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Técnicas de biología molecular
Bases de la Biología Molecular Biología del cáncer El laboratorio de Biología Molecular Fundamentos de las técnicas de Biología Molecular
Técnicas Moleculares para el Diagnóstico de la LMC
1. Extracción de ácidos nucleicos2. Cuantificación 3. RT-PCR 4. PCR Convencional5. Secuenciación Directa 6. PCR Cuantitativa
Recepción de muestras
• Recepción de muestras : SP, MO, Tejido, Citologías
• Extracción de ADN y/o ARN
• Valoración de la calidad
• Diferentes técnicas en función de los estudios relacionados con las diferentes neoplasias
Empieza el juego...
Densidad
pH
1. Separación de las células que nos interesan
mediante centrifugación por Gradientes de densidad.
Separación de células
Los componentes de la mezcla se reparten en diferentes fases en función de la densidad y de la afinidad por los componentes químicos que utilizamos
Obtención de los ácidos nucleicos
2. Desnaturalización de los ácidos nucleicos. Se provoca la ruptura de la pared celular para que el ADN quede libre en la mezcla
3. Purificación del resto de componentes mediante centrifugación
Precipitación de los ácidos nucleicos
3. Precipitación de los ácidos nucleicos para formar un pellet celular que resuspenderemos en un tampón adecuado y a una concentración óptima
Valoración calidad/pureza
El Espectrofotómetro mide la absorbancia de la luz a través
de la muestra a una longitud de onda determinada
RATIO: Abs 260/280
Concentración (ng)
de ácidos nucleicos
Restos de proteínas y alcoholes
Técnicas Moleculares para el Diagnóstico de la LMC
1. Extracción de ácidos nucleicos2. Cuantificación 3. RT-PCR 4. PCR Convencional5. Secuenciación Directa 6. PCR Cuantitativa
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
+ =
Es como hacer un caldo...
1. DNA MOLDE. Segmento de ADN de doble cadena que contiene la secuencia diana que queremos amplificar
2. PRIMERS. Pequeños fragmentos de ADN de cadena simple. Complementarios a los extremos flanqueantes del ADN molde. Marcarán el punto de partida y delimitarán la zona de ADN a amplificar
PCR (I)
4. DNA POLIMERASA. (Taq Polimerasa) Enzima que produce las copias de ADN
3. dNTPs. Suplemento de nucleótidos. Sustrato que usará la Polimerasa cuando produzca el nuevo ADN
5. Tampón y MgCl2 . Adición de sales y un tampón que mantenga el pH adecuado en la mezcla
PCR (II)
A C G T
Veamos que pasa dentro del caldo...
Ciclos de amplificación
La muestra se lleva a una temperatura de 94-96°C para que se rompan los puentes de hidrógeno y las dos cadenas del ADN molde se separen
Desnaturalización
Los primers o cebadores que hemos añadido en la muestra actúan a una temperatura de entre 50 y 70ºC para unirse uno por cada extremo a las cadenas de ADN molde de manera complementaria. De esta manera delimitarán la zona a amplificar
Hibridación
La ADN polimerasa actúa a 72ºC para que se realice
la extensión de las cadenas de ADN por
complementariedad de bases entre los dNTPs y la
cadena molde
Extensión
Y esto es lo que ocurre...
En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se crean más de mil millones de copias del
ADN de interés!
En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se crean más de mil millones de copias del
ADN de interés!
Original DNA target region
Thermal cycle
Identificación de bandas
Para visualizar el producto
de la PCR utilizamos la
electroforesis en gel de
agarosa. Como conocemos
el tamaño del gen a
estudiar, visualmente
podemos observar si está o
no presente en la muestra.
PCR enTiempo Real
Es una variante de la PCR que permite cuantificar el
producto de la amplificación.
Añadimos un fluorocromo que emitirá una fluorescencia con
cada copia del ADN. Esto nos indicará si el gen está presente
o no en la muestra, y de ser positivo, si se encuentra en mayor
o menor cantidad
PCR+
12-may-05
08-may-0631-jul-06
30-abr-07
03-sep-07
26-feb-08
13-feb-06
07-nov-05
29-ene-07
06-nov-06
17-dic-07
30-may-08
09-ene-0919-ago-080,001
0,01
0,1
1
10
100
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CR
-AB
L/G
US
(%
)
MUCHA SUERTE!!