manual afla 2010 pdf

Manual de Procedimentos AflaTest®

VICAM Rua Pleasant, 313

Watertown, MA 02472 U.S.A. Tel: 800-338-4381, 617-926-7045

Fax: 617-923-8055 e-mail: [email protected]

Effective date: April 9, 2009

2

ÍNDICE PÁGINA 1.0 Introdução 1.1 Destinação 5 1.2 Princípio 5 1.3 Aplicabilidade e Aprovações 5 1.4 Limitações 7 1.5 Amostragem 7 1.6 Vida Útil e Condições de Armazenagem 7 1.7 Etapas do Método AflaTest 8 2.0 Preparação do Equipamento 2.1 Calibração do Fluorímetro Torbex Model FX-100 9 2.2 Calibração do Fluorímetro VICAM Series 4 and 4EX 13 2.3 Calibração do MF-2000™ Mini Fluorímetro 15 2.4 Comparação das Configurações de Calibração do Fluorímetro 17 2.5 Preparação da Filtração 18 2.6 Configuração do Suporte de Bomba 19 2.7 Limpando o Equipamento 20 3.0 Preparação dos Reagentes e Teste 3.1 Preparação da Solução de Extração 21 3.2 Preparação da Solução Reveladora 21 3.3 Preparação da Solução de Diluição/Lavagem 22 3.4 Verificando os Reagentes 23 4.0 Procedimentos: Materiais e Equipamentos Exigidos 24 Alfalfa 25 Amêndoas 69 Amendoim, cru e com casca, limite de detecção inferior (0 – 25ppb) 71 Amendoim, cru e Manteiga de Amendoim (Método AOAC) 38 Amendoim, Farofa de Amendoim, Manteiga de Amendoim (0 – 100ppb) 67 Amendoim, Farofa de Amendoim, Manteiga de Amendoim (0 – 200ppb) 69 Arroz Branco (USDA-FGIS) 36 Arroz em Casca (USDA-FGIS) 89 Arroz Integral 36 Aveia (0 – 100 ppb) 87 Aveia (0 – 300 ppb) 89 Casca de Amendoim 72 Castanha de Caju 69 Castanha-do-Pará 27 Cebola Seca 59 Cúrcuma 78 Farelo de Glúten de Milho (USDA-FGIS) 47 Fibra – Amostras de Fibra Dietética (0 – 100ppb) 87 Fibra – Amostras de Fibra Dietética (0 – 300ppb) 89 Figos e Passas 55 Flocos de Arroz (Ceral Matinal) 53 Flocos de Milho (Cereal Matinal) e Farelo de Gérmen de Milho(USDA-FGIS) 91 Grãos (0 – 300 pbb) 32 Grãos (0 – 50 ppb) 30

3

Grãos de Destiladores, secos (0 - 100 ppb) 87 Grãos de Destiladores, secos (0 - 300 ppb) 89 Grãos de Destiladores, secos (USDA-FGIS) 51 Grãos de Destiladores, secos com materiais solúveis (USDA-FGIS) 51 Leite, líquido 55 Materiais Solúveis Condensados de Destiladores² 28 Milho de Pipoca (USDA–FGIS) 34 Milho usando etanol 41 Milho, Amendoim Cru e Manteiga de Amendoim(AOAC) 36 Milho, Farelo de Milho, Farinha de Milho, Flocos de Milho para Mingau e

Mistura de Milho/Soja (USDA-FGIS) 34

Milho, filtração única (USDA-FGIS) (0 – 300 ppb) 39 Milho, filtração única (USDA-FGIS) (0 – 100 ppb) 37 Milho, Grãos e Rações (0-50ppb) 30 Milho, Milo¹, Grãos e Rações (0 – 300ppb) 32 Milo (produto feito de sorgo) (0 – 300 ppb) 32 Milo (produto feito de sorgo) (0 – 50 ppb) 30 Mistura de Soja/Milho (USDA-FGIS) 34 Molho de Soja (Shoyu) 79 Nozes 74 Noz-moscada 57 Noz-Pecã 74 Óleo Vegetal 83 Orégano 61 Páprica, Pimenta Malagueta e Pimentão Vermelho 63 Passas 53 Pimenta Malagueta e Pimentão Vermelho 63 Pimenta-do-Reino 76 Pipoca, estourada 78 Pistache 69 Ração de Glúten de Milho (USDA-FGIS) 43 Rações (0 – 100ppb) - feitas com milho/soja 32 Rações (0 – 50 ppb) - feitas com milho/soja 30 Salsa 65 Semente de Açafrão-bastardo e Farelo de Açafrão-bastardo (0 – 100ppb) 85 Semente de Açafrão-bastardo e Farelo de Açafrão-bastardo (0 – 300ppb) 87 Semente de Algodão, em farelos e inteira (0 – 100ppb) 47 Semente de Algodão, em farelos e inteira (0 – 300ppb) 49 Semente de Canola e Farelo de Canola (0 -100ppb) 87 Semente de Canola e Farelo de Canola (0 -300ppb) 89 Sementes de Damasco 69 Soja (USDA-FGIS) 34 Sorgo (USDA–FGIS) 34 Suplementos para Bezerro em Pellets (0 -100ppb) 87 Suplementos para Bezerro em Pellets (0 -300ppb) 89 Tabaco 81 Trigo (USDA-FGIS) 89 Triguilho (0-100ppb) 85 Triguilho (0-300ppb) 87 Planilha de Procedimento do Fluorímetro AflaTest 91 5.0 Informações Adicionais 5.1 Padronizando Amostras com Aflatoxina 92

¹N.T.- “Milo” é o nome comercial de um produto feito de sorgo. ²N.T.- Também conhecidos como xarope, são um subproduto da produção de etanol, por exemplo, e são usados como ração por serem altamente nutritivos.

4

5.2 Limpeza Simultânea do Fluorímetro e do HPLC 92 5.3 Precauções Gerais 93 5.4 Solução de Problemas 93 6.0 Referências 98 7.0 Assistência Técnica 98 8.0 Responsabilidade 99 9.0 Informação para Pedidos 78

5

1.1 DESTINAÇÃO AflaTest é um método quantitativo para a detecção de aflatoxina em muitos commodities¹. A biotecnologia avançada de VICAM permite a medição de todas as princípais aflatoxinas (incluindo AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 and AFM1) sem o uso de solventes tóxicos como clorofórmio ou di-cloro-metano. O teste AflaTest para aflatoxina é utilizado em uma grande variedade de localizações desde o elevador de uma fazenda local a laboratórios de controle de qualidade de processamento de comida e laboratórios de teste do governo – qualquer lugar onde uma análise de aflatoxina rápida, fácil de realizar e de alta precisão possa prenvinir contaminação e melhorar a qualidade do fornecimento de comida. 1.2 PRINCÍPIO Aflatoxina, uma toxina de um fungo que ocorre naturalmente, é um carcinógeno do Grupo 1 e foi comprovado que causa câncer em humanos. Aflatoxina também pode causar perdas econômicas ao rebanho devido a doenças ou redução da eficiência de produção. AflaTest é um método rápido, simples, seguro e de alta precisão para medir quantitavamente a aflatoxina em muitas commodities. As amostras são preparadas adicionando uma solução de extração, misturando e filtrando. O extrato então é aplicado à coluna AflaTest ligada com anticorpos específicos para a aflatoxina. Neste estágio, a aflatoxina se liga ao anticorpo na coluna. Então, a coluna é lavada com água para livrar a coluna de imunoafinidade de impurezas. Ao passar metanol pela coluna, a aflatoxina é removida do anticorpo. Essa solução de metanol pode então ser analisada em um fluorímetro. Esses passos estão esquematizados na seção 1.7, Visão Geral do método AflaTest. 1.3 APLICABILIDADE E APROVAÇÕES AflaTest foi otimizado para a medida quantitativa de aflatoxinas em muitas commodities. O Índice, lista os procedimentos de teste, desenvolvidos para commodities específicas a partir da data de publicação deste manual. Ajuda para medir aflatoxina em commodities que não estejam listadas neste manual podem ser obtidas contatando nosso Departamento de Assistência Técnica. Entres os diferentes procedimentos existe uma variação no volume de amostra passada pela coluna de afinidade, quanto maior o volume, maior será a sensibilidade, entretanto, quanto menor o volume, maior será a faixa de contaminação possível de ser analisada (faixa de trabalho). Em geral, métodos de 0,2 equivalente/g tem um alcance de teste maior e são mais rápidos. Métodos de 1,0 equivalente/g tem um limite de detecção mais baixo. Ambos os métodos são precisos. AflaTest passou por avaliação pelo USDA, FGIS para a detecção de aflatoxina total (B1, B2, G1 e G2) para milho, flocos de milho, farinha de milho, farelo de gérmen de milho, ração de glúten de milhor, farelo de glúten de milho, farelo de milho, mistura de milho/soja, flocos de milho para mingau, materiais solúveis condensados de destiladores, grãos destilados secos, grãos destilados secos com materiais solúveis, arroz branco, arroz integral, arroz em casca, flocos de arroz, milho de pipoca, sorgo, soja e trigo. Sob a autoridade do Ato dos Padrões de Grãos do Estados Unidos, esse teste foi reconhecido a atender ou exceder todos os critérios de desenvolvimento e de desempenho em testes como foi definido em “Design Criteria and Test Performance Specifications for Quantitative Aflatoxin Test kits” (especificações para critério de desenvolvimento e desempenho em testes para equipamentos para teste de aflatoxina). Esse equipamento para teste é citado no Programa de Métodos Oficiais da AOAC, como método oficial 991.31 aplicável para a

6

determinação de aflatoxina B1, B2, G1 e G2 tanto por fluorometria quanto por análise por HPLC. AflaTest tem o status de Método Oficial da AOAC de ação final. ¹N.T. Commodities são mercadorias de origem primária, matérias-prima.

7

1.4 LIMITAÇÕES Este teste foi desenvolvido para ser utilizado com os procedimentos e reagente descritos nas páginas que se seguem. Não utilize materiais fora do prazo de validade. Se desviar dessas intruções pode não produzir os melhores resultados. Não congele colunas ou reagentes. 1.5 AMOSTRAGEM Micotoxinas não são encontradas em todas sementes de um lote e podem ser encontradas e apenas uma porcetagem pequena das sementes de um lote. Por conta da grande variação de concentração de micotoxinas entre sementes individuais de um lote contaminado, a variação de amostra para a mostra pode ser grande. É importante obter uma amostra representativa de um lote. Os produtos devem ser coletados de localizações diferentes baseadas em um plano de amostragem padrão . Essa amostragem deve retirar amostras do topo para o fundo do lote. As amostras obtidas devem ser trituradas e misturadas bem e uma subamostra deve ser tomada para teste. Para mais informações sobre amostragem de grãos, consulte as seguintes publicações do FGIS: FGIS Aflatoxin Handbook FGIS Grain Inspection Handbook, Book 1, Grain Sampling FGIS Mechanical Sampling Systems Handbook Esses podem ser visualizados online em: http://www.usda.gov/gipsa/reference-library/handbooks/handbooks.htm http://www.usda.gov/gipsa/reference-library/brochures/sampling.pdf 1.6 VIDA ÚTIL E CONDIÇÕES DE ARMAZENAGEM Armazenar a temperatura ambiente. Temperaturas de armazenagem acima de 30°C por períodos de tempo prolongados podem reduzir a vida útil. Se temperatudas de armazenagem acima de 30°C forem previnidas, todos os componentes podem ser armazenados no refrigerador (2 - 8°C). Não congele colunas ou reagentes. Para uso, é recomendado que os reagentes estejam à temperatura ambiente (18 - 22°C).

8

1.7 ETAPAS DO MÉTODO AFLATEST

EXTRAÇÃO DA AMOSTRA

Triturar e pesar amostra Misturar a amostra com sal e uma mistura de água/metanol

Filtrar

DILUIÇÃO E FILTRAÇÃO

Diluir uma alíquota da amostra extraída com água ou tampão Filtrar

CROMATROGRAFIA DE AFINIDADE

Passar o filtado pela coluna de afinidade

Lavar com água ou tampão por cima da coluna

Eluir aflatoxinas da coluna com metanol e coletar eluato em uma cubeta.

MEDIR AFLATOXINA

Adicionar revelador ao eluato, misturar. Colocar cubeta em um fluorímetro calibrado imediatamente.

Gravar a leitura digital depois de 60 segundos.

9

2.1 CALIBRAÇÃO DO FLUORÍMETRO TORBEX MODEL FX-100 A seção a seguir detalha os procedimentos de calibração para o fluorímetro Torbex Model FX-100. Para informações mais detalhadas sobre a operação deste fluorímetro, consulte o Manual de Operação do Fluorímetro TorBex Model FX-100 que foi fornecido juntamente com o fluorímetro. A. Iniciando o Fluorímetro 1. Ligue o fluorímetro (ON) utilizando o interruptor na parte de trás do painel. 2. O modelo FX-100 se identificará na tela de LCD e então passará por uma série de

testes próprios. Se quaisquer mensagens de erro aparecerem, consulte o manual do operador.

3. O fluorímetro então passará por um teste de impressão. Se quaisquer mensagens de

erro aparecerem, consulte o manual do operador. 4. Ajuste a Data e Hora Quando a data e hora são mostradas pela primeira vez, o visor mostra:

DATE XX/XX/XX Time XX:XX:XX Change (mudar) Continue (continuar)

Se a data e hora mostradas estiverem corretas, pressionar a seta abaixo de CONTINUE (continuar). Se não estiverem corretas, pressionar a seta abaixo de CHANGE(mudar). O visor

então perguntará se é a data ou a hora que deve ser mudado. Você pode escolher e mudar utilizado on teclado numérico. Quando a data ou hora corretas forem digitadas, pressionar a tecla ENTER. O

sistema volta a mostrar a mensagem de data e hora dada acima com os novos dados informados.

Para mudar a data se a hora já tiver sido ajustada, escolha a seta abaixo de

CHANGE, escolha DATE(data), e entre com a nova data em continue como acima.

Quando a hora e data estiverem corretos, pressionar a seta abaixo de CONTINUE. 5. Ajustando o Tempo de Atraso para Teste

A seguinte mensagem aparecerá:

TEST DELAY TIME (Tempo de Atraso para Teste) 60 SEC (segundos) PRESS ENTER (pressione enter)

Isso permite ao usuário ajustar o Tempo de Atraso, que é a diferença de tempo entre o momento no qual a amostra é colocada no fluorímetro e o momento no qual ela é de fato medida. Para aplicações AflaTest o tempo de atraso é 60 segundos.

10

O teclado lerá 60, pressione ENTER.

6. Ajustando o Formato de Resposta Depois que o tempo de atraso para teste for ajustado, a tela mostrará o seguinte:

SELECT ANSWER FORMAT (escolha o formato de resposta) INTEGERS (inteiros) DECIMALS (decimais)

Escolher inteiros, dará apenas números inteiros, escolher decimais, dará números menores que dez com uma casa decimal. Escolha DECIMALS.

7. Escolhendo Unidades de Medida A seguinte mensagem aparecerá:

SELECT MEASUREMENT UNITS (escolha unidades de medida) PPM PPB

Isso permite a você escolher a saída em ppm ou ppb. Escolha PPB.

B. Procedimento de Calibração

Depois de escolher o formato de resposta, a seguinte mensagem aparecerá rapidamente:

START CALIBRATION (começar calibração) CHECKING GAINS.(conferindo ganhos) WAIT (aguarde)

Então a mensagem muda para:

INSERT RED VIAL (insira o frasco vermelho) Escolha frasco de calibração superior (VERMELHO) e coloque-o na câmara da amostra. Garanta que o frasco esteja completamente inserido e encosta o fundo da câmara de amostra. O monitor mostra agora:

CALIBRATION VALUE (valor de calibração) 24.0 PPB PRESS ENTER (pressione enter)

Apesar de 24 ppb ser o valor padrão, qualquer valor de calibração, que seja maior que o

valor do branco, e menor 1000 ppb, pode ser usado. Consulte o procedimento específico AflaTest para o valor apropriado. Entre com o valor desejado e aperte ENTER. Pressionar ENTER começará a medição de calibração de amostra. O monitor mostrará:

MEASURING CALIBRATOR (medindo calibrador) Quando a calibração estiver completa a mensagem a seguri aparecerá:

REMOVE RED VIAL (remova o frasco vermelho)

11

Remova o frasco de amostra de calibração da câmara de amostra. A próxima mensagem a aparecer será:

INSERT GREEN VIAL (insira o frasco verde) CONTINUE CALIBRATION (contiuar calibração)

Neste momento, o frasco de “branco” (VERDE) deverá ser escolhido e colocado na câmara de amostra. Tenha certeza que o fraco seja completamente inserido e toque o fundo da câmara de amostra. O monitor mostrará:

BLANK VALUE (valor do “branco”) -1.0 PPB PRESS ENTER (pressione enter)

Apesar de -1.0 ppb ser o valor padrão, qualquer valor de “branco” que seja inferior ao valor de calibração pode ser utilizado, inclusive números negativos. Consulte o procedimento específico AflaTest para o valor apropriado. Entre com o valor desejado utilizando o teclado numérico. Pressionar ENTER começará a medição de calibração “branco”. O monitor mostrará:

MEASURING BLANK(medindo “branco”) Quando a medição do branco acabar, essa mensagem aparecerá:

MEASURING BLANK (medindo “branco”) REMOVE GREEN VIAL (remova o frasco verde)

Remova o frasco de “branco” neste momento. O monitor mostrará agora:

PUSH ENTER TO CONTINUE (aperte enter para continuar) RECAL (recalibrar) <SOFT KEYS>(teclas) RETEST (retestar)

Esta mensagem define as duas setas ativas. A da esquerda (RECAL) deve ser pressionada no final de uma medição se o sistema deve ser recalibrado. A seta da direita (RETEST) deve ser pressionada no final de uma medição se a amostra deve ser remedida (sem tempo de atraso). Para ler um frasco com um atraso de 5 segundos, pressiona a seta do meio antes de inserir o frasco.

O processo de calibração está agora completo. Pressione ENTER para preparar o instrumento para medir amostras desconhecidas. O monitor mostrará:

READY TO START TESTING (pronto para começar o teste) INSERT SAMPLE TO MEASURE (insira a amostra a ser medida)

Neste ponto, a calibração pode ser checada inserindo o frasco de calibração AMARELO para a medição. O resultado desta medida deverá corresponder ao valor apropriado para os parâmetros de calibração encontrados no procedimento específico AflaTest. Se não corresponder, recalibre o fluorímetro com um conjunto diferente de padrões. Para recomeçar o processo de calibração, pressione a seta da esquerda (RECAL).

C. Medição da Amostra

12

1. Para medir a concentração de aflatoxina em uma amostra: Coloque a cubeta de amostra na câmara de amostra. Tenha certeza que a amostra está completamente inserida e toca o fundo ca câmara. O monitor mostrará:

TEST DELAY IN PROGRESS (atraso de teste em progresso_ _ X_ SECS TILL MEASUREMENT (x segundos até a medição)

O número de segundos restantes antes que a medição comece diminuirá até atingir zero(0) e então a mensagem será:

PERFORMING MEASUREMENT (realizando medição) Quando a medição acabar, os resultados que aparecerão serão dessa maneira:

TEST RESULTS (resultados do teste) _ X_ _PPB REMOVE SAMPLE VIAL (remova o frasco de amostra)

2. Opções de re-medição:

Neste momento há três ações, que podem ser escolhidas pelo operador: a. Remover a cubeta de amostra e proceder para a próxima amostra para

medição. O monitor mostrará:

PREV RESULTS (resultados anteriores) _ X_ _ PPB INSERT NEXT SAMPLE (inserir próxima amostra)

quando a próxima amostra for inserida no espaço a mensagem mudará para:

PREV RESULTS (resultados anteriores)_ _X _ PPB _ _X _ SECS TILL MEASUREMENT (x segundos até a medição)

A amostra será medida e os resultados serão mostrados como antes. b. Repetir Medição A amostra pode ser re-medida sem o tempo de atraso pressionando a seta da

direita (RETEST). A amostra será imediatamente medida e os resultados serão mostrados como antes.

c. Se a amostra foi removida, um resultado pode ser obtido em 5 segundos

pressionando a seta do meio antes de inserir a cubeta no fluorímetro. d. Re-calibrar Se for desejado, o fluorímetro pode ser re-calibrado. Para iniciar o processo

de calibração pressione a seta esquerda (RECAL). O instrumento então procederá ao processo de calibração como descrito na Seção B acima.

13

2.2 CALIBRAÇÃO DO FLUORÍMETRO PARA VICAM SERIES 4 E 4EX 1. Pressione a tecla SELECT TEST (escolher teste) até AFLATEST aparecer na tela.

Então aperte ENTER. 2. O fluorímetro mostrará:

START CALIBRATION... OPEN THE LID (começar calibração... abra a tampa) INSERT RED VIAL (insira o frasco vermelho)

Abra a tamba e insira o frasco de calibração vermelho. Tenha certeza de que o

frasco está completamente inserido e toca o fundo do espaço. 3. O monitor deve mostrar:

HIGH CAL (calibração superior) 22 PPB Se este é o valor do frasco vermelho correto para o procedimento que você está

utilizando, pressione ENTER. Caso contrário, entre com o valor de calibração desejado. Confirme que o valor desejado aparece na tela e aperte ENTER.

4. O monitor mostrará:

READING HIGH CAL... SAVING HIGH INTENSITY (lendo calibração superior... salvando alta intensidade)

e então mostrará:

OPEN THE LID (abra a tampa) INSERT GREEN VIAL (insira o frasco verde)

Abra a tampa, remova o frasco vermelho e insira o frasco de calibração verde,

novamente garantindo que o frasco está completamente inserido e toca o fundo do espaço.

5. O monitor deverá mostrar:

LOW CAL (baixa calibração) -1.0 PPB Se este é o valor do frasco verde desejado para o método que você está utilizando,

aperte ENTER. Caso contrário, entre com o valor desejado. Confirme que o valor desejado aparece na tela e pressione ENTER.


READING LOW CAL... SAVING LOW INTENSITY (lendo baixa calibração... salvado baixa intensidade)

e então mostrará:

OPEN THE LID (abra a tampa) Abra a tampa e remova o frasco verde.

14


VICAM READY (VICAM pronto) O monitor pode mostrar outros números para indicar qual versão do software você

instalou. Pressione SELECT TEST(escolher teste). O monitor mostrará:

AFLATEST Pressione ENTER. 8. O monitor mostrará:

START RUN TEST (começar teste) OPEN THE LID (abra a tampa) 9. Insira o padrão de calibração amarelo. A leitura do frasco amarelo deve estar no

alcance listado na seção de procedimentos. 10. O fluorímetro está agora pronto para ter as amostras inseridas. Os fluorímetros das

series-4 e series-4EX precisam ser calibrados apensa uma vez por semana. Para recalibrar o fluorímetro: Aperte a tecla STOP(parar). Pressione a tecla

OPTIONS(opções) até aparecer na tela:

CALIBRATE TEST (calibrar teste) Então aperte ENTER. A tela deve mostrar:

AFLATEST Se não mostrar, pressione SELECT TEST (escolher teste) até “AFLATEST”

aparecer na tela e então aperte ENTER. Insira os frascos de calibração vermelho e verde e calibre como descrito acima.

Para rodar um teste: pressione SELECT TEST até a tela mostrar:

AFLATEST (ou o teste desejado) Então aperte ENTER. Para sair de qualquer procedimento: pressione STOP. Para mais detalhes sobre o uso do fluorímetro, por favor, consulte o Manual do Operador do fluorímetro.

15

2.3 CALIBRAÇÃO DO MF-2000™ MINI FLUOROMETER A calibração será necessária apenas se a unidade foi desligada ou após 24 horas desde a última calibração. 1. Ligue o aparelho utilizando o interruptor atrás do instrumento. 2. A luz verde de POWER (força) READY (pronto) acenderá indicando que o

instrumento está operando e pronto para proceder com o teste. Permita ao instrumento um aquecimento de 15 min.

3. Pressione o botão RUN/STEP(correr/passo). A luz vermelha de INSERT RED

VIAL(insira o frasco vermelho) acenderá. Realize o próximo passo dentro de 15 segundos ou a luz READY(pronto) acenderá.

4. Abra a tampa e insira o frasco de calibração vermelho. Garanta de que o frasco

esteja completamente inserido e toca o fundo do espaço. 5. Pressione o botão RUN/STEP(correr/passo). A calibração estará completa quando

a luz vermelha INSERT GREEN VIAL(insira o frasco verde) acender. Realize o próximo passo dentro de 15 segundos ou a luz READY(pronto) acenderá.

6. Abra a tampa e insira o frasco de calibração verde. Garanta de que o frasco esteja

completamente inserido e toca o fundo do espaço. 7. Pressione o botão RUN/STEP(correr/passo). A calibração estará completa quando

a luz verde INSERT SAMPLE(insira a amostra) acender. 8. Abra a tampa e remova o frasco verde. A luz INSERT SAMPLE(insira a

amostra) acenderá. 9. Insira o frasco amarelo para conferir a calibração. Pressione o botão

RUN/STEP(correr/passo). As luzes de BAR GRAPH(gráfico de barras) acenderão. Verifique o resultado de acordo com a variação aceitável listada no procedimento apropriado.

10. A luz READY(pronto) acenderá. 11. Pressione o botão RUN/STEP(correr/passo). A luz INSERT SAMPLE(insira a

amostra) acenderá. 12. Insira a cubeta contendo a amostra eluída e pressione o botão

RUN/STEP(correr/passo). As luzes de BAR GRAPH(gráfico de barras) acenderão. Leia a concentração de toxina utilizando o revestimento apropriado.

13. Repita os passos 11 e 12 para ler mais amostras. 14. As luz vermelha de OVER HIGH CAL(acima da calibração superior) acenderá

quando a concentração de toxina for maior que a concentração do frasco vermelho. 15. A luz vermelhra ERROR(erro) acenderá quando houver um erro de inicialização,

quando a concentração da amostra estiver fora de alcance (muito baixa ou muito alta), quando o calibrador superior tiver mais flourescência do que o instrumento

16

pode medir ou quando o calibrador inferior tiver menos fluorescência que o instrumento pode detectar.

17

2.4 COMPARAÇÃO DOS VALORES DE CALIBRAÇÃO DO FLUORÍMETRO Os valores de calibração do fluorímetro variam dependendo do método e do modelo do fluorímetro. A tabela a seguir contem uma descrição geral das configurações apropriadas do fluorímetro. Por favor, veja o método específico na seção de procedimentos para a configuração de calibração para cada método. Please see the specific method in the procedures section for the calibration setting for each method.

Torbex FX-100 VICAM V1 MF-2000™

series 3 series 4/4EX revestimento Equivalente-grama do

método

vermelho/verde (amarelo)

vermelho/verde (amarelo)

0.2 120 / -2 (59 ± 5)

110 / -2 (54 ± 5)

AflaTest® 0.2 g

0.5 48 / -1 (24 ± 2)

44 / -1 (22 ± 2)

AflaTest® 0.5 g

1.0 24 / -1 (12 ± 2)

22 / -1 (11 ± 2)

AflaTest® 1.0 g

FGIS 160 / -3 (78 ± 4)

AflaTest® USDA-FGIS

18

2.5 PREPARAÇÃO DA FILTRAÇÃO

Filtro de Pregas O primeiro passo de filtração é uma simples filtração por gravidade através de um filtro de pregas de papel para separar a solução de extrato de amostra dos sólidos de amostra particulados grossos. O filtado é coletado em um recipiente limpo ou em uma proveta. 1. Abra um filtro de pregas cuidadosamente e

insira em um recipiente limpo. (Opcional: um funil pode ser utilizado para segurar o filtro).

2. Dobre as bordas do filtro por cima da boca

do copo para segurá-lo no lugar. Mantenha as pregas do papel de filtro para maximizar a superfície. Isto aumentará a velocidade de filtração.

3. Não é necessário esperar todo o extrato

passar pelo filtro antes de continuar. Filtro de Microfibra O segundo passo da filtração é a filtração do extrato por gravidade através de um filtro de microfibra. Isto remove quaisquer precipitados no extrato e garante que o extrato passará facilmente pela coluna de afinidade. A filtração de microfibra é realizada exatamente antes da cromatrografia de afinidade. 1. Coloque um funil pequeno na saída de

cima de uma seringa ou de um copo de coleta limpo.

2. Coloque um filtro de microfibra

gentilmente dentro do funil pequeno pressionando o filtro dentro do funil com o dedo indicador. Cuidado para não rasgar ou furar o filtro.

19

2.6 CONFIGURAÇÃO DO SUPORTE DE BOMBA

A cromatografia de afinidade AflaTest é facilmente realizada com a coluna de afinidade AflaTest anexada a um suporte de bomba. O suporte tem uma seringa de 10mL que serve como um reservatório para a coluna. Uma seringa grande com tubo e acoplamento provem pressão de ar para empurrar manualmente líquidos através da coluna. Uma bomba de ar ajustável (parte VICAM n°20650) pode ser anexada ao tubo da bomba ao invés de uma grande seringa para operar sem usar a pressão manual. Suportes de bomba de dupla posição (parte n° 21030), suportes de bomba de quatro posições com bombas de aquário (parte VICAM n°21045), e suportes de bomba de doze posições com bombas de aquário (part # VICAM G1104) estão disponíveis para correr múltiplas amostras de uma só vez. Quando utilizar um suporte de bomba:

1. Remova a tampa grande de cima da coluna. 2. Corte-a pela metade, retirando a ponta

inferior da tampa. Isto provem um acoplamento reutilizável para anexar a coluna.

3. Recoloque a tampa azul da coluna que foi

cortada, anexe a coluna à ponta da seringa de vidro e coloque o reservatório de resíduos abaixo da coluna de afinidade.

4. Verta o extrato dentro do filtro de

microfibra (ver seção anterior) e colete a quantidade desejada de extrato em seringa de vidro utilizando as marcações na seringa para medir o extrato.

5. Puxe o pistão da seringa de plástico. 6. Insira o acoplamento no final do tubo

dentro da seringa. Remova a tampa de baixo da coluna.

7. Aplique pressão ao pistão da seringa de

plástico para empurrar o líquido através da coluna. Mantenha uma taxa de fluxo de 1-2 gotas por segundo. Empurre todo o líquido através da coluna. Repita para os passos de lavagem e eluição (ver procedimentos).

Nota: Evite puxar o pistão da seringa de plástico enquanto o acoplamento estiver anexado à seringa de vidro. Isto pode deslocar o suporte de gel coberto de anticorpos e afetar os resultados do teste.

20

2.7 LIMPANDO O EQUIPAMENTO Antes de Começar o Teste AflaTest Para eliminar qualquer fluorescência de fundo¹ garanta que o equipamento está limpo e não está contaminado com materiais que possam causar fluorescência de fundo. Isso é especialmente importante quando utilizar equipamentos nunca utilizados antes ou equipamentos que não foram utilizados por um longo período de tempo. Antes de utilizar o equipamento, ele deve ser lavado com uma solução de detergente neutro e então enxaguadas perfeitamente com água purificada. Isto inclui as seringas de vidro utilizadas como reservatórios de amostra. Lave seringas novas para suportes de bomba utilizando uma escova com sabão e água. Então enxague com água purificada e metanol. As outras partes do equipamento que precisam ser lavadas com detergente antes de serem usadas são provetas, funis e copos de liquidificador. Dosadores precisam apenas ser lavados com metanol antes de serem utilizados. Entre Análises: Depois de cada análise, todas as partes do copo do liquidificador precisam ser lavadas com uma solução de detergente neutra e então enxaguadas perfeitamente com água. O mesmo procedimento de limpeza deve ser relizado para qualquer equipamento que for reutilizado para conter, coletar ou transferir extratos de amostra.∗

Não lave o dosador com sabão. O dosador de metanol precisa apenas ser enchido novamente com metanol. Entre cada análise, O reservatório da seringa pode ser lavado com ethanol e seguido de um enxague com água purificada. Isso será suficiente para evitar contaminação de uma amostra para outra. Depois que algumas amostras tiverem sido testadas, a seringa de vidro deve ser lavada com uma escova e detergente e ser bem enxaguada com água. Não é recomendado lavar e reutilizar cubetas. Estas cubetas são feitas para uso único e devem ser descartadas. Outas Precauções Impotantes Utilize apenas equipemento especificado pela VICAM. Evite o contato de quaisquer soluções ou reagentes do teste (tais como metanol, água, extrato, eluato da coluna ou revelador) com borracha ou plásticos macios e flexíveis. Estes materiais podem lixiviar materias fluorescentes contaminadores na amostra e através disso afetar os resultados. Nota: Algumas tampas de copos de liquidificador são forrados com papelão encerado. Estes forros não são resistentes a soluções de metanol e água e quebrarão quando usados para a extração da amostra. O extrato então será contaminado com materiais, que podem causar fluorescência de fundo. Tampas com forro de papelão não devem ser usadas. ∗ Mais detalhes sobre descontaminação podem ser encontrados em JAOAC 48, 681 (1965); Am. Hyg. Assoc. J. 42, 398 (1981); e IARC Sci. Publ. No. 37, IARC, Lyon, France, 1980. ¹N.T. Fluorencência de fundo é aquela causada por substâncias que deixam um rastro de fluorescência do equipamento, podendo causar falsos positivos nos testes.

21

3.1 PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE EXTRAÇÃO

O procedimento AflaTest utiliza uma solução de metanol ou água/metanol para extrair a aflatoxina da amostra.

Para preparar a solução de extração: Utilize metanol de alto grau de pureza (ou melhor – isto é pureza para HPLC) para preparar soluções de extração.

Solução desejada (metanol:água)

Metanol (mL)

Água Purificada (mL)

Volume Total (mL)

80:20 800 200 1000 (1 litro)

70:30 700 300 1000 (1 litro)

60:40 600 400 1000 (1 litro)

CUIDADO: O solvente de extração é inflamável. Mantenha o recipiente firmemente tampado quando não estiver sendo utilizado. Prepare a solução de extração toda semana ou conforme o necessário. As fórmulas acima preparam 1 litro de solução. O volume de solução pode ser aumentado ou diminuído conforme o necessário desde que a proporção de reagentes seja mantida. 3.2 PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO REVELADORA

Para preparar a solução reveladora AflaTest diluída:

1. Meça 2.0 mL de solução reveladora AflaTest concentrada e coloque no frasco âmbar de 50 mL. do dosador (parte VICAM nº 20600).

2. Adicione 18.0 mL de água purificada e misture bem. 3. Feche o dosador firmemente. Mantenha a solução reveladora diluída

firmemente tampada quando não estiver em uso. Não use revelador diluído depois de mais que 8 horas desde a preparação.

Para usar o revelador:

Dispense ou pipete exatamente 1.0 mL de solução reveladora diluída diretamente na cubeta contendo o eluato da coluna de afinidade e misture bem antes de ler esta solução no fluorímetro. Quando utilizar o dosador, garanta que não há bolhas no tubo.

Para garantir desempenho máximo da solução reveladora AflaTest siga estas recomendações:

1. Faça a solução reveladora diluída a cada 8 horas. Se estiver em dúvida sobre

a potência do revelador diluído, é melhor fazer uma nova solução diluída do revelador concentrado.

2. Evite a contaminação da garrafa de revelador concetrado, vidraria e pipetadores com sujeira, poeira e outros líquidos. Mantenha a garrafa firmemente tampada quando não estiver em uso. A solução de estoque de solução reveladora deve ter uma cor amarela definida. Esta cor é uma boa indicação de sua potência. Não utilizar se a solução concentrada estiver incolor.

22

3. Etiquete cada novo frasco de revelador concentrado com a data na qual ele foi aberto pela primeira vez. Não utilizar após 30 dias aberto.

4. Teste a solução reveladora diluída para fluorescência de fundo. Coloque 2.0 mL de revelador diluído em uma cubeta. Coloque a cubeta em um fluorímetro calibrado. O visor digital do fluorímetro deve mostrar 0. Se a leitura não for igual a 0, veja a seção 3.4, Verificação dos Reagentes.

3.3 PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE DILUIÇÃO/LAVAGEM

As fórmulas abaixo preparam 1 litro de solução. O volume da solução pode ser aumentado ou diminuído conforme o necessário desde que a proporção de reagentes seja mantida.

1. Soluções de Metanol:água; preparar toda semana ou conforme necessário

Solução desejada (metanol:água)

Metanol puro para HPLC (mL)


Volume Total (mL)

10:90 100 900 1000 (1 litro)

20:80 200 800 1000 (1 litro)

2. Soluções de Tween-20; preparar todo mês ou conforme necessário

Solução desejada Tween-20 (mL)


Volume Total (mL)

Tween-20 10% 100 900 1000 (1 litro)

Tween-20 15% 150 850 1000 (1 litro)

3. PBS

8.0 g NaCl 1.2 g Na2HPO4 0.2 g KH2PO4 0.2 g KCl dissolver em aproximadamente 990 mL de água purificada ajustar o pH para 7.0 com HCl concentrado completar para 1 liter com água purificada

Uma solução concentrada 10X de PBS também pode ser compradada VICAM (parte nºG1113). PBS concetrado 10X deve ser duluído para 1X com água purificada conforme o necessário – isto é dilua 100 mL de PBS 10X com 900 mL de água purificada.

4. Tampão de Lavagem Tween-20 0.01%

0.1 mL Tween 20 1000 mL PBS Um tampão de lavagem Tween-20 0.01% concentrado 10X também pode ser comprado de VICAM (parte nº G1114). O tampão concentrado 10X deve

23

ser diluído a 1X com água purificada conforme o necessário – isto é dilua 100 mL de tampão 10X em 900 mL de água purificada.

3.4 VERIFICAÇÃO DOS REAGENTES Nos procedimentos AflaTest, os níveis de aflatoxina são detectados e quantificados por fluorimetria. Para determinação precisa da concentração de aflatoxina é crucial que somente a aflatoxina na cubeta esteja emitindo fluorescência. Fluorescência de fundo e/ou quimioluminescência causadas por reagentes ou pelas cubetas serão erroneamente mensurados como aflatoxina pelo fluorímetro. É boa prática e fortemente recomendado verificar os reagentes e as cubetas para garantir que eles não são fluorescentes e não contribuirão para a fluorescência medida pelo fluorímetro. Este é um processo fácil e deve ser realizado diariamente ou toda vez que um novo lote de reagentes ou cubetas for utilizado. Para Verificar Reagentes e Cubetas: 1. Calibre o fluorímetro. 2. Pipete 2 mL de metanol utilizado para a eluição na coluna em uma cubeta. 3. Meça a fluorescência de fundo no fluorímetro. A leitura deve ser 0. 4. Pipete 2 mL de água purificada utilizada para lavagem da coluna em uma cubeta. 5. Meça a fluorescência de fundo no fluorímetro. A leitura deve ser 0. 6. Pipete 2 mL de revelador diluído em uma cubeta. 7. Meça a fluorescência de fundo no fluorímetro. A leitura deve ser 0. 8. Pipete 1 mL de metanol em uma cubeta e adicione 1 mL de revelador diluído. Misture bem. 9. Meça a fluorescência de fundo no fluorímetro. A leitura deve ser 0.

*** IMPORTANTE *** Soluções que não derem uma leitura de 0 devem ser testadas novamente com uma nova cubeta. Se a solução ainda não ler 0, ela deve ser descartada e uma nova solução deve ser preparada e testada. Se todas as três soluções testadas derem leituras acima de 0, verifique novamente a calibração do fluorímetro. Se a calibração for satisfatória, então há uma boa possibilidade de que as cubetas estejam com defeito e um novo lote de cubetas deve ser obtido. Tenha certeza de utilizar cubetas adquiridas de VICAM. Outras cubetas podem conter material fluorescente. Sugestão Útil: Antes de começar a testar uma amostra, uma boa verificação dos procedimentos, reagentes e equipmentos deve ser feita correndo uma análise completa sem amostra. A leitura do fluorímetro para uma análise “branca” deve ser 0.

24

4.1 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS EXIGIDOS

Materiais Exigidos

Descrição Cód. nº Colunas AflaTest (50/caixa) 12022 *Pipetas de Plástico Descartáveis (50) 20652 *Filto de Papel com Pregas VICAM, 24 cm (100) 31240 *Filtros de Microfibra, 1.5µm, 11 cm (100) 31955 *Lenços de Papel Kim Wipes(1 Caixa) 31967 *Revelador AflaTest (50 mL) 32010 *Padrões de Calibração de Micotoxina 33020 ou Padrões de Calibração AflaTest-FGIS 33030 ou Padrões de Calibração AflaTest-M 33040 *Cubetas Descartáveis (250) 34000 Metanol, pureza para HPLC (4 x 4 L) 35016 *Béqueres Descartáveis de Plástico (25) 36010 Sal conforme as especificações da ACS (100 g) (sal não iodado, NaCl) G1124 Tween-20 (50 mL) (para alfalfa, noz-moscada, orégano, pimenta do reino e cúrcuma) 33501 Filtros de Microfibra, 1.0µm, 9 cm (100) (para amendoim cru com casca) G2005 Filtros para seringa de membrana de nylon de 0.22 mícrons (para casca de amendoim e ração de glúten de milho) G2007

Tween/PBS 0.1% Concentrado 10X (150 mL) (para molho de soja) G1112 Tween/PBS 0.01% Concentrado 10X (150 mL) (para figos e passas) G1114 Colunas WB Aflatest (25/caixa) (para procedimento USDA-FGIS para glúten de milho) G1024 Tween/PBS 2% Concentrado 10X (300 mL) (para procedimento USDA-FGIS para glúten de milho) G1105

Água Purificada

Equipmentos Exigidos

Descrição Part nº *Proveta, 50mL 20050 *Balança Digital com Adaptador AC 20100 *Liquidificador Comercial com Recipiente de Aço Inoxidável 20200 *Proveta, 250mL 20250 *Copo de Liquidificador de Vidro Eberbach 500 mL 20300 *Dispenser para garrafa de 500 mL para Metanol (alcance de 0-3 mL) 20501 *Dispenser para garrafa de 50 mL para revelador (alcance de 0-3 mL) 20600 *Pisseta, 500 mL 20700 *Prateleira de Cubetas 21010 *Suporte de Bomba de Posição Única com bomba de ar G4061 ou Suporte de Bomba de Posição Única com bomba manual 21020 *Funis de Filtro, 65 mm (10 por pacote) 36020 *Fluorímetro Series 4 ou 4EX G8000 ou MF-2000 Mini Fluorometer G8200 Centrifuga capaz de obter 2000g (para leite apenas)

SUGERIDO MAS NÃO EXIGIDO

Descrição Part nº Ponteiras de Micro-pipeta para Micro-pipetador de 1mL (100) 20656 Vortex 23040 Funis de Filtro, 105 mm (4 por pacote) 36022 Micro-pipetador, 1.0 mL G4033

* Incluído no Pacote de Equipamento Básico do Fluorímetro AflaTest Series 4 - 110V, U.S.A. (VICAM nº G8001) e 220V, Internacional (VICAM nº G8002).

25

4.2 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA ALFALFA, COM FLUORÍMETRO (0 - 300 PPB)

1.0 Configurações de Calibração: utilize padrões de calibração de micotoxina Instrumento Verde Vermelho Amarelo TorBex Model FX-100 series 3 -2 120 59 ± 5

VICAM series 4 and 4EX -2 110 54 ± 5 A leitura de aflatoxinas totais será em partes por bilhão

2.0 Preparação: 2.1 Calibre o fluorímetro. Tenha certeza de que a leitura do padrão de

calibração amarelo está na variação listada acima. 2.2 Tenha certeza de que 2 mL de água purificada em uma cubeta mostrem 0

ppb em um fluorímetro calibrado. 2.3 Prepare a solução de metanol:água (80:20 por volume) toda semana ou

conforme o necessário. 2.4 Prepare uma solução de Tween 20 10% em água (por volume) toda

semana ou conforme o necessário. 2.5 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 2.6 Garanta que o branco para reagentes(1 mL de metanol + 1 mL de

revelador em uma cubeta) mostre 0 em um fluorímetro calibrado.

3.0 Extração da Amostra: 3.1 Pese 25g de amostra bruta com 5g de sal (NaCl) e coloque no copo de

liquidificador. 3.2 Adicione ao copo 100mL de metanol:água (80:20). 3.3 Tampe o copo do liquidificador e bata a alta velocidade por 1 minuto. 3.4 Remova a tampa do copo e despeje o extrato em um filtro de papel com

pregas. Colete o filtrado em um recipiente limpo.

4.0 Diluição do Extrato 4.1 Pipete ou despeje 5.0 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 20 mL de solução Tween 20 10%. Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro de

1.5µm em um recipiente limpo ou diretamente em uma seringa de vidro utilizando as marcações na seringa para medir 4 mL.

5.0 Cromatografia por Coluna

5.1 Passe 4mL de extrato filtrado diluído (4 mL = 0.2 g de amostra) completamente através da coluna AflaTest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.2 Passe 10 mL de água purificada através da coluna a uma vazão de 1-2 gotas por segundo.

5.3 Repita o passo anterior mais uma vez até entrar ar na coluna. 5.4 Coloque a cubeta de vidro (parte VICAM nº 34000) abaixo da coluna e

adicione 1.0 mL metanol de pureza para HPLC à seringa de vidro. 5.5 Elua a coluna a uma vazão de 1 gota/segundo passando o metanol

através da coluna e coletando toda a amostra eluída (1.0 mL) em uma cubeta de vidro.

26

5.6 Adicione 1.0 mL de revelador AflaTest ao eluato na cubeta. Misture bem e coloque a cubeta em um fluorímetro calibrado. Leia a concentração de aflatoxina após 60 segundos.

6.0 Limite de Detecção: Interpolado para ser 2 ppb.

27

4.3 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA CASTANHA-DO-PARÁ, COM FLUORÍMETRO (0 - 50 PPB)

1.0 Configurações de Calibração: utilize padrões de calibração de micotoxina Instrumento Verde Vermelho Amarelo VICAM series 4 and 4EX -0.5 22 11 ± 1 A leitura de aflatoxinas totais será em partes por bilhão




conforme o necessário. Prepare a solução de metanol:água (20:80 por volume) toda semana ou conforme o necessário.

2.4 Tenha certeza de que os 2 mL de metanol:água (20:80) em uma cubeta mostrem 0 em um fluorímetro calibrado.

2.4 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 2.5 Garanta que o branco para reagentes(1 mL de metanol + 1 mL de



liquidificador. 3.2 Adicione ao copo 125 mL metanol:água (60:40). 3.3 Tampe o copo do liquidificador e bata a alta velocidade por 1 minuto. 3.4 Remova a tampa do copo e despeje o extrato em um filtro de papel com

pregas. Colete o filtrado em um recipiente limpo. 4.0 Diluição do Extrato

4.1 Pipete ou despeje 20 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 20 mL água purificada. Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro de

1.5µm em um frasco limpo ou diretamente em uma seringa de vidro utilizando as marcações na seringa para medir 10 mL.


5.1 Passe 10 mL de extrato diluído filtrado (10 mL = 1.0 g de amostra) completamente através da coluna AflaTest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.2 Passe 10 mL de metanol:água (20:80) através da coluna a uma vazão de aproximadamente 2 gotas por segundo.


adicione 1.0 mL metanol de pureza para HPLC em uma seringa de vidro. 5.5 Elua a coluna a uma vazão de 1 gota/segundo passando o metanol



6.0 Limite de Detecção: 0.5 ppb.

28

4.4 PROCEDIMENTO USDA-FGIS AFLATEST PARA MATERIAIS SOLÚVEIS CONDENSADOS DE DESTILADORES, COM FLUORÍMETRO (0 - 100 PPB)

1.0 Configurações de Calibração: utilize padrões de calibração AflaTest FGIS

Instrumento Verde Vermelho Amarelo VICAM series 4 and 4EX -3 160 78 ± 4

MF-2000™ Revestimento AflaTest FGIS 66-81

A leitura de aflatoxinas totais será em partes por bilhão

2.0 Preparação:

2.1 Calibre o fluorímetro. Tenha certeza de que a leitura do padrão de calibração amarelo está na variação listada acima.

2.2 Tenha certeza de que os 2 mL de água purificada em uma cubeta mostrem 0 ppb em um fluorímetro calibrado.

2.3 Prepare a solução de metanol:água (80:20 por volume) toda semana ou conforme o necessário.






4.0 Diluição do Extrato 4.1 Pipete ou despeje 10 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 20 mL água purificada. Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro de

1.5µm em um recipiente limpo.

5.0 Cromatografia por Coluna 5.1 Passe 2mL de extrato filtrado diluído completamente através da coluna

AflaTest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna. 5.2 Passe 6 mL de água purificada através da coluna a uma vazão de 1-2

gotas por segundo. 5.3 Repita o passo anterior mais uma vez até entrar ar na coluna. A

quantidade total de água que lavou a coluna é 12 mL. 5.4 Coloque a cubeta de vidro (parte VICAM nº 34000) abaixo da coluna e



29


6.0 Limite de Detecção: Menor que 3 ppb.

30

4.5 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA MILHO, MILO, GRÃOS e RAÇÕES BASEADAS EM MILHO/SOJA, COM FLUORÍMETRO (0 – 50 PPB)

1.0 Faixa de Trabalho:

Instrumento Alcance da Análise

Series 3 0 - 50 ppb Series 4 and 4EX 0 - 50 ppb

MF-2000™ 0 - 24 ppb 2.0 Limite de Detecção (LD):

Instrumento LD Series 3 1.0 ppb

Series 4 and 4EX 1.0 ppb MF-2000™ 1.5 ppb

3.0 Configurações de Calibração: utilize padrões de calibração de micotoxina

Instrumento Verde Vermelho Amarelo TorBex Model FX-100 series 3 -1 24 12 ± 2 VICAM series 4 and 4EX -1 22 11 ± 2

MF-2000™ Revestimento AflaTest® 1.0g 10 - 12





conforme o necessário. 4.4 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 4.5 Garanta que o branco para reagentes(1 mL de metanol + 1 mL de





6.0 Diluição do Extrato 6.1 Pipete ou despeje 10 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 6.2 Dilua o extrato com 40 mL água purificada. Misture bem.

31

6.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro de 1.5µm em um frasco limpo ou diretamente em uma seringa de vidro utilizando as marcações na seringa para medir 10 mL.








32

4.6 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA MILHO, MILO, GRÃOS e RAÇÕES BASEADAS EM MILHO/SOJA, COM FLUORÍMETRO (0 – 300 PPB)

1.0 Alcance da Análise:








MF-2000™ Revestimento AflaTest® 0.2g 53 – 65



calibração amarelo está na variação listada acima. 4.2 Tenha certeza de que os 2 mL de água purificada em uma cubeta

mostrem 0 ppb em um fluorímetro calibrado. 4.3 Prepare a solução de metanol:água (80:20 por volume) toda semana ou



5.0 Extração da Amostra: 5.1 Pese 50g de amostra com 5g de sal (NaCl) e coloque no copo de




33




7.2 Pass 5 mL de água purificada através da coluna a uma vazão de 1-2 gotas por segundo.





34

4.7 PROCEDIMENTO AFLATEST® USDA-FGIS PARA MILHO, FARELO DE MILHO, FARINHA DE MILHO, FLOCOS DE MILHO PARA MINGAU E MISTURA DE MILHO/SOJA, PIPOCA, ARROZ BRANCO, ARROZ INTEGRAL, SORGO E SOJA, COM FLUORÍMETRO (0-100 PPB)





2.0 Preparação:











5.0 Cromatografia por Coluna 5.1 Prepare uma coluna AflaTest para utilizar removendo ambas as tampas

de baixo e gentilmente agitando a solução tampão desde o topo da coluna.

5.2 Utilizando um micro-pipetador de 1 mL, adicione 1 mL de extrato filtrado ao headspace da coluna. Anexe a coluna a um suporte de bomba VICAM. Passe todo o extrato filtrado através da coluna a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.3 Lave a coluna com 1 mL de água purificada a uma vazão de 1-2 gotas por segundo. Se a coluna estiver anexada à uma seringa de vidro, remova a coluna da seringa e coloque água diretamente no headspace da coluna.

5.4 Repita o passo anterior mais uma vez até entrar ar na coluna.

35

5.5 Coloque a cubeta de vidro (parte VICAM nº 34000) abaixo da coluna e adicione 1.0 mL metanol de pureza para HPLC no headspace da coluna. Elute a uma vazão de 1 gota/segundo e coletando toda a amostra eluída (1 mL) em uma cubeta de vidro.



36

4.8 PROCEDIMENTO AFLATEST® - AOAC - PARA MILHO, AMENDOIM CRU E MANTEIGA DE AMENDOIM, COM FLUORÍMETRO (0 - 50 PPB)



A leitura de aflatoxinas total será em parte por bilhão.




conforme o necessário. 2.4 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 2.5 Garanta que o branco para os reagentes(1 mL de metanol + 1 mL de

revelador em uma cubeta) mostre 0 ppb em um fluorímetro calibrado.

3.0 Extração da Amostra: 3.1 Pese 25 g de amostra bruta com 5 g de NaCl e coloque no copo de

liquidificador. 3.2 Adicione ao copo 125 mL metanol:água (70:30). 3.3 Tampe o copo do liquidificador e bata a alta velicidade por 2 minutos. 3.4 Remova a tampa do copo e despeje o extrato em um filtro de papel com




5.0 Cromatografia por Coluna 5.1 Passe 15 mL de extrato filtrado diluído (15 mL = 1.0 g de amostra)

completamente através da coluna AflaTest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.






6.0 Limite de Detecção: O estudo Colaborativo da AOAC correu amostras a um

nível abaixo de 10 ppb. Outros estudos em VICAM mostraram que é possível detectar a níveis de 2 ppb.

37

4.9 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA MILHO - USDA-FGIS - DE FILTRAÇÃO ÚNICA, COM FLUORÍMETRO (0-100 PPB)


Instrumento Verde Vermelho Amarelo

VICAM series 4 and 4EX -2.0 110 53 ± 4 A leitura de aflatoxinas total será em parte por bilhão.

2.0 Preparação:


2.2 Tenha certeza de que 2 mL de água purificada em uma cubeta mostrem 0 ppb em um fluorímetro calibrado.


2.4 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 2.5 Garanta que o branco para os reagentes(1 mL de metanol + 1 mL de

revelador em uma cubeta) mostre 0 ppb em um fluorímetro calibrado. 3.0 Extração da Amostra:

3.1 Pese 50 g de amostra bruta com 10 g de sal (NaCl) e coloque em uma Recipiente com tampa de 500 mL, ou elemayer.

3.2 Adicione ao recipiente 100 mL de metanol:água (80:20). 3.3 Tampe o Recipiente e agite manualmente por 1 minuto (também pode

ser agitado em um agitador mecânico de balanço). 4.0 Diluição do Extrato e filtração:

4.1 Remova a tampa do recipiente e adicione 250 mL água purificada. 4.2 Recoloque a tampa do recipiente e agite a mistura vigorosamente de 5 a

10 segundos. 4.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de 1.5 µm

(VICAM nº 31955) em um recipiente limpo. 5.0 Cromatografia por Coluna:

5.1 Passe 2 mL de extrato filtrado (2 mL = 0.29 g de amostra) completamente através da coluna de imunoafinidade Aflatest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna. Os 2 mL devem ser precisamente medidos com um pipetador manual ou uma pipeta volumétrica - não utilize as marcações na seringa para medir os 2 mL de extrato.

5.2 Lave a coluna passando 3 mL de água purificada através da coluna a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.3 Repita o passo anterior mais uma vez até entrar ar na coluna. 5.4 Elua a coluna com 1.0 mL de metanol de pureza para HPLC a uma

vazão de 1 gota/segundo e colete todo o eluato da amostra(1.0 mL) em uma cubeta de vidro.

38

5.5 Adicione 1.0 mL de revelador Aflatest recém-feito ao eluato na cubeta. Misture bem e meça a fluorescência em um fluorímetro calibrado. Leia a concentração total de aflatoxina após 30 segundos.

7.0 Limite de Detecção: 0.47 ppb

39

4.10 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA MILHO - USDA-FGIS - DE FILTRAÇÃO ÚNICA, COM FLUORÍMETRO (0-300 PPB)




2.0 Preparação:




2.4 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 2.5 Garanta que o branco para os reagentes(1 mL de metanol + 1 mL de

revelador em uma cubeta) mostre 0 ppb em um fluorímetro calibrado.

3.0 Extração da Amostra: 3.1 Pese 25 g de amostra bruta com 5 g de salt (NaCl) e coloque em uma

garrafa de 250mL. 3.2 Adicione à garrafa 50 mL de metanol:água (80:20). 3.3 Tampe a garrafa e agite em um agitador mecânico de balanço por 1

minuto. Alternativamente, pode ser agitada manualmente. 4.0 Diluição do Extrato:

4.1 Remova a tampa e adicione 125 mL de água purificada. 4.2 Coloque a tampa de volta na garrafa e agite a mistura vigorosamente por 10 segundos.



5.1 Passe 2mL de extrato filtrado diluído completamente através da coluna AflaTest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.


5.3 Coloque a cubeta de vidro (parte VICAM nº 34000) abaixo da coluna e adicione 1.0 mL metanol de pureza para HPLC à seringa de vidro.

5.4 Elua a coluna a uma vazão de 1 gota/segundo passando o metanol através da coluna coletando toda a amostra eluída (1.0 mL) em uma cubeta de vidro.


40

6.0 Limite de Detecção: 2 ppb.

41

4.11 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA MILHO USANDO ETANOL (0-100 PPB)

1.0 Configurações de Calibração: utilize os padrões de calibração AflaTest FGIS




calibração amarelo está na variação listada acima. 2.2 Tenha certeza de que os 2 mL de água purificada em uma cubeta

mostrem 0 ppb em um fluorímetro calibrado. 2.3 Prepare etanol:água (80:20 por volume) toda semana ou conforme o

necessário. Utilize etanol com pureza para HPLC/espectrofotometria, 200 proof para este procedimento.




liquidificador. 3.2 Adicione ao copo 100 mL etanol:água (80:20). 3.3 Tampe o copo do liquidificador e bata a alta velocidade por 1 minutos. 3.4 Remova a tampa do copo e despeje o extrato em um filtro de papel com



1.5µm em um recipiente limpo. 5.0 Cromatografia por Coluna

5.1 Prepare uma coluna AflaTest para utilizar removendo ambas as tampas de baixo e gentilmente agitando a solução tampão desde o topo da coluna.

5.2 Utilizando um micro-pipetador de 1 mL, adicione 1 mL de extrato filtrado ao headspace da coluna. Anexe a coluna a um suporte de bomba VICAM. Passe todo o extrato filtrado através da coluna a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.3 Lave a coluna com 1 mL de água purificada a uma vazão de 1-2 gotas por segundo. Se a coluna estiver anexada à uma seringa de vidro, remova a coluna da seringa e coloque água diretamente no interior da coluna.


adicione 1.0 mL HPLC grade ethanol no headspace da coluna. Elua a uma vazão de 1 gota/segundo coletando toda a amostra eluída (1 mL) em uma cubeta de vidro.

42


6.0 Limite de Detecção: menor que 1.0 ppb.

43

4.12 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA RAÇÃO COM GLÚTEN DE MILHO - USDA-FGIS - COM FLUORÍMETRO (0 - 100 PPB)


Instrumento Verde Vermelho Amarelo VICAM series 4 and 4EX -3 160 78 ± 4 A leitura de aflatoxinas totais será em partes por bilhão

2.0 Preparação:




2.4 Prepare solução de Tween/PBS 2% todo mês ou conforme o necessário. 2.4 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 2.5 Garanta que o branco para os reagentes(1 mL de metanol + 1 mL de revelador

em uma cubeta) mostre 0 em um fluorímetro calibrado.


liquidificador. 3.2 Adicione ao copo 200 mL metanol:água (60:40). 3.3 Tampe o copo do liquidificador e bata a alta velocidade por 1 minuto. 3.4 Remova a tampa do copo e despeje o extrato em um filtro de papel com pregas.

Colete o filtrado em um recipiente limpo.

4.0 Diluição do Extrato 4.1 Pipete ou despeje 10 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 20 mL água purificada. Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro de 1.5µm em

um recipiente limpo. 4.4 Pipete ou despeje 6 mL de extrato filtrado em uma seringa de 10 mL limpa com

um filtro para seringa de membrana de nylon 0.22 anexado (parte VICAM nº G2007).

4.5 Utilizando uma bomba de ar ou o pistão da seringa, empurre o extrato através do filtro e colete-o em um recipiente limpo.


5.1 Passe 4mL de extrato filtrado diluído completamente atráves da coluna AflaTest WB (parte VICAM nº G1024 – não é uma coluna AflaTest) a uma vazão de 1 gota/segundo até entrar ar na coluna.

5.2 Remova a coluna da seringa de vidro e ponha 3 mL de Tween/PBS 2% diretamente no headspace da coluna. Anexe a coluna à seringa de vidro e ponha 7 mL de Tween/PBS 2% na seringa. Passe Tween/PBS 2% através da coluna a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.3 Remova a coluna da seringa de vidro e ponha 3 mL de água purificada diretamente no headspace da coluna. Anexe a coluna à uma segunda seringa limpa e ponha 7 mL de água purificada na seringa. Passe água purificada através da coluna a uma vazão de 1-2 gotas por segundo.

5.4 Coloque a cubeta de vidro (VICAM # 34000) abaixo da coluna e adicione 1.0 mL metanol de pureza para HPLC no headspace da coluna.

5.5 Elua a coluna a uma vazão de 1 gota/segundo passando o metanol através da coluna e coletando toda a amostra eluída (1.0 mL) em uma cubeta de vidro.

44



45

4.13 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA FARELO DE GLÚTEN DE MILHO – USDA/FGIS - COM FLUORÍMETRO (0 - 100 PPB)





2.0 Preparação:









4.0 Diluição do Extrato 4.1 Pipete ou despeje 10 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 20 mL água purificada. Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através 1.5µm filtro de microfibra de vidro em

um recipiente limpo. 5.0 Cromatografia por Coluna

5.1 Passe 3 mL de extrato filtrado diluído completamente através da coluna AflaTest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.






46


47

4.14 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA SEMENTE DE ALGODÃO EM FARELOS E INTEIRA, COM FLUORÍMETRO (0 – 100 PPB)



Series 4 and 4EX 0 - 100 ppb MF-2000™ 0 - 48 ppb

2.0 Limite de Detecção (LD):

Instrumento LD Series 4 and 4EX Interpolado para ser 1.0 ppb

MF-2000™ Interpolado para ser 1.5 ppb


Instrumento Verde Vermelho Amarelo Torbex Model FX-100series 3 -1 48 24 ± 2 VICAM series 4 and 4EX -1 44 22 ± 2



4.0 Preparação:







liquidificador. 5.2 Adicione ao copo 200 mL metanol:água (80:20). 5.3 Tampe o copo do liquidificador e bata a alta velocidade por 5 minutos. 5.4 Remova a tampa do copo e despeje o extrato em um filtro de papel com




48

7.0 Cromatografia por Coluna 7.1 Passe 10 mL de extrato diluído filtrado (10 mL = 0.5 g de amostra)







8.0 Notas

8.1 25 g de amostra com 5 g de sal e 100 mL de metanol:água (80:20) também podem ser usados nos passos 5.1 e 5.2. O restante do procedimento deve ser seguido conforme o escrito.

8.2 Em alguns casos, sementes de algodão podem absorver todo os 200 mL de metanol:água (80:20) no passo 5.2. Neste caso, bata 50 g de amostra com 15 g de sal e 300 mL de metanol:água (80:20). Passe 15 mL de extrato filtrado e diluído pela coluna AflaTest no passo 7.1. A diluição do extrato, configurações de calibração do fluorímetro, lavagem de coluna e eluição com methanol devem ser seguidas conforme o escrito.

49

4.15 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA SEMENTE DE ALGODÃO EM FARELOS E INTEIRA, COM FLUORÍMETRO (0 - 300 PPB)







3.0 Configurações de Calibração: utilize padrões de calibração de micotoxina Instrumento Verde Vermelho Amarelo

TorBex Model FX-100 series 3 -2 120 59 ± 5 VICAM series 4 and 4EX -2 110 54 ± 5

MF-2000™ Revestimento AflaTest® 0.2g 53 – 59


4.0 Preparação:





revelador em uma cubeta) mostre 0 em um fluorímetro calibrado. 5.0 Extração da Amostra:

5.1 Pese 50g de amostra bruta com 10g de sal (NaCl) e coloque no copo de liquidificador.

5.2 Adicione ao copo 200 mL metanol:água (80:20). 5.3 Tampe o copo do liquidificador e bata a alta velocidade por 5 minutos. 5.4 Remova a tampa do copo e despeje o extrato em um filtro de papel com




50

7.0 Cromatografia por Coluna 7.1 Passe 4mL de extrato filtrado diluído (4 mL = 0.2 g de amostra)


7.2 Pass 5 mL de água purificada através da coluna a uma vazão de 1-2 gotas por segundo.





8.0 Notas

8.1 25 g de amostra com 5 g de sal e 100 mL de metanol:água (80:20) também podem ser usados nos passos 5.1 e 5.2. O restante do procedimento deve ser seguido conforme o escrito.

8.2 Em alguns casos, sementes de algodão podem absorver todo os 200 mL de metanol:água (80:20) no passo 5.2. Neste caso, bata 50 g de amostra com 15 g de sal e 300 mL de metanol:água (80:20). Passe 6 mL de extrato filtrado e diluído pela coluna AflaTest no passo 7.1. A diluição do extrato, configurações de calibração do fluorímetro, lavagem de coluna e eluição com methanol devem ser seguidas conforme o escrito.

51

4.16 PROCEDIMENTO AFLATEST USDA-FGIS PARA GRÃOS DE DESTILADORES SECOS, E COM MATERIAIS SOLÚVEIS E FLOCOS DE ARROZ, COM FLUORÍMETRO (0 - 100 PPB)

1.0 Configurações de Calibração: utilize padrões de calibração AflaTest FGIS Instrumento Verde Vermelho Amarelo VICAM series 4 and 4EX -3 160 78 ± 4



2.0 Preparação:









4.0 Diluição do Extrato 4.1 Pipete ou despeje 10 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 20 mL água purificada. Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através 1.5µm filtro de microfibra de vidro em

um recipiente limpo.

5.0 Cromatografia por Coluna 5.1 Prepare uma coluna AflaTest para utilizar removendo ambas as tampas de

baixo e gentilmente agitando a solução tampão desde o topo da coluna. 5.2 Utilizando um micro-pipetador de 1 mL, adicione 1 mL de extrato filtrado

ao headspace da coluna. Anexe a coluna a um suporte de bomba VICAM. Passe todo o extrato filtrado através da coluna a uma vazão de 1-2 gotas por segundo.

5.3 Repita o passo anterior mais uma vez até entrar ar na coluna. A quantidade total de extrato passado através da coluna é 2 mL.


5.5 Repita o passo anterior mais cinco vezes até entrar ar na coluna. A quantidade total de água que lavou a coluna é 6 mL.

52

5.6 Coloque a cubeta de vidro (parte VICAM nº 34000) abaixo da coluna e adicione 1.0 mL metanol de pureza para HPLC no headspace da coluna AflaTest. Elua a coluna a uma vazão de 1 gota/segundo passando o metanol através da coluna e coletando toda a amostra eluída (1.0 mL) em uma cubeta de vidro.



53

4.17 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA FIGOS E PASSAS (0 - 50 PPB), COM FLUORÍMETRO


Instrumento Verde Vermelho Amarelo VICAM series 4 and 4EX -0.60 22 11 ± 2


2.0 Preparação:



2.3 Prepare Tween/PBS 0.01% todo mês ou conforme o necessário (parte VICAM nºG1114).



3.0 Extração da Amostra: 3.1 Pese 25g de amostra bruta e coloque no copo de liquidificador (não use

sal). 3.2 Adicione ao copo 30 mL água purificada. Tampe o copo do

liquidificador e bata a alta velocidade por 1 minuto. 3.2 Adicione ao copo 70 mL metanol de pureza para HPLC. Tampe o copo

do liquidificador e bata a alta velocidade por 1 minuto. 3.4 Remova a tampa do copo e despeje o extrato em um filtro de papel com


4.0 Diluição do Extrato 4.1 Pipete ou despeje 10 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 40 mL de Tampão de Lavagem PBS/Tween 0.01%.

Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro de


5.0 Cromatografia por Coluna 5.1 Passe 20 mL de extrato filtrado diluído (20 mL = 1 g de amostra)

completamente através da coluna AflaTest a uma vazão de aproximadamente 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.2 Passe 10 mL de Tampão de Lavagem Tween 0.01% através da coluna a uma vazão de aproximadamente 2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.3 Passe 10 mL de água purificada através da coluna a uma vazão de aproximadamente 2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.4 Coloque a cubeta de vidro (parte VICAM nº 34000) abaixo da coluna e adicione 1.0 mL metanol de pureza para HPLC em uma seringa de vidro.


54


6.0 Limite de Detecção: 0.5ppb para passas, 0.75ppb para figo

55

4.18 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA LEITE LÍQUIDO, COM FLUORÍMETRO (0 – 2.0 PPB)



Series 3 0 - 2.0 ppb Series 4 and 4EX 0 - 2.0 ppb

MF-2000™ 0 - 2.2 ppb 2.0 Limite de Detecção (LD):



3.0 Configurações de Calibração: utilize padrões de calibração AflaTest-M

Instrumento Verde Vermelho Amarelo TorBex Model FX-100 series 3 -0.10 2.20 1.10 ± 0.2 VICAM series 4 and 4EX -0.10 2.0 1.0 ± 0.2

MF-2000™ Revestimento AflaTest® Milk 0.94 - 1.1


4.0 Preparação:



4.3 Prepare a solução de metanol:água (80:20 por volume) toda semana ou conforme o necessário. Prepare a solução de metanol:água (10:90 por volume) toda semana ou conforme o necessário.

4.4 Garanta que 2 mL de metanol:água (80:20) em uma cubeta mostre 0 em um fluorímetro calibrado. Garanta que os 2 mL de metanol:água (10:90) em uma cubeta mostre 0 em um fluorímetro calibrado.

4.5 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 4.6 Garanta que o branco para reagentes (1 mL metanol:água (80:20) + 1

mL Developer em uma cubeta) mostre 0 em um fluorímetro calibrado.

5.0 Extração da Amostra: 5.1 Adicione 1g de sal a 50 mL de amostra líquida de leite e misture bem. 5.2 Centrifugue o leite a 2000g* por 10 minutos.

Nota: g* = força de centrifugação, NÃO rpm. O valor em rpm que corresponde a 2000g varia de acordo com o rotor da centrífuga. Utilize um nomograma para identificar o valor em rpm correspondente a 2000g para o rotor da sua centrífuga. Nomogramas geralmente são distribuídos pelo fabricante com o rotor.

56

5.3 Cuidadosamente remova a porção desnatada (camada de baixo) do leite para a análise sem perturbar a camada de cima de gordura. Você pode usar uma agulha de seringa para fazer um buraco no fundo do tubo de centrífuga de baixo para remover a camada de baixo.

5.4 Imediatamente antes da análise por cromatografia de afinidade, filtre a amostra desnatada através de um filtro de microfibra de vidro de 1.5µm.


6.1 Passe 10 mL de soro filtrado completamente através da coluna AflaTest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

6.2 Remova a coluna da seringa de carregamento. 6.3 Encha o headspace da coluna com solução de metanol:água (10:90). 6.4 Coloque a coluna em uma seringa de vidro limpa. Encha a seringa de

vidro com 10 mL de solução metanol:água (10:90). 6.5 Passe 10 mL de metanol:água (10:90) através da coluna a uma vazão de

2 gotas por segundo. 6.6 Repita o passo 6.5 mais uma vez até entrar ar na coluna. 6.7 Coloque a cubeta de vidro (VICAM # 34000) abaixo da coluna e

adicione 1.0 mL metanol:água (80:20) em uma seringa de vidro. 6.8 Elua a coluna a uma vazão de 1 gota/segundo passando o metanol:água



57

4.19 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA NOZ-MOSCADA COM FLUORÍMETRO (0 - 300 PPB)







conforme o necessário. 2.4 Prepare a solução de Twenn 20 15% em água (por volume) toda semana

ou conforme o necessário. 2.5 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 2.6 Garanta que o branco para reagentes(1 mL de metanol + 1 mL de





4.0 Diluição do Extrato 4.1 Pipete ou despeje 5 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 20 mL de solução Tween 20 15% . Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro de








58


6.0 Limite de Detecção: Interpolado para ser 2 ppb

59

4.20 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA CEBOLA SECA COM FLUORÍMETRO (0 - 300 PPB)

1.0 Configurações de Calibração: utilize os padrões de calibração AflaTest FGIS Instrumento Verde Vermelho Amarelo TorBex Model FX-100 series 3 -2 120 59 ± 5 VICAM series 4 and 4EX -2 110 54 ± 5



















60


61

4.21 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA ORÉGANO COM FLUORÍMETRO (0 - 300 PPB)







conforme o necessário. 2.4 Prepare a solução de Twenn-20 10% em água (por volume) toda semana

ou conforme o necessário. 2.4 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 2.5 Garanta que o branco para reagentes(1 mL de metanol + 1 mL de





4.0 Diluição do Extrato 4.1 Pipete ou despeje 5 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 20 mL de solução Tween 20 10%. Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro de









62


63

4.22 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA PÁPRICA, PIMENTA MALAGUETA E PIMENTÃO VERMELHO COM FLUORÍMETRO (0 - 300 PPB)








2.4 Tenha certeza de que os 2 mL de metanol:água (20:80) em uma cubeta mostre 0 em um fluorímetro calibrado.









5.1 Passe 4mL de extrato filtrado diluído (4 mL = 0.2g de amostra) completamente através da coluna AflaTest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.



adicione 1.0 mL metanol de pureza para HPLC em uma seringa de vidro. 5.5 Elua a coluna AflaTest-P a uma vazão de 1 gota/segundo passando o

metanol através da coluna e coletando toda a amostra eluída (1.0 mL) em uma cubeta de vidro.

64



65

4.23 PROCEDIMENTO DO FLUORÍMETRO AFLATEST PARA SALSA (0 - 300 PPB)











pregas. Colete o filtrado em um recipiente limpo. Não permita que o extrato repouse por mais de 15 minutos antes de seguir para o passo 4.1.

4.0 Diluição do Extrato




5.1 Passe 8 mL de extrato filtrado diluído (8 mL = 0.2 g de amostra) completamente através da coluna AflaTest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.






66


67

4.24 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA AMENDOIM, FAROFA DE AMENDOIM, MANTEIGA DE AMENDOIM, AMÊNDOAS, PISTACHE, SEMENTE DE DAMASCO E CAJU, COM FLUORÍMETRO (0 – 100 PPB)







3.0 Configurações de Calibração: utilize padrões de calibração de micotoxinas












68

6.0 Diluição do Extrato 6.1 Pipete ou despeje 20 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 6.2 Dilua o extrato com 20 mL água purificada. Misture bem. 6.3 Filtre o extrato diluído através filtro de microfibra de vidro de 1.5µm em

um frasco limpo ou diretamente em uma seringa de vidro utilizando as marcações na seringa para medir 10 mL.



7.2 Passe 10 mL de água purificada através da coluna a uma vazão de aproximadamente 2 gotas por segundo.





69

4.25 PROCEDIMENTO DO FLUORÍMETRO AFLATEST PARA AMENDOIM, FAROFA DE AMENDOIM E MANTEIGA DE AMENDOIM (0 – 200 PPB)









TorBex Model FX-100 series 3 -1 48 24 ± 2 VICAM series 4 and 4EX -1 44 22 ± 2












70





7.3 Coloque a cubeta de vidro (parte VICAM nº 34000) abaixo da coluna e adicione 1.0 mL metanol de pureza para HPLC em uma seringa de vidro.



71

4.26 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA AMENDOIM CRU DESCASCADO, LIMITE DE DETECÇÃO INFERIOR, COM FLUORÍMETRO (0 - 25 PPB)



VICAM series 4 and 4EX -0.3 11 5 ± 1

A leitura de aflatoxinas totais será em partes por bilhão 2.0 Preparação:






3.0 Extração da Amostra: 3.1 Pese 25g de amostra bruta com 5g de sal (NaCl) e coloque um um copo

de liquidificador Eberbach de 500 mL (VICAM nº 20300). O uso do copo copo de 500 mL assegura uma mistura apropriada. Copos de volumes maiores podem resultar em resultados menos precisos.

3.2 Adicione ao copo 125 mL metanol:água (70:30). 3.3 Tampe o copo do liquidificador e bata a alta velicidade por 2 minutos. 3.4 Remova a tampa do copo e despeje o extrato em um filtro de papel com


4.1 Pipete ou despeje 25 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 50 mL água purificada. Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através filtro de microfibra de vidro de 1.0 µµµµm

(VICAM cat. nº G2005) em um recipiente limpo. 5.0 Cromatografia por Coluna



5.3 Repita o passo anterior mais uma vez até entrar ar na coluna. 5.4 Coloque a cubeta de vidro (VICAM # 34000) abaixo da coluna e




6.0 Limite de Detecção: 0.5 ppb

72

4.27 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA CASCA DE AMENDOIM, COM FLUORÍMETRO (0 - 300 PPB)



TorBex Model FX-100 series 3 -2 120 59 ± 5







3.0 Extração da Amostra: 3.1 Pese 25g de amostra bruta with 10g salt (NaCl) e coloque no copo de



4.0 Diluição do Extrato 4.1 Pipete ou despeje 20 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 20 mL água purificada. Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através filtro de microfibra de vidro de 1.5µm em

um recipiente limpo.

5.0 Cromatografia por Coluna 5.1 Anexe um filtro de membrana de nylon para seringa de 0.22 µm (part nº

G2007) ao final da seringa de vidro. Anexe a coluna AflaTest ao filtro de disco utilizando o acoplamento.

5.2 Passe 4mL de extrato filtrado diluído (4 mL = 0.2g de amostra) completamente através do filtro e da coluna AflaTest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.3 Remova o filtro e reanexe a coluna AflaTest diretamente a seringa de vidro.





73



74

4.28 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA NOZ-PECÃ E NOZES, COM FLUORÍMETRO (0 - 50 PPB)

1.0 Configurações de Calibração: utilize padrões de calibração de micotoxina Instrumento Verde Vermelho Amarelo TorBex Model FX-100 series 3 -1 24 12 ± 1






2.4 Tenha certeza de que os 2 mL de metanol:água (20:80) em uma cubeta mostre 0 em um fluorímetro calibrado.















75


76

4.29 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA PIMENTA DO REINO E CÚRCUMA, COM FLUORÍMETRO (0 - 300 PPB)







conforme o necessário. 2.4 Prepare uma solução de Tween 20 10% em água (por volume) toda

semana ou conforme o necessário. 2.5 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 2.6 Garanta que o branco para reagentes(1 mL de metanol + 1 mL de





4.0 Diluição do Extrato 4.1 Pipete ou despeje 5 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 20 mL de solução Tween 20 10%. Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro de









77


78

4.30 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA PIPOCA ESTOURADA, COM FLUORÍMETRO (0 - 50 PPB)



TorBex Model FX-100 series 3 -1 24 12 ± 2 VICAM series 4 and 4EX -1 22 11 ± 2 A leitura de aflatoxinas totais será em partes por bilhão











5.0 Cromatografia por Coluna 5.1 Passe 20 mL de extrato filtrado diluído (20 mL = 1.0 g de amostra)








79

4.31 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA MOLHO DE SOJA, COM FLUORÍMETRO

1.0 Configurações de Calibração: utilize padrões de calibração de micotoxina Instrumento Verde Vermelho Amarelo VICAM series 4 and 4EX -1.0 44 22 ± 2

A leitura de aflatoxinas totais será em partes por bilhão 2.0 Preparação:




2.4 Prepare Tween/PBS 0.1% todo mês ou conforme o necessário (parte VICAM nºG1112).

2.5 Prepare solução reveladora Aflatest a cada 8h. 2.6 Garanta que o branco para reagentes(1 mL methanol + 1 mL diluted

Developer em uma cubeta) mostre 0 em um fluorímetro calibrado. 3.0 Extração da Amostra:

3.1 Pese 25g de amostra com 2.5g de sal (NaCl) e coloque no copo de liquidificador.

3.2 Adicione ao copo 100mL de metanol:água (80:20). 3.3 Tampe o copo do liquidificador e bata a alta velocidade por 1 minuto. 3.3 Remova a tampa do copo e despeje o extrato em um filtro de papel com

pregas. Colete o filtrado em um recipiente limpo. 4.0 Diluição do Extrato and Filtration:

4.1 Pipete ou despeje 10 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo. 4.2 Dilua o extrato com 40 mL água purificada. Misture bem. 4.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro de 1.5

µm em um frasco limpo ou diretamente em uma seringa de vidro utilizando as marcações na seringa para medir 10 mL.

5.0 Cromatografia por Coluna:

5.1 Passe 10 mL de extrato diluído filtrado completamente através de uma coluna de afinidade AflaTest a uma vazão de aproximadamente 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.2 Passe 10 mL de Tween/PBS 0.1% através da coluna a uma vazão de aproximadamente 2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.3 Passe 10 mL de água purificada através da coluna a uma vazão de aproximadamente 2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.

5.4 Repita o passo anterior mais uma vez até entrar ar na coluna. 5.5 Coloque a cubeta de vidro under AflaTest column e adicione 1.0 mL

metanol de pureza para HPLC em uma seringa de vidro. 5.6 Elua a coluna AflaTest a uma vazão de 1 gota/segundo passando o

metanol através da coluna e coletando toda a amostra eluída (1.0 mL) em uma cubeta de vidro.

80



81

4.32 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA TABACO, COM FLUORÍMETRO (0 - 300 PPB)


Instrumento Verde Vermelho Amarelo TorBex Model FX-100 series 3 -2 120 59 ± 5



calibração amarelo está na variação listada acima. 2.2 Prepare a solução de metanol:água (80:20 por volume) toda semana ou


2.3 Tenha certeza de que 2 mL de metanol:água (20:80) em uma cubeta mostre 0 em um fluorímetro calibrado.















82


83

4.33 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA ÓLEO VEGETAL, COM FLUORÍMETRO (0 - 100 PPB)


Instrumento Verde Vermelho Amarelo TorBex Model FX-100 series 3 -1 48 24 ± 2







3.0 Extração da Amostra: 3.1 Pese 25g de amostra com 5g de sal (NaCl) e coloque no copo de












84


85

4.34 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA TRIGUILHO, AVEIA, MISTURA PARA BEZERRO EM PELLETS, GRÃOS DESTILADOS SECOS, SEMENTE DE CANOLA, FARELO DE CANOLA, SEMENTE DE AÇAFRÃO-BASTARDO, FARELO DE AÇAFRÃO-BASTARDO E AMOSTRAS DE FIBRA DIETÉTICA, COM FLUORÍMETRO (0 – 100 PPB)











4.0 Preparação:










86

6.3 Filtre o extrato diluído através filtro de microfibra de vidro de 1.5µm em um frasco limpo ou diretamente em uma seringa de vidro utilizando as marcações na seringa para medir 10 mL.








8.0 Notas

25 g de amostra com 5 g de sal e 100 mL de metanol:água (80:20) também podem ser usados nos passos 5.1 e 5.2. O resto do procedimento deve ser seguido conforme o escrito.

87

4.35 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA TRIGUILHO, AVEIA, MISTURA PARA BEZERRO EM PELLETS, GRÃOS DESTILADOS SECOS, SEMENTE DE CANOLA, FARELO DE CANOLA, SEMENTE DE AÇAFRÃO-BASTARDO, FARELO DE AÇAFRÃO-BASTARDO E AMOSTRAS DE FIBRA DIETÉTICA, COM FLUORÍMETRO (0 - 300 PPB)





Instrumento LD Series 3 Interpolado para ser 2.0 ppb

Series 4 and 4EX Interpolado para ser 2.0 ppb MF-2000™ Interpolado para ser 4.1 ppb





4.0 Preparação:









6.0 Diluição do Extrato 6.1 Pipete ou despeje 10 mL de extrato filtrado em um recipiente limpo.

88

6.2 Dilua o extrato com 40 mL água purificada. Misture bem. 6.3 Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro de




7.2 Pass 5 mL de água purificada através da coluna a uma vazão de aproximadamente 2 gotas por segundo.





8.0 Notes

25 g de amostra com 5 g de sal e 100 mL de metanol:água (80:20) também podem ser usados nos passos 5.1 e 5.2. O resto do procedimento deve ser seguido conforme o escrito.

89

4.36 PROCEDIMENTO AFLATEST USDA-FGIS PARA TRIGO, FARELO DE GÉRMEN DE MILHO, FLOCOS DE MILHO, GRÃOS DE DESTILADORES SECOS E ARROZ EM CASCA DO FLUORÍMETRO (0 - 100 PPB)





2.0 Preparação:











5.0 Cromatografia por Coluna 5.1 Prepare uma coluna AflaTest para utilizar removendo ambas as tampas

de baixo e gentilmente agitando a solução tampão desde o topo da coluna.

5.1 Passe 2mL de extrato filtrado diluído completamente através da coluna AflaTest a uma vazão de 1-2 gotas por segundo até entrar ar na coluna.



adicione 1.0 mL metanol de pureza para HPLC no headspace da coluna.

90

Elua a uma vazão de 1 gota/segundo e coletando toda a amostra eluída (1 mL) em uma cubeta de vidro.


91

4.37 PLANILHA DE PROCEDIMENTO DO FLUORÍMETRO AFLATEST Consulte o procedimento AflaTest® desejado e complete com os volumes e

quantidades apropriados.

Amostra: ______________ Padrões de Calibração: ______________ Fluorímetro series _____________ Calibração do Fluorímetro: Verde = ________Vermelho= _______ Amarelo= _________ Extração da amostra: 1. Pese ______________ g de amostra bruta e coloque no copo do liquidificador. 2. Adicione ________________ g de NaCl (sal) na amostra no copo. 3. Adicione ao copo ____________ mL de___________% solvente de extração

metanol:água. 4. Tampe o copo do liquidificador e bata em alta velocidade por_________ minuto(s). 5. Remova a tampa do copo e despeje mais ou menos 50 mL de extrato no filtro de

papel com pregas. Colete o filtrado em um recipiente limpo. Diluição do Extrato: 6. Pipete ou despeje________ mL de extrato filtrado em um copo ou recipiente limpo. 7. Dilua o extrato com ___________ mL de água destilada. Misture bem. 8. Filtre o extrato diluído através de um filtro de microfibra de vidro (parte VICAM nº

31955). Colete o filtrado em um copo ou recipiente limpo. Cromatografia de Afinidade AflaTest®: 9. Prepare a coluna AflaTest® para cromatografia de afinidade. 10. Pipete ________ mL de extrato filtrado através da coluna AflaTest®

(=___________g sample). 11. Empurre o extrato através da coluna vagarosamente. 12. Pipete __________ mL de água destilada na coluna e empurre-a através da coluna

vagarosamente. 13. Repita a lavagem da coluna com outra porção igual de água destilada ______vezes. 14. Elua as aflatoxinas da coluna AflaTest® com 1.0 mL de metanol de pureza para

HPLC e colete o eluato em uma cubeta de vidro. 15. Adicione 1.0 mL de reveladorAflaTest® diluído (feito novo diariamente)

diretamente no eluato na cubeta. Misture bem. 16. Coloque a cubeta em um fluorímetro calibrador. Grave a leitura digital após 60

segundos. A leitura será de aflatoxinas totais em partes por bilhão (ppb) para a amostra extraída.

92

5.1 PADRONIZANDO AMOSTRAS COM AFLATOXINA Nós utilizamos o padrão para aflatoxina Supelco que é o produto nº 4-6304 quem vem em ampolas lacradas. A concentração desta solução padrão de aflatoxina é de aproximadamente 2.6ng/µl. Este padrão é preparado de acordo com os métodos oficiais de AOAC. O certificado de análise mostrará a concentração exata de cada uma das 4 diferentes aflatoxinas. Nós utilizamos uma ampola aberta por até duas semanas. Padronize uma amostra de 50g a 26ppb conforme o seguinte:

26ppb (ng/g) X amostra de 50g= 1300ng 1300ng ÷ concentração padrão de 2.6ng/µL = 500µL de padrão de aflatoxina Adicione 500µL de padrão a 50g de amostra.

A padronização é feita preferencialmente com uma seringa Hamilton ou uma pipeta volumétrica mas um micro-pipetador ajustável com ponteiras de plástico também pode ser utilizado. Padronize as amostras em uma capela e permita a elas secar por no mínimo 30 minutos antes de analisar.

5.2 PROCEDIMENTO AFLATEST PARA LIMPEZA SIMULTÂNEA DO FLUORÍMETRO E DO HPLC

O 1 mL de metanol eluído de um procedimento para fluorímetro AflaTest pode ser dividido. Uma pequena porção deste eluato pode ser injetado no HPLC. O revelador AflaTest pode ser adicionado à porção maior do eluato na proporção de um pra um e a amostra pode ser lida no fluorímetro. Antes de adicionar o revelador AflaTest, um eluato de 1mL de metanol de um procedimento do Fluorímetro AflaTest pode ser dividido da seguinte maneira:

Eluato de 1mL de metanol do procedimento do fluorímetro AflaTest

100µL de eluato removido da cubeta 900µL de eluato restante na cubeta + + 100µL de água 900µL revelador AflaTest misturar no vortex e inejetar a porção misturar e pôr no fluorímetro no HPLC Nota: É normal que os resultados do HPLC sejam mais baixos que os resultados do fluorímetro uma vez que o fluorímetro é calibrado para contabilizar a perda de aflatoxina na limpeza do extrato e o HPLC não.

misturar no vortex

93

5.3 PRECAUÇÕES GERAIS

Dependendo do procedimento específico, tenha certeza de adicionar sal antes da extração da amostra. Tenha certeza que o sal não tenha aditivos. Tenha certeza de que o tubo do dispenser de metanol está preparado e livre de bolhar de ar antes de usar. Sempre utilize equipamentos e reagentes bons e limpos (metanol de pureza para HPLC para a eluição da amostra e água purificada, deionizada ou de osmose reversa). Verifique a fluorescência de fundo dos reagentes confome o descrito na seção Verificação de Reagentes. Cubetas não adiquiridas de VICAM podem apresentar fluorescência de fundo e nunca devem ser utilizadas com testes VICAM. Não exceda as vazões recomendadas no procedimento. Use cubetas limpas e evite a contaminação da solução de eluato na cubeta. Procure contaminantes dentro da cubeta (fios, partículas ou bolhas de ar) ou sujeira e impressões digitais na parte de fora. Limpe fora da cubeta com lenço Kim-wipe e garante que não haja partículas dentro da cubeta antes das leituras fluorométricas. Proteja os padrões de calibração da luz e substitua-os após a data de validade impressa na caixa. Carregue a amostra na coluna imediatamente após a filtração de microfibra. Realize o teste do começo ao final sem interrupções. Utilize apenas equipamento especificado por VICAM. Eviste contato de qualquer soluções ou reagentes da análise (tais como metanol, extrato, eluato da coluna ou revelador) com borracha ou plásticos macios e flexíveis. Estes materiais podem lixiviar fluorescência na amostra causando falsas leituras elevadas.

5.4 SOLUÇÃO DE PROBLEMAS

1. Problema: Falsas leituras elevadas Solução:

Verifique os reagentes. Tenha certeza de que a água purificada, a solução de lavagem e a solução de eluição leiam 0. Não misture a cubeta colocando o polegar no topo e balançando. Faça revelador fresco a cada 8 horas. Tenha certeza de que a amostra está límpida após a filtragem por microfibra. Evite o contato dos reagentes com plásticos flexíveis e macios ou borracha. Colete o extrato em um recipiende de vidro ou um béquer de plástico duro (VICAM nº 36010). Tenha certeza de que não há poeira ou partículas nas cubetas.

94

Lave novas seringas para suportes de bomba utilizando uma escova com água e sabão. Então enxague com água purificada e metanol antes de utilizar. Não passe a solução reveladora AflaTest através da coluna AflaTest.

2. Problema: Falsas leituras baixas Solução:

Tenha certeza de que o método está sendo seguido corretamente. Tenha certeza de que a solução de extração está sendo feita corretamente e não foi feita a mais de uma semana. Mantenha as vazões recomendadas através da coluna de afinidade durante a passagem da amostra, lavagem e eluição. Não passe a amostra através da coluna ou da coluna de eluição mais rápido que a vazão recomendada.

3. Problema: Leituras Inconsistentes Solução:

Tenha certeza de comparar as leituras das mesmas colunas nas quais foram corridas as mesmas amostras de filtrado ao mesmo tempo. Tenha certeza de que as amostras foram misturadas muito bem. Amostras diferentes podem mostrar variações na leitura devido a diferenças no conteúdo de aflatoxinas. Mesmo porções diferentes de uma amostra podem variar em conteúdo de aflatoxinas. Proteja os padrões de calibração da luz e substitua-os após a data de validade impressa na caixa. Calibre o fluorímetro corretamente para o procedimento que você estiver utilizando. As configurações corretas de calibração estão listadas no procedimento e podem ser diferentes das configurações padrões do fluorímetro. Siga as instruções cuidadosamente. Corra a amostra do começo ao fim sem parar. Corra diariamente uma amostra de valor conhecido para sevir de controle de precisão cotidiano. Misture o filtrado bem depois de diluir. Tenha certeza de que o tubo do dispenser de metanol está preparado e livre de bolhar de ar antes de usar.

Colete todo a amostra eluída na cubeta. Insira a cubeta no fluorímetro imediatamente após adicionar o revelador AflaTest e misturar. Utilize um atraso de 60 segundos.

95

Solução de Problemas do TorBex Model FX-100 Series 3

1. Problema: Mensagem “Lamp data ready error” (erro na preparação dos dados da lâmpada) na leitura de amostras mas não na leitura de frascos de padrão de calibração. Solução: Garanta que o eluato final na cubeta não esteja turvo ou fortemente

colorido. 2. Problema: Não aparecem palavras na tela após ligar o instrumento. Solução: Tenha certeza de que o botão de brilho no lado direito está ligado.

Verifique o fusível. 3. Problema: A impressora imprime coisas sem sentido. Solução: Verifique as configurações da chave DIP. As chaves DIP para Seiko Epson Model P-40 S estão ajustadas corretamente se as

chaves DIP na parte de trás da impressora estiverem dispostas da seguinte maneira: UP (em cima) * * * * DOWN (embaixo) * * * * 1 2 3 4 5 6 7 8 A chaves DIP para Seiko DPU-411-11BU estão ajustadas corretamente se as chaves

DIP na parte inferior da impressora estiverem dispostas da seguinte maneira: UP (REAR) [em cima (atrás)] * * * * * * DOWN (FRONT) [embaixo (frente)] * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6

A chaves DIP para a impressora Seiko DPU-411 estão ajustadas corretamente se as chaves DIP na parte inferior da impressora estiverem dispostas da seguinte maneira:

UP (REAR) * * DOWN (FRONT) * * * * * * 1 2 3 4 5 6 7 8

As chave DIP para a impressora Seiko DPU-414 estão armazenadas internamente. Estas configurações foram ajustadas por VICAM antes do envio. Se sua DPU-414 estiver imprimindo coisas sem sentido, por favor chame o Suporte Técnico.

4. Problema: O fluorímetro não está segurando a calibração Solução:

A sala de análises deve ser mantida a uma temperatura constante. Verifique se os frascos de calibração estão límpidos. Gentilmente limpe a câmara da amostra com ar limpo. Faça uma leitura do frasco amarelo imediatamente após a calibração, e então periodicamente durante o dia. Os frascos podem ser lidos novamente apertando a

96

seta do meio antes de por o frasco no fluorímetro. Se o valor mudar significativamente com o tempo, todos os dias, com uma temperatura constante na sala, então o fluorímetro precisa ser devolvido para reparos. Por favor, ligue para VICAM antes de devolver qualquer fluorímetro para conserto.

5. Problema: Mensagens de erro aparecem após ligar o instrumento (“range check failure” [falha na verificação do alcance] ou “lamp check failure” [falha na verificação da lâmpada]).

Solução: Desligue o instrumento, e ligue-o novamente. Se o problema continuar, the instrument o fluorímetro precisa ser devolvido para reparos. Por favor, ligue para VICAM antes de devolver qualquer fluorímetro para conserto.

6. Problema: O fluorímetro pode permanecer ligado “overnight” (a noite toda)? Solução: O fluorímetro pode permanecer ligado permanentemente, mas deve ser

recalibrado diariamente. O fluorímetro pode ser recalibrado pressionando a seta esquerda, abaixo de onde é mostrado a leitura.

7. Problema: O frasco amarelo nunca lê na variação indicada. Solução: Tente utilizar um conjunto diferente de padrões. Os padrões devem ser

substituídos após a data de validade impressa na caixa.

8. Problema: Mensagem “Range check failure” (falha na verificação de alcance). Solução: Verifique o fusível.

Solução de Problemas do VICAM Series 4 and 4EX Fluorometer

1. Problema: Problema no que é mostrado no monitor Solução: Limpe a memória e reinicie o monitor utilizando o seguinte procedimento:

1.1 Pressione a tecla “STOP” (parar). 1.2 Em “VICAM VX.XX READY” digite esta sequência de números:

8,3,1,1,5. 1.3 O monitor mostrará “CLEAR MEMORY?” (limpar memória?),

pressione ENTER. 1.4 O monitor mostrará “CONFIRM CLEAR?” (confirma limpeza?),

pressione 1. A memória está limpa. 1.5 Em “VICAM VX.XX READY” pressione estes números um de cada

vez: 7,5,7,6,1,2. Você não verá nenhuma mudança na mensagem “VICAM VX.XX READY”.

1.6 Para instrumentos series 4 com serial numbers (números de série) maiores que 177 e para instrumentos series 4EX, pressione o número 2.

1.7 Para instrumentos series 4 com serial numbers (números de série) 177 or menos, pressione o número 1. Isto configurará o monitor para a última revisão.

1.8 O instrumento está pronto para operação normal.

97

2. Problema: Os resultados variam de 0 a 270 ppb no frasco de calibração. Solução: Tenha certeza de empurrar os frascos de padrão e cubetas completamente no instrumento para que o fundo do frasco toque o fundo do espaço para amostra.

98

Solução de Problemas do procedimento AflaTest para Leite

1. Problema: Não é possível empurrar o leite através da coluna. Solução: Leite integral precisa ser centrifugado, a camada de baixo deve ser removida sem

perturbar o sobrenadante de gordura. Tente remover a camada de baixo furando o fundo de um tubo de centrífuga de plástico com uma agulha de espessura 18.

Centrifugue a 2000 g de 10 a 15 minutos. O valor em RPM que corresponde a

2000g irá variar de acordo com o rotor da centrífuga. Para um rotor JA18, 2000g são 4500 rpm. Utilize um nomograma para identificar a rotação em rpm correspondente a 2000g para o rotor de sua centrífuga.

Lembre-se de adicionar sal e filtrar a amostra através de um filtro de microfibra. É melhor rodar a amostra de leite à temperatura ambiente.

2. Problema: Falsos positivos.

Solução: Garanta a troca da coluna AflaTest por uma seringa limpa depois de passar leite

pela coluna e antes de lavar com metanol 10%. Coloque parte da primeira lavagem direto no headspace¹ da coluna.

Elua com metanol 80%. 3. Problema: Falsos negativos. Solução: Calibre o fluorímetro com padrões AflaTest para leite.

6.0 REFERÊNCIAS

1. Hansen T.J., Journal of Food Protection, Affinity column cleanup and direct fluorescence measurement of Aflatoxin M1 in raw milk, 53 (1) (1990) 75-77.

2. Truckess, M. W., Stack. M. E., Nesheim, S., Page, S. W., Albert, R. H., Hansen, T.

J. and Donahue, K. F., Journal of the Association of the Official Analytical Chemistry, Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography post column derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts and peanut butter: collaborative study, 74 (1) (1991) 81-88.

7.0 ASSITÊNCIA TÉCNICA NO BRASIL

Para assistência, por favor, contate Solcampo Imp.Com.Repres. Telefone: (19) 3933-3141 e-mail : [email protected]

¹N.T. – Em artigos de química a palavra headspace não é traduzida. Sua tradução literal é “Espaço de Cabeça”. Pode ser interpretado como o volume deixado no topo de um recipiente antes de fechá-lo.

99

8.0 RESPONSABILIDADE

Os métodos analíticos descritos acima foram desenvolvidos por VICAM para serem usados exclusivamente com os reagentes neste teste. O usuário assume todos os riscos em utilizar os procedimentos analíticos e produtos AflaTest. VICAM não dá garantia de nenhum tipo, expressa ou implícita, além daquelas que dos produtos AflaTest conforme as especificações impressas da VICAM e padrões de controle de qualidade. VICAM, conforme sua opção, consertará ou substituirá qualquer produto ou parte que se prove ser defeituosa no acabamento ou material. O empreendimento de VICAM em reparar ou substituir tais produtos é exclusivo e será conforme a garantia, seja ela escrita, expressa oralmente, ou implícita, inclusive qualquer garantia de comercialização ímplicita ou aptidão para um propósito particular. VICAM não será responsável por previsões ou perdas de lucro ou qualquer perda, inconveniência ou dano, seja ele direto, incidental, consequencial ou qualquer outro, a pessoas ou propriedades, ou por pura resposabilidade ou negligência vindas de ou em conexão com o uso desses procedimentos de teste ou produtos AflaTest.

ESTE FLUORÍMETRO VICAM É FEITO E DESENVOLVIDO PARA AS

ESPECIFICAÇÕES VICAM E É DESTINADO PARA USO EM CONEXÃO OU CONJUNÇÃO COM OS PRODUTOS, MÉTODOS E PROCEDIMENTOS VICAM APROPRIADOS, TODOS JUNTOS, GARANTINDO UMA APLICAÇÃO CONSISTENTE E DE ALTA FIDELIDADE DA TECNOLOGIA REGISTRADA E ESPECIALIZADA DA VICAM. PORTANTO, QUALQUER USO DESTE FLUORÍMETRO VICAM COM OU EM CONJUNÇÃO COM QUALQUER PRODUTO “NÃO-VICAM” PODE COMPROMETER A INTEGRIDADE DA APLICAÇÃO OU DO PROCEDIMENTO E PODE RESULTAR EM DANOS FÍSICOS AO PRODUTO, PARA OS QUAIS, QUALQUER CONSERTO OU SUSBSTITUIÇÃO PELA GARANTIA, NÃO DEVEM SER CONSIDERADOS RESPONSABILIDADE DA VICAM PELOS COMPRADORES. QUALQUER USO DO FLUORÍMETRO VICAM COM OU EM CONJUNÇÃO COM PRODUTOS “NÃO-VICAM”, INDEPENDENTE DO DANO CAUSADO AO PRODUTO, LIVRARÁ A VICAM DE REALIZAR CONSERTOS OU SUBSTITUIÇÕES DO PRODUTO DENTRO OU DEPOIS DO PERÍODO DE GARANTIA.

Não obstante, protocolos e outro produtos desenvolvidos por VICAM são

periodicamente melhorados e revistos com o intuito de maximixar a confiabilidade e otimizar o uso do cliente e sua satisfação. Quando uma versão melhorada, nova ou substituta de um protocolo e produto estiver disponível, VICAM não será responsável por qualquer versão anterior de um protocolo ou produto, mesmo se o uso da versão anterior de um protocolo ou produto estiver dentro da data de validade. Por favor, informe-se sobre novos protocolos enviando um e-mail, fax ou telefonando a VICAM ou sua distribuidora local VICAM.

VICAM não será responsável por nenhum resultado ou desempenho insatisfatório

ou errado envolvendo o uso dos podutos ou protocolos VICAM se os testes ou amostragens em questão não forem conduzidos apropriadamente. O usuário é unica e inteiramente responsável por se educar a respeito dos procedimentos para teste e amostragem adequados utilizando os protocolos e produtos VICAM.

Todos os produtos VICAM são protegidos por patentes e marcas registradas internacionais. N.T. Esta tradução não tem efeito algum para fins legais. Em caso de necessidade, por favor, consultar o contrato original.

100

9.0 INFORMAÇÃO PARA PEDIDOS Para realizar um pedido contate seu distribuidor VICAM local : Solcampo Imp.Com.Repres.Prod.p/Análise Alimentos Ltda. Fone (19) 3933-3141 e-mail: [email protected]

Instruction Manual # 715001734 Rev B Observações:

1. USDA (United States Department of Agriculture) – É o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos

2. FGIS (Federal Grain Inspection Service) – É o Serviço Federal de Inspeção de Grãos.

3. AOAC International - Uma Associação Americana sem fins lucrativos que produz métodos de análise químicos padronizados.

4. O tradutor julgou inadequado traduzir o nome dos modelos de fluorímetro, uma vez que eles vêm em inglês. Em caso de necessidade, por favor, contatá-lo.

5. ACS(American Chemical Society) – Sociedade Americana de Química

manual afla 2010 pdf

Documents

secos usda

farinha de milho

casca de amendoim

amendoim cru

milhosoja usda

farofa de amendoim

arroz em casca usda

sojamilho usda