Life Goes On 

Dr. Kwok Cheong CHUNG Department of Biology 

The Chinese University of Hong Kong 

6 th International Junior Science Olympiad (IJSO) 

Genetic Engineering 

1 

Genetic Engineering Outline 

•  Recombinant DNA •  Restriction Endonucleases •  Host / Vector Systems •  DNA Libraries •  Applications of transgenic  technology 

2 

Notes to Teachers •  Learning Objectives 

– Structure of DNA and recombinant DNA – Functions and specificity of restriction endonucleases – Various Host / Vector Systems – Formation and functions of DNA Libraries – Applications of transgenic  technology 

•  Time allocation: 4 hrs – DNA structure: 1 hr – Structure of recombinant DNA: 0.5 hr – Restriction endonucleases: 0.5 hr – Various Host / Vector Systems: 0.5 hr – DNA libraries: 0.5 hr – Applications of transgenic  technology:  1 hr 

3 

Learning Outcomes 

•  Know the structure of DNA and RNA •  Understand the basic principles of genetic engineering 

•  Know the components of recombinant DNA •  Know the function and specificity of restriction endonucleases 

•  Know various host / vector systems •  Appreciate the various applications of transgenic technology 

After studying this topic students will be able to: 

4 

Recombinant DNA •  A molecule  that combines DNA from two sources  resulting a new combination of genetic material 

•  Genetically modified organisms are possible  because of the universal  nature of the genetic code 

•  Examples of recombinant organisms –Transfers  gene(s) of interest  to develop and improve plants, animals and other organisms 

–Human  insulin gene placed  in bacteria  for producing  insulin in large quantities  for diabetics 

5 

Genetic Engineering – Basic Principle •  Select the desired gene(s) to be inserted 

•  DNA molecules cut into fragments with  restriction enzymes 

•  Splice the fragments together  in the desired combination 

•  Recombinant DNA introduced  into a living cell by a vector 

•  Transformation:  uptake of foreign DNA into cells ­ replication and change their genetic make up  6

Restriction Endonucleases •  Enzymes which cleave DNA at  specific nucleotide sequences and create DNA fragments 

•  Each restriction endonuclease has a specific recognition sequence and can cut DNA from any source into fragments 

•  Due to complementarity  single­stranded ends can pair with each other ­ sticky ends 

•  Fragments joined together with DNA ligase 

Type I ­ simple cuts 

Type II – cut at dyad symmetry 

CUT 

7  8 

Vectors •  DNA molecules  that can be moved  into and replicated  in an organism 

•  If a fragment of DNA is ligated  into an appropriate vector,  it can be inserted  into cells which will  then be replicated 

•  Typical vectors ­ plasmids or viruses that engineered  to both accept DNA insertions and reproduce  inside cells 

•  Cloning is the process of inserting DNA encoding a gene of interest into a vector, then establishing  it as a stable part of a cell line 

Vector  Size of Insert (kb) 

Plasmid  Up to 15 

Bacteriophage  Up to 90 

Bacterial artificial chromosome (BAC)  100 ­ 500 

Yeast artificial chromosome (YAC)  250 ­ 2000 9 

Plasmids •  E. coli – the most flexible and common host 

•  Plasmids and phages are the two most commonly used vectors 

10 

Typical Plasmid ­ pUC 18 

lacZ Gene 

Multiple Cloning Site 

aagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggat ccccgggtaccgagctcgaattc HindIII SphI PstI SalI XbaI BamHI XmaI KpnI SstI EcoRI AccI  SmaI   BanII    HincII  BspMI 

Origin of Replication 

Amp R Gene 

2,686 bp 

11 

Selecting for Cells with Vectors •  Vectors are commonly engineered  to carry antibiotic resistance genes 

•  Host bacteria die in the presence of the antibiotic 

•  Bacteria harboring  the vector will survive 

•  Growing cells on media with antibiotics ensures that all growing cells must carry the vector 

12

To Know the Results of Cloning 

Ampicillin ­ Kills all bacteria that lack the plasmid 

Blue colonies ­ Express β­ galatosidase which metabolizes colorless X­gal to blue and turn blue thus lacZ is not disrupted and there is no foreign DNA cloned 

X­Gal ­ A lactose analog which turns blue when split by β­ galactosidase 

Cloned fragments disrupt lacZ thus make no β­ galactosidase and colonies remain white 

IPTG ­ Induces expression of lacZ 

13  14 

DNA Libraries •  A collection of DNA from a specific source in a form that can be propagated  in a host 

•  All the DNA from an organism is digested with a restriction enzyme and cloned  into plasmids,  forming many different recombinant plasmids each with a different fragment of cloned DNA 

•  Genomic  library (Shotgun library) –  Collection of DNA fragments that represent all the DNA in the genome 

•  Chromosome  library –  All the DNA fragments in that specific chromosome 

•  cDNA library –  Produced using reverse  transcriptase –  Makes DNA copies of mature mRNA 

15 

DNA Libraries 

16 

Library Screening •  Libraries  tend to have a lot of clones only one of which has the sequence of interest 

•  Screening a library  is the process of eliminating  those clones that do not contain the sequence of interest and locating  the clone that does 

•  Preliminary  screening – Eliminate any clones without a vector and clones with vectors that do not contain DNA of interest 

– Employ vector with gene for antibiotic  resistance and lacZ gene 

– Expose to growth medium 

17 

Secondary Screening • Hybridization screening 

–DNA from a library  is bound to a membrane –The membrane  is exposed  to a radioactive probe (single­stranded DNA) that is complementary  to and would base pair (hybridize)  to the sequence of interest –Autoradiography 

• Expression vectors –If the gene for a protein is cloned,  the protein  is made and detected 

18

cDNA Libraries •  Because of the large size of libraries and the difficulties of screening, anything  that can be done to limit  library size is favorable 

•  Protein coding regions of most eukaryotic genomes make up only a small percentage of the total DNA (3% in humans) 

•  Most cells only express a small subset of an organism’s genes 

•  By using reverse  transcriptase, a cDNA (complementary DNA) copy of the mRNA being produced  in a group of cells can be made 

•  Cloning cDNA to make a library produces a much smaller library enriched with the part of an organism’s genome that is of most interest 

19 

Rev. Trans. 

TTTTTTTTTTTT5’ 3’ 

cDNA Library Construction 

TTTTTTTTTTTT5’ 

TTTTTTTTTTTT5’ 3’ 

cDNA after RNase treatment 

AAAAAAAAAAA3’ 5’ mRNA 

AAAAAAAAAAA3’ 5’ 

mRNA cDNA hybrid 

Insert into vector 

AAAAAAAAAAA3’ 5’ 

Reverse transcription 

TTTTTTTTTTTT5’ 3’ 

Double stranded cDNA after DNA polymerase 

RN ase 

AAAAAAAAAAA3’ 5’ DNA Pol 

20 

Applications of Biotechnology •  Medical applications 

– Pharmaceuticals • Drug production •  Introduction of protein­encoding genes 

– Gene therapy • Add working  copies of single defective gene 

– Tissue engineering – Vaccines 

•  Agricultural – Enhance growth of crops or animals – Enhance quality of crop or animals 

• Resistance to diseases,  insects, and herbicides • Nitrogen fixation 

•  Industrial •  Environmental 

– Transgenic organisms  in bioremediation  21  22 

Subunit Herpes Vaccine 

23 

Agricultural Applications •  Ti plasmid  from Agrobacterium tumefaciens used as vector – Nitrogen fixation 

•  Introduce genes that allow crops to fix nitrogen – reduce need for fertilizer 

– Herbicide resistance •  Insert genes encoding  for proteins making crops resistant  to herbicide – widespread herbicide use possible 

–  Insect resistance •  Insert genes encoding proteins harmful to insects 

Golden Rice with high levels of β­carotene

24

•  Limited to exchanges between the same or very closely related species 

•  Little or no guarantee of obtaining any particular gene combination  from the millions of crosses generated 

•  Undesirable  genes  can be transferred along with desirable genes 

•  Take a long time to achieve desired results 

Conventional Breeding Genetic Engineering 

•  Allows the direct transfer of one or just a few genes, between either closely or distantly related organisms 

•  Crop improvement can be achieved  in a shorter  time compared to conventional breeding 

25 

Ti Plasmid 

26 

27  28 

Transgenic Rice 

29 

Bt Corn – Insect Resistance 

•  Natural insecticide  from Bacillus thuringiensis 

•  Non­toxic to humans •  Target insect: corn borer •  Potential  to: 

–  reduce insecticide use –  reduce mycotoxins 

•  40% U.S. Corn crop Bt (2006) •  Concerns 

– Bt pollen harms non­target species? – Bt crops select for resistant  insects – Bt pollen can drift to organic  fields 

30

Herbicide Resistance •  Roundup Ready Soy, Corn, Canola •  Allows post­emergence herbicide spraying •  Increases yield •  Facilitates no­till farming •  89% U.S. Soy crop (2006) •  Concerns 

– Encourages herbicide use – Groundwater contamination – Kills beneficial soil microbes – Cross­pollinates weeds – Fosters dependence on Agrochemcial companies 

31 

Transgenic Animals •  More difficult than plants •  Several techniques to insert DNA 

– Chemicals to open holes in plasma membrane and liposomes carry DNA in cells 

– Electroporation–a brief jolt of electricity to open membrane 

– Microinjection–uses microscopic needles – Particle bombardment – a gun like device shoots metal particles coated with foreign DNA 

32 

33 

Bovine Somatotropin Bovine somatotropin •  Homology with prolactin •  Increase milk production 

34 

Industrial Applications ­ The Dye Indigo 

•  The blue dye in blue jeans •  Originally came from mollusks 

or fermented  leaves of woad or indigo plants 

•  Synthetic process uses coal tar ­ releases  toxic by­products 

•  With recombinant DNA E. coli can produce  indigo 

Indigo Plant 35 

Bioremediation •  Transgenic organisms can provide process as well as products 

•  Ability to detoxify pollutants •  Examples 

– Hg­contaminated soils – GFP gene reveal  locations of land mines – Pseudomonas putida with TNT inducible promoter  fused to GFP 

– Organisms to treat oil pollution 

36

Risk and Regulation •  Questions 

– How do we measure the potential risks of genetically modified animals and crops ? 

– Is eating genetically modified food dangerous ? – Are genetically modified crops harmful to the environment ? 

– Should we label genetically modified  foods ? – What limits should society place on genetically engineered organisms? 

– If you could alter the genetic makeup of your child, where would you draw the line? 

37 

•  Safety guidelines – Safety concerns 

• Introduction of transgenic organisms into the environment 

• Health effects on humans from consuming GM crops 

– Safety measures • Special facilities designed to hold pathogenic organisms 

• Science of risk assessment 

Safety Issues 

38 

References for Further Study 

•  Genetic Engineering by Wikipedia –  http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_engineering 

•  Genetic Engineering and Its Dangers –  http://online.sfsu.edu/~rone/GEessays/gedanger.htm 

•  What is Genetic Engineering? –  http://online.sfsu.edu/~rone/GEessays/WhatisGE.html 

•  Genetic Engineering –  http://www.cfaitc.org/LessonPlans/pdf/412.pdf 

39 

End 

40