listeria monocytogenes · 2018-06-21 · para respuesta inmune de base celular dinámica del...
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Listeria monocytogenes Aspectos relevantes e implicación en
la seguridad alimentaria
Dr. David Rodríguez Lázaro Área de Microbiología. Facultad de Ciencias
• Gram + • Catalasa positiva • Anaerobia facultativa • Contenido bajo en G-C
Listeria spp.
10 especies: • L. monocytogenes • L. innocua • L. ivanovii • L. seeligeri • L. welshimeri • L. grayi
Humanos, rumiantes
Rumiantes
4 nuevas especies: L. rocourtiae, L.marthii, L.fleischmannii and L.weihenstephanensis
Bacterias Gram+ bajo % G+C
• Patógeno de origen alimentario
• Modelo en investigación biomédica
- análisis molecular del parasitismo intracelular - respuesta inmune de base celular - dinámica del citoesqueleto de actina
• Múltiples biotopos
- suelo y materia vegetal descomposición - alimentos procesados - intestino de los vertebrados - células animales • Crecimiento a 4ºC
• Supervivencia en el ambiente
Lactobacillus casei Streptococcus pyogenes Eneterococcus faecalis Listeria monocytogenes Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Mycoplasma pneumoniae
¿Por qué es una bacteria tan interesante?
Listeria es un modelo para … + estudios de biología celular de organismos superiores Para respuesta inmune de base celular dinámica del citoesqueleto de actina Conocimiento del metabolismo celular normal
Listeria es un modelo para … + estudios evolutivos tanto meramente darwinianos como sobre patogenicidad
• L. monocytogenes • L. innocua • L. ivanovii • L. welshimeri • L. seeligeri • L. grayi
L. welshimeri
L. innocua
L. ivanovii
L. monocytogenes
L. seeligeri
prs prfA plcA hly mpl actA plcB orfB orfA ldh
orfX orfZ
orfC orfD orfE orfK dplcB
prs
prs
ldh
ldh
orfX orfL
ORF3
ORF6
ORF5 ORF7
ORF11 ORF8
ORF10 ORF9
ORF9 i- inlB smcL
i -inlF
i -inlE i- inlH i -inlJ
i -inlI
i -inlK i- inlL i- inlB 2
ORF3
ORF6
ORF5 ORF7
i-inlG
LIPI-2
L. ivanovii
L. monocytogenes
Listeria es un modelo para … + estudios sobre patogenecidad y regulación microbiana
PrfA regula positivamente la expresión de los factores de virulencia de LIPI-1
The PrfA virulence regulon P4 P3 P2 P1
PPP2 P3P
prs prfA plc A hly mpl ac tA plc B orfB orfAorfX
orfZP1P2 P1
PrfA
(Positive Regulatory Factor)
P
inlA inlB
P
hpt
P
inlC
-41.5
TGTTTTCTGCATG aTAACAAGTGTTAA TGACGGAAAGAGAGTATCTGGTTTATATTTTTA... hpt
CCCTTTATCGTCG TTAACAAATGTTAA TGCCTCAACATAAAAGTCACTTTAAGATAGGAATA plcATTATGTTGAGGCA TTAACATTTGTTAA CGACGATAAAGGGACAGCAGGACTAGAATAAAGCTAT hly
AAATTTAGAAGAA TTAACAAATGTaAA AGAATATCTGACTGTTTATCCATATAATATAAGCA mplTGGGGTTAACTGA TTAACAAATGTTAg AGAAAAATTAATTCTCCAAGTGATATTCTTAAAT actA
TAAAGGGTAGAGG aTAACATAaGTTAA TTCTTTTTTTTGGAAAAATAGTTATTATTATTTAA inlATTTTCGATTATTA TTAACgCTTGTTAA TTTAAACATCTCTTATTTTTGCTAACATATAA inlC
TTAACANNTGTTAA CONSENSUS
P1P2
prfA
P
plcA
PrfA
Positive regulatory factor
Ambiente Intracelular Genes de virulencia necesarios Cambio conformación de PrfA y gran Gran cantidad de PrfA Genes PrfA dependientes activamente expresados
Ambiente Extracelular Genes de virulencia no necesarios (gasto metabólico) Forma PrfA no activa y poca cantidad Genes PrfA dependientes no expresados
Ingestión /inicio de invasión Genes de virulencia empiezan a ser necesarios Forma PrfA no activa y regulación sigmaB Genes PrfA dependientes ligeramente expresados
P1P2
prfA
P
plcA
PrfA
Positive regulatory factor
PrfA inactivo PrfA Activo
plcA prfA
COFACTOR
prfA plcA
a b
c d
ACTIVADO
Mecanismo de regulación de PrfA
INACTIVO
Ambiente extracelular Ambiente extracelular
P14 P14-A
Valencia 1989 Madrid 1999
Identificación de mutantes hiperhemolíticos de L. monocytogenes Espontáneo (Ripio et al. 1996) Inducido (Ermolaeva et al. 1997)
Mutantes hiperhemolíticos portan mutaciones puntuales en prfA y sobre-expresan constitutivamente todos los genes PrfA-dependientes Mutantes Hly+++ portan una sustitución Gly145®Ser en PrfA (mutación PrfA*)
1 M N A Q A E E F K K Y L E T N G I K P K Q F H K K 25
26 E L I F N Q W D P Q E Y C I F L Y D G I T K L T S 50
51 I S E N G T I M N L Q Y Y K G A F V I M S G F I D 75
76 T E T S V G Y Y N L E V I S E Q A T A Y V I K I N 100
101 E L K E L L S K N L T H F F Y V F Q T L Q K Q V S 125
126 Y S L A K F N D F S I N G K L G S I C G Q L L I L 150
151 T Y V Y G K E T P D G I K I T L D N L T M Q E L G 175
176 Y S S G I A H S S A V S R I I S K L K Q E K V I V 200
201 Y K N S C F Y V Q N L D Y L K R Y A P K L D E W F 225
226 Y L A C P A T W G K L N 237
S
F S
CIII CIII
a b
Mutaciones PrfA* aumentan la capacidad de unión a DNA de PrfA
0
15
30
45
norm
alis
ed g
ene
expr
essi
on
PrfA* HeLa / PrfA-wt BHI
PrfA-wt HeLa / PrfA-wt BHI
PrfA* BHI / PrfA-wt BHI
PrfA* HeLa / PrfA* BHI
PrfA* HeLa / PrfA-wt HeLa
PrfA-wt HeLa / PrfA* BHI
42.42
24.82
15.89
2.67 1.71 1.58 0.93 0.86 0.71 1.31 1.08 1.21
PrfA* PrfA specific non-specific
Mutaciones PrfA* aumentan la capacidad de unión a DNA de PrfA
+ estudios de parasitismo intracelular Listeria es un modelo para …
Entrada
Evasión de la vacuola fagocítica y replicación citosólica
Movilidad intracelular y paso de célula a célula
Movilidad intracelular de Listeria monocytogenes
speed 150 ´ (0.3 m/s)
Listeria es un modelo para … + Patógeno alimentario
• Organismo ubicuo (=en todas partes) • Organismo piscrotrofo (capaz de crecer a temperaturas de refrigeración) • Amplio rango de pH (de pH próximos a 4 hasta 9) • Moderadamente resistente a concentraciones de sal • Ligeramente resistente a tratamientos de pasteurización baja • Capaz de producir BIOPELÍCULAS
• Aislado en todas las sectores alimentarios (cárnico, lácteo, pesquero …) • Elevada mortalidad (superior al 25% y llegando hasta el 60%) • Capaz de pasar la barrera hematoencefálica ð LESIONES Y SÍNTOMAS NERVIOSOS • Capaz de pasar la barrera hematoplacentaria ð ABORTOS Y LESIONES EN EL FETO • Requiere más de 5 días para su detección
Ecología de Listeria monocytogenes Suelo (vegetación en descomposición) ? ® ambiente rural (abono, etc) ® cadena alimentaria
Patofisiología de la infección por Listeria (Listeriosis)
- enfermedad severa, mortalidad media 20-50 % en humanos
- Dos formas clínicas:
perinatal (1/3) (mujeres embarazadas, fetos, y recién nacidos)
pacientes adultos (2/3) (>40 años)
placentitis, abortos y sepsis neonatal
meningoencefalitis
Gran Canaria 1992 24 4b cheese?
Location date cases strain food
Canada (N. Scotia) 1981 41 4b coleslaw Massachussets 1983 49 4b milk?
Boston 1979 23 4b vegetables?
California 1985 142 4b cheese Switzerland (Vaud) 1983-87 122 4b cheese United Kingdom 1987-1989 >300 4b pâté
France 1992 279 4b pork tongue in aspic France 1993 38 4b “rillettes”
France 1995 35* 4b cheese Illinois 1994 45* 1/2b chocolate milk
France 1997 14 4b cheese Italy 1996 39 1/2b rice salad
* gastroenteritis
Epidemias de listeriosis de origen alimentario
………….. ………. …. ….. ………… Canada 2008 43 (22 V) RTE delis Austria 2009-10 34 (8V) Cheese
Relevancia en la salud pública USA
9,388,075 casos
Relevancia en la salud pública USA
Casi 19% muertes 29% bacterianas
Desde el punto de vista legislativo
Tolerancia cero (AUSENCIA): EE.UU., Canadá, Japón En función de la capacidad del alimento de soportar el crecimiento de Listeria: EU ðAquellos que no lo soportan: 100 ufc/g ðAquellos que lo soportan: 100 ufc/g
Cómo se analiza?
Cómo se analiza?
Dos apuntes finales de los dos últimos brotes serios …
CASO ESTUDIO: Brote de Listeriosis en Canadá
Verano 2.009
Patatas Meléndez S.L. Valladolid, 26 de Enero 2.009
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Reacciones:
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Reacciones:
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Reacciones:
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Reacciones:
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Lección aprendida por la empresa ð Actitud pro-activa y de liderazgo
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Brote de Listeriosis en Austria – verano 2.009
EMPRESA OFICIAL / UNIVERSIDAD
Nivel de contaminación: < 5 cfu / 100g ò
Probabilidad de detección 45-60% (usando 5 muestras de 25g)
Probabilidad de detección <20%
(usando 1 muestra de 25g)
Probabilidad de detección usando ISO 11290-2 <1%
Brote de Listeriosis en Austria – verano 2.009