Garantindo a esterilidade dos produtos parenterais

Seringas pré-carregadas ou comprimidos de peptídeos?

Enfrentando os desafios de fabricação atreladosaos injetáveis de liberação estendida

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Pharmaceutical Technology26 Edição Especial LÍQUIDOS 2013 Pharmaceutical Technology 27Edição Especial LÍQUIDOS 2013

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cos ou para propagar as linhagens celula-res ou as culturas celulares.

O objetivo deste estudo é demonstrar que a água ultrapura produzida pelo sis-tema arium pro VF apresenta um conteúdo de endotoxina que está bem abaixo dos limites prescritos, e que pode ser utiliza-do nas aplicações das categorias acima mencionadas.

Teste de endotoxina Um método para a detecção de endoto-

xina é o chamado de teste de LAL (Limulus Amebocyte Lysate), um teste que utiliza a reação de coagulação de um lisado de amebócitos isolados do caranguejo--ferradura (Limulus polyphemus). Esta re-ação envolve uma cascata de coagulação, primitiva do ponto de vista evolutivo, na qual proteases são ativadas sequencial-mente, resultando assim na formação de um coágulo.

A cascata de coagulação (também chamada de Cascata das Enzimas Limu-lus, ver [2], [3]) pode ser desencadeada por endotoxinas ou, alternativamente, por ß-glucanas, que são polissacarídeos

Katrin Toeppner e Elmar Herbig

Os componentes da parede celular de bactérias Gram-negativas, tais como E. coli e Pseudomonas, são chamados de endotoxinas. Esses componentes possuem um polissacarídeo hidrofílico e um lipídio lipofílico e, ao contrário das bactérias das quais eles se originam, são altamente estáveis ao calor e ao pH. As endotoxinas pertencem aos pirogênios, ou seja, podem causar febre se entrarem em contato com as membranas mucosas ou se entrarem na corrente sanguínea (com referência a Steck, 2006, [1]).

De acordo com as farmacopeias preva-lentes, os valores limite definidos em rela-ção ao conteúdo de endotoxina não podem ser ultrapassados durante o processo de fabricação de produtos farmacêuticos.

Em culturas de células de mamíferos que são utilizadas para a produção de produtos biofarmacêuticos, tais como imunoglobulinas, a presença de endoto-xinas pode provocar a morte celular. Por esta razão, meios ultrapuros, isto é, água ultrapura, com níveis comprovadamente inferiores aos limites, devem ser utilizados na fabricação de produtos biofarmacêuti-

de cadeia curta encontrados nas paredes celulares de leveduras e fungos. A via das ß-glucanas pode levar a resultados falso- positivos [1]. Com base na coagulação, o lisado, líquido e incolor reage por coagu-lação para formar um sólido, gel leitoso, e daí o termo “método de gel coágulo”. Como a sensibilidade do lisado é extre-mamente alta, é indispensável descartar uma reação falso-positiva causada por contaminação com endotoxinas ou ß- glucanas. Por esta razão, os requisitos de pureza excepcionalmente elevados devem estar associados com a água ultrapura.

Além do método de gel coágulo, o conteúdo de endotoxina também pode ser analisado utilizando um método cro-mogênico quantitativo. Neste método, um peptídeo cromogênico sintético, um substrato cromogênico, é adicionado ao lisado. Enquanto que, no método de gel coágulo, um coágulo gel é formado pela enzima de coagulação, o substrato cromo-gênico sintético no método cromogênico é quebrado pela enzima de coagulação, resultando numa mudança de cor para amarelo. A intensidade da coloração ama-

Ensaio de endotoxina quantitativo de água ultrapura

Katrin Toeppner, Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Alemanha, e Dr. Elmar Herbig, Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Junho 2012.

Adaptado do artigo original Alemão pelo Dr. Herbig, Junho 7, 2012

rela está diretamente correlacionada com o conteúdo de endotoxina da amostra (en-saio cromogênico). A preparação do lisado tanto no método de gel coágulo quanto no método cromogênico deve, portanto, ser feita usando água ultrapura.

Descrição do sistema de águaultrapura arium® pro VFO sistema arium® pro VF (Figura 1) foi

projetado para produzir água ultrapura a partir da água pré-tratada potável e remo-ver qualquer contaminante ainda presente nesta água potável. A produção de água ultrapura requer recirculação contínua e uma taxa de fluxo de água constante, o que é conseguido usando um sistema de bomba com pressão controlada. A condu-tividade da água é medida na entrada de alimentação de água e na saída a jusante, ou saída de água do produto.

O sistema arium pro VF utilizado nos testes descritos neste artigo funciona com dois cartuchos diferentes. Estes cartuchos são preenchidos com um adsorvente de carbono ativado especial e uma resina de troca iônica de leito misto para fornecer água ultrapura com um baixo conteúdo de TOC. Além disso, a unidade possui uma lâmpada UV integrada com efeito bacteri-cida e oxidante nos comprimentos de onda de 185 nm e 254 nm, respectivamente.

Além disso, o sistema de água ultrapura arium possui um módulo de ultrafiltro integrado usado como um filtro de fluxo cruzado. A membrana do ultrafiltro utili-zada neste filtro retém coloides, micror-ganismos, endotoxinas, RNA e DNA. Um filtro final de 0,2 µm instalado na saída da água serve para remover partículas e bac-térias durante a dispensação da corrente de água ultrapura produzida. O processo que o equipamento emprega para produzir

água ultrapura é mostrado na Figura 2 (diagrama de fluxo do arium pro VF).

Métodos de teste Nos testes realizados para avaliar o

conteúdo de endotoxina na água ultrapura obtida do arium pro VF, tanto o método de gel coágulo quanto o método cromogênico foram realizados.

Método do Gel Coágulo: O lisado lio-filizado (Charles River Endosafe R 15006) foi dissolvido em água ultrapura obtida do sistema arium pro VF e congelado em alíquotas em tubos de ensaio isentos de pirogênio. Uma série padrão da endotoxina que consiste no LPS da E. coli 055:B5 (Lon-za N 185) foi preparada em concentrações de 0,001 UE/ml a 25 UE/ml usando água ultrapura do sistema arium pro VF. O lisado dissolvido foi testado utilizando o padrão de endotoxina preparado a fim de verifi-car se ele tinha a sensibilidade indicada (0,06 UE/ml). Uma amostra de 100 µl foi pipetada em 100 µl de lisado e incubada em banho maria a 37°C. Após uma hora, cada tubo foi individualmente removido do banho maria, girado 180° e avaliado quanto à formação de gel coágulo.

Método Cromogênico: O substrato cromogênico (Charles River Endochrome R1710K K) foi dissolvido em água ultra-pura produzida pelo sistema arium pro VF. Este substrato cromogênico e as amostras padrão de endotoxina foram pipetados em placas de 96 cavidades livre de endotoxi-nas numa proporção de 1:1. A absorção de

cada amostra foi medida continuamente, a intervalos de um minuto, durante uma hora a 405 nm utilizando um leitor de placas TECAN Safire, a 37°C.

Resultados No intervalo de 0,001 UE/ml a 0,05 UE/

ml, o método de gel coágulo demonstrou um resultado negativo, ou seja, não houve formação de gel coágulo (endotoxinas não detectadas, ver Tabela 1).

Uma concentração ≥ 0,1 UE/ml resul-tou na formação de um gel coágulo. Este resultado mostra que, dentro dos limites de sensibilidade de detecção do método de gel coágulo, não havia endotoxinas presentes na água ultrapura filtrada pelo arium pro VF.

As 60 leituras de absorção a 405 nm

Sistema de água ultrapura arium® pro VF (foto cedida pela Sartorius)

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Diagrama esquemático do fluxo do sistema de água ultrapura arium pro VF (para maior clareza, as válvulas e seus controladores estão omitidos)

Amostra Padrão de Endotoxina Gel Coágulo Ensaio Cromogênico Preparado [UE/ml]* [UE/ml]* Água Ultrapura do arium® pro VF 0 No 0** Padrão de Endotoxina 0,001 No 0** Padrão de Endotoxina 0,005 No 0** Padrão de Endotoxina 0,01 No 0,009 Padrão de Endotoxina 0,05 No 0,055 Padrão de Endotoxina 0,1 Yes 0,083 Padrão de Endotoxina 0,5 Yes 0,63 Padrão de Endotoxina 1,0 Yes 1,2 Padrão de Endotoxina 5,0 Yes 4,47 Padrão de Endotoxina 10 Yes 8,4 Padrão de Endotoxina 25 Yes 25 * UE/ml, unidade de endotoxina; 1 UE corresponde a aproximadamente 100 picogramas de endotoxina (como uma regra) ** Abaixo do limite de detecção quantificável

TABE

LA 1

Análise do conteúdo de endotoxina na água ultrapura arium pro VF e em amostras padrão de endotoxina usando o método de gel-coágulo e o método cromogênico

Pharmaceutical Technology28 Edição Especial LÍQUIDOS 2013

(Figura 3) no método cromogênico produ-ziram curvas com diferentes inclinações, dependendo do conteúdo específico de endotoxina das amostras padrão. Os tempos que foram necessários para se alcançar uma absorção específica foram determinados utilizando um programa de computador especial e usados como base para a extrapolação das amostras com um teor de endotoxinas desconhecido (para os valores, ver Tabela 1 - ensaio cromo-gênico). Como as amostras padrão com as menores concentrações (0,005 e 0,001 UE/

ml) e a água Arium não atingiram o valor de extinção 1 necessário para calcular o conteúdo de endotoxina, eles foram ava-liados como abaixo do limite de detecção.

Os valores obtidos com água ultrapura arium pro VF foram consideravelmente mais baixos do que aqueles apresentados pela curva de 0,001 UE/ml.

A Figura 4 mostra os dados obtidos de concentrações de endotoxina na água da torneira, água deionizada (água Dl) e água Arium em comparação com os dois padrões de endotoxina selecionados (0,05 UE/ml e 0,005 UE/ml).

O conteúdo de endotoxina nas amos-tras de água foi calculado a partir dos valores medidos usando os padrões de endotoxina e é mostrado na Tabela 2.

Na amostra de água DI, endotoxinas de 0,02 UE/ml foram detectadas, o que estava abaixo dos limites atualmente

válidos para WFI (água para injetáveis). Na água da torneira, com 25 UE/ml, uma carga excepcionalmente elevada de endo-toxina foi encontrada. Este achado não foi ainda analisado. Em contraste, um valor extremamente baixo de <0,001 UE/ml foi medido na água ultrapura obtida a partir do sistema arium pro VF, o qual está muito abaixo dos limites usuais encontrados.

Discussão Os resultados dos testes mostram que

a água ultrapura produzida pelo sistema arium pro VF pode ser prontamente utili-zada como uma alternativa econômica na preparação de amostras a serem ensaiadas nos testes de endotoxina, pois as concen-trações detectáveis de endotoxina na água ultrapura produzida são excepcionalmente baixas (<0,001 UE/ml). Os resultados obti-dos confirmam testes anteriores, nos quais uma carga de endotoxina <0,001 UE/ml foi encontrada na água ultrapura Arium [4].

A concentração de endotoxina na água ultrapura do arium® pro VF está muito abaixo dos limites exigidos pela Farma-copeia dos Estados Unidos, o que, por conseguinte, faz desta água teoricamente adequada para utilização na produção/monitoramento de endotoxina de pro-dutos farmacêuticos. Exemplos de tais utilizações são formulações de produtos, soluções para diafiltração, tampões de cro-matografia e água para extração, etapas de lavagem e higienização, bem como para soluções de cultura celular.

Precisamente dentro do âmbito das aplicações de cultura celular, tem de se prestar atenção às contaminações nas várias etapas desses processos. Para manter o controle sobre os efeitos das endotoxinas em tais culturas e sobre a sensibilidade das células, particularmente com respeito a tais endotoxinas, os meios para o crescimento celular devem ser comprovadamente livres de endotoxinas detectáveis (ver também [5]). Agradecimentos: Nossos agradecimentos especiais à Dra. Stephanie Steck da Rentschler Biotechnologie GmbH, Laupheim, na Alemanha, pela revisão do manuscrito deste trabalho e pela sua discussão construtiva sobre este assunto.

Literatura1. Steck, S. :Endotoxine und ihre Bedeutung bei R & D Applika-

tionen. Bioforum 6/2006. 2. Endosafe® -PTS™ Glucan Assay, Charles River Laboratories

International, Inc, 2009. 3. EndotoxinCompendium, V 2.11, Hyglos GmbH, Bernried,

Alemanha. 4. Untersuchungsbericht Fresenius Medical Care, Deutschland

GmbH, Werk St. Wendel, 2007. 5. Dawson, M.E. : LAL Update von Associates of Cape Cod

Incorporated, Março 1998, Vol. 16, No. 1.

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Leituras de absorção de amostras padrão de endotoxina durante um período de 60 minutos usando o método cromogênico

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Teste de endotoxina nas amostras de água

Amostra Concentração de Endotoxina [UE/ml]Água ultrapura > 0,001do arium® pro VFÁgua DI 0,02Água da torneira 25

TABE

LA 2

Tabela mostrando o conteúdo de endotoxi-nas em diferentes amostras de água