leur chondriome. En effet, la moûlité des
effrcacité alimentaire à partir d;une population spermatozoides dépend de I'activité
Rhode Island Red à oeufs bruns. Les deux lignées, mitochondriale fournissant l'énergie nécessaire au
I'une à forte consommation résiduelle notee R+ et mouvement flagellaire (Auger et al., 1989 ;I'autre à faible consommation résiduelle notee R-, Folger6 et al., 1993). La masse membranaire
sont sélectionnees depuis 1976 @ordas et Mérat, mitochondriale peut être évaluée indirectement en
l9g4; Bordaset a1.,19927. utilisant la l0-N-nonyl acrydine orange ou NAO
En plus de la réponse directe à la sélection, (Maftah etal.,l989;Petitetal.,l992;1995)alorsd'autres sont apparues affectant la fertilité et la que la Rhodamine 123 ou Rù123 permet I'analyse
viabilité embryonnaire @ordas et Mérat, 1993). in situ de I'activité mitochondriale sur cellules
De façon à élucider les raisons de la baisse intactes (Darzynkiewicz et ql., l98l ;d'éclosion chez les animaux R+, nous avons étudié Nadakavukaren et al', 1985)'le sperme de 9 coqs de la lignée R- et 10 coqs de lalignée R+ en comparant, entre les deux lignées, le
Deuxièmes foumées de la Recherche AvÎcolc, Tours, 8-10 awil 1997
ùlatériels et Méthodes
Lignées et anintaux'. la description complète duprotocole de sélection et des conditions d'élevage adéjà été donnée (Bordas et al.. 1992). Le critère desélection. appelé consommation résiduelle et notéR. représente l'écart individuel de laconsommation obser,vée (O) à une valeur de cetteconsommation prédite à partir d'une équation derégression multiple tenant compte du poidscorporel (P) et de la variation de poids (DP). Cecritère R est calculé sur une période de 28 jours de.l I à 38s L'équation utilisée en 199.1 chez les coqsest :R : o - 9 l . o P " ' s - 3 . 6 ' 7 D P + I 9 o 7Les performances des animaux utilisés dans celravail. données dans le tableau l. reflètent leseffets de la sélection portant sur le critère R : lesvaleurs de la prise alimentaire (O) diffèrentsrgnificativement entre lignées alors que le poidscorporel (P) et la variation de poids (DP) sontproches entre lcs animaux R- et R+
TABLEAU l: Performances mo]'ennes des 9 coqsR- et des l0 coqs R+ retenus comme reproducteursaprès la sélection sur le critère R
*** P < 0-(x) l
Fertilité et petfbrmdrlce.s à l'éclosion'. cinq poulespar coq ont reçu. tous les 4 j. par inséminaûonartificielle (IA). 0.2 mL dilué au % dans unesolution de NaCl à 7.5 glL- Les oeufs ont étérécoltés pendant 2 périodes de 3 semaines etconsen'és entre 12 et l4oc avant incubation. Lesperformances à l'éclosion de chacun des 19 coqs etchacune des femelles ont été enregistrées . lespourcentages d'oeufs clairs, de mortsembryonnaires précoces (avant le 5ème jourd'incubation), de morts embryonnaires tardrves(avant le l8ème jour d'incubation) et de morts encoquille (entre le 18ème jour d'incubation etl'éclosion) ont été notés.Evqluation des éjaculats: l'étude du sperme desdeux lignées a été réalisee aussitôt après lacampagne de reproduction. Le volume deséjaculats a été déterminé par pesee et laconcentraton en spermatozoides a été estimée, sur8 prélèvements effectués sur 4 semaines, palmesure de la densité optique à 535 nm sur unedilution de l'échantillon.
Jt'Iotilité nta.s,sale-. elle a été étudiée sur '7
prélèvements. le sperme étant dilué au % dans duBPSE (Sexton. 1977). La notation a été réaliséed'après la méthode de Petitlean (1978) sur uneéchelle variant de 0 à 6
Etude morphologique des spermatozoicles. lacoloration des spermatozoides a été réalisée à 4"Cavec du sperme dilué au % en BPSE Quarante mLde sperme dilué ont été ajoutés à 150 mL de lasolution de coloration (éosine 16 gL. nicrosine 60g[L en BPSE). Après 2 min de coloration. 2 frottisont été réalisés pour chacun des échantillons. Lesspermatozoides morts. vivants et anonnaux ont étéobservés et comptés sur un total de 300spermatozoides par échantillon et ce sur 1prélèvements par coq.
Aspects qualitutilis clu planna séminal: le plasmaséminal a été préparé selon la méthode décrite parBlesbois et Hermier (1990). Les analyses ont étéréalisées, pour chaque coq. sur le mélange duplasma sémrnal obtenu lors de 4 prélevements. Lamesure du pH a été réalisée puis les dosages deI'acide urique et des protéines ont été réalisés àl'aide de kits (Boehringer Mannheim)
Analyse tlu contenu mitochondrial et de I'activitémitochondriale des spennatozoi:der: cette analysepar cytométrie en flux (CI!F) a été réalisée sur lesspermes de 8 coqs R- et de 9 coqs R+ di,lués au %en BPSE. Le marguage à la NAO (5x10-' M) a étéeffectué sur 2xl0' spermatozoldes pendant 15 mrnà temffrature.ambiante (TA). Pour le marquage àla Rh123 (10* M). 2xl0o spermatozoides ont étéincubés pendant 30 min à TA puis marqués. 2 minavant I'analyse par CMF, à I'iodure de propidrum(P) à 50 mglml- de façon à distinguer lesspermatozoides morts (colorés par I'IP etprésentant une fluorescence rouge) desspermatozoides vivants. La fluorescence verteémise après coloration à la NAO ou à la Rhl23 aété recueillie à 530t30 nm alors que lafluorescence rouge émise par l'IP a été analysée àdes longueurs d'ondes supérieures à 600 nm
Analyse statistique'. dans tous les cas, les variablesrelatives aux proportions ont été transforméesavant analyse par la fonction racine carrée de I'arcsinus. Cependant, les valeurs moyennes desmoindres carrés des données non transformées sontfournies pour une interprétaton plus aisee. Pourles critères de fertilité et d'éclosion, les résultatsissus des deux lots d'éclosion ont été sommés pourchaque accouplement et les ratos correspondantsont été calculés pour chaque couple mâle-femelle.Toutes les variables ont été analysées par analysede variance selon le modèle: Ytjr = m + l; + s1+eiik, où Ytit est l'observation de la kème pouleinséminee par le jème coq de la ième lignée. m est
câractèrelignée R- lignée R+valeur du t etsignificativité
de ladifférence
P (e) 3 454+t 38 3 64811 l6 l . l
DP (e) -t02!24 -10 I r28 0.03
O (e) 2 0 l7+l _ j3 3 798rrJ I I 1 , 7 * * *
R ( s,) -746t$1 870-62 18 ,5+* *
la moyenne générale, l; est I'effet fixe de la ièmelignée, sij est I'effet aléatoire du jème coq de. laième lignee et e1k, est un résidu gaussien N(0, s"e).Comme la qualité et le contenu du sperme ont étéanalysés de façon répetée pour le même coqpendant 4 semaines, une analyse de variance a étémenée sur I'ensemble des variablescorrespondantes selon le modèle: Yiir : m + li + sii* dt + (d);1 + er;r où Yi.;L est I'obsewation aukème jour du jème coq de la ième lignée, m est lamoyenne générale, l; est I'effet fixe de la ièmelignee, sij est I'effet aléatoire du jème coq de laième lignée, d1 est I'effet fixe du kème jour, (ld);pest I'interaction entre les effets de la ième lignée etdu kème jour et eijk, est un résidu gaussien N(0,s'e). Pour toutes les variables, mesurées oucalculées une seule fois pour chacun des coqs, lesdeux lignées ont été comparées en utilisant le testde Student.
Résultats
Fertilité et per/itrmances à l'éclosion'. lesdifférences entre les deux lignées (Tableau 2) sonttrès significatives (P < 0,001) pour le taux d'oeufséclos/oeufs incubés et pour le taux d'oeufs clairs/oeufs incubés. De même. la mortalitéembryonnaire précoce est plus élwée (P < 0.001)dans la lignée R+ que dans la lignees R-.Cependant. la mortalité embryonnaire tardive et lamort en coquille ne diftrent pas entre les deuxlignées. Une faible différence @ < 0.05) estobsewée entre les deux lignées pour le rapportoeufs écloVoeufs fecondés
TABLEAU 2: Moyerures des moindres carréscoellicients de variation (CV) des performancesl'éclosion chez les ligrées R- et R+.
età
* : P < 0 , 0 5{'*' P < 0,01**+. P < 0,001
Eclkrc: Eclos/incubésCVInc: ClairVincubésEcÆec: Eclos/fecondés
MEP: Morts embryonnaires precoces/oeufs fécondésMET: Morts embryonnaires tardiveVoeuts fecondésMC: Morts en coquille/oeufs fécondés
Evaluation des éjaculats: le volume de l'éjaculatne diftre pas entre les deux lignées. (Tableau 3)mais la concentraûon en spermatozoides est plusélevee chez les coqs R- ; De ce fait, le nombre despermatozoïdes par éjaculat est deux fois moinsélevé chez les coqs R+ par rapport aux coqs R-.Ces différences entre lignees sont trèssignificaûves (P < 0,001). La motlité massale estplus élevee (P < 0,001) chez les animaux R- et letaux de spermatozoides morts est environ deux foisplus élevé (P < 0,05) dans la lignée R+. Aucunediftrence signilicative n'a été observée entrelignée pour les autres caractères étudiés.
TABLEAU 3: moy'ennes des moindres carrés et coellicient de variation (CV) des variables de composition du sperme etdes caractères des spermatozoïdes
movenne des moindres. , |ciuTes
valeur de F et signiltcativité de I'etïèt- cv'
Caractère R- R+ lienée cooÂisnée tour limée x iow o/o
Volume(ml)
435 444 0,05 7,7**t 8,6*** 1,4 20
Concentr./mz/ml)
2,98x10- l,54xl0' 24,5*** 2,6** 1 .7 0,7 35
NombresDz
1,33 xl0- 0,70x10' 18,5*+* 2,6*. 2,4 ) 7 38
motilite 4.4 2,3 41,2*t+ 4-0**{ t a a + 3.2t* 28%o morts 3.6 6.1 7 -lt 1.5 2.6 I . l go anorm. 4.3 5-2 0.6 5.3*** 1.7 2-O 44Vovivants
92 89 3,8 3,7*** 2,9t 0,2 4
: variables non2: variables transfornrees par la fonction racine carrée de I'arc sinus (les variables relatives aux pro'portions)* : P < 0 , 0 5 * * . P < 0 , 0 1 * * * . P < 0 , 0 0 1
moyenne desmoindrescarrésl
CVI
nrD( R. R+ lignee coq /lisnée
Yo
EcÂnc 0,55 0,35 I 3,8+** 1 ,3 5 t
CVInc 0,06 0,30 21,3*t ' * 2,8** 58
EcÆec 0,58 0,48 4,9* 0,8 39MEP 0,09 0,21 43>3**+ 0,4 6 l
MET 0,09 0,09 0,2 t,2 86
MC 0,22 0 , l 8 1,0 1,2 47non
': variables transformées par la fonction racine carrée deI'arc sinus
39
Le facteur jour a un effet important sur le volumede l'éjaculat (P < 0.001) mais peu ou pas d'effetsur les autres mesures. La motilité est le seulcaractère a être significativement affecté par leseffets majeurs du modele. Ce caractère présenteégalement une interaction significative entre lignéeet Jour.
Aspects qualitatifs du plasma séminal'. aucunedifférence n'a été observée entre les deux lignéesen ce qui concerne le pH du plasma sémirnl et sesconcentrations en acide urique et protéines.
Analyse du contenu mitochondrial et de I'activitémitochondrial e de s sperntatozoitles. une différencesignificative (P < 0.01) entre les deux lignées estobservée pour la fluorescence verte émise aprèscoloration des spermatozoi'des à la NAO : cettefluorescence est plus importante chez lesspermatozoides des coqs R- (76.54 !3.46 pour lescoqs R- et 63.95 r. 2"64 pour les coqs R+) Demême, la fluorescence verte émise après colorationdes spermatozoldes à la Rhl23 présente unedifférence significative (P < 0.01) entre les deuxlignées : 133,33 1 2.33 pour les R- et 110.60 t6.34pour les R+. Cependant. le rapport de fluorescenceRhl23^lAO est similaire dans les deu:i lignées(1.74 et 1.73).
Discussion
Les diftrences entre lignées concernant le tauxd'éclosion et le pourcentage d'oeufs clairs tendentà incriminer un évènement proche de lafécondationNous n'avons noté aucune différence entre lignéespour ce qui concerne les caractères biochimiquesdu plasma séminal testés mais une différence entrelignées a été observée pour le nombre moyen despermatozoldes par éjaculat qui est, chez lesanimaux R+. presque deux fois inférieur à celuides coqs R-. Ainsi, chacune des femelles R- reçoitenviron 266 millions de spermatozoides lors d'uneIA alors que la poule R+ n'en reçoit que l4lmillions. Cependant, ce chiffre est encore situédans un ordre de valeur conduisant à une IAefficace @rillard et de Reviers, 1989). Cettedifférence ne devrait donc pas expliquer ladifférence de performance à la reproductionobservée entre les deux lignées.Chez les coqs R+, la motilité massale est plusfarble et les taux de spermatozoides morts etanonnarD( sont plus élwés. Ces caractères sontcertainement impliqués dans la baisse de fertilitéobservée comme le montrent les corrélationstrouvées entre le taux de spermatozoldes anonnauxet le rapport oeufs clairs/oeufs incubés (+0,45. P <0.01) et entre le taux de spermatozoldes anormauxet le rapport oeufs écloVoeufs incubés (4,51, P <0.05).
Enfin, I'analyse par cytométne en flux montre queI'incorporation des deux marqueurs fluorescentsest plus faible chez les animaux R+ alors queI'activité mitochondriale rapportée à la masse duchondriome (rapport Rhl23/NAO) est la mêmed'une lignee à I'autre. Ces résultats montrent quela différence porte en fait sur la massemitochondriale qui est 17% plus faible chez lesspermatozoides des coqs R+.Ainsi. la sélection pourrait avoir affecté. chez lesanimaux R+, une fonction cellulaire impliquant laproduction d'énergie qui pourrait expliquer labaisse de motilité des spermatozotdes et lesdiminutions des performances de reproductiondans cette lignée.
Remerciements
Les auteurs remercient sincèrement ElisabethBlesbors et Isabelle Grassot pour leur conseils elcommentaires concernant ce lravail et exprimentleur reconnaissance à Baudoin Rivet pour sacontribution technique Ce travail a été frnancé parI'A.I P. "Variabilité génétique de la viabilitéembryonnaire chez les animaux domestiques".Institut National de la Recherche Agronomique
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LES DISPOSITIFS DE DETECTION DES GENES CONTROLANT LES CARACTERES
QUANTITATTFS (QTL) A L'AIDE DE MARQUEURS MOLECULAIRES ET LEUR UTILISATIONEN AVICULTURE.
Tixier-Boichard Michè|el. Douaire Madeleine2, Beaumont Catherine3,
Etsen Jean-Michela
. t
INRA; Génétique Factorielle, 78352 Jouy-en-Josas Cedex," INRA:ENSA, Génétique animale, 65, rue de St Brieuc, 35000 Rennes,
" fN$A Station de Recherches Avicoles, 37380 Nouzilly"'
rNRA. SAGA. 8P27. 31326 Castanet-Tolosan
Résumé
Des marqueurs moleculaires sont maintenant disponibles pour rechercher des QTL chez le poulet. Les
dispositifs de détection combinent l'informaton apportée par les marqueurs génétiques avec la mesure des
p.rfo**a"s ; ils sont réalisés intra-lignée ou en croisement. Le succès d'un protocole dépend du plan
à'accouplement et de la taille des familles, souvent plus gtande que dans un schéma avicole classique. Le choix
d'un piotocole de détection de QTL est discuté en fonction de I'objectif zootechnique (mono- ou
pluricaractères), du matériel animal disponible, de I'information génétique préalable et des coûts d'élevage et
à. typ"g. moleculaire. Plusieurs disposiiifs ont déjà été mis en place chez le poulet en France et à l'étranger'
Sunmarl
Desips to detect quantitative trait loci with molecular markers and their use in poultry breeding
Molecular markers are now available to search for QTL in chicken. Designs to detect QTL combine
simultanous information on performance and on marker genes. they can be established either within line or by
crossbreeding. To be successfrrl, the size of the design must be planned in terms of mating scheme and family
size. The r{urred family size may often be largei than the value usually encountered in classical poultry
breeding schème. the ciroice of a specific design is discussed according to the traits to be considered. to
available animal material, to previousgeneûc knJwledge and to costs of typing and trart measurement. Sweral
projects have been set up already for the chicken in France and abroad.
Introduction
Chez les volailles cornme chez les autres espècesd'animaux domestiques, les performanceszootechniques mesurées présentent généralementune variation contnue qui résulte de I'actionsimultanee àes effets du milieu et des effetsgénétiques. Le modèle d'analyse le plus employépar les génétciens est le modèle infinitésimal, quisuppose pour chaque caractère à selectionnerI'existence d'un gnnd nombre de gènesindependants ayant un effet petit et additif. Cemodèle apparemment simpliste est oÉratonnel : ila permis aux selectionneurs de modifier lesperformances. Pourtant, certains gènes ayant uneffet important sur des caracGres quantitatifs ontété identifiés, l'exernple le mieux connu enVolailles étant le gène de nanisme lié au sexe.La notion de QTL (Quantitatve Trait Locus =
locus de caractère quantitatf) a été introduite pourdésigrer un gène à transmission mendélienne quiexplique une partie de la variance d'un caractèrequanttatif. Quand I'effet d'un QTL est trop faiblepour que celui+i soit révélé directement à partir deI'analyse statisique des performances d'élwage, le
seul moyen pour l"identifier est de combinerI'informaûon sur les performances avec uneinformation génétique apportee par des rnarqueurs'Un marqueur génétique est une séquence d'ADNque I'on sait identifier, généralement par unetechnique de laboratoire (:typage), sans le plus
souueni, d'effet direct sur les caractères mesurés'Pour être uûle, un ilnrqueur doit être polymorphe,
c'est à dire posseder plusieurs formes (allèles) : il
sera possible d'identifiet chez un reproducteurhétérorygote pour ce rnarqueur (ayant reçu deux
allèles difrérents de son pere et de sa mère) celui
des deux allèles qu'il a transmis à chacun de ses
descendants. Chaque nxuqueur étant localisé dansla carte généûque de I'espece' il permet de suiwela transmission du segment chromosomique sur
génome.
Deuxîàrnes fournees de Ia Recherche Avbolc, Tours, &10 cvrÛl 19974 l
Les marqueurs moléculaires sont maintenantdisponibles en nombre sufrsant, grâce auxprogrammes de cartograplue génétique, etpermettent de mettre en pratique le concept anciende la recherche d'association entre caractères etmarqueurs chez de nombreuses espèces d'élevage,dont le poulet (Bidanel et al., 1996; Vignal, L997).Les marqueurs doivent être nombreux et bienrépartis pour qu'il y ait au moins un marqueurgénétiquement proche du QTL recherché, où qu'ilsoit. Chez le poulet, il faut utiliser au moins 150marqueurs.L'identification de QTL nécessite de planifier lacombinaison de I'information zootechnique etmoléculaire dans le cadre de protocoles specifiques.D'une façon générale, ces protocoles reposent surI'analyse de descendances de reproducteurshétéroz_vgotes en des gènes marqueurs (disonsMlM2 pour un gène donné) : si un QTL est situé àproximité du locus de ce marqueur. et si lereproducteur est aussi hétérozygote pour ce QTL(disons QlQ2 et supposons que ce reproducteur areçu Ml et Ql de son père, M2 et Q2 de sa mère),une différence de performance moyenne pour lecaractère sera observée entre les descendants avantreçu Ml de ce reproducteur, et donc le plus soul'entQl. et ceux avant reçu M2. et donc le plus souventQ2 (FIGURE la)
les moyennes de performance selon I'allèle reçu,Ql ou Q2 = Ql{2) que I'on veut pouvoir détecter.Enfin, cette différence QlQ2 étant d'autant moinsbien estimée qu'il y a plus de recombinaisons entreles locus marqueur et le QTL, il conviendra dedisposer d'une bonne couverture du génome par lesmarqueurs. La localisation du QTL est d'autantplus facile qu'il est encadré par deux marqueurspolymorphes, c'est le principe de la méthode de lalocalisation par intervalle, (Lander et Botstein,198e).Nous allons d'abord décrire les différents types dedispositif et discuter les conditions de leur mise enoeuvre pratique, puis les situer dans le contexteavicole avant de conclure sur les perspectivesd'application en sélection avicole.
1. Conception du Dispositif
1.1. Intra-race
On suppose dans ce cas que la proportiond'hétérozygotes Ql/Q2 parmr les reproducteursutilisés est suffisante pour trouver des famillesinformatives. Le déséquilibre de liaison est observéintra-famille quand un marqueur est proche duQTL
Dans le schémadénommé 'filles',
propose par Soller etGenizi (1978), lesdescendants d'unpère hétérozygoteaccouplé à desmères quelconquessont mesurés ettypes pour leurgénotypes aux locusmarqueurs(FIGIJRE la). Cesont donc lesperformancesindivrduelles quisont directementmises en relationâvec les allèlesmarqueurs transmispar les parents.Ce schéma trèssimple a été lepremier proposé
mais il est mal adapté au contexte avicole.Dans le schéma dénommé 'petites-filles', proposépar Weller et al. (1990), les descendants d'un $rehétérozygote sont types pour les marqueurs maisIefret du QTL est estimé sur leur descendance, quin'est 1ms typée (FIGLIRE lb). Ce protocoles'applique directement arx schémas de #lectionutilisant le testage sur desoendance en routine
FIGURE I : Schémas de dispositifs de détecûon de QTL intra-race
b : "petites-filles"
6,GD {æ NQrMl/Q2M2
seuls
génorype au QTL : QIQ? ou Q2Q?
proportion (l-i)n r12 rl2 (l-t\12
r = taur de ræombineiron entre M et Q
Modèl.e d'anolvse P : père + QTL(père)+ effds ræiduels @lia + sa'étique')
Un dispositf de détection doit être conçu pouraugmenter autant que possible la chance d'observerdes familles informatives, c'est à dire desdescendances de reproducteurs doubleshétérozygotes aux QTL et aux nulrqueurs qui leursont liés. Il doit aussi maximiser la chance dedetecter les QTL dans ces familles infonnatives : lenombre d'individus à mesurer doit être déterminéen fonction de la taille de I'efret (différence entre
a : "filles"
cornme c'est le cas chez les bovins laiûers.L'effetdu QTL est estimé par des moyennes deperformances et donc avec plus de précision quedans le schéma "filles". Une adaptation aux especesavicoles peut être envisagee.Un protocole intra-race permet donc de détecterdes QTL qui peuvent être immédiatement utilisésen sélection, en intégrant I'information sur lesmarqueurs dans l'évaluation génétique desreproducteurs (Fernando et Grossman. 1 989).
1.2. Croisement
A I'opposé des dispositifs intra-race, ces dispositifreposent sur I'utilisation de croisements entre racesou lignées aux performances si diftrentes que l'onpeut supposer la fixation aux QTL d'allèlesdifférents dans chaque raceLa stuation extrême, envisageable chez les plantesou pour les animaux de laboratoire, est celle delignées consanguines. dans lesquelles tous les locus(QTL et marqueurs) sont à l'état homozygote. Dansce cas. les individus Fl issus d'accouplements entrereproducteurs (F0) des deux lignees seront tousidentiques et hétérozygotes pour tous les locus pourlesquels les lignées parentales diftraient Lesindividus Fl sont alors accouplés entre eux (ouavec leurs parents homozygotes) pour produire desdescendants F2 (ou "backcross")qui sont mesurés et types(FIGI.JRE 2)Dans cette situation extrême. ledésequilibre de liaison est observéau niveau des populations F2 ouBackcross dans leur ensemble etla présence d'un QTL lié à unmarqueur est detecté globalementet non plus intra famille. Il suffrtde comparer les performancesmo)€nnes d'individus de cespopulations regroupés selonI'ongine grand-parentale (F0) desallèles formant le génotype aumârqueur. En règle générale. undispositif F2 est 2 fois plusefficace qu'un dispositif decroisement en retour car onutilise I'informaûon des méiosesdes 2 parents Fl.En praûque pour les animauxdomestiques, les lignees ou races
- le croisement entre lignees sélectionneesdivergentes où l'étude est ciblee sur I'objectif deselection, qui correspond souvent à un caractèrediffrcile à manipuler en selection classique. Deplus, I'analyse préalable de I'expérience deselection fournit une information utle pour laplanificaton du dispositif (paramères génétiques,variabilité phénotypique, réponse à la selection)'Ce dispositif peut facilement être appliqué auxlignees expérimentales avicoles.- le croisement entre lignées extrêmes (du typepondeuse x poulet de chair) où les parents F0diffèrent par un nombre très élevé de caractères etne sont généralement pas consanguins. Ces ligneesn'ayant pas la même origine génétique, lepolymorphisme aux marqueurs est donc très élevéet le désequilibre de liaison marqueur / QTLimportant chez les animaux Fl. Ce type deprotocole est utlisé chez le Porc (Bidanel et al,1996) et le poulet (voir TABLEAU 1).Ces protocoles bases sur des croisementspermettent donc de détecter les QTL responsablesde la diftrence entre les lignees croisees. Ilsidentifient des régions chromosomiques où il peutêtre intéressant de rechercher du polymorphismedans les populations commerciales. Si I'allèlefavorable est absent de ces populatons, il faut l'yintrodrure par introgression (voir 3.4).
FIGURE 2 : Sctremas de dispositifs de détection de QTL en croisement
@
@
o*l,t * ; QlQl : (1-r)2| 4 t
"ilinii : QrQ2 :dtrt2 |" "F2
iQ2Q2:Pt+ |
consangunes.croisement entre lignees très
différentes pour un ou des caractères augmente laprobabilité d'obtenir des individus Flhétérorygotes pour des gènes d'importanceeconomique et autorise I'analyse des donneesobtenues avec les méthodes applicables en touterigueur aux croisements entre ligneesconsanguines. Deux situatons sont envisagées :
descendants F2 ou BCtypés et mesurés
ne sontCependant,
pasle 1.3. Dispositifs dérivés
Les rés,uttats des dispositifs de croisementsprécedemment décrits étaient analyses enzupposant l'homogénéité des familles F2 ou backcrôis. Dans le cas de populations hétérogènes,
I'approche de detection "intra-race" (analysefamiliale) doit aussi être appliquee. Ce ne sont plus
hétérozygotes Q lM l/Q2M2
croisement en retourQlQ2 x QlQr
lntercrolsementQlQ2 x QrQ2
43
les QTL qui expliquent la différence entre leslignées parentales mais tous les QTL quicontribuent à la variabilité du caractère expriméchez le produit croisé qur sont alors recherchés.Ces QTL pounont ensuite être directement utiliséspour la sélection des lignées parentales. Cetteapproche a été proposee pour un schéma desélecton avicole (Van der Beek et al., 1996), oùl'étage Fl est issu d'un croisement entre lignéesgrand-parentales, il produit ensuite une générationF2 qui peut elle-même être testée sur descendancecroisée.Les races "exotiques" ou les lignées exffrimentalespeuvent posséder des allèles exceptionnels auxQTL contrôlant les caractères qui font I'objet d'unesélecûon. Ces allèles peuvent être detectés encroisant ces races avec une lignée commercialeLa détection débouchedirectement sur I'introgressionde l'allèle favorable par uncroisement d'absorption \,€rsla lignee commerciale
(FIGURE 3). Ce protocole a étéutilisé avec succès chez latomate. où il a permisd'introdurre dans une variétéd'élite des QTL favorables issusd'une tomate non améliorée(Tanksley et al., 1996). Cetteapproche doit pouvoirs'appliquer aux espèces avicoles.
1.4. Cas particulieranomalies ou gènes àqualitatif
il existe chez le poulet denombreuses mutations qulpeuvent avoir une importanceéconomique dans certarns cas(coloration de la peau ou duplumage) et dont la position chromosomique et lanature moléculaire sont inconnues. Lorsque lephénotype permet de reconnaître facilement leshomozygotes porteurs, on peut rechercher desmarqueurs moleculaires liés au gène par laméthode'd'identité-parorigine', mise au pointpour l'étude des maladies génétiques humaines(Houwen et al., 1994). Dans cette méthodecomplètement diftrente des méthodes d'analyse deliaison, on recherche les marqueurs issus d'unancêtre cornmun (porteur de I'anomalie) qui seretrouvent à l'état homorygote chez lesdescendants de ce même ancêtre atteints deI'anomalie. Il sufrt de typer un petit nombre deporteurs du phénotype anormal avec un grandnombre de marqueurs. L'applicaûon de ces étudesest de fournir un test de tlpage pour identifier lesporteurs hétérorygotes d'une mutaton récessive et
de progresser vers I'identification moléculaire de lamutatlon.
2. Mise en oeuvre des dispositifs
2.1. Plan d'accouplement et taille des familles
Les effectifs nécessaires pour détecter un QTL avecune probabilité donnée dépendent de la part de lavariabilité due au QTL et de l'informativité desmarqueurs (nombre, polymorphisme, répartition).La "taille" des QTL en ségrégation dans unepopulatron étudiée étant une inconnue, le protocoledevrait être dimensionné pour la détection de QTLqui soient ensuite valorisables en sélection ouintrogression assistées par marqueurs.Les méthodes permettant d'exploiter atl mleuN
FIGURE 3 : Détection en croisernent suivie d'introgression du QTL
I'informativité des marqueurs se sont peu à peuaffinées. Dans les développements les plus récents.I'origine grand parentale d'un segmentchromosomique, sur lequel la présence d'un QTLest testée, est estimee en probabilité compte tenu deI'ensemble de linformation fournie par tous lesmarqueurs encadrant ce segment. L'utilisation deces méthodes minimise la taille des dispositifs pourune même efficacité de détection.
Dans le cas des protocoles de détection intra-race.les paramètres essentiels sont le nombre de familleset le nombre de descendants étudiés par famille.Pour un nombre total de descendants mesurésfixés, il est nécessaire de réaliser un compromisentre ces deux effectifs : le nombre de familles doitêtre assez élevé pour augmenter le nombre deparents hétérorygotes aux QTL et la taille desfamilles doit être assez grande pour améliorerI'estmation des différences entre descendants selon
deseffet
44
receveur
choix des individus BC
en fonction des marqueurs proches de Qf
:ment en retour
les allèles nurqueurs. Par rapport aux dispositifshabituellemnt uûlisés pour l'estimation desparamètres génétiques, pour un même effectif totalde descendants étudiés, il est généralement plusefficace d'avoir des familles en nombre réduit maisde taille plus grande (par exemple 50 familles de20 frèreVsoeurs plutôt que 100 de 10), (Soller etGenizi, 1978; Knott et llaley, 1992; Luo, 1993). Atitre d'exemple, un protocole 'pettes-filles' mis enplace chez les Bovins comporte au moins unedizaine de pères ayant chacun 50 à 200 fils quisont typés et testés sur au moins 50 petites-filles enproducûon (Georges et al., 1995). Dans cetteespÈce les accouplements ne sont pas planifiés enwe de la détection de QTL et les descendants de3ème génération sont presque toujours des demifrères ou demi-soeurs. En revanche, l'applicationau poulet d'un protocole intra-race ofte despossibilités supplémentaires pour planifier lesaccouplements puisque I'on peut choisir entre laproduction de pleins-frères ou de demi-frèresPlusieurs variantes ont été comparées par Van derBeek (1995), son dispositif le plus puissantconsistait à procréer des frls pleins frères entre eux(étage 2 de la FIGURE 2), qui étaient ensuiteaccouplés à des mères non apparentées dont undescendant est mesuré. Les descendants mesurés(étage 3 de la FIGURE 2) étaient donc des demi-frères ou -soeurs.Dans le cas des protocoles de croisement, laplanification est facile lorsque les lignéesparentales sont homozygotes : comme tous lesindividus Fl sont identiques et hétérozygotes, ilsuffit de raisonner sur le nombre total de F2 quelleque soit la structue familiale. Si, de plus, leslignées sont fixées pour des allèles d'effets opposésà tous les locus contrôlant un caractère, il estpossible de déterminer simplement la taille desQTL susceptbles d'être détectés dans les famillesF2 ou 'backcross' issues d'un croisement entre ceslignees (Lander et Botstein, 1989). A titred'exemple, avec 2 lignees différant en moyenne par3 écafi-types phénotypiques, il faut 270descendants F2 pour détecter avec une probabilitéde 9O%o un QtfL dont l'effet vaut I écart-typephénotypique, er utlisant des marqueurséquidistans de 20cM. L'effectif doit être 4 fois plusgrand pour permettre la détection de QTL 2 foisplus petits.Pour les protocoles de croisement entre raceshétérogènes cornme pour les protocoles intra-race,la planification est nettement moins facile pourplusieurs raisons :- comme il n'y a pas fixaton des allèles des
marqueurs ni des QTL, une proportion variable deparents (Fl dans les croisements) n'est pilshétérozygote pour ces gènes et produit unedescendance non informative (homozygoûe au
QTL) ou peu informatve (homozygotie aumarqueur proche du QTL); il faut donc augmenter
la taille totale du dispositif par un facteur diffrcile àdéterminer, empiriquement relié au degré deressemblance entre les races parentales ,- le plan d'accouplement n'est plus indifférent : il
faut aussi optimiser le degré de parenté desfemelles Fl qui détermine le nombre de grand-parents F0, qui conditonne à son tour laprobabilité d'avoir un QTL en ségrégation ;- les descendants d'une famille (F2 pour les
croisements) sont généralement un mélange defrères et de demi-frères, et la proportion des deuxdoit être planifiée: il semble préférable d'avoir degrandes familles de frères-soeurs issues d'un peûtnombre de mères Fl accouplées à un même pèreF l .Etant donné le nombre important de paramètres àconsidérer et I'incertitude sur les effets du ou des
QTL, la planification d'un dispositif s'effectue aucas par cas, en fonction de I'information prealablesur la variabilité génétique intra- ou entre races etdes contraintes d'élevage. Un exemple est donnépar I'opûmisation du plan d'accouplement d'undrspositif de recherche d'un gène majeur derésistance aux salmonelles (Beaumont et al' 1997).La puissance de 24 protocoles. qui diffèrent par lenombre de pères. de mères et le nombre de soeursaccouplées à chaque père, a été comparée parsimulation, suivant douze modèles génétiques : lesparamètres de ces modèles font intervenir lafréquence de I'allèle favorable, l'existence d'unallèle dominant et la proximité des marqueurs' Ledispositif retenu comporte 25 pères accoupléschacun à 2 soeurs.
2.2. Critères de choix d'un dispositif et stratégiede typageLe choix d'un dispositif dépend d'abord deI'objectif zootechnique. selon que I'on recherchedes QTL pour un caractère bien particulier (projetciblé) ou bien que I'on veut mettre en évidence tousles QTL présents sur un nombre maximum deqrmctères (proJet généraliste). Le deuxièmeélément est le coût total et sa répartition entretypages et contrôle de performances. A titreindicatif, le prix moyen d'un rézultat de typagepour un rnarqueur microsatellite est de 15 F paranimal. Projets ciblés comme projets généralistespewent faire I'objet de dispositifs en race pure eten croisement. Le choix dépend de l'éventail despopulations pouvant en être le support.Lorsque le dispositif utilise les animaux contrôléspar ailleurs dans le cadre d'un schéma de sélection,ia mesure des performances est déjà organisée.Même si des caractères noweaux plus ou moinscoûteux à mesurer pewent être rajoutés, lestlpages représentent le coût le plus important.Dans ce cas, le dispositif à 2 étages (pettes-filles)est préferable au dispositif à I étage (filles) car ilest plus puissant pour un même nombre de typages.
45
Dans le cas d'un protocole de croisement ciblé surun caractère. le coût des typages estimportant parrapport au coût de la mesure du caractère. On peutdiminuer la charge représentée par les typagesgrâce à la mise en oeuvre du typage sélectif, oirseuls sont types les échanûllons correspondant auxextrêmes de la distribution (par exemple, les l0%inférieurs et l0o supéneurs), cependant lesperformances de tous les individus sont incluesdans I'analyse statistique afin de ne pas biaiserl'estimation de I'effet du QTL (Lander et Botstein1989. Darvasi et Soller, 1992) Le raisonnementreste valable si on étudie un groupe de caractèrescorrélés entre eux (Muranry. Goffinet et Santi. nonpublié). Dans le cas particulier du croisement entrelignées consanguines issues d'une base commune.on peut espérer que les régions chromosomiques neprésentant pas de variabilité aux marqueurs necontiennent pas non plus de QTL. Dans ce cas. larecherche du polymorphisme aux marqueurs chezles parents Fl est fondamentale puisque le typagedes individus F2 pourrait se limiter aur régions dugénome polymorphes entre les lignéesEtant donné les contraintes pratiques. le nombred'indilidus t1pés dans les procoles mis en oeuvreactuellement en France ou à l'étranger sur lesdifférentes espèces domesûques varie en général de500 à 1000 n s'agit donc de gros projetsreprésentant fréquemment plus de 100000 typages
3. Spécificités avicoles en ure de la détection deQTL
3.1. Caractéristiques de I'espèce
Les espèces avicoles se caractérisent par unintervalle de génération court et un effectifgénétique élevé. dfi à I'utilisation d'un grandnombre de reproducteurs pil lignée. Le cycle deproduction est encore plus rapide pour laproduction de viande que pour la productiond'oeufs. Ces éléments appellent deux remarques :- I'information apportée par des marqueurs doit
être obtenue rapidement pour être utilisable ;- un reproducteur indtviduel n'a jamais une valeur
très supéneure à celle des autres, car chaquereproducteur contribue à peu près également à lagénération suivante, la 'valeur ajoutee' apportéepar I'information marqueur à un candidat à lasélection ne sera pas exploitée autant que dans unschéma bovin par exemple, le coût de cetteinformatron sera donc déterminant.L'intérêt de I'information apportée par lesmarquerus demeure enter pour les caractèreslimités au sexe car elle peut contribuer à la pré-sélection des coqs sur les caractères de ponte.La variabilité génétique des caractères selectrormésest aussi un paramètre à considérer. L'informationapportée par les marqueurs sera plus utile pour lescaractères où la performance mesurée est un
médiocre prédicteur de la valeur génétique, commec'est le cas pour les caractères de reproduction,d'héritabilité faible.Enfin. les schémas avicoles utilisentsystématiquement le croisement et l'amélioratongénétque porte sur la productivité du produitterminal et la capacité reproductive de la parentalecroisée. Il est donc necessaire que les effets desQTI- soient directement détectés ou ultérieurementvalidés dans la sous populatton où ils serontvalorisés.
3.2. Mise en oeuvre de la détection de QTL
Les caractères pour lesquels il seraitparticulièrement intéressant d'identifier des QTLsont ceux pour lesquels la sélection classique estdifficile ou coûteuse, c'est-à dire les caractères quieigent I'abattage, qui sont mesurés tard ou dansun seul sexe. Tel est notârnment le cas de larésistance aux maladies, la reproducûon, lacomposition corporelle, I'efftcacité alimentaire enponte et la qualité de I'oeuf.Les caractères qur sont mesurés au cours duprocessus normal de sélectton seront plusfacilement étudiés dans le cadre d'un protocole detype intra-race, appliqué aux lignées commercialeset calqué sur le schéma en cours. Pour lescaractères qui ne sont pas mesurés en routine, unprotocole sur mesure devra être monté, soit dansles lignées commerciales, soit à partir de lignéesexpérimentales ou de races originales chezlesquelles ces caractères sont mieux connus. Eneffet, chez le poulet, on dispose de nombreuseslignées expérimentales sélecûonnées de façondivergente à partir d'une même populaûon initiale.Leur intérêt est de maxrmrser la variabilité d'uncaractère sur lequel peu de donnees sontdisponibles. On se réfère à la situation décrite enFIGIJRE 2, en supposant que ces lignees diffèrentpar la fréquence de certains allèles à effets opposés,qui étaient en ségrégaûon dans la populaûoninitiale. Toutefois, il faudra tenir compte dans leprotocole du fait que ces lignees ne sont pasparfaitement consanguines. La présence inévitabled'individus non informatifs dewa être compenseepar une augmentation des effectifs totaux.Le coût d'un programme de détecton pouvant êtreélevé, le choix sera conditionné par I'importanceéconomique du caractère, mais il faut soulignerI'importance de l'étude de caractèresbiologiquement importants, qui pourrait fournir denouveaux outils au sélectionneur et notammentconfirmer le rôle d'un gène candidat ou proposerde nouveaux candidats.
3.3. Exemples de dispositifs de détection de QTLdans les espètes avicoles
Le TABLEAU I présente les prqets de détectionde QTL en France et la plupart de ceux qui sont encours à l'étranger. Ils sont en majorité réalisés encroisement et ciblés sur un objectif zootechniqueparticulier. Les effectifs ne sont pas toujoursconnus avec précision, leur variabilité recouvredifférentes contraintes expérimentales selon lecaractère étudié. Les premiers résultats, obtenusavec des marqueurs couvrant imparfaitement legénome, suggèrent I'identification de QTL pour larésistance à la maladie de Marek en race Leghorn
(Cheng, Vallejo, Bumstead, non publié) etI'implicaton d'une région du chromosome I sur lepoids corporeljeune (Soller, Groenen, non publié).L'existence de QTL sur les caractères de ponte arécemment été suggérée dans un protocole decroisement, mais leur localisation n'a pas étépossible (Lamont et al., 1996).
3.4. Perspectives d'application en aviculture
Les QTL détectés dans les dispositifsprécédemment exposés peuvent être utilisés soitpar sélection intra-race assistee par marqueurs(SAM soit par croisement suivi d'introgression.
TABLEAU I : Dispositifs de détection de QTL en cours chez le poulet ou la dinde
Davs Woe de disoositif obiectif zootechnique contâct tfeférence) eftctifs
France lntra-race
rntra-race
résistance à lasalmonelloseengraissement dinde
C Beaumont(l)SRA - INRAM. Douaire(l)INRA.ENSAR
360
3 2 + 8 4
crorsement entrelignées divergentescroisement entrelignees divergentescroisement entrelisnees diversentes
efficacité alimentairede la poule pondeuserésistance au sarcome deRousengraissement poulet
M. Tixier-BoichardLGF.INRAP. ThoravalSPAP - INRAB. Leclercq, SRAM. Douaire ENSAR
500 F2
130 F2
1000 F2
croisement entre racesextrêmes
résistance à lacoccidiose
M-H Pinard - van der Laan, 800 F2LGF,(2)
Grande-Bretagne
croisement entre racesextrêmescrorsement entre racesextrêmes
'généraliste':poulet
chair / poule pondeusecouvarson
de P. Hocking (z)
Roslin InstituteP. SharpRoslin Institute
4 x 5 0 0F2,|
croisement entrelignees divergentescroisement entrelignees divergentes
engraissement poulet
résistance à la maladie deMarek,à la salmonellose
H. GriffinRoslin InsttuteN. Bumstead (2)
IAH, Compton
,|
80 BC
Pays-Bas intra-race lignées commercialespoulet de chair
de M. Groenen(z) 500 F2,
Finlande croisement entre racesextrêmes
qualité de I'oeuf M. Tuiskula-HaavistoJokionen,(2)
320F2
Israel croisement entrelignées divergentesou enre races
engraissementréponse immunitaireproduction de dindecroissance poulet
A. Cahaner,D. Heller€)J. Hillel; RehovotM. Soller. Jerusalem (a)
150 F2400 + 400,|
144F2,190F3
Australie croisement enûe racesextrêmes
'généraliste':poulet
chair / poule pondeuseÈ. sheldon, (a)
CSIROde 220F2
USA croisement entre résistance à la maladie de H. cheng, R. Vallejotz) 4oo Fz
lienéesdivergentes Marek ADOL,EaLTours 1997s de la Recherche Avicole' Tours 1997 ;
<a >OfVe*. Congrès de IISAG, Tours 1996 '(3) 9ème Conférence europeenne d'aviculture, Glasgow, 1994 ;(4) )OOVème congrès de I'ISAG, Prague 1994;
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- la SAM peut s'appliquer assez facilement s'ilexiste un déséquilibre de liaison intra-race, quipermette d'associer sans ambiguité la présence deI'allèle favorable Ql à I'allèle marqueur Ml. Dansune lignée fermée. d'effectif génétique élevé.comme le sont les lignées commerciales de poulet.le déséquilibre n'existera probablement qu'intra-famille ; il faut alors typer et analyserqystématrquement toutes les familles pour établir àquel allèle rnarqueur est associé I'allèle favorableQl. Cette procédure est coûteuse et impose unetaille de famille suffisante, souvent plus importanteque celle rencontrée en sélection habituelle Laseule situation simple correspond au cas ou lemarqueur est dans le QTL luimême et où lepolymorphisme étudié est la mutation causale- l'introgression suppose d'utiliser des marqueurs
très proches du QTL pour le suivre. etéventuellement des marqueurs couvrant tout legénome pour éliminer le reste du génome donneur(Hospital et al.. 1992). Pour accélérer le retour augénome receveur, rl faut identifier les individusporteurs du QTL qui ont perdu la plus grandeproportion du génome donneur à la faveur desrecombinaisons aléatoires Très souvent. cesindrvidus sont rares et le succès du protocoledépend de la productrvité numérique de l'espèce.La sihration du poulet est assez bonne sur ce planet quelques indrvidus peuvent sufftre en effet àintroduire un QTL dans une population ensélection (Hillel et al. 1993, Yancovrch et al.1996). Cependant, le QTL reste associé pendantquelques générations à un segment chromosomiquede type 'donneur', plus ou moins grand.- lorsque plusieurs QTL indépendants sont
détectés dans différentes lignées, leur connaissancepourra contribuer à la planification desaccouplements ou au choix des lignées à croiser.afin de réunir des QTL à effets complémentaires oucumulatifs ; on parle alors de construction degénotypes assistée par marqueurs
Conclusion
La relaûve facilité d'élwage des espèces avicolespermet de mettre en oeuvre plusieurs types deprotocoles de détecûon de QTL Cette facilité nedoit faire oublier ni les hypothèses sous-jacentes mles contraintes concernant I'effectif total et lastructure familiale du dispositif. Si on veut pouvoirdétecter des QTL d'effet moyen, pour lesquels ladifférence entre allèles représente un demiécart-type phénotypique, il est inevitable de devoir typerplus de 500 individus. Un dispositif trop petit estmoins cher mais encore trop cher s'il n'aboutit à
rien ! On ne peut se limrter à un dispositif de tailleplus limitée (moins de 500 individus) que srl'existence d'un gène à gros effet a été suggéréepréalablement, soit par le suivi de la réponse à lasélection ou une analyse de ségrégation ou uneidentification dans une autre espèce.
Références
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PROGRES DE LA CARTOGRAPIIIE GENETIQUE CHEZ LA POULE
Vignal Alain
I.N.R.A. - Labmatoire de Génétique Cellulaire, 31326 Casanet-Tolosan
Résumé
Bien que le nombre de marqueun génétiques dévelop@s au niveau international soit en progrès constant, liacouverture homogène du génome de la poule n'est pas encole prfaite, en partie à cause dme prticularité ùlcaryotype de ceme espèce, qui présente un grand nombre de chromosomes dont beaucoup, appelésmicrochromosomes, sont de rès petite taille. L'intensification des recherches, notamment dans le caùe du projetErnopéen Chicklvlap regrcupant 7 laboratoires, se poursuit dans plusieurs directions. La couverture du génomedoit ête estimée correctement ptr une appoche intégée de développerrent des caræs génétique et cyogénétique.Parallèlement à lhpproche au hasarrd, des stratégies complémenaires de développement de mrqueurs dans desrégions ciblées du génome dernont êre mises en æuwe afin de compléter la caræ. Le développement d'outilsnouveaux pour la localisation de gènes, aidant à lia réalisaton de cartes comparées entre esSces et pennettânt èbénéficier des avancées réalisées chez lhomme et la souris, sont égalementprévus.
Abstract
Progress in the chicken genetic map
Although the number of genetic malters develqed at the international level is in constant prcgress, compleæcoverage of the chicken genome is not yet achieved, partly due to the particular caryotype of this specie,composed of a large number of cbromosomes, irmongst which many, called microchromosomes, are of a verysmall size. Further investigations, like those crried out in the framework of the European ChickMap hojectinvolving 7 laboratories, are curied out. The genome coverage must be estimated conectly by an integratedapproach of genetic and cyogenetic map development. Together with the randmr approach, srategies of trgeredrrarker development towards specific regions of the genome will be used to compleæ the map. New tools aimed
at the mapping of genes will be develope( helping in the establishment of ompared maps bet$,een species,enabling ûo benefit ftom the detailed human and mouse genetic maps.
fntroduction
Les marqueurs génétiques peuvent avoir plusieursapplicæions dqns le domaine agronomique, dont lesprincipales sont laide à Ia détection et à la localisationde gènes impliquâs dens l'expression de 6acÈr€squalitatifs ou quantitatifs (QTL ou Quantitative traitLoci), I'aide à la séleaion ou laide à I'introgressiongénique pour une espèoe domée (tixier-Boiclrd etal., 1997).l.a méthode la plus courallrment utiliséeactuellement afin d'ide,lrtifier les régions portânt bgènes puticipant à I'exp'ression de cæactèæs défnis,consiste à test€r des mmqueurs génétiques dans mepopulation pÉsentmt des væiatims pbé'notypiquasporn le cæctère. La co-ségrégation d'allèles de certainsdes mrqueurs avec des valeurs phénotypiques pounaindiquer une liaison gé,nétique et" si la position sur le
génome du ou des mtrqueurs liés est @nnue, unelocalisation génétique porn le camc!èrc pourra êtresuggérée. Afin de réalis€r de telles rechercheq il estnécessaire de pouvoir diqposer dm éseau èmtrqueNrni génétiques informatifs, c'est à dircpésentant des allèles différens et sé$égeant èmanière me,ndélienne dans la population à éÛdie'r'espaoâs régulièrement sur tout le génome. Ce réseaude marqueurs cmpose la ctrte génétique de I'espèce' àchaque c,homosomedevant oonesem0re un groupe èmflqueurs liés e,lrte eux, 4pelé groupe de liaison.Cirâoe aux dévelryements r@nts des tecbniques èbiologie moléculaire, les mtqueu$ gtrtquesmoléculaires ac'tuelleme,nt employés dét€ct€nt dlpolymorphisure, correspmdant ou non à des gènes' auniveau mêrne de I'ADN. Ces maquerns pennettent laréalisaton de cmes génétiques à bauæ densité, tellesque celles réalisées chez lhomme @ib et al., 1996) ou
Dewiètttcs Journées de laReclurclv Avicolc,Tours, &10 avril 1997 49
chez des espèces modèles en biologie comme la souris(Dietrich et al., 1994). Des cartes génétiques de densitémoyenne ont également été réalisées pour les espècesmammifères bovines et porcines Q,evéziel eta1.,1995 ; Archibald et al., 1995) et des gènes, telsque le gène RN ayant un effet sur la qrnlité de laviande porcine (Milan et a1., 1996) ou des QTLsagissant sur la croissance et I'engraissement chez leporc (Andersson et al., 1994) ou sur la productionlaitière chez la vache (Georges et aI., 1995) ont étélocalisés grâce à I'utilisation de marqueurs proverumtde ces cartes.
Cbezla poule, la première carte génétique, composéede l8 locus Épartis en 5 groupes de liaison, a étépubliée par F. B. Hutt en 1936 (Hutt, 1936),constituant ainsi le premier exemple réalisé chez uneespèce d'élevage. Cetæ première carte, appelée la euteclassique, a été étendue et est composée actuellementd'une cinquantaine de marqueurs phénotypiques telsque le cou nu, la polydactylie ou les æufs bleus, maisaussi de nurqueurs dont l'étude nécessite une analyseen laboratoire, tels que les groupes sanguins (Bitgoodet Somes, 1993). Une carte généûque moléculaire èdensité moyenne est également en cours de réalisationpour cette espèce, gr'âc€ à un effort de collaborationinternational, défini en 1992 lors du premier workshopintemational sur la cartographie de la poule de laSociété Intemationale de Génétique Animale (ISAG).En raison de la structure particulière de son caryotype,composé de quelques macrochromosomes et d'un grandnombre de microchromosomes, le développement èla carle génétique de la poule rencontre des difficultésspécifiques.
1. La cartographie des génomes : différenteséchelles en fonction des applications
Tout comme il existe des cafies géographiquesréalisees à des échelles différentes et portant desindications différentes, selon les applicationsauxquelles elles sont destinées, il existe différentstypes de cartes représentant un génome, chacune ayantson utilité, ses avantages et limites.
L'intégraton de la cæte génétique avec les différentsauhes types de cartes : cytogénétque, moléculiaire, parhybrides somatiques inænffcifiques ou par hybridesd'irradiation, permet d'augmenær sa puissanced'utilisation. Toutes ces cartes ayant des degrés èrésolution et & facilité de mise en ceuwe différ€nts,elles pennettent des applications sffcifiques et sontdonc complémentaires. Cette intégration entre lesdifférenæs cartes est réalisée grâce à certains destrurqueurs, localisés dans plusieurs denEe elles, etservant donc de liens. Dans ce même but d'utilisaton
efficæe des cartes, le plus grand nombre possible ègènes est intégré. Ceci permet la réalisation de ctrTescomparées ente es@ces et de pouvoir proposer desgènes candidats sur des critères positionnels aussi bienque fonctionnels, lors & la localisation génétque ècaractères phénotypiques.
1-1. La carte cytogénétique
La cytogénétique s'occupe de définir la représentationdu complément chromosomique ou caryotype desespèces. Dans un caryotype, les cbromosomes sontgénéralement représentés au stade de la métaphase etsont colorés pm des techniques pennettânt Ce révélerdes bandes spécifiques de chaque paire. L'utilisaton ètechniques d'hybridation in situ de fragments dADNsur métaphase, avec révélation radioactive oufluorescente (FISH), permet leur localisaton sur lacarte cytogénétique. Ceue cafie pennet donc dhvoirune vue d'ensemble de la localisation des gènes sur legénome, mais reste d'une résolution grossière. Deplus, sa réalisation nécessite des sondes de taillesuffisante pour pouvoir visualiser le signaldhybridation.
l-2. La carte génétique
La caræ génétque est construite par l'analyse de laségrégation des allèles correspondant à des rurqueursdans des fanilles ou des croisemen8 adaptés. Leparanèûe ainsi mesuré est le taux de recombinaisonméiotique ente les marqueurs. Ce taux est exprimé encentimorgans ou cM, qui est un centième de Morgan,unité correspondânt à un intervalle statistique où seproduit une recombinaison à chaque méiose. Plus deuxnnrqueurs sontproches, plus la probabilité dobserverune recombinaison entre eux est faible et donc plus ladistance en cM est faible. Inversement, entre deuxmtrqueurs éloignés, le caux de recombinaison seraélevé. Une ségrégation indépendante des allèles de deuxmarqueus poura suggérer soit une disance physiquetrès grande, soit une localisation sur deuxchromosomes différents, soit I'existence d'un pointchald de recombinaison ente les deux marqueurs. Deproche en proche, les marqueurs sont ainsi reliés enûeeux en réseaux appelés groupes de liaison et le nomb'rede groupes de liaison pour une cre satrnée doitccrespondre au nombre de chromosomes. Afind'assigner les groupes de liaison aux chromosomes, ilest cependant nécessaire de développer des mmqueunpouvant ête localisés à la fois sur la carte génétique etla cafie cytogénétique.
L'intéret de la cme génétique est qu'elle peut êûecomposée aussi bien de marqueus moléculaires que èrnrquettrs phénotypiques, la seule condition pourpouvoir utliser un rnarqueur étant I'existence drrrpolymorphisme avec des allèles ségrégeant dans lapopulation éffdiée. Par exemple, dans le cas d\nepathologie monogénique, les allèles ségrégeantpouront êfe la résisunce ou la sensibilité et ellepourra ainsi être considéée comme un marqueu et êtrelocalisée génétiquement. Dans les cas plus complexesdes pathologies mutgéniques et des caractÈresquantitatifs, la situation est plus compliquée, maisseule la cartographie génétique pouna mener à leurlocalisaton.
1-3. La cartographie parsomatiques inter-spécifiques
hybrides
Une noisième méthode de carographie utilise laæchnologie des hybrides somatques inter-sffcifiques.Une cellule donneuse d'une espèce est fusionnée avecune cellule rec€veuse d'une aute espèce, généralementhamster ou souris. Seuls certains chromosomes oufragments de cbromosomes de la cellule donneuse sontretenus dans les cellules hybrides obtenues. Unecollecton & cellules hybrides peut ainsi êneconstituée et cæactérisée pour le contenuchromosomique provenant des cellules donneuses. Partest de la pésence ou absence du fragment d'ADNcontenant le gène étudié, une localisation égionalegrossière peut ainsi facilement ête obtenue.
l-4. La cartographied'irradiation
par hybrides
De la tecbnologie des hybrides sonratques inter-spécifiques a été dérivée celle des hyb,rides dirradiation.La différence réside dans le fait que la cellule donneuseest inadiée aux rayons X avant la fusion et leschromosomes sont ainsi cassés. Les fragments retenusdans la lignée hybride sont alors de petite taiUs. p6ur
réaliser la cartogaphie par hybrides d'iradiation, unpanel drme centaine de [gnées cellulaires hyb'rides estconstitué. La carographie de maquatrs à I'aide de ætype de panel se fait par test de présence ou ahencBdes fragments d'ADN conespondant dans les lignées.Si deux ma[queurs sont proches, la probabilité èI'exisænce dun point de cassure entre eux est faible etils seront le plus souvent soit présents ensemble, soitabsents ensemble dqns les lignées. La @umce ècassure enûe deux marqueuni sera ainsi un indicateude leur distance. Les distances sont exprimées ancentiRays ou cR. La cartographie à I'aide des hybridesdirradiation ne peflnet dutliser que des mffqueurs
moléculaires, mais elle pennet d'obtenir unerésolution supérieure à celle de la caræ génétique etelle pemret d'intégrer dans la même carte, desmarqueurs polymorphes et monomorphes, facilitantainsi la cartographie de gènes
1-5. La carte physique moléculaire
Il s'agit du degé le plus fin de cartographie desgénomes. Cetæ caræ se situe à l'échelle moléculiaire etconsiste en lbrdonnancement de clones chevauchants,contenant des portions d'ADN. Un gfoupe de cloneschevauchants est appelé contg. Sauf dans le cas ûrgénome humain où une première génération de ce t1ryede caræ à été éâlisée pour le génome enter, descontigs ne sont réalisés que pour des régions précisesqui repésentent un intérêt particulier, généralementdans le but didentifier le ou les gènes présents.
1-6 La cartographie comparée
Iæs groupes de synténie sont des groupes de gènes oude marqueurs présents ensemble sur un mêmecbromosome. Le but de la caftographie comparée estde localiser des gènes homologues das des espècesdifférenæs, afin de mette en évidence lévenûrelleconservation de groupes de synténie. Comme on peutsuppposer que I'ordre des gènes à I'intérieur dutgroupe de synténie conseryé entre deux espèces, seraégalement conservé, la carographie corprée peflnetdefairebénéficier à une espèce, des avancées éaliséesdans une autre.
2. Les outils pour la réalisation de la cartegénétique chez la poule
2-1. Les familles de référence
Pour détenniner la distance génétique entre detxmarqueurs, il est nécessaire dénrdier la ségrégaton èleurs allèles sur les mêmes méioses et donc dans lesmêmes familles. Ainsi, bien que les mrqueurs soientdéveloppés pæ différents laboratoires, leur ségrégationallélique est analysée sur des familles de Éf&€nce.Celles-ci sont au nombre de dern pour la cdtographiede la poule, sont toutÊs deux de type back-cross et ontété reconnæs lors du prerrier workshop intemationatsur la crtographie & la poule. L'une a éé réatisée àCompton (U. K.), ente deux lignées de Leghornblanche différant pour la résisance à la salmonelloseet comporte 56 descerdans (Bumstead et Palyga'
5 l
Facilité deDéveloppemen
Utilisation Reproductibilité Couverturedu génome
Polymorphisme Specificité visà vis d'un
Iocus
RAPDAFLPRFLPIRS-PCRMinisaælliteMicrosatellite
++++++++++++
+++++++++++
+++
+++++++
+++++++
+++++++++++
+++
+++
++++++++
+T
++++
++++++
TABLEAU 1
1992).; l'autre à été réalisée à East Lansing (J. S. A.),enûe une lignée de Leghom blanche et une lignée èpoule de Jungle et comporte 52 descendants(Crittenden et al., 1993). Ce demier croisement à étéoptimisé par l'utilisation de lignées tès différentes,afin dhugmenter les chances & rouver drpollmorphisme pour les ûnrqueurs éûrdiés.L'utilisation de ces deux familles pour localiser lesrurqueurs génétiques a permis détablir deux cartes,appelées carte de East Lansing et carte de Compton.Les deux cartes sont reliées enûeælles grâce à dænnrqueus qui ont été analysés dans les detxcroisements.
2-2, Les marqueurs utilisés
Il existe différens types de marqueurs génétquesmoléculaires, pouvant êre utilisés pour réaliser descartes génétiques, chacun ayant des caractéristiquesrendant leur utilisation appropriée à des applicationsdifférentes (tableau 1). Les marqueurs de type RAPD(Random Amptified Polymorphic DNA), AFLP(Amplified Fragment Lengh Polymorphism) ou IRS-PCR (hterspersea Repeat Sequences-PolymemseChain Reaction) sont tous trois basés sur desméthodes permettânt I'analyse simultanée de plusieurslocus dans une population donnée, sans sélection àpriori des locus polynorphes et sans utilisationd'outils préalablement développés peffiettânt èreconnaître ces locus. Ils pemrettent donc I'analyserryide de la ségégaton de locus polymorphes dansune population, mais ne permettent que rèsdifficilement de Eansposer les résultats à une autrepopulation. En revanche, les marqueurs de type RFLP(Resricton Fragment Lengh Polymorphism),minisatellites (dans le cas de l'utlisation de sondesspéciliques) ou microsatellites, sont spécifiques drmlocus détenniné sur le génome et pennefient dorrcgénéralerrent de réaliser des liens enûe des crtesdévelop'pées dans différentes populations ou enfre les
Les marqueurs génétiques moléculaires
différens types de cartes (cytogénétque, génétique ouaute). Une étape préalable de développement d'unesonde (RFLP, minisatellite) ou d'un couple d'amorcesspécifiques pour la PCR (microsatellites) estnécessaire. Malgré leur informativité faible, limitantleur utilisation dans un grand nombre de populations,les marqueurs RFLP pésentent I'intérêt de pouvoirconespondre à des gènes, si ils ont été développes pal'utlisation de sondes ADNc.
La ændance actuelle pour développer les ctrtesgénétiques moléculaires consensus pour les génomesanimaux, est d'utliser les marqueurs de typemicrosatellite, hautement informatifs et co-dominants,spécifiques chacun d'un locus et d'utilisation facile etautomatisable par PCR et analyse sur sfuuenceurs àADN. L'étape la plus lourde du développement initialde chaque rnrqueur est répartie entre les différentslaboratoires participant à la construction de la cmte,chaque laboratoire développant une fraction desilmrqueurs. L'avanrâge des microsatellites par la suiteest la grande probabilité d'observer du polymorphismeà un locus d'intérêt dans différentes populations, grâceau nombre élevé d'allèles que ces marqueurs permettentde mettre en évidence.
Pour la recherche de liaison avec des ctrâctèrcsquantitâtifs ou qualitatfs dans des croisements,I'utlisation de marqueurs de type AFLP commence àse généraliser, car ils permett€nt l'étude rapide et sansdéveloppement spécifique préalable, d'un nombreimportant de locus, tout en présentant descamctéristiques de reproductibilité satisfaisantes.Ainsi, bien que le taux de polymorphisme pour chaquelocus anonyme analysé soit faible, leur grand nomb'revisualisé simultanément peûlet de générer unequantité appréciable de données de cartographie.Cependant" il est difficile actuellement d'effectuer uneanalyse en codominance de la Eansmission des allèlesdes marqueurs AFLP, limitant leur utlisatonoptimale aux réhoctoisements. Une utlisation hmtrqueurs AFLP se fera toujours conjointement avec
52
des mæqueurs spécifiques de locus, généralementmicrosatellites, alin de pouvoir se reffru sur la cætegénétique.
3. Le génome de la poule et la cartographie
3-1. Les particularités du génome de lapoule
Comme cbez la plupart des espèces d'oiseaux, lecâryotype de la poule présenæ un grand nombre èchromosomes, dont seuls quelques-uns peuvent êtercconnus facilement. En effet, seules les huit plusgrades paires de chromosomes, ainsi que leschromosomes sexuels Z etW, ont été décrits dans lecaryotype international en bandes G et sont appelésmacrocbromosomes (K. Ladjali et al., 1993). Les 30auEes paires de chromosomes, appelésmicrochromosomes, sont difficiles à distinguer dansles prépæation de métaphases polrr la cartographiecytogénétique et sont de ce fait classés arbirairementpar ordre décroissant de taille. Malgré leur petite taille,les microchromosomes ont une importanceconsidérable dans le génome de la poule, cr les ilôtsCpG, qui sont des séquences dADN riches en di-nucléotdes CpG non méthylés, présenæs dans larégion 5'de beaucoup de gènes de vertébnés, y sontmajoritairement concenfiés McQueen et al., 1996).La densité de gènes serait donc supérieue dans lesmicrochromosomes que dans les macrocbromosomes.La structure du génome de la poule, avec seschromosomes présentant des différences de taille siimportrntes, pose plusieurs problèmes pour laéalisaton de la carte génétque.
3-2. Lt carte génétique de la poule
Pou I'espèce poule, plusieurs cartes génétiques ont étépubliées, éalisées à I'aide de différents types èmarqueurs, soit RFLP (Bumstead et Palyga. 1992),soit RAPD, RFLP et IRS-PCR (Levin et al., 1994),soit intégrant un nombre croissant de mmqæusmicrosatellites (Cheng et al., 1995 ; Crooijmans s1al., 1990.l-acææconsensus acûrelle, réalisée sur lesdeux familles de référence de East Lansing et èCompton, contient 648 marqueurs, dont 143cone.sponOent à de.s gènes de fonction oonnue ouinconnue et 248 sont des mtrqueurs de t5æemicrosatellite (Mariani et al., 196) (tableau 2).Cependant, d'autrres cattes sont générées par desprogrammes de recherche de QTLs réalisé.s pmgénotypage de populations adaptéas. Ainsi, Bmarqueurs non localisés à I'aide des familles è
TABLEAU 2 Marqueurs de la caræ génétique de tapoule
référence, le sont souvent glâce à l'étude de cescroisements, pour lesquels le nombre de méiosesinfomratives peut varier enre 100 et æs de 1000,selon l'informativité du matqueu (Groenen et al.,1996). Le nombre supplémentaire de maryueurs ainsicartographiés peut être estimé à plus de 150, portant lenombre total de rulrquettrs & type microsatelliteplaés sur les cafies génétiques de la poule à plus è400.
Si la cartographie génétique des macrochronosomesne pose pas de problèmes particuliers par rapport àcelle de chronosomes de marmifères, il n'en va piude même pour celle des microchromosomes. En effet'la sfiatégie habituelle de réalisation des ctrtesgénétques passe par un développement au hasard èrru[queurs, qui sont ensuite localisés les uns parapport aux auÛes. cetæ stratégie apliquê à laconstruction de la carte génétque de la poule a gffi'quelques grands gf,oupes de liaison correspondant auxmacrocbromosomes et tm bien plus grand nonbre èpetits groupes de liaison et des mtrqueursindépendants, dont lappartenance chromosomique estdifficile à établir, mais dont la plupart correspmdentvraisemblablerrent à des microcbromosomes(Tableau 3).
Si I'on considère les marqueurs indépendânts coûrmefaisantpartie dun groupe de liaison composé dm seulIrurqueur, le nmbre de groupes de linison de la categénétique qui est de 71 pour la crte de East Lansinget 61 pour la cre de Compton Clableau 3)' estlargement supériern au nombne de paires
cbromosomiques, qui n'est que de 38 plus lescbromosomes sexuels. Beaucoup de ces groupes èliaison doivent donc êre synténiques, c'est à dircappafienir à un même chromosome. Ceci a pu ênedé,monrré pour les plus græds gtoupes de liaisoncore.spondant aux macrochomosomes, soit ptr
lvlqueurs Nombne
Gènes exprimés, identifiés ou nonMiqosat€llitesMinisatellitesRétrovirus endogènesRFLP, RAPD ou autre
r432483930188
Total &8
53
Nombre denulrquetlÎs
Nombredegroupes de
liaisonEast Lansing
Nonbre degroupes de
liaisonCompton
I (marqueursindépendans)
2J
45678()
l0tr-202r-404l-100
30656ôJ
15000744
2r61 14J
0I2II532
Total groupes >2 marqueurs 4 l 39
Total groupes 7 1 61
TABLEAU 3 Taille etnombre de groupes deliaison des cartes de East Lansine et
de Compton
intégration ente les cartes génétiques et la wæcytogénétique, soit grâce aux données d'intégratonenûe les cartes de East Lansing et de Compton. Ainsi,le chromosome 1 est couvert par deux groupes èliaison de la carte de East Lansing et par hois $oupesde liaison de la caræ de Compton (Figue 1). Pour sixaufres cas, 1l a été démonné que deux groupes &liaison de la caræ de Compton appartiennent à unmême chromosome. L'absence de liaison foræ enredes groupes de liaison synténiques, peut êEe due soit àdes points chauds de recombinaison dans les régionschromosomiques concærnées, soit à un manque èmarqueus dans la zone, soit à des efiettrs ègénotypage affectant les calculs de distances génétique.En tenant compte de ces données, le nombre ègroupes de synténie connus de la carte génétique,contenant deux ou plus de marqueurs est de 39 pour lactrte de East Lansing et de 31 pour la carte ëCompton. Si I'on inclut les nuryueurs indépendants,ce nombre est de 69 et 52 respectivement, ce quiindique que de nouvelles synténies enEe groupes è
liaison et ilurqueurs indépendants doivent encore êtreEouvées.
La compléton de la couverture en nurqueurs de lacrte génétique de la poule coflrmence à êhe réalisée,notâmment en ce qui conceme la ftaction desmacrochromosomes. La taille des cartes de EastLansing et de Compton est respectivement de 2500 et3400 cM environ. Si I'on tient compte des exuémitésdes groupes de liaison et des marqueurs indépendants,on peut estimer que la couvertue est bien supérieurre à4000 cM pour les deux cartes. Cette taille importantede la cææ génétique, relativement à la taille physiquedu génome, est vraisemblablement ùre arxrecombinaisons dans les microchromosolnes, qui sontparticulièrement nombreuses, compte tenu de leurfaible contenu en ADN (Rodionov, 1996). Ainsi,comme le rapport entre la taille gfuétique et la taillephysique est plus élevé pour les microcbromosomesque pour les macrochromosomes, et que le
FIGURE I Intégration des cartes génétques etde la crte cytogénétique
La positon des marqueurs sur la carte cytogénétiqueest indiquée par les traits verticaux plaés en regard èl'idéogranrme représentant le chromosome. Lesgroupes de liaison de la carte génétique sontreprésentés par des traits verticaux, cbaque trait courthorizontal représentant la position d'un marqueur oud'un groupe de marqueurs. Les traits obliquesreprésentent les liens entre les deu caræs génétiqueset entre les cartes génétiques et la carte cytogénétique.
FIGURE 2 Rapport enfre les tailles génétique etphysique pour les
macrochromosomes et lesmicrochromosomes
Les recombinaisons dans les micbromosomessemblent êtne un phénomène obligatoire, comme leIaisse supposer le comptage de chiasmas ou de nodulesde recombinaison (Rodionov, 1996). Dans cettehypothèse, le rapport entre la taille de lâ cmegénétique et celle de la cræ physique est plus élevéque pour les macrochromosomes (B). A cause trflumque de marqueus génétiques sur lesmicrochromosomes, la caræ n'est pas satuée à @jour (C).
4. Futurs développements ; Ie projetEuropéen ChickMap
Le projet ChiclcùIaP, coordonné par D. Burt (RoslinInsttute) et financé par la CEE pour trois ans,re$oupe sept laboraûoires Européens dont deutfrançais, et vise à développer cbezla poule les outilsnécessaires aux projets de localisation génétque èQTLs, de cartographie fine des régions mises enévidence et finalement d'identification des gènes lesgouvernant par les méthodes du clonage positionnel.Les objectifs majeurs du projet sont :- De développer une carte de marqueurs microsatellitescouvrant le génome complet et de développcr dæcollections de marqueus utilisables sur séqrcrrceursautomatiques.- D'intégrer la carte génétique et cytogénétique afin ès'assur€r de la couverture complète du génome, ce quiest particulièrement complexe dans le cas du poulet, àcause de I'existence des rricrochromosomes, difficilesà distinguer en cytogénétque.- De dévelo'pper des méthodes pour isoler desmarqueurs supplémentaires dans des régions précisesdu génome.- De développer une carte comparative avec lesgénomes de manrmifères, afin de définir des zones èsynténie @nservées, peflnetlant d'utliser les donnéesparticulièrement denses des cart€s humaines et èsouris.- De développer une collection dhybrides dirradiation,pennettant de faciliær la carûographie de gènes.
Nou,e implication au laboratoire se situe plusparticulièrement dans la carûographie fine desmicrochromosomes en développant une collecton èsondes permettant de les identifier en cyogénétique(Fillon er al., 1997) et en intégrant les groupes èliaison de la carte génétique avec cesmicrochromosomes ainsi identifiés. Nous participonségalement au développement de maqueursmicrosatÊllites, en dirigeant nos efforts sur la fractiondes microchromosomes.
Conclusion
La densité en mffqueurs de la cate génétique de lapoule est dès à présent satisfaisanæ et peflnet d'initierdes travaux de reùerche de QTLs dans des croisementsappropriâs. Cependant, les efforts de développementdoivent encore êue poursuivis, afin de combler lesrégions déûcientes en mfiNerrrs, qui sont plutôtsituées sur les microcbromosomes. L'inEoduction ètecbniques complénrenaires telle que celle bhybrydes dirradiatim sera un atout supplémentaire
acrochromosomes
développement au hamrd de marqueurs pennet unecouverture physique régulière du génome, le ésultatest une densité moindre de la carte génétique desmicrochromosomes (Figure 2).
Des groupes de synténie contenant les mrqueusindépendants et laplupartdes petts groupes de liaisondoiventencoreête consEuits par intégration entre lescaræs génétiques et la cafie cyûogénétique, peflnettantI'assignation dss groupes de liaison à deschromosomes définis. Mais surtout, la saturation de lacarte, obtenue en développant de nouveaux mtrqueurs,soit de manière aléatoire, soit en concenFant lesefforts sur des régions spécifiques, permettra à termedobtenir un groupe de liaison par cbrornosome. Cesdeux approches devront être menées en concentrant leseffors srn la fraction des microcbromosomes.
3-3. Conservation avec les mammifères
En comparant la carte de Ia poule avec celles èmamnifères, la conservation de 19 groupes èsynténie a été observée, impliquant ente 2 et 6 locus(But et al., 1996). La conservation de groupes èsynténie peut ooncemer les microchromosomes (Pitelet al., 1997).
20 cM
hA c
Microchromosomes
) )
pour approfondir la conaissance du génome,pennettânt d'augmenter I'efficacité des prograrmes èrecherche de gènes.
Références
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)6
ETTQUETAGE DES MICROCHROMOSOMES DU POULETPAR DES MARQUEURS MOLECULAIRES
EN UTILISANT L'HYBRIDATION IN SITU EN FLUORESCENCE.
Fillon Valérie', Morisson Mireille', Zoorob Rima', Auffray Charles', Douaire Madeleine', Vignal Alain'
'Laboratoire de Génétique Cellulaire, Centre INRA de Toulouse-Auzeville,BP27,31326 Castanet Tolosan,France,'Génétique Moléculaire et Biologie du Développement, CNRS UPR 420, 94801 Villejuif, France, 3
Laboratoire de Génétique, ENSAR, 65 rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes Cedex, France.
Résumé
Le caryotype du poulet comporte 78 chromosomes (2n=78) dont 60 microchromosomes de très petite taille,quasiment indiscernables les uns des autres et donc classés approximativement par ordre de taille décroissante.Ces microchromosomes sont typiques des génomes aviaires, et leur importance génétique est loin d'êtrenégligeable. En effet, ils représentent environ un tiers du génome total, et semblent contenir une très grandeproportion de gènes. Pour les identifier et attribuer ainsi à chaque paire un contenu génétique (groupe deliaison), nous avons choisi de les étiqueter à I'aide de sondes moléculaires par hybridation in situ en fluorescence(FISH). Ces marqueurs sont alors visualisés simultanément sur les chromosomes. A ce jour, l5 paires ont étéétiquetées ; des groupes de liaison pourront ainsi être attribués à des microchromosomes clairement identifiés etpermettre d'accéder à de nouvelles connaissances concernant les gènes portés par cette partie du génome.
Abstract
Labelling of chicken microchromosomes by molecular markersusing two-color lluorescentin situ hybridization (FISH)
The chicken karyotype is constituted of 78 chromosomes (2n=18) including 30 pairs of indistinguishablemicrochromosomes usually ordered arbitrarily by decreasing size. Microchromosomes are typical of aviangenomes. They represent one third of the chicken genome and seem to carry a high gene density. In order to
distinguish each microchromosome and to facilitate linkage group assignments, we realized two-colorfluorescent in situ hybridization (FISH) experiments using simultaneously different probes. Presently, 15
different microchromosome pairs have been individualized. This will enable the assignment of linkage groups
to the microchromosomes, and thus contribute to the assessment of the gene content for this part of the genome.
Introduction
Le caryotype du poulet comporte 78 chromosomes(2n=78) répartis en 9 paires de macrochromosomes(dont les gonosomes ZZ pour les mâles ou ZW pourles femelles) comparables en taille à deschromosomes de mammiÊres, et en 30 paires demicrochromosomes (figure l). Ces derniers sont detrès petite taille et quasiment indiscernables les unsdes autres lorsque I'on établit le caryotype : ils sontsimplement classés approximativement par ordre detaille décroissante. La standardisation du caryotype dela poule n'a donc pas pu être précisée au delà de lahuitième paire d'autosomes (Ladjali et al., 1993). Les
microchromosomes sont typiques des génomes
d'oiseaux, et leur importance génétique est loin d'êtrenégligeable (Rodionov, 1996, pour revue). En effet,ils représentent environ un tiers du génome total(Tegelstrôm et Rytman, l98l), et semblent contenirune grande densité de gènes puisque les îlots CpG y
sont concentrés (Mac Queen et al., 1996). A ce jour,
plusieurs gènes y ont été localisés (Ponce de Leon et
Burt, 1993), mais seule une estimation de la taille desmicrochromosomes concernés a pu être donnée. Par
ailleurs, d'autres études ont montré I'existence d'unchiasma par microchromosome au moment de laméibse (Rahn et Solari, 1986; Rodionov et al., 1992).Il y aurait donc au moins une recombinaison parmicrochromosome et leur taille génétique serait donc
Deuxièmes journées de la Recherche Avicole, Tours, 8-18 avril 1997 ) t
considérable par rapport à leur taille physique. Pouraméliorer la connaissance du génome de la poule, descartes géniques sont actuellement en cours dedéveloppement (Burt et al., 1995; Vignal, 1997).
Un problème majeur de la réalisation des cartes estqu'il est pour I'instant très difficile d'attribuer àchaque paire de microchromosomes un contenugénétique (groupe de liaison) puisqu'il est impossiblede les identifier. Nous avons donc choisi d'étiqueterces microchromosomes à l'aide de marqueursmoléculaires. En effet, la technique de I'hybridationin situ en fluorescence (FISH; permet de les visualisersous forme de signaux fluorescents directement surles chromosomes métaphasiques observés aumicroscope photonique.
Stratégie
Nous avons d'abord sélectionné des sondes hybridantsur des microchromosomes à partir de clones issus debanques d'ADN génomique de poulet à grandesinsertions (figure 2).
FIGURE 2 : schéma rappelant le protocole desélection des marqueurs de microchromosomes.
Banque d'ADN génomiquede poulet
JFISH
Clones de microchromosomes
Comme il aurait été fastidieux d'hybrider les sondessélectionnées deux 'à deux dans toutes lescombinaisons possibles, la taille approximative dechacun des microchromosomes marqués a été estiméeet des groupes de deux ou trois sondes concernant deschromosomes de taille voisine ont été constitués.Après avoir vérifié que les sondes de chaque groupeétaient différentes, nous avons réalisé deshybridations des groupes pris deux à deux, chacunétant révélé par un fluorochrome de couleur différente(figure 3).
FIGURE 1 : photographie d'une métaphase de poulet(mâle), 2n=78 dont 60 microchromosomespunctiformes.
FIGURE 3 : schématisation du protocole deI'utilisation des groupes de sondes.
Estimation de la tailledes microchromosomes marqués
I+Constitution de groupes de 2 ou 3 sondes
(microchromosomes de taille voisine)
I+FISH simultanée en simple couleur
des sondes d'un même groupe
I+FISH en double couleur entre les groupes
Lorsqu'un microchromosome a été étiqueté par deuxmarqueurs et donc deux couleurs, les sondes desgroupes concernés ont été hybridées deux à deux pourdéterminer celles qui identifiaient le mêmechromosome. Chaque marqueur moléculaire a ainsiété affecté à une paire de microchromosomes.
58
Matériel et méthodes
Préparations chromosomiques
Les chromosomes sont obtenus à partir de culturescellulaires de fibroblastes d'embryon de pouletsynchronisés par 0,8 mg/ml de thymidine (Sigma)puis bloqués en métaphase par 0,06 pg/ml decolcémide (Gibco). Le choc hypotonique est réaliséclassiquement avec du sérum de veau fætal dilué(l:5), puis les cellules métaphasiques sont fixées parun mélange d'ethanol et d'acide acétique (3:1) etétalées sur des lames porte-objet.
Clones
Les clones testés proviennent de banques d'ADNgénomiques à grandes insertions, réalisées dans desvecteurs de type BAC (Bacterial ArtificialChromosome) ou PAC (P1-derived ArtificialChromosome). Ils ont été choisis au hasard ou aprèsle criblage préalable pour la présence d'unmicrosatellite (CA)".
FISH en simple couleur
Selon la technique décrite par Yerle et al. (1992),
100 ng d'ADN sont marqués à la biotine parincorporation de biotin-16-dUTP (Boehringer
Mannheim). Après une hybridation de 24 heures, lessondes sont révélées en vert par de I'avidine-fluoresceine isothiocyanate (FITC, Vector) et leschromosomes sont colorés en rouge par de I'iodure depropidium (Sigma) ajouté au milieu de montage(Vectashield, Vector).
FISH en double couleur
Pour distinguer chaque microchtomosome, dessondes différentes sont hybridées simultanément.Deux groupes de 2 ou 3 sondes sont marqués par
I'incorporation de digoxigénine (digoxigenin-11-
dUTP, Boehringer Mannheim) ou de biotine (biotine-
l6-dUTP, Boehringer Mannheim). Les sondesmarquées sont ensuite resuspendues ensemble ethybridées 24 heures avec la préparation
chromosomique. Les sondes marquées à la biotinesont ensuite révélées en rouge avec de I'avidine-Texas red (Vector), alors que celles ayant incorporéde la digoxigénine sont détectées par du FITC de
couleur verte (Boehringer Mannheim). Leschromosomes sont colorés en bleu par du DAPI (4',
6-diamidino-2-phénilindole-dihydrochloride, Sigma)ajouté au milieu de montage (Vectashield, Vector).
Observation des lames
Les lames sont observées avec un microscope Zeiss(objectif à immersion, grossissement 100) et un
minimum de 20 métaphases sont analysées pour
chaque expérience. Les chromosomes qui présentent
des signaux d'hybridation sont photographiés avec unfilm couleur 400 ASA Ektachrome.
Résultats
1. Repérage des sondes de microchromosomes
Des clones issus de différentes banques d'ADNgénomique de poulet ont été hybridés afin de repérer
les sondes concernant des microchromosomes. Ainsi,
à partir de 29 BAC et de 32 PAC, nous avons
sélectionné 12 marqueurs de microchromosomesprésentant une intensité de signal suffisante et donc
pouvant servir de sondes de référence. Nous avons
également rajouté deux gènes et un cosmide à ce
panel pour disposer finalement de 15 marqueurs(tableau l). Il est à noter qu'un des clones BAC a
donné des signaux d'intensités différentes, donc
discernables, sur deux paires de microchromosomes.
TABLEAU 1 : liste des marqueurs utilisés pour
constituer le panel d'identification de
microchromosomes.
Clones PAC 6
Clones BAC 6
Clones cosmidiques l
Cosmide du gène de la synthétase
des acide gras (Le Fur et al., 1996)I
Cosmide du gène du comPlexemajeur d' histocompatibilité(Guillemot et al., 1988)
I
lotal 15
59
2. Etiquetage des microchromosomes
Les 15 sondes ont été réparties en 6 groupes de 2 ou 3clones identifiant des microchromosomes différents.Après une série de 15 hybridations en double couleurde ces groupes pris deux à deux dans toutes lescombinaisons possibles, deux clones se sont localiséssur le même microchromosome. Ils ont pu êtreidentifiés après les hybridations successives dessondes des deux groupes concernés. Le nombre desondes-étiquettes de microchromosomes a donc étéramené à 14. Sachant par ailleurs qu'un des clonespermet d'identifier deux paires de micro-chromosomes, un total de l5 paires différentes a doncainsi été étiqueté par ces I4 marqueurs.
Conclusion
Crâce à cette collection de sondes, Ia moitié desmicrochromosomes sont aujourd'hui identif iables.D'autres clones seront progressivement rajoutés afinde compléter l'étiquetage de ces petits chromosomes.Mais, au fur et à mesure de la progression du travail,i l sera de plus en plus diff ici le de marquer unenouvelle paire.Par ailleurs, des marqueurs génétiques dérivés dessondes utilisées sont en cours de développement etvont permettre de compléter les données decartographie génétique. De nouveaux groupes deliaison pourront ainsi être attribués à desrnicrochromosomes clairement identifiés. DansI'arvenir, i l deviendra ainsi possible d'évaluer la tail legénétique des microchromosomes et leur taux derecombinaison et d'accéder à de nouvellesconnaissances concernant les gènes qu'i ls portent.
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60
ASSOCIATION ENTRE POLYMORPHISME DES GENES DE LA SYNTHETASE DES ACIDESGRAS ET DE L'ENZYME MALIQUE ET VARIABILITE DE L'ETAT
D'ENGRAISSEMENT CHEZ LI\ DINDE
Sourdioux Michell2, Delabrosse Yvefie2, Douaire Madeleine!
' Laboratoire de génétique animale. INRA-ENSA de Rennes, 65 rue de St Brieuc, 35042 Rennes Cedex2 Béûna Sélection. Trédion. 56250 Elven
Résumé
Une recherche d'associations entre polymorphisme d'ADN et variabilité de l'état d'engraissement est effectueechezla dinde. Deux échantillons d'animaux, de structures différentes, permettent en particulier l'étude de deuxRFLP sur deux gènes candidats, celui de la synthétase des acides gras et celui de l'enryme malique Unepremière association est suggérée après I'analyse effectuee sur 32 femelles prélevees au hasard. La deuxièmeanalyse est réalisée sur un échanûllon constitué de 8 familles de demilpleines soeurs de pere hétérozygote pourI'un des RFLP précédemment cités. Sur ce dispositif mieux équilibré et permettant de separer les effets desgènes candidats de ceux des autres polygènes, les associations entre polymorphismes et variabilité del'engraissement sont confirmées, identifiant ainsi les gènes de la synthétase des acides gras et de I'enrymemalique comme deux candidats majeurs du déterminisme de la variabilité de l'engraissement chez la dinde.
Introduction
La connaissance partielle du déterminisme génétiqued'un caractère d'intérêt zootechnique dewaitprochainement permettre de compléter les méthodesde sélection actuellement basées sur l'application dela théorie de la génétique quantitative. Pour cela. ilconvient de rechercher des structures génétiquesassociées à la variabilité du caractère. Compte tenudes connaissances acquises sur les mecanismesbiochimiques sous-jacents à la variabilité deI'engraissement chez les oiseaux. une étude dupolymorphisme d'ADN de quelques gènes ditscandidats a pu être proposée chez la dinde. Il s'agitdes gènes codant pour des enzymes clés de larynthèse hépatique des lipides, à savoir, l'acétyl coAcarboxylase. la synthétase des acides gras, la 9désaturase et I'enzyme malique. Le choix de cesenzymes est en partie guidé par les résultats desmesures d'activité @annister et al., 1984 ; Legrand etal., l9E7 ; Asante et Bulfield, 1988 ; Legrand etHermier, 1992) et de taux d'ARNm @ouaire et al.,1992) obtenus à partir de poulets de lignéesselectionnees de façon divergente sur leur étatd'engraissement (Leclercq et al., 1980).
Plusieurs RFLP des gènes precédemment cités ont étéidentifiés sur différentes souches de dindes(Sourdioux et al., 1996). Les associations entregénotypes et niveaux d'engraissement sont iciétudiees pour $urtre d'entre eux daru une souche.L'accent est mis en particulier sur un polymorphismedu gène de la synthétase des acides gras, MspVpFS,présentant 3 haplotypes B, C et F, et unpolymorphisme du gène de I'enryme malique,
HindIIVem. également présent sous trois formesallèliques A, D et F. Les deux autres polymorphismespris en compte dâns cette étude concernent les gènesde I'acétyl coA carboxylase et de la 9 désaturase,dénommés respectivemen! TaqUacc, MspI/9Sma3. 7.
1. Matériels et méthodes
1.1. Les animaux
Les travaux sont conduits sur une lignee commercialeen sélecton (Bétna Sélection). Un premieréchantillon est constitué de 32 femelles. Ces animauxprélevés au hasard sont majoritairement non-apparentés.Un deurième echantllon de 84 animaux est consûtuéde 8 familles de demilpleines soeurs de pèrehétérozygote pour au moins un des deux RFLP, dugène de I'enryme malique, HindIIVem, ou du gène dela synthétase des acides gras, MspVpF5. Il s'agissaitainsi déquilibrer les génotypes de ces deux RFLPdans la descendance.
1.2. Typages
L'ADN génomique des animaux est exlrait à partirdes cellules sanguines après separation des noyaux,digestion à la protéinase K, et précipitation desprotéines en solution saline Mller et al., 1988). Les4 RFLP sont obtenus après digestion soit par HindIII,MspI, ou TaqI et hpridation par les sondesmoleculaires decrites TABLEAU l.
Deuriàrnes Joumées de b Recherche Avicolc, Tours, &10 aryil 19976 1
Gène Sonde Nahrre dufrasment
Origrne
Acétyl coAcarboxylase
Synthétasedes acidesgras
Enrymemalique
9 désaturase
pF5
acc
em
9Sma3
ADNgénomique/2,3kb(incluant le lerexon codant)
ADNcpartieU2kb
ADNccompleV2kb
ADNgénomique/3.7kb(incluant exons4. 5 et en partre
6)
El Khadir-Mounier
e t a l ,r996
Le Fur etal ,1996
Back eta l . t986
Langlois.1995
TABLEAU I : Caractéristques des sondes utilisées
I.3. Variables étudiées
L'état d'engraissement est évalué par trois types demesure. Sur le premier échantillon d'animaux.l'évaluation a lieu in vivo par une mesure all\ultrasons @usseil, 1987) puis après I'abattage par lecalcul du rapport de poids de peau et gras sous cutanéde la cuisse sur le poids de cuisse. Sur le deuxièmeechanûllon ces deux me$ues sont complétées d'undosage direct des lipides de la cuisse, pardétermination de I'extrait à I'oryde diéthylique(extracteur Soxtec) afin d'améliorer la précision deI'estimation de l'état d'engraissement.
1.4. Analyses statistiques
La comparaison des niveaux d'engrarssement enfonction des génoq'pes aux divers RFLP est effectuéepar analyse de variance. Pour I'analyse du premieréchanûllon. le modèle suivant est appliqué :
l i ir,= P+>.RFLP1+eqr,
ou .lY, est la mesure du caractère pour I'individu È de
génotlpe"l au RFLP i.
Pour le deuxième échanûllon, I'effet associé augénot'?e de chaque RFLP est testé dans un modèlepartiellement hiérarchique incluant un effet père etmère intra père comme suit :
! i1n = P+ 1+ Mi( |)+RFLP +e,,0,
oit liitt est la mesure de I'individu de génorype k de
mère j et de pere i. Pour I'analyse de la teneur enlipides (extmction Soxtec), ainsi que pour la mesrue
noù Goo et (i,k
âux ultrasons le poids vif est intégré cornmecovariable. L'introduction d'un effet père et mèreintra père perrnet de prendre en compte le caractèrepolygénique du déterminisme de I'engraissement etainsi de mieur évaluer les effets éventuels associésaux gènes polymorphes étudiés
Une analyse des effets associés aux haplotypes (effetsmoyens de substitution) des deux RFLP HindIII/em etMspVpF5 a également été réalisée sur cet échantillonà partir du calcul des contrastes suivant (Pinard et al .lee3) :
ZoG* -G,*)
sont les niveaux d'engraissement
mo-vens des genot)'pes où sont respecilvemenlprésents les haploqpes h (haplonpe étudié) et r(haplotype pris comme référence).
2. Résultats
Aucune association n'a été observée entre le nileaud'engraissement et les génotlpes aux RFLP des gènesde l'acétyl coA carboxylase (Taql/acc). de la 9désaturase (MspI/9 Sma 3 7)
2.1. Etude du polymorphisme MspVpFS du gènede la synthétase des acides gras.
L'analyse des animaux du premier échantillonsuggère I'existence d'une association statistique entrele génotype au polymorphisme du gène de lasynthétase des acides gras. MspI/pFS. et le nlveaud'engraissement. En effet, les probabilités du test Fd'analyse de variance sont de 0,11 et 0.08respectivement pour la mesure par ultrasons et pourle rapport de poids de peau sur poids de cuisse. Danscet échantillon où 5 des 6 génotypes sont représentés(le génotlpe C/C est absent), les animaux les plusmaigres sont de génotype BÆ puis FÆ. Entre I et 2écart-types phénotyprques séparent ces deuxgénotypes des trois autres
Cette liaison entre le polymorphisme MspI/pF5 etl'état d'engraissement semble être confirmée surl'échantillon constitué de 8 familles de demi/pleinessoeurs. La probabilité associée à l'effet du génotlpeMspI/pF5 est respectivement pour les variables demesure aux ultrasons, de rapport de poids de peau surpoids de cuisse, et de teneur en lipides, de 0,07,0,29et 0,10. La figure I présente les moyennes de teneuren lipides de la cuisse en foncûon du génotype desanimaux. Il apparaît clairement entre les génotypesBÆ et C/C d'une part, et le génotype FÆ d'autre part,une différence d'environ 1,5 écart-type, différencesignificatve (au seuil 57o) dans le cadre de lacomparaison multiple des moyennes. Ce classementsuggère donc (comme dans I'analyse du premier
62
echantllon d'animaux) que l'haplotype F est associé àune diminuûon de l'état d'engraissement ou que leshaplotypes B et C sont associés à une augmentationde la teneur en lipides. Cette tendance peut êtrecorroboree par I'analyse des effets associés à chaquehaplotype, efrets moyens de substitution (Falconer,1989), calculés par la méthode des contrastes. Ainsila zubstitution (au hasard) d'un haplotype B par unhaplotype F entraîne, dans l'échantillon d'animauxétudié, une diminution moyenne de 1,72%o de lateneur en lipides (p{,12).
FIGURE I : Teneur en lipides de la cuisse (en pour-cent de la matère seche) selon le génotype au locusMspVpF5
(F/F) (B/c) (c/F) @Æ) (c/c) (B/B)
Génotl/pê au locl|s IrËpUpFE
2.2. Etude du polymorphisme HindIIVem du gènede I'enzyme malique.
Dans le premier echantillon, une associaton entre legénotype au polymorphisme HindIIVem et l'étatd'engnissement estimé par le rapport de poids depeau sur poids de cuisse est suggéree par les résultatsde I'analyse de variance (50,15).Toutefois, cettetendance ne semble pas se retrouver lorsque l'étatd'engraissement est estimé par ultrasons (laprobabilité du test F est de 0,50). Cette divergence enfonction de la méthode d'estimaton de létatd'engraissement se confirme dans I'analyse deI'echantllon de stnrcture familiale. En effet, alors quela probabilité du test F est de 0,85 pour I'analyse de lamesure aux ultrasons zuggérant une absenced'association enûe le polymorphisme du gène deI'enryme malique et la mesure de I'adiposité parultrasons, elle est de 0,33 et 0,30 pour respectivementle rapport de poids de pea.u sur polds de cuisse et lateneur en lipides de la cuisse. Bien que lesprobabilites soient encore élevées pour ces deuxdernières variables, la comparaison des moyennes pargénotype montre une difiérence (significative au æuilde 5%Q entre les animaux de génotypes FÆ (maigrc)et D/D (gras). La différence entre ces deux gtoupesest d'environ 1,3 ecart-type phénotypique(FTGIJRE 2).
FIGURE 2 : Teneur en lipides de la cuisse (en pour-cent de la maûère seche) selon le génotype au locusHindlIUem
32b
ï
24.æa r r & ffi
J fl!ffi
o- - ^a J l
;I:s8 xÉ - -gÊo
A 2 4coF
o=! . "t o ' -l,
to
Ë t t=oÊo! e r-o
"'to
(D/R (A/F) (r'lA) (A/D) (D/D)
Génorype au locus l'lindlluêrn
L'analyse des effets associés aux haplotypes dupolymorphisme HindIIVem conforte I'hypothèsed'association avec les variables de poids de peau surpoids de cuisse ou de teneur en lipides de la cuisse(TABLEAU 2). Ainsi, le classement de I'ensembledes génotypes, et les effets de subsûtution des troishaplotypes suggèrent I'existence de trois niveauxd'engraissement diftrents associés au\ troishaplotypes et se combinant de façon quasi strictementadditive.
TABLEAU 2 : Effets moyens de substitution deshaplotypes au locus HindIIVem pour les variablesd'estimation de l'engraissement
Variable Probabilitédu contraste
Teneur enlipides de lacuisse (% dela MS)
Mesure auxultrasons(pts)
Rapport depoids de peausur poids decrusse
0 , 1 70,03
0.550,47
0,100.14
31,3b 32,01b
Tï
T Tffi25,5a
#ffi
Efret moyen desubstitution
ADF
ADF
ADF
2.06+ 1,473,1811,48
0
1,80+ 3,012,13+2,98
0
0,69+0,420,60+0,41
0
63
Discussion et conclusion
L'ensemble de ces résultats tend à démonuerI'existence d'une association entre un polymorphismedu gène de la synthétase des acides gras, unpoll"morphisme du gène de I'enryme malique, et lalariabilité de I'engraissement chez la dinde. La portéede ces résultats est principalement limitée par lafaible taille des échantillons sur lesquels ont étéeffectués ces analyses, et par le fait que I'effet testésur l'état d'engraissement est, dans les modèlesstatistiques utilisés. directement affecté auxpolymorphismes tyÉs. L'étude de la transmissionintra famille d'un haploty,pe par rapport à un autre,sur un échantillon de grande taille, permettrait unemeilleure analyse et une validation de ces résultats.Cependant. les résultats sont obtenus dans deu:iéchantillons indépendants et de structures différentes(animaux non apparentés. familles de demi/pleinessoeurs). ainsi que dans une autre souche de dinded'origine génétique diftrente (donnees nonprésemées. Sourdioux et al.. 1996). Ils permettentdonc de considérer les gènes de la synthétase desacides gras et de l'enz.v-me malique comme descandidats maJeurs dans I'explication de la variabilitéde l'état d'engraissement chez la dinde
Références
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64
LOCALISATION DU GENE DE LA SYNTHETASE DES ACIDES GRAS DE LA POULE DANSUNE REGION DU GENOME CONSERVEE ENTRE UN MICROCHROMOSOME AVIAIRE
ET LE CHROMOSOME 17q IIUMAIN.
Pitel Frédériquer, Fillon Valériel, Le Fur Nathalie2, Vignal Alainr
t Laboratoire de Génétique Cellulaire, INRA, Castanet-Tolosan, France, 2laboratoire de Génétique,INRA-ENSAR Rennes. France.
Résumé
La synthétase des acides gras (,F75) est une enzyme-clé de la lipogénèse et joue probablement un rôle crucialdans la variabilité du poids de tissu adipeux abdominal du poulet de charr. Nous avons localise ce gène sur unmicrochromosome de poulet par hybridation in situ en fluorescence. Un polymorphisme a été mis en évidencedans différentes lignées de poulet après amplification d'un fragment du gène FIS (de 626 paires de bases),digestion par I'enzyme RsaI et analyse de conformation en simple brin. Les deux familles de référenceinternationales pour la cartographie génique du poulet se sont révélées informatives pour ce polymorphisme, etle gène FAS a été localisé sur les groupes de liaison E3l (carte américaine) et C25 (carte anglaise). Le groupeC25 contient également. à 3.6 cM du gène FAS,le gène .À/DPrK (Nucleoside Diphospho-Kinase) localisé sur lechromosome humain 17 (dans la région q2.l), sur lequel est également localisé le gène FAS (q2.5). Nous avonsdonc ici conservation de synténie entre un microchromosome de poule et un chromosome humain.
Abstract
Localization of tbe avian fatty acid synthase gene to a conserved region between a chickenmicrochromosome and human chromosome 17q.
The fatty acid synthase (FZS) is a key enzyme of lipogenesis, and may play a crucial role in the weightvariability of abdominal adipose tissue in the growing chicken. We have localised this gene on amicrochromosome by FISH, using a cosmid probe containing a genomic fragment of the avian FIS gene. A626bp long fragment was amplified by PC& and showed polymorphism in different avian lines after digesttonu'ith RsaI and Single Strand Conformation Analysis. Both the East Lansing and Compton reference familieswere informative with this SSCP and the F,4S gene was assigned to linkage groups E3l and C25 respecûvelyon the East Lansing and Compton maps. These groups were already associated through marker COM93. TheC25 linkage group contains also the.VDP,( gene (3.6 cM to ̂ FZS), located on human chromosome l7q2.l. TheF?S gene being also located to human chromosome 17, in the region q2.5, tTis is the first demonstraûon of$'nteny conservation between an avian microchromosome and a human chromosome.
Introduction
La synthétase des acides gras, ou .FZS pour "FattyAcid Synthase", est une enzyme majeure impliquéedans la biosynthèse des acides gras à longue chaîneà partir de I'Acétyl Coenzyme A. Elle convertitl'Acétyl-CoA et le Malonyl-CoA en palmitate. Cegène joue par consequent un rôle primordial dansle métabolisme du gas. En particulier, lavariabilité de poids du ûssu adipeux aMominalchez le poulet en croissance peut être en partieconûôlee par ce gène @ouairc et al., 1992).Comme la quantité de gas est d'une importanceeconomique non négligeable dans les lignées depoulet de chair, une connaissance précise des gènesimpliqués dans I'expression de ce caractèrequanttatif pourrait être utile dans les programmesde selection.
Notre objectf dans ceffe étude était de localiser legène .E4S sur la carte génique du poulet, ce quiconstitue un pas important vers I'analyse génétiquede I'implication de ce gène dans le c:tractère"quantité de gtas" qui nous intéresse.
Nous disposions des sfuuences des ADNc codantpour le gène FIS publiées chez le rat (Amy et al.,1992), la souris @aulauskis et Sul, 1989), I'oie(Kameda et Goodridge, l99l) et le poulet (Huanget al., 1994).
Matériel et méthodes
Localisation génétique
Les reactions PCR @olymerase Chain Reaction)ont été effectuees à I'aide de deux oligonucleotdes
Deuxièmes fournées de la Recherche Avicolc, Tours, 8-10 avril 199765
choisis à partir de la séquence du gène IZS depoulet drsponible dans la banque de donnéesEMBL sous le numéro d'accès J03860, dans larégron 3' non codante: FASU: 5'-TCAGAAGGGTGGAAGTGAG-3,, FASL: 5'.AGGTCTCCTCTGTATCATAG.3'.
La température d'h)ôridation pour ce couple est de57 iC. Le mélange réactionnel contenait 20 ngd'ADN génomrque, 200 pM de chaque dNTP, IpM de chacune des deux amorces, 1,5 mM deMgClr, 20 mM de Tris-HCl (pH 8,a), 50 mM deKCI et une unité de Taq polymérase (Gibco BRL).Le fragment amplifié (de 626 parres de bases) a étédigéré par 5 U de RsaI, et analysé aprèsdénaturaton sur un gel non dénaturant(AcrylamideÆisacrylamide (49/I) + Glycérol 5%)pour visualiser un polymorphisme de conformationen simple brin (SSCP : Single StrandConformation Polymorphism, Beier" 1993) aprèscoloration à I'argent (Budowle et al.. I99l).
Un polymorphisme a été observé dans chacune desdeux familles de référence (Compton. U. K.. etEast Lansing, U. S A.) utilisées pour construire lacarte génétique du poulet (Bumstead et Palyga.1992 ; Crittenden e/ al.. 1993)
Localisation cytogénétique
Les métaphases ont été obtenues à partir decultures de fibroblastes d'embryons ayant subi unedouble synchromsation à la thymidine (0,8 mglml,Sigma). Les cultures ont été anêtées par 0.06mglrnl de colcémide (Gibco), et fixées par lesprocédures habituelles (éthanoVacide acetique 3 : l).Suivant les méthodes décntes par Yerle et al.(1992), cent nanogrammes du cosmide Fcl6 (LeFur el al., 1996) ont été marqués à la biotrne parrandom priming (incorporaton de biotin-16duTP,Boehringer Marurheim). La sonde a été hybridée lnsi/z pendant 24 heures en présence de 40 pgd'ADN de poulet soniqué et détecté par FITC(avidin-fluorescein isothiocyanate, Vector). Leschromosomes ont été contre-colorés par de I'iodurede propidium (Sigma) ajouté au milieu de montage(Vector).
L'analyse des lames a été réalisee avec unmicroscope (Zeiss) en fluorescence, et 43métaphases ont été observees. Les métaphasesportant un signal fluorescent ont étéphotographiees sur un film couleur EktachromeASA 4OO.
Résultats et discussion
Localisation génétique
Un fragment du gène FAS de 227 paires de bases.obtenu après drgestion par RsaI du fragment de626 paires de bases amplifié par PCR, a montré unpolymorphisme de conformaûon en simple brindans les deux familles de référence. Deux allèlesont été observés, et le parent Fl était hétéroz-vgotedans les deux cas. Ce polymorphisme dans la partie3'-non codante du gène de la synthétase des acidesgras du poulet nous a permrs de localiser ce gènesur le groupe de liaison C25 de la famille deréference anglaise (Compton), et sur le groupe deliaison E31 chez la famille américaine (EastLansing) (Fig l) Nous savions déjà que ces deuxgroupes de liaison étaient équivalents. puisqu'ilscontenaient tous les deux le marqueur COM93Une donnée intéressante réside dans le fait que legène FIS est lié, sur la carte anglaise. au gèneNDPK (Nucleoside Di-Phosphate Kinase) Cesdeux gènes sont localisés sur la carte humaine surle bras q du chromosome 17 (Jayakumar at a/.1994. Backer et al.. 1993\
Localisation cytogénétique
Parmi les métaphases obsewées. 32 ('|+'yi\montraient un signal fluorescent sur une paire demicrochromosomes.
Comme nous avons assigné le gène E{^l du pouletsur un microchromosome par hybridation in .çitu. etqu'il est génétiquement lié. chez la poule. à ungène également situé sur le chromosome l7qhumain, nous pouvons supposer qu'une région duchromosome l7q humain est conservée sur unmicrochromosome aviaire.
Le chromosome 17 humain est en grande partieconservé sur le chromosome I I de la souris (HGM,1993) et est homologue au chromosome 12 porcin(Goureau et al.. 1996). Une conservation des'îténie a également été observée entre desportions du chromosome I7 humain et lechromosome l0 chez le rat, 19 chez les bovins et1l chez le mouton (HGM, 1993). La conservationde groupes de synténie a déjà été observée entre lepoulet et d'autres espèces (rernre par Bluft et al.,1995), mais ces régions conservées sont enmajorité localisées sur des macrochromosomes, cesderniers étant les plus souvent étudiés. Ce résultatpermet d'espérer que la cartogaphie comparéeentre le poulet et les especes les mieuxcartographiees actuellement poura être dweloppeeavec succès, même dans des régions génomiquesrestreintes comme les microchromosomes.
66
FIGURE 1 : Localisation du gène FZS chez le poulet. Comparaison avec la catte humaine
HUMAIN POULET
UK C25
coM93 US 831
r 9
o
r 9
r 9
1 9NDPK
ADL32
coM93
NDPK
FAS
FAS, ADLl84
ADL2gO, H33B
HSA 17
Conclusion
Outre cet intérêt en cartographie comparee, lesrésultats apportés par ces travaux permettent de faireavancer l'intégration des cartes génétque etqrtogénéûque du poulet, qui est un des objectifsimportânts de la cartographie du génome aviaire àI'heure actuelle (Vignal, 1997).D'autre part, l'éhrde du polymorphisme du gène F.4Spounait prochainement êÎre effectuée dans descroisements appropriés à la détection de QTL(comme un croisement entre une lignê grasse et unelignee maigre par exemple). La mise en évidenced'un tel polymorphisme poura nous permettre, dansI'avenir, de déterminer s'il existe une liaison entre cegène et une région du génome impliquee dans laquantité de gras. Même si ce gène n'intervient pasdans le phénotype observé, une analyse génétiquepeut permettre d'exclure la portion du génomeentourant ce gène en tant que région intéressantepour le catactère, le gène intervenant alors commesimple marqueur génétique.
Remerciements
Nous remercions L.B. Crittenden, H. Cheng et N.Bumstead pour nous avoir fourni les echantllonsd'ADN des familles de référence internationales, etMadeleine Douaire pour nous avoir donné le cosmideFcl6.
Références
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MICROCHROMOSOME
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67
ROLE DE L'INSULINE DAI{S LA REGULATION DU METABOLISME CHEZLE POULET
Taouis Mohammed
Endocrinologie de la Croissance et du Métabolisme, Station de Recherches Avicoles. NOUZILY.
Résumé
Le poulet est caractérise par une hyperglycémie (291) et une relative insulino-résistance. Notre laboratoire adans le passe montré que le récepteur de I'insuline est exprimé dans diftrents tissus du poulet (foie. muscle.cerveau etc...) et que sa structue moléculaire est similaire à celle du récepteur des mammifères (Simon et al:1986 ; Simon et Taouis, 1993). Recemment, nous avons cloné et séquencé le gène codant pour une proteinereprésentant le substrat majeur de la tyrosine kinase du recepteur de I'inzuline (IRS-I) (Taouis et al., 1996) etcaractérisé la Pl3-kinase, enzyme impliquee dans le transport de glucose et des acides aminés. chez le poulet(Gillet et al , 1996). Le but de notre travail était de démontrer le rôle de I'insuline dans la régualtion d'IRS-l etde la PI 3-kinase en fonction de l'état nutriûonnel. En effet, le jeûne réduit la phosphorylation de tRS-l etI'activité PI 3-kinase dans le foie mais pas dans le muscle et qui sont restaurées après réalimentation desanllnâux.
Introduction
L'insuline est considéree comme hormoneanabolisante dont les actions métaboliques etmitogéniques favorisent le développement des tissusen augmentant leur capacité de synthèse et destockage des lipides et des proteines ainsi qu'enaugmentant I'actMté mitoûque. Dans les drxdernières années une progression considérable a étérealisee dans la compréhension du mode d'action deI'insuline chez les mammiferes. En particulier. leclonage et le séquençage du substrat majeur durecepteur de I'insuline : IRS-I ont permi decaractériser cette proteine clé dans le mécanismed'action de I'insuline. En effet, après la liaison deI'insuline à son récepteur celui ci est autophosphoryléet phosphoryle à son tour des substrats endogènesdont IRS-I. La phosphorylaton d'IRS-l est realiseesur des résidus tyrosine localisés dans desenvironnements sÉifiques : Y)OOM ou YNDCvIpermettant à IRS-I d'activer d'autres protéines tellesque la PI-3 kinase, enzyme responsable de latranslocation des transporteurs de glucose en réponseà l'insuline. IRS-I peut aussi s'associer à d'autresproteines intervenant dans la qynthèse proteique,lipidique ou activant I'expression génique et lamultiplicaton cellulaire.
Chez le poulet les connaissances cocemant le moded'action de I'insuline jusqu'à L992 était limitées auxétudes du recepteur et de la régulaton de son activitétyrosine kinase en utilisant des zubstrats artificiels.Ces études ont montré que chez cette especehyperglycemique et relativement resistante àI'insuline exogène et possédant une insulinehyperactive, le récepteur de l'insuline est fonctionnelet présente les mêmes caractéristiques moléculaires et
enzymatiques que son homologue decrit chez lesmammiferes. Toutefois. pour la compréhension durôle de I'insuline dans la régulation du métabolismeprotéique. glucidique et lipidique dans les tissuscibles (muscle. foie et tissu adipeux) il étaitindispensable d'identifier un ou plusieurs substratsendogènes du récepteur. Nous avons dans un premiertemps cloné et sequencé l'homologue d'IRS-l chez lepoulet. étudié son expression pendant ledweloppement embryonnaire. La régulation de laphosphorylation d'IRS-l par la prise alimentaire aété étudiee dans le muscle et le foie. Nous avons aussicaractérisé la Pl3-kinase dans le foie et dans lemuscle et étudié sa régulation par la prisealimentaire.
Résultats
1. Clonage et séquençage d'IRS-1
Comme la région codante d'IRS-l chez lesmammifères n'est pas intérrompue d'introns, nousavons tenté d'isoler I'homologue du gène codant pourIRS-I à partir d'ADN génomique par PCR. Les:rmorces utilisees ont été selectionnees par alignementdes sequences des mammifères et le couple d'amorcechoisi encadrait toute la régron codante. Un fragmentde 3,1 kb a été amplifié et correspond à la tailleattendue. La sequence d'acides aminés deduitemontre que IRS-I du poulet contient 1240 acidesaminés. La sequence d'acides aminés d'IRS-l duponlet présente une identité de 9IoÂ, 83yo, E4yo et640/o avæ respectivement IRS-I de I'homme, desouris, de rat et du xenope. Ce rézultat montre queIRS-I est très conservé . IRS-I du poulet content 9motifs Y)OO\d (dans les positions 463,549,610, 630,660,73o,940,987 et l0l0), dont la phosphorylation
Deuxièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, E-10 avril 199769
leur permet d'intéragir avec des proteines possédantdes domaines Src Homologl 2 (SH-2) telle que la pI-3kinase IRS-I du poulet posséde aussi un résidutvrosine (posiûon 895) permettant I'intéraction avecGrb2 (Grouth Binding Receptor), protéine activant lavoie ras/raf essentielle dans l'activation del'expression génique et la multiplication cellulaire.Enfin. IRS-I du poulet possède plusieurs résidussérines qui sont des potentiels substrats pour laprotéine kinase A AMPc-dépendante. la protéinekinase C. la caséine kinase II. et la cdc2 kinase (Sune t a l . l 9 9 l )
2. Expression d'IRS-l
L'expression d'IRS-l a été utidiée par RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)âu cours du développement embryorutaire et aprèséclosion L'ARNm codant pour IRS-I a été détectéchez les embryons de 7 jours (tête et corps). de 14 et20 lours (foie et muscle) et après 2 jours et 3semaines de l'éclosion dans le foie. le muscle et letissu adipeux. Ce résultat indique que IRS-I estcxprimé très tôt dans le d&eloppement embryonnaireet dans plusieurs tissus cibles de l'insuline et cetteexpressron persiste après l'éclosion et au cours de laphase de croissance du poulet.
3. La phosphorylation d'IRS-1 chez le poulet estrégulée par la prise alimentaire
Dans un premier temps nous avons caractérisé IRS-Ichez le poulet en utiltsant la technique de Western-blot et des anticorps anti-IRs-l de rat Nous avonsmontré que IRS-I est exprimé dans le foie et dans lenruscle du poulet et que IRS-I est phosphorylé in vivosur résidus tvrosines (Dupont et al., 1996). Dans undeuxième temps nous avons étudié la régulation de laphosphorylation d'IRS-l et de la sous-unité B durécepteur de I'insuline par la prise alimentaire. Eneffet. l'étude a été réalisée sur deux tissus cibles deI'insuline : le muscle et le foie dans trois situationsnutritionnelles différentes ( àjeun pendant 48 heures,à jeun pendant 48 heures et renourris pour 30mrnutes et enfin nourris ad-libinrm). Aprèssolubilisation des tissus. immunoprécipitation avecdes anticorps anti-phosphotyrosines ou anû-récepteurs, les échantillons sont soumis à uneélectrophorèse et électrotransfert sur membrane denitrocellulose. Les membranes de nitrocellulose sontrévélées en utlisant les mêmes anticorps et serontsoumis à une revélaûon ECL(Electrochioluminescence). Les résultats obtenusindiquent que le jeûne reduit significativement laphosphorylation du recepteur et de IRS-I et que larealimentation stmule cette phosphorylation dans lefoie. En effet, à jeun I'insulinémie baisse alors que larealimentaûon augmente le niveau d'insuline qui àson tours activera le recepteur de I'insuline quiphosphorylera [RS-l engendrant ainsi les actions
métaboliques de I'insuline dans le foie. Toutefois, cesvariations observées dans le foie ne sont pasretrouvées dans le muscle où le jeûne alfecte peu leniveau de phosphorylaûon d'IRS-1. Ces donnéesindiquent que le foie et le muscle se comportentdifféremment vis à vis de la prise alimentaire et celaaussi indiquerait une distribution différente desnutriments. Enfin, en utilisant la RT-PCR nous avonsmontré que le jeûne induit une surexpression durécepteur de I'insuline et d'IRS-l @upont et al., enpréparation).
4. Caractérisation, régulation et expression de laPI3-kinase chez le poulet:
Après sa phosphorylation IRS-l intéragit avecplusieurs proteines intervenant dans les actionsmétabolique et mitogénique, parmi ces proteines la pI3-kinase est considérée actuellement comme uneenzyme clé dans la translocation insulinodépendantedes transporteurs de glucose à la surface cellulaire.Par conséquent cette enzyme du point zootechniqueest très importante parcequ'elle va réguler letransport des nutriments (glucose et acides aminés)vers les tissus cibles (muscle, foie et tissu adipeux) enréponse à I'insuline et favorise la croissance.
Nous avons caractérisé la sous-unité catalytique de laPI 3-kinase la p85 et montré qu'elle est expriméedans le foie et dans le muscle et présente le mêmepoids moléculaire que celle décrite chez lesmammifères ( Taouis et al., 1994; Gillet et al., 1996).L'acûvité PI 3-kinase a été aussi mesurée etcaractérisée dans le foie et dans le muscle du poulet.Nous avons aussi montré que cette actvité est réguléedans le foie par la prise alimentaire dans le mêmeprotocole expérimental défini pour IRS-I. En effet, lejeûne induit une réduction de I'activité PI 3-kinasedans le foie qui est restaurée après réalimentation desanimaux. Ces variations ne sont pas observées dans lemuscle et comme pour la phosphorylation d'IRS-1I'activité PI 3-kinase semble être régulée d'unemanière tssudépendante indiquant arnsi desincorporations di-ftrentes de nutriments en réponse àI'insuline et en foncton des tssus considérés. Cesvariations d'activité enzlmatique ne sont pas dues àdes variations d'expression de messager parcequenous avons montré par RT-PCR que I'expression deI'ARNm de la PI 3-kinase n'est pas modifié par laprise alimentaire.
Conclusion
Nous avons caractérise deux proteines clésintervenant dans I'acûon de I'insuline chez le poulet: IRS-I et la PI 3-kinase. Ces deux protéines sontexprimees dans le foie et le muscle, tiszus cibles deI'insuline, et leur régulaton est tissu-s1Écifique. Lamise à jeun des animaux reduit la phosphorylationd'IRS-1 et l'acûvité PI-3 kinase. Cette réduction
70
serait liee au niveau de I'insulinémie des animaux àjeun et qui est très bas. La réalimentaton desanimaux augmentent la phosphorylation d'IRS-1 surtyrosine et I'activité PI 3-kinase dans le foie mais pasdans le muscle. La réalimentation est accompagnéepar une augmentation de I'insulinémie. ces donneesindiquent que in vivo I'insuline régule étroitement laphosphorylation d'IRS-l et I'activité PI 3-kinase etpar conséquent régule le transport des nutrimentsvers les tissus cibles. Cette régulation est tissu-specifique indiquant ainsi le rôle de I'insuline dans ledistnbution des nutriments.
La compréhension du mode d'action de I'insulinedans les différents ussus cibles (foie. muscle et tissuadipeux) nous permettra dans le futur de mieuxcontrôler la distribution des nutriments et leurtransport vers les différents tissus
Reférences
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7 l
SELECTION POUR LA PONTE ET HETEROSIS CHEZ LA CAILLE JAPONAISE
Minvielle Francisl, Monvoisin Jean-Louisl, Costa Josel et Frénot Alain2
I INRA, Génétque Factorielle, ?8352 Jouy en Josas' Ecole d' Aviculture . 7 8l2O Rambouillet
Résumé
Une expérience de selection sur la ponte précoce, jusqu'à l'âge de 98 jours, a été menee pendant 13 générationspour comparer les effets de la selection directe (lignees DD et EE) et de la sélecûon récurrente (lignees AA etBB) d'après les demi-soeurs croisées, et pour étudier l'évoluton de l'hétérosis sous ces 2 modes de sélection.La sélection directe a entrainé une augmentation de la ponte précoce ainsi qu'une baisse de l'âge au premieroeuf. Parallèlement, le poids corporel à 5 semaines a diminué ainsi que le poids de I'oeuf. Les réponses etassociations observées sont cohérentes avec les paramètres génétiques estimés à I'aide du modèle animal sanseffet de dominance. Les performances de pontes observees sur 12 mois chez les cailles de la l3ième générationsont supérieures chez les animaux croises mais ne sont pas à I'avantage des croisés AB ou BA en dépit d'unhétérosis accru par la selection récurrente.
Introduction
La caille japonarse est surtout produite pour la chair(Baumgartner 1993) et les travaux sur sa croissanceet sa composition corporelle sont nombreux (Caron etal. 1990, Marks 1993, par exemple). Or, cette caillefut d'abord gardee pour son chant puis selectionneepour la ponte au Japon durant l'ère Meiji. Cependant,on trouve ûès peu de travaux publiés concernant c€caractère (Annaka et al. 1993, Nestor et al. 1983,Okamoto et al. 1989, Strong et al. 1978) ou sonhétérosis en croisement (Chahil et al. 1975, Minvielleet al. 1995, Wilhelmson 1980). Le présent uavailprésente les résultats d'une première analyse de 2lignees DD et EE soumises à la sélection directe surla ponte precoce à Jouy en Josas et il rapporteI'evoluton de l'hétérosis entre ces ligneescomparativement à celle decoulant d'une selectionrécurrente reciproque menée en même temps (ligneesAA et BB), pour comparer finalement la ponte totaleobtenue en un an, à la dernière génératon, (13) selonla lignee et le croisement.
Matériel et Méthodes
Quatre lignees de cailles , AA et DD d'une origine(Mérat et Monvoisin, l99l), BB et EE de l'autre(Mills et Faure, t99l) ont éæ mises en place en 1989à Jorry à partir d'une vinglaine de familles de frères-soeurs par origine (2 à 3 fondateurs gardés parfamille). A chaque génération et dans chaque lignéeenviron 10 femelles étaient testees en cageindividuelle pour la ponte entre les âges de 34 et 98jours. Vingt femelles, soit à peu près le tierszupérieur, étaient alors gardées comme reproductriceset accouplees individuellement à 20 mâles des mêmesfamilles, en évitant les croisements frères-soeuts,dans les lignées DD et EE. Pour les lignées AA et
BB, un croisement reciproque préalable était effectuéà chaque généraûon et les meilleures familles étaientsélectionnees en pur d'après la ponte normale encroisement de 4 demÈsoeurs croisees par famille,pour aboutir à 22 accouplements individuels danschacune des 2 lignees AA et BB. Alternativementpour AA et BB et pour DD et EE, soit une générationsur deux, les croisements réciproques entre lignees'intra mode de sélection, étaient effectués pourévaluer I'hétérosis, at CEZ de Rambouillet (128animaux en cage individuelle par lot). Enfin, lesfemelles produites à la l3ième généraûon ont ététestees pour leur ponte complète, jusqu'à I'arrêtnaturel de la ponte.Tous les animaux en cage individuelle, soumis à l4hd'eclairement par 24h, pouvaient s'abreuverlibrement et recevaient ad libitum un alimentcommercial (2500 Kcam(g EM, l0yohtûnidrté, Izytcendres, l97o protéines brutes, 47o matières grasses et3olo fibres brutes).Sur chaque femelle testée, on a mesuré le poidscorporel au début et à la fin de l'épreuve de ponte,l'âge au premier oeuf normal, la ponte et la qualité deI'oeuf. Sur tous les animaux, on a mesuré le poids à34 jours.Les paramèues génétiques dans les lignées DD et EEont été estimés par un REML multcaractère appliquéau modèle animal, grâce au logiciel VCE (Groenveld1994> , avec pour seul effet fixe la combinaisongénération*lot. L'évolution phénotypique descaractères et de I'hétérosis a été obtenue parrégression linâire sur le numéro de génération. Leprogrès génétique a été évalué par régression linéairesur le numéro de génération des valeurs génétiquesmoyennes prédites à I'aide du logiciel Pest(Groenveld et al. 1990) par un BLLJP multicaractèreappliqué au modèle animal.
Deuxièmes Journées de Ia Recherche Aviaolc, Tours, &10 atil 1997
Résultats et discussion
1. Paramètres génétiques en lignee pure (Tableauci-dessous).
En I'absence d'une prise en compte des effets dedominance, et vu le mode d'accouplement (1 femellepar mrâle), I'héritabilité des caractères de ponte estcertainement un peu surévaluée (Ming et van derWerf, 1993) ainsi que celle du poids à 34 jours. Ontrouve en revanche des corrélations génétiques demagnitude et de signe anticipes par comparaison auxvaleurs correspondantes obtenues sur la poule. saufpour I'absence de relation entre ponte et poids d'oeufdans la lignée EE. Enfin. on notera I'existence d'unehéritabilité non négligeable de la différence du poidscorporel à 34j. entre femelles et mâles (f-m) et descorrélaûons qui relient cette différence de poidsfavorablement aux critères de ponte precoce maisdéfavorablement au poids d'oeuf.
2. Evolution des performances et des valeursgénétiques en lignée pure @igures a à d)
Les progrès obtenus pour les 2 caractères de pontedans les lignées se sont accompagnés d'une légèrediminution du poids de I'oeuf et du poids corporel à34 jours. Ces tendances phénotypiques sontconfirmées par I'examen de I'evolution des valeursgénétiques (BLLJP). Ainsi, le gain génétique pargénéraûon était estimé à 1,5 et 2,2 oeufs nonnaux,-0.8 et -0.3 jours d'âge au premier oeuf normal et de-0.7 et -1.4 g de poids corporel à 34 jours,respectivement dans les lignees DD et EE. Onremarque que le progrès génétique est toujours
nom b re0 .3 60.39
superieur aux changements observés, et ceci enparticulier pour le caractère selectionné. Cephénomène est certainement en relation avec le biaispositif déjà mentionné induit par la non prise encompte de la dominance dans I'estimation deI'héritabilité des caractères de ponte .
3. Evolution de I'hétérosis (Figures e et 0
L'hétérosis entre les deux lignées en selection directe(DD et EE) demeure stable pour les deux caractèresde ponte precoce. Au contraire, il augmente trèssignificaûvernent entre les lignees sounises à laselection reciproque. Ce contraste entre les deuxmodes de selection semble indiquer qu'ilsn'exploitent pas la même source de variationgénétique et conforte donc I'intérêt que présenteraitune selection en race pure intégrant I'informaton encroisement pour la production d'animauxcommerciaux croisés (Ming et van der Steen l99l).
4. Courbes de ponte (Figures g et h)
Quel que soit le mode de sélection, I'intensité deponte (par caille présente) est supérieure encroisement, avec également une persistanceamélioree par rapport atD( lignees pures. Lescroisements des 2 types (AB et BA ou DE et ED)montrent des courbes de ponte sur 12 mois de testtrès semblables, avec cependant un léger avantage(non testé) pour les croises DE et ED. Enfin, il fautnoter les performances de la ligne DD, très prochesde celles des croisement.
f-moeuf- 0 . 5 5-0 .190 . 5 4
-0.09 ns0 . 6 10.51
0 . 3 60.51-0 .56-0.64-0 .3 4-0.23
18
Paramètres génétiques des lignées DD et EEh'et r^
age-0 .90-0 .750.400.62
Ponte et Poids
h2 sur la diagonale
po ids f- 0 . 2 1
-0.09 ns-0.03 ns
-0 .160 . 4 20.5 70 . 7 50.68
po ids m-0 .3 9-0.360 . 2 20 . 1 70 . 6 20.710 . 9 10.870 . 7 80.78
| 0 . 2 3
i !.?f
ô a i5it .
H r-E 1 8 1- 8 .
1 4 J
Figure a)
Ponte à 98 jours d'age6 8 - 7
; .@ryy
Figure b)
Age au ler oeuf
-llgnéc DD -lignée ËE
Figure d)
Poids corporel à 5 semainesxfi -,
fr2t
1 2 3 4 5 6 7 8 t 1 0 1 1 1 2 1 3
GENERATION
Figure c)
Poids de I'oeuf
42 ),
l l l.,lï1ffI r i.s -
$rr .o7,z f
rit3.5 -
-llgnê OO -llgna. EE I
9.0 -.-.-------''- --.--
1 2 3 4 5 0 7 t 9 l 0 l 1 t 2 t 3
cEllEiAnoal
Figure e)
ba0.t0'
, b.t.o-
a n l "
2 E 1 5 6 7 I 9 l O 1 1 1 2 1 3
CET{ERATTOfl
Figure 0
2tâ
oU. N
e0
r7!t
t50
Hétérosis pour la ponte
-25
-3.5oi -+so
6,5
€.5
Hétérosis pour la précocité
génération2 3 a 6 3 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3
1 2 3 4 5 6 7 E 9 t O l l 1 2 t 3
2 3 1 5 6 7 I 9 r 0 1 1 1 2 1 3
génération\
l- ral.racun ntêl aql- '3al.dl]rct | \" bao.36-
t9
?D
$
ô
Figure g)
Courbe de ponte : sélection directe
{ D - . É - , Ë - , E D
Conclusion
Malgré un hétérosis augmenté, la sélection récurrented'après demi-soeurs croisées ne s'est pas avéreesupérieure à la sélection directe pour la ponte desanimaux croisés. Pour les deux modes de selecton,ces derniers présentaient en efiet des courbes deponte semblables et plus favorables que celles de 3des 4 lignees pures sous sélection.
Références
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Figure h)
Courbe de ponte : sélection récurrente
.ô A{ -BB { .AB "r Bl
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