master rad - pmf.ni.ac.rs · su 5-7.5 cm dugi, i 2-3.5 (4) cm široki, skoro sedeći, smešteni pri...

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Hemotaksonomska karakterizacija Pinus nigra Arnold iz

jugozapadne Srbije - nivo epikutikularnih voskova

MASTER RAD

Kandidat: Mentor:

Sanja Todorović 170 Dr Zorica S. Mitić

Niš, 2016.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Chemotaxonomic characterisation of Pinus nigra Arnold

from southwestern Serbia - the level of epicuticular waxes

MASTER THESIS

Candidate: Mentor:

Sanja Todorović 170 Dr. Zorica S. Mitić

Niš, 2016.

BIOGRAFIJA KANDIDATA

Sanja Todorović, rođena je 08. marta 1991. godine u Nišu. Osnovnu školu "Desanka

Maksimović" završava u Čokotu 2006. Iste godine upisuje srednju ekonomsku školu –

bankarski službenik smer, u Nišu i završava je sa odličnim uspehom. Prirodno-matematički

fakultet u Nišu upisuje 2010. godine na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne

akademske studije završava 2014. godine kada i upisuje master akademske studije na

Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-matematičkog-fakulteta u Nišu, smer

Biologija. Master akademske studije završava 2016 godine.

ZAHVALNICA

Najsrdačnije se zahvajujem svom mentoru dr Zorici Mitić sa Departamana za

biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu na stručnim sugestijama i

nesebičnoj pomoći prilikom realizacije ovog master rada. Zahvaljujem se na izdvojenom

vremenu, uloženom trudu, kao i velikom razumevanju od samog početka.

Veliku zahvalnost dugujem i prof. dr Bojanu Zlatkoviću sa Departamana za biologiju

i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu na dragocenoj pomoći u sakupljanju

biljnog materijala.

Posebnu zahvalnost dugujem prof. dr Gordani Stojanović i Snežani Jovanović, sa

Departmana za hemiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, na pomoći u realizaciji

hemijskih analiza i interpretaciji dobijenih rezultata.

Zahvaljujem se i svim profesorima Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu koji su

doprineli uspešnom završetku mojih studija.

Beskrajnu zahvalnost za neizmernu podršku i razumevanje dugujem svojim

roditeljima, Dragani i Slavoljubu, sestri Vanji, dečku Nenadu, Tini i ostalim prijateljima koji

su bili uz mene.

SAŽETAK

U radu је analiziran hemijski sastav epikutikularnih voskova dvogodišnjih četina iz

jedne autohtone populacije Pinus nigra Arnold ssp. nigra sa područja jugozapadne Srbije.

Kombinacijom GC i GC/MS analize identifikovana su četiri primarna alkohola i 11 n-alkana

u seriji od C21 do C31. Dominante komponente voskova na nivou ispitivane populacije su

četiri n-alkana sa neparnim brojem C atoma: C25, C27, C23 i C29 (26.47%, 22.90%, 14.11%,

10.59%, respektivno). Multivarijacione statističke analize (CDA i CA) pokazale su da, iako

se jedinke iz populacije Uvac grupišu zajedno sa ostalim populacijama P. nigra iz Srbije

(determinisanim kao tri različite podvrste ssp. nigra, ssp. banatica (Borbás) Novák i ssp.

pallasiana (Lamb.) Holmboe) i Bosne i Hercegovine (ssp. nigra), može se primetiti blaga

tendencija njihovog izdvajanja i približavnja grupi ssp. banatica iz Rumunije. Kao posledica

toga, gubi se pravilna klinalna diferncijacija P. nigra populacija u pravcu sever-jug, ali i

pored toga možemo reći da najjužnije (makedonske) i najsevernije (rumunske) populacije

zadržavaju svoj distinktan položaj u odnosu na populacije crnog bora iz Srbije. Ugljenični

preferencijalni indeks (CPItotal) za n-alkane u voskovima 10 populacija P. nigra varira od 3.9

do 25.8 (u proseku 11.7), dok se prosečna dužina lanca (ACLtotal) nalazi u opsegu od 25.6 do

26.5 (u proseku 26.1). Relativni odnosi n-alkana srednjeg i dugog niza pokazuju jasnu

dominaciju n-alkana dugog (n-C25-33 = 58.9%) u odnosu na n-alkane srednjeg niza (n-C21-24 =

17.3%), dok n-alkani kraktkog niza (n-C16-20) nisu detektovani. Dobijeni rezultati su

upoređeni sa dostupnim podacima o hemijskom diverzitetu i diferencijaciji P. nigra

populacija.

Ključne reči: Pinus nigra, epikutikularni voskovi, n-alkani, CPI, ACL, hemotaksonomija

ABSTRACT

This paper analyzes the chemical composition of epicuticular waxes of two-year old

needles originating from one native population of Pinus nigra Arnold ssp. nigra from

southwestern Serbia (Uvac). By combining the GC and GC/MS analysis, four primary

alcohols and 11 n-alkanes in a series from C21 to C31 were identified. Dominant wax

components at the population level are four n-alkanes with an odd number of C atoms: C25,

C27, C23 and C29 (26.47%, 22.90%, 14.11%, and 10.59%, respectively). Multivariate

statistical analyses (CDA and CA) have showed that, even as individuals from the Uvac

population are grouped together with other P. nigra populations from Serbia (determined as

three different subspecies ssp. nigra ssp. banatica (Borbás) Novák and ssp. pallasiana

(Lamb.) Holmboe) and Bosnia and Herzegovina (ssp. nigra), a slight tendency for their

separation and convergence to the group ssp. banatica from Romania may be noticed. As a

result, regular clinal differentiation of P. nigra populations in the north-south direction is lost.

Even so, we can still conclude that the southernmost (Macedonian) and the northernmost

(Romanian) populations retain their distinct positions in relation to the populations of black

pine from Serbia. The carbon preference index (CPItotal) for the n-alkanes in the waxes of ten

populations of P. nigra varied from 3.9 to 25.8 (average of 11.7), while the average chain

length (ACLtotal) ranged from 25.6 to 26.5 (average of 26.1). Relative ratios of n-alkanes of

the medium- and long-chain indicate clear dominance of the n-alkanes of the long-chain

group (n-C25-33 = 58.9%) compared to the n-alkanes of the medium-chain (n-C21-24 = 17.3%),

while the n-alkanes of the short-chain (n-C16-20) were not detected. The obtained results have

been compared with the available data on the chemical diversity and differentiation of P.

nigra populations.

Keywords: Pinus nigra, epicuticular waxes, n-alkanes, CPI, ACL, chemotaxonomy

SADRŽAJ

1. UVOD ................................................................................................................................ 1

1.1. Opšte karakteristike vrste Pinus nigra Arnold ............................................................ 1

1.1.1. Sistematski položaj .............................................................................................. 1

1.1.2. Morfološke karakteristike .................................................................................... 1

1.1.3. Distribucija i infraspecijska taksonomija ............................................................. 3

1.2. Opšte karakteristike kutikularnih voskova .................................................................. 7

1.2.1. Opšte karakterisitke i distibucija alkana .............................................................. 9

1.2.2. Taksonomski značaj alkana ............................................................................... 11

2. CILJEVI RADA ............................................................................................................. 12

3. MATERIJAL I METODE ............................................................................................. 13

3.1. Biljni materijal........................................................................................................... 13

3.2. Ekstrakcija epikutikularnih voskova ......................................................................... 14

3.3. GC-FID i GC-MS analiza epikutikularnih voskova .................................................. 14

3.4. Statistička analiza ...................................................................................................... 15

4. REZULTATI I DISKUSIJA .......................................................................................... 17

4.1. Hemijski sastav epikutikularnih voskova .................................................................. 17

4.1.1. Promenjivost pojedinačnih komponenti voskova .............................................. 19

4.1.2. Diferencijacija analiziranih populacija .............................................................. 21

4.2. Varijabilnost ugljeničnog preferencijalnog indeksa (CPI) i prosečne dužine lanca

(ACL). .................................................................................................................................. 25

4.3. Varijabilnost relativnog odnosa n-alkana srednjeg i dugog niza .............................. 29

5. ZAKLJUČCI ................................................................................................................... 31

6. LITERATURA................................................................................................................ 34

Sanja Todorović Master rad

1

1. UVOD

________________________________________________________

1.1. Opšte karakteristike vrste Pinus nigra Arnold

1.1.1. Sistematski položaj

Pinus nigra Arnold (crni ili austrijski bor) pripada najvećoj (više od 230 vrsta),

ekonomski najznačajnijoj i filogenetski bazičnoj familiji četinara Pinaceae (Stefanović et al.,

1998). Prema filogenetskoj klasifikaciji kopnenih biljaka, koju su predložili Chase i Reveal,

2009. godine, ova vrsta pripada potklasi Pinidae (=Pinophyta, Pinopsida), redu Pinales i

familiji Pinaceae (tabela 1.1).

Tabela 1.1. Položaj vrste P. nigra u filogenetskom sistemu kopnenih biljaka.

Klasa (classis): Equisetopsida

Potklasa (subclassis): Pinidae

Red (ordo): Pinales

Familija (familia): Pinaceae

Podfamilija (subfamilia): Pinoideae

Rod (genus): Pinus

Podrod (subgenus): Pinus (Diploxylon) (Gernandt, 2005)

Sekcija (section) Pinus (Gernandt, 2005)

Podsekcija (subsection) Pinus (Gernandt, 2005)

1.1.2. Morfološke karakteristike

Pinus nigra je visoko, srednje ili nisko drvo do 30, ređe 40 (50) m, u zavisnosti od

staništa, sa širokokupastom do amrelastom krošnjom (slika 1.1). Kora na odraslom stablu

debela, tamnosiva; rano ispuca nepravilnim, kasnije dubokim uzdužnim i poprečnim

brazdama. Kora se u boji i debljini malo razlikuje u donjem i gornjem delu (razlika od P.

sylvestris). Mlade grančice gole, sjajne, pokrivene sitnim rombičastim ljuspama. Pupoljci

valjkasti pri vrhu, oštro zašiljeni, smolasti. Četine po dve, tamnozelene, krupne, duge 8-18


2

cm, široke, 1.5-2.1 mm, pravo pružene ili blago uvijene, traju obično 4-5 godina, pri bazi su

obuhvaćene zajedničkim rukavcem. Smoni kanali u četinama medijalno postavljeni; rukavac

trajan, dug 10-12 mm, obavija po dve četine (Vidaković, 1982; Jovanović, 1992).

Crni bor je jednodoma vrsta sa jednopolnim strobilusima. Muški i ženski strobilusi se

pojavljuju od aprila do maja meseca. Muški strobilusi (mikrostrobilusi) podsećaju na rese,

zbijeni su pri osnovi mladih grančica, žutozeleni, gotovo sedeći i kožasti. Sastoje se od

spiralno raspoređenih mikrosporofila, raspoređenih oko tanke kožaste osovine. Na

mikrosporofilima su, sa spoljne strane, smeštene po dve mikrosporangije ispunjene

mikrosporama. Mikrospore (polenova zrna) snabdevene su sa dva mehurasta dodatka koji se

formiraju od njihovog spoljnog omotača (egzine). Ženski strobilusi (makro-, megastrobilusi)

su 5-7.5 cm dugi, i 2-3.5 (4) cm široki, skoro sedeći, smešteni pri vrhu mladih izdanaka.

Jajastog su do kupastog oblika, smešteni u grupama od 2-4 komada, sjajnosmeđi. Strobilus je

Slika 1.1. Pinus nigra ssp. nigra na platou kanjona Uvac, jugozapadna Srbija (foto: Zlatković, 2013)


3

građen od snažnije osovine, sa spiralno raspoređenim makrosporofilima (plodnim ljuspama).

Pri bazi plodnih ljuspi nalaze se zaštitne ljuspe, a sa unutrašnje strane, pri bazi plodne ljuspe,

smeštena su dva semena zametka. Semeni zameci su mikropilama okrenuti ka osovini

strobilusa. Razvijen ženski strobilus (šišarka, conus) je izgrađen od kompaktno raspoređenih,

odrvenelih plodnih ljuspi koje su, sa donje strane, crnosmeđe, poprečno ispucale, a na vrhu

poseduju štitoliki izraštaj, apofizu. Zreli semeni zameci su izduženo jajasti, 4-6 mm dugi,

sivi, sa izduženim, krilastim, poluprozirnim dodatkom 3-4 puta dužim od samog semenog

zametka. Sazrevanje šišarke i semenih zametaka traje skoro dve sezone nakon oplođenja

(Zlatković i Šarac, 2016). Seme sazri do jeseni druge godine (u septembru ili oktobru, 18

meseci nakon oprašivanja). Šišarke se otvaraju narednog proleća (u trećoj godini) kada se

krilasta semena rasejavaju vetrom.

1.1.3. Distribucija i infraspecijska taksonomija

Crni bor je jedan od najšire rasprostranjenih i najpolimorfnijih četinara Evrope.

Diskontinuirano je rasprostranjen oko severnog Mediterana, od istočne Španije i južne

Francuske, preko Korzike i Kalabrije, Austrije i Balkanskog poluostrva do Male Azije i

Krima (slika 1.2).

Slika 1.2. Diskontinuirani areal i distribucija šest podvrsta P. nigra (prema, Quezel and Medail, 2003)


4

U Srbiji, glavna oblast prostiranja crnoborovih šuma nalazi se u zapadnom i

jugozapadnom delu, u srednjem toku reke

Drine (Maljen, Tara, Zlatibor, Kremna,

Šargan, Viogor), odakle se pružaju na jug u

Polimlje (Priboj – Crni vrh, Zlatar, Ozren

kod Sjenice). U centralnoj Srbiji crnoborove

šume su rasprostranjenje po ograncima

Golije, Zimovnika, Trnave, u Đakovu,

Studenici i Bresniku, po Troglavu, na levoj

strani Ibra, po Studenoj, Stolovima, Goču i

Kopaoniku, na desnoj strani Ibra. Međutim,

u istočnoj Srbiji crni bor ima krajnje sužen

areal: kanjon Lazareve reke, kanjon Jerme,

Golaš na Suvoj planina i Jarešnik na planini

Crnook kod Bosilegrada (slika 1.3). Obično

se javlja na nadmorskoj visini od 500-

1300 m, optimalno na visinama od 900-

1200 m (Šarac, 2014).

U saglasnosti sa geografskom i ekološkom raznovrsnošću areala, disjunktnom

distribucijom i dugom istorijom, crni bor je vrsta izraženog morfološkog varijabiliteta.

Izražena varijabilnost u morfološko-anatomskim karterima (Delevoy, 1949), ali i činjenica da

su geografske grupe prostorno inter-fertilne (Vidaković 1982), predstavljaju najveću prepreku

za tradicionalne klasifikacije bazirane uglavnom na sintezi morfološko-anatomskih i

fitogeografskih istraživanja ove veoma kompleksne četinarske vrste. Kаo posledicа togа, do

dаnаs su publikovаne mnogobrojne klаsifikаcije crnog borа аli opšti koncenzus još uvek nije

postignut (Šarac, 2014).

Na osnovu pregleda literaturnih podataka, jasno je da postoje velike razlike između

pojedinih autora u percepciji vrste P. nigra (Šarac, 2014). Naime, jedna grupa autora

(Svoboda, 1953; Fukarek, 1958; Gaussen, 1960) smatra da je reč o nekoliko malih ili

geografskih vrsta koje formiraju agregat (kolektivnu vrstu), dok druga grupa (Schwarz, 1938;

Delevoy, 1949; Gaussen et al., 1993) crni bor posmatra kao jednu vrstu sa dve ili više

podvrsta i većim brojem nižih infraspecijskih taksona. Gaussen i sar. (1993) u Flori Evrope

Slika 1.3. UTM 10x10 karta rasprostranjenja P. nigra u

Srbiji: ● P. nigra ssp. nigra, ● P. nigra var. gocensis, ● P.

nigra ssp. pallasiana, ● P. nigra var. banatica


5

crni bor tretiraju kao jednu vrstu u okviru koje razlikuju na pet alopatričnih podvrsta

(slika1.2): ssp. nigra (od Austrije do centralne Italije i Grčke), ssp. dalmatica (Vis.) Franco

(priobalni region i ostrva Dalmacije - Hrvatska), ssp. pallasiana (Lamb.) Holmboe

(Balkansko poluostrvo, južni Karpati i Krim), ssp. salzmannii (Dun.) Franco (Ceven i Pirineji

- Francuska, centralna i istočna Španija), i ssp. laricio (Poir.) Maire (Kalabrija i Sicilija -

Italija i Korzika - Francuska). Takođe, afričke populacije P. nigra opisane su kao posebna

podvrsta: ssp. mauretanica (Maire and Peyerimh) Heywood (Greuter et al., 1984).

Na osnovu istraživanja crnog bora na teritoriji Srbije, opisano je nekoliko

intraspecijskih taksona čiji odnosi još uvek nisu dovoljno razjašnjeni (Šarac, 2014). Iako je

teritorija Srbije, kao deo istočnog areala crnog bora, uključena u relativno veliki broj

klasifikacija (npr. Schwartz, 1938; Fukarek, 1958; Gaussen et al., 1964; 1993), do sada je

sprovedeno svega nekoliko taksonomskih istraživanja na ovim prostorima (Vidaković, 1955;

1957; Bojović et al., 2012; Šarac et al., 2013; 2015; 2016). U Flori Srbije, Jovanović (1992)

navodi dve podvrste crnog bora za koje možemo reći da su geografski diferencirane (slika

1.3). Naime, u zapadnim, jugozapadnim i centralnim delovima Srbije široko je

rasprostranjena tipska podvrsta (ssp. nigra) u okviru koje su opisana tri varijeteta: var. nigra,

var. zlatiborica Adam. i var. gocensis Đorđević. Jovanović (1992) još navodi da je u "Flori

Nacionalnog parka Tara" Gajić (1988) opisao posebnu podvrstu crnog bora (ssp. drinana

Gaj.). Sa druge strane, u istočnoj, severoistočnoj i jugoisotičnoj Srbiji gde crni bor ima

krajnje sužen areal, opisana je ssp. pallasiana, u okviru koje autor izdvaja varijetet banatica

(Endl.) Georg. et Jon.

Kod tipske podvrste (ssp. nigra) (slika 1.1) ovogodišnje grančice su sivosmeđe,

starije su crvenkastosmeđe. Ljuspe kraće od rukavaca četina. Četine krupne, tamnozelene,

vrlo gusto stojeće, pri vrhovima grančica priklonjene grančici, 8-14 cm duge. Snopići

hipodermalnih ćelija, na poprečnom preseku četina, polumesečasti, sa 2-3 slojeva ćelija.

Smonih kanala u parenhimu obično oko 11. Šišarice duge 4-8 cm, svetlosmeđe; apofize na

srednjim i gornjim ljuspama sa oštrim poprečnim rebrom.

Podvrsta je rasprostranjena širom zapadne, jugozapadne i centralne Srbije (slika 1.3)

sa tri varijeteta: var. nigra (četine tamnozelene, kora odraslih stabala pretežno sa podužnim

brazadama; tipičan široko rasprostranjeni oblik u arealu podvrste) (slika 1.1), var. zlatiborica

(četine u gornjoj trećini zlatnožute; poznato po jedno stablo na Murtenici i Zlatiboru) i var.


6

gocensis (četine tamnozelene, kora odraslih stabala sa izraženim poprečnim i podužnim

brazdama; opisan sa planine Goč).

Palasov ili krimski crni bor (ssp. pallasiana) se od tipične podvrste odvaja, pre

svega, dužim lisnim rukavcima (18-26 mm) (Jovanović, 1992). Ovogodišnje grančice su žute

do svetlosmeđe, sjajne. Ljuspe na grančicama svetložute, po dužini jednake rukavcima četina

ili duže. Ljuspe su tri puta duže od svoje širine, sa paralelnim ivicama; na leđima imaju usko,

istaknuto rebro i zašiljen, povijen vrh. Četine prave do malo savijene, krute, duge 8-12 (-18)

cm i 1.6-2.1 mm široke, tamnozelene. Hipodermalne ćelije sa 2-5 slojeva. Smonih kanala u

parenhimu obično manje od 11. Šišarice tamnosmeđe i sjajne, duge 5-10 cm, 2-4 cm široke sa

tupim rebrom na zrakasto naboranim apofizama gornjih i srednjih ljuspi; grbice crvenkaste do

sive.

Palasov crni bor je zabeležen jedino u jugoistočnoj Srbiji (Rajevski, 1950) na planini

Crnook (Jarešnik) u okolini Bosilegrada (slika 1.3), na nadmorskoj visini oko 1300 m, na

kristalastim škriljcima. Takson je zakonom zaštićen kao prirodna retkost na području Srbije

(Sl. gl. R. Srbije br. 66/91, 83/92), dok je stanište na Crnooku proglašeno za strogi rezervat

prirode.

U okviru ssp. pallasiana Jovanović (1992) opisuje i banatski crni bor (var.

banatica): jednogodišnje grančice različite boje, od tamnoljubičastocrvene do

svetlozelenožute. Četine tamne (zelenocrnkaste), krute do vrlo krute, bodljikave, (5-) 9-10 (-

13) cm duge, 1.5-2.5 mm široke. Smonih kanala 4-10. Šišarice jajolike, simetrične, (3-) 5-6 (-

7) cm duge, dva puta uže nego što su duge, sa apofizama koje imaju slabo izražene radijalne

brazde. Seme dugo 3-9 mm, krilca jednobojna ili prugasta.

Banatski crni bor je prvi put opisan u Rumuniji u dolini Černe (Domogled), kraj

Đerdapa, gde se javlja na nadmorskoj visini od 300 do 1100 m. Iako su ove populacije crnog

bora sa Južnih Karpata poznate još sa početka XIX veka (Rochel, 1828; Schwarzott, 1831),

njihov taksonomski položaj je ostao izuzetno kontraverzan (pregled u Boşcaiu i Boşcaiu,

1999; Šarac, 2016). Morfološki je vrlo varijabilan, a na osnovu anatomije četina opisano je

čak 7 formi i 12 luzusa. U istočnoj Srbiji ovaj takson ima krajnje sužen areal, u vidu vrlo

malih i veoma udaljenih enklava (kanjon Lazareve reke, kanjon Jerme i Golaš na Suvoj

planini; slika 1.3).


7

1.2. Opšte karakteristike kutikularnih voskova

Različiti nepovoljni abiotički i biotički faktori uslovili su pojavu efikasnih

mehanizama zaštite kod biljaka kao sesilnih organizama. U odbrani od nepovoljnih uslova

spoljašnje sredine bitnu funkciju ima zaštitini lipidni sloj na površini nadzemnih zeljastih

delova koji se naziva kutikula.

Biljna kutikula je lipofilna struktura nataložena na spoljašnjim zidovima epidermalnih

ćelija. Na osnovu rastvorljivosti u organskim rastvaračima razlikuju se dva osnovna tipa

komponenti biljne kutikule: lipofilna jedinjenja koje se oslobađaju ekstrakcijom u organskim

rastvaračima kolektivno su označena kao "kutikularni vosak", dok je lipofilna komponenta

koja se ne može ekstrahovati zbog polimerne strukture označena kao "kutin" (Šarac et al.,

2014). Najčešća i najzastupljenija grupa jedinjenja u kutikularnim voskovima su alifatični,

acikični, negranati, zasićeni ugljovodonici, koji sadrže najmanje 20 ugljenikovih atoma.

Ovakva "dugolančana jedinjenja" nastaju elongacijom masnih kiselina sa više od 18

ugljenikovih atoma i daljom modifikacijom u odgovarajuće alkane, aldehide, ketone,

primarne i sekundarne alkohole, kao i estre koji se formiraju između masnih kiselina i

alkohola (Samuels et al., 2008). Manje zastupljena grupa jedinjenja u kutikularnim

voskovima mnogih biljnih vrsta su pentaciklični triterpenoidi. U kutikularnom vosku

pojedinih biljnih vrsta mogu se naći i aromatična jedinjenja, ali u manjim količinama (Jetter

et al., 2007).

Slika 1.4. Komponente kutikule i domeni ćelijskog zida epidermalne ćelije (Šarac, 2014)


8

Vosak prožima kutikulu celom debljinom, pri čemu je jedan deo voska ugrađen u

kutinski polimerni matriks (intrakutikularni vosak), a drugi nataložen na spoljašnjoj površini

kutina (epikutikularni vosak) (slika 1.4) (Jeffree, 1996). Naime, intrakutikularni vosak je

amorfna smeša lipida uronjenih u kutin, koja povezuje kutikulu sa ćelijskim zidom, dok se

epikutikularnim voskom smatraju površinski lipidi (u kontaktu sa atmosferom) nataloženi na

spoljašnjoj površini kutina. Brojna istraživanja, pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije

(SEM), otkrila su da epikutikularni vosak formira površinski voštani film sa posebnim

trodimenzionalnim strukturama (kristaloidima) koji štrče u atmosferu i čiji oblik, veličina, i

orjentacija u odnosu na površinu izuzetno variraju kod različitih biljnih vrsta (Barthlott et al.,

1998; Jeffree, 2006). Prema Koch i sar. (2008), najčešći mikromorfološki tipovi

epikutikularnih voštanih kristaloida koji se sreću u biljnom svetu su: korice, pločice, štapići,

tubule (cevčice), končaste strukture itd.

Kod golosemenica, voštani krisatloidi uglavnom imaju izgled tubula i odlikuje ih

dominacija sekundarnog alkohola nonakozan-10-ola (tzv. nonakozanol-tubule, Barthlott et

al., 1998). Nonakozan-10-ol je dominantna komponenta kutikularnih voskova većine

golosemenica (Ginkgo, Pinus, Abies, Picea, Wollemia, Taxus itd.) kao i nekih

skrivenosemenica, i smatra se odgovoranim za tubularnu mikrostrukturu epikutikulanog

voštanog sloja kod ovih biljaka (Jeffree, 2006). Iako se hemijski sastav različitih tipova

kristaloida odnosi na dominantnu komponentu ukupnog ekstrahovanog voska, nekoliko

istraživanja potvrdilo je sposobnost nonakozan-10-ola da rekristališe in vitro u formi tubula

(Jetter i Riederer, 1994; Ensikat et al., 2006). Kod P. nigra, voštane tubule su vrlo gusto

raspoređene sa mrežastim izgledom i koncentrisane uglavnom u stominim komorama, dok

najveću površinu četina prekriva glatki voštani sloj (slika 1.5; Šarac et al., nepublikovani

podaci). Međutim, sadržaj i varijabilnost nonakozan-10-ola u kutikularnim voskovima crnog

bora do sada nije istraživan. Hemijski sastav epikutikularnih voskova kod ove vrste analiziran

je samo sa aspekta n-alkana i primarnih alkohola (Maffei et al., 2004; Bojović et al., 2012,

Šarac et al., 2016).

Fizičke i hemijske osobine kutikularnih voskova određuju neke od vitalnih funkcija

biljaka (Šarac, 2014). Pre svega, vosak značajno redukuje nestomaternu transpiraciju, a veza

između kserofitnog karaktera pojedinih biljaka i količine lisnih kutikularnih voskova je

potvrđena u velikom broju radova. Vosak, takođe, štiti biljku od raznih spoljašnih uticaja:

vetra, snega, mraza i ultravioletnog zračenja (Reicosky i Hanover, 1978; Barnes et al., 1996);

redukuje zadržavanje vode na površini biljaka, smanjuje apsorpciju prašine, polena i ostalih


9

zagađujućih materija iz vazduha (Kerstiens, 1996; Barthlott i Neinhaus, 1997) pri čemu

pokazuje osobinu "samo-čišćavanja" (lotus efekat – Barthlott i Neinhaus, 1997). Takođe,

pokazano je da kutikularni vosak ima značajnu ulogu u zaštiti biljaka od mnogih bakterijskih

i fungalnih infekcija (Jenks et al., 1994) i da učestvuje u različitim interakcijama između

biljaka i insekata (Eigenbrode i Espelie, 1995).

1.2.1. Opšte karakterisitke i distibucija alkana

Alkani su zasićeni ugljovodonici, poznati pod nazivom parafini. Sastoje se od dva

elementa: ugljenika (C) i vodonika (H), povezanih kovalentnim vezama. Veličinu alkana

određuje broj međusobno vezanih C atoma. Alkani sa više od tri C atoma mogu formirati

različite strukturne izomere. Na taj način možemo razlikovati linearne, normalne alkane (n-

Slika 1.5. SEM mikrografija epikutikularnog voska na licu četine P. nigra

(Šarac et al., unpublished data)


10

alkane), sa ugljenikovim skeletom cik-cak strukture i opštom formulom: CnH2n+2 i račvaste

(iso-alkane) sa opštom formulom CnH2n+2, n>3 (Nikolić, 2008).

Alkani su nepolarni ili slabo polarni jer se vodonik i ugljenik vrlo malo razlikuju po

elekronegativnosti, a ostale veze su između ugljenika i ugljenika, gde polarnosti nema. Sa

porastom broja ugljenikovih atoma u molekulu alkana rastu i tačke ključanja i mržnjenja.

Izuzev prva četiri alkana, tačka ključanja raste za 20 do 30 stepeni pri povećanju molekula

alkana za jedan ugljenikov atom. Povećanje tačke mržnjenja nije tako pravilno, jer

međumolekularne sile u kristalu ne zavise samo od veličine molekula, već i od slaganja

kristalnih rešetki. Prva četiri n-alkana (metan, etan, propan i butan) su gasovi, sledećih 13

(C5-C17), zbog povećanja lanca odnosno tačke ključanja i mržnjenja su tečnosti, a oni sa 18 i

više ugljenikovih atoma se nalaze u čvrstom agregatnom stanju.

U skladu sa pravilom da se slično rastvara u sličnom, alkani su rastvorljivi u

nepolarnim rastvaračima kao što su benzen, etar i hloroform, a nerastvorljivi u vodi i drugim

polarnijim rastvaračima. Takođe, tečni alkani su dobri rastvarači za slabo polarna jedinjenja,

dok polarna jedinjenja ne rastvaraju. U poređenju sa drugim organskim jedinjenjima alkani su

slabo reaktivna jedinjenja. Nereaktivnost alkana potiče otuda što su oni izgrađeni od sigma C-

C i C-H veza. Da bi alkan stupio u rekaciju, potrebno je da se ove veze raskinu, a to zahteva

znatnu količinu energije. Zato alkani reaguju samo pod posebnim uslovima, tj. na visokoj

temperaturi i pod uticajem radijacija (sunčeve svetlosti).

Dugolančani n-alkani sa neparnim brojem C atoma su jedna od najzastupljenijih

komponenti kutikularnih voskova. Zbog svoje velike nepolarnosti, oni znatno doprinose

hidrofobnim osobinama voskova, smanjujući nestomaterni gubitak vode sa površine listova i

drugih delova biljke. Kod većine terestričnih biljaka najzastupljeniji su n-alkani C27, C29 i

C31, koji ponekad čine i do 90% ukupnog sastava voska (Nikolić, 2008). Akvatične biljke

karakteriše dominacija n-alkana C23 i C25, dok je dominacija n-alkana relativno kratkih

nizova ugljenikovih atoma (C15, C17, i C19) utvrđena kod algi i cijanobakterija (Chikaraishi

and Naraoka, 2003). U kutikularnim voskovima četinara najčešće dominira n-alkan C31, a

zatim C27, C29 i C25 (Maffei et al., 2004). U slučaju P. nigra, n-alkani C27, C25, C23, and C29 su

detektovani kao glavne komponente kutikularnih voskova (Šarac et al., 2016).


11

1.2.2. Taksonomski značaj alkana

Kao jedna od najzastupljenijih komponenti kutikularnih voskova, čiji je biosinteza

pod strogom genetičkom kontrolom, n-alkani su najčešće korišćeni kao hetmotaskonomski

markeri različitih biljnih familija (Maffei et al., 1996; 2004). Takođe, mnoge studije su

pokazale da se n-alkani mogu koristiti i kao veoma informativni markeri u proučavanjima

geografske varijabilnosti i/ili identifikaciji infraspecijskih taksona Pinus (Nikolić et al.,

2012a; 2012b; Bojović et al., 2012; Šarac et al., 2016), Picea (Nikolić et al., 2013) i

Juniperus (Rajčević et al., 2014) vrsta.

Dva parametra koja se najčešće koriste za opisivanje profila alkana u kutikularnim

voskovima su: ugljenični preferencijalni indeks (CPI - "carbon preference index"), koji

pokazuje odnos alkana sa neparnim i parnim brojem C atoma i prosečna dužina lanca (ACL -

"average chain lenght"). S obzirom da kutikularne voskove terestričnih biljaka odlikuje

snažna dominacija dugolančanih n-alkana sa neparnim brojem C atoma, CPI i ACL vrednosti

se nalaze u opsegu 3-34 i i 26-30, respektivno (Rommerskirchen et al., 2006; Stojanović et

al., 2003). Interesantano je da su u kutikularnim voskovima najprimitivnijih golosemenica iz

potklase Cycadidae, alkani sa parnim i neparnim brojem C atoma približno jednako

zastupljeni, što za posledicu ima i veoma niske CPI vrednosti (0.88-2.70; Vane et al., 2016)

koji izlaze iz opsega karakterističnog za većinu Spermatophyta.

I pored neosporne činjenice da su sastav i produkcija alkana u kutikularnim

voskovima genetički determinisani, kod alkana (kao i kod drugih sekundarnih metabolita

biljaka) uočava se određena varijabilnost, kao posledica uticaja različitih ekoloških faktora

(pregled u Šarac, 2014). Zbog toga je pre analize taksonomskog značaja neophodno istražiti

intra- i interpopulacionu varijabilnost alkana određenog taksona. Takođe, pravilno

uzorkovanje i doslednost u postupcima branja, skladištenja i izolacije alkana su preduslovi

validne interpretacije dobijenih rezultata (Marin, 2003).


12

2. CILJEVI RADA __________________________________________________________________________________

Osnovni naučni ciljevi ovog istraživanja mogu se predstaviti u nekoliko teza:

1. Upoznavanje hemijskog sastava epikutikularnih voskova dvogodišnjih četina iz

jedne autohtone populacije P. nigra ssp. nigra sa područja jugozapadne Srbije

(Uvac)

2. Poređenje sastava epikutikularnih voskova populacije Uvac sa prethodno

publikovanim rezultatima za 9 populacija crnog bora (opisanih kao ssp. banatica

(Borbás) Novák, ssp. nigra i ssp. pallasiana) sa područja Južnih Karpata i

centralnog Balkana (Šarac et al., 2016).

3. Utvrđivanje varijabilnosti ugljeničnog preferencijalnog indeksa (CPI) i prosečne

dužine lanca C atoma (ACL) i njihovog potencijalnog hemotaksonomskog značaja

4. Utvrđivanje odnosa n-alkana srednjeg i dugog niza u epikutikularnim voskovima

P. nigra


13

3. MATERIJAL I METODE __________________________________________________________________________________

3.1. Biljni materijal

Analize su vršene na dvogodišnjim četinama koje su sakupljene sa 15 odraslih stabala

u populaciji Uvac (Zavojci) na području jugozapadne Srbije. U ručnom frižideru uzorci su sa

mesta sakupljanja prenešeni do zamrzivača (- 20°C) na skladištenje do momenta upotrebe.

Geografski položaj populacije je određen uz pomoć GPS uređaja (GPS Garmin eTrex

Vista® C). Orografske karakteristike staništa pre svega nadmorska visina i ekspozicija su

preuzeti iz SRTM (Shuttle Radar Topography Mission) (Reuter et al., 2007) digitalnog

elevacionog modela rezolucije 90 x 90 m (Farr al., 2007) pomoću softvera ArcGIS 10 (ESRI,

2011) (tabela 3.1). Herbarski primerak je deponovan su u Herbarijumu Departama za

biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu (HMN).

Tabela 3.1. Geografski položaj i stanišne karakteristike istraživane populacija P. nigra ssp.

nigra.

Takson P. nigra ssp. nigra

Lokalitet Uvac (Zavojci)

Broj analiziranih jedinki (n) 15

Geografska širina (N) 43°36'43.65''

Geografska dužina (E) 19°38'39.86''

Nadmorska visina (m) 1106

Ekspozicija SW

Geološka podloga serpentinit

Datum sakupljanja 27.06.2013.

Vaučer broj 6937 HMN


14

3.2. Ekstrakcija epikutikularnih voskova

Epikutikularni voskovi ekstrahovani su potapanjem 5 g iglica u 10 ml n-heksana u

trajanju od 60 sekundi. Nakon toga ekstrakti su filtrirani, upareni do suvog stanja i zatim

rastvoreni u 1 ml n-heksana. Koncentrovani ekstrakti su frakcionisani na mini koloni

korišćenjem Paster pipete napunjene florisilom (60–100 mesh). Voskovi su dobijeni

eluiranjem sa 5 ml n-heksana, nakon čega su upareni do suvog, ponovo rastvoreni u 1 ml n-

heksana i čuvani na -20°C do dalje analize. Ekstarkcija voskova izvršena je posebno za svaku

jedinku (15 uzoraka).

3.3. GC-FID i GC-MS analiza kutikularnih voskova

Hemijski sastav heksanskih ekstrakata je određen pomoću GC-MS i GC-FID tehnika

analize. Svi uzorci su snimani u triplikatu, na 7890/7000B GC/MS/MS tripl-kvadripol

sistemu (Agilent Technologies, USA) sa Combi PAL auto-semplerom i HP-5 MS kolonom

(5% fenil metil siloksan, 30 m x 0.25 mm i.d. i 0.25 µm debljina filma).

Temperaturni program: prvih 2.25 minuta izotermalno na 70 0C, zatim linearni porast

temperature, od 70 do 300 0C (5 °C min-1), potom izotermalno na 300 0C, zadnjih 10 minuta

programa. Injektovana zapremina uzorka 5 µL (split 2:1). Bekfleš (nakon završetka analize)

1.89 min, na 280 0C, sa helijumom pod pritiskom od 50 psi. MS uslovi: jonizacija -70 eV,

opseg masa 50-650 amu, vreme skenova 0.32 sekunde. GC-FID analiza je izvedena pod istim

eksperimentalnim uslovima kao što je već navedeno za GC-MS analizu. Procentni sastav je

preračunat na osnovu površine GC-FID pikova, bez korekcionih faktora.

Identifikacija komponenti. Komponente voskova su identifikovane pomoću AMDIS

softvera (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, Ver. 2.1,

DTRA/NIST, 2011), na osnovu lineranih retencionih indeksa (RI), koji su određeni na

osnovu retencionih vremena standardne serije alkana (C8-C40), snimljene na istom aparatu i

pod istim uslovima kao i uzorci. RI su upoređivani sa literaturnim vrednostima (Van Den

Dool i Kratz, 1963; Stein, 1990; Adams, 2007; NIST Chemistry WebBook); identifikacija je

izvršena na osnovu upoređivanja masenih spektara komponenata voska sa


15

literaturnim/bibliotečkim masenim spektrima Wiley 6, NIST02, MassFinder 2.3 (Stein, 1990)

i MS bibliotekama dobijenih na osnovu snimanja čistih supstanci.

Izračunavanje CPI i ACL vrednosti. Ugljenični preferencijalni indeks (CPI -

"carbon preference index") za ukupne parne i neparne n-alkane (CPItotal) je izračunat

korišćenjem formule koju navode Mazurek i Simoneit (1997). Srednja vrednost dužine

ugljovodoničnog niza (ACL - "average chain lenght") za ukupne parne i neparne n-alkane

(ACLtotal) je izračunata prema Poynter i Eglington (1990). Da bi uporedili dobijene rezultate

sa postejećim literaturnim podacima, CPI25-33 i CPI25-31 su izračunati prema formuli koju

navode Bray i Evans (1961). Relativni odnosi n-alkana srednjeg i dugog niza su izračunati

prema Kuhn i sar. (2010).

3.4. Statistička analiza

Sve identifikovane komponente epikutikularnih voskova obrađene su metodama

univarijantne i multivarijantne statistike (Quinn i Keough, 2002) uz pomoć programskog

paketa Statistica, version 5.1 (StatSoft Inc., 1996, Tulsa, OK, USA).

Deskriptivna statistika. Za sve hemijske karaktere urađena je osnovna deskriptivna

statistika (srednja vrednost, maksimum, minimum, standardna devijacija i koeficijent

varijacije) na osnovu koje je urađena analiza varijabilnosti pojedinačnih hemijskih karaktera

u okviru populacije Uvac. Ovi rezultati su grafički prikazani uz pomoć whisker box plota gde

je za svaki karakter prikazana njegova varijabilnost na nivou ispitivane populacije.

Koeficijent varijacije (CV%) je korišćen za opisivanje hemijske varijabilnosti karaktera i u

odnosu na njegove vrednosti karakteri su okarakterisani kao nisko varijabilni (CV% < 20),

umereno varijabilni (20 < CV% > 60), visoko varijabilni hemijski karakteri (CV% > 60), oni

karakteri kod kojih je CV% >100 su okarakterisani kao jako visoko varijabilni.

Jednofaktorska analiza varijanse (ANOVA) je urađena da bi se utvrdilo da li

postoji statistički značajna razlika u prosečnim vrednostima analiziranih karaktera između

populacija. Osnovni postupak na kome se zasniva ova tehnika jeste izvođenje dve različite

ocene varijanse populacija iz podataka, za koje se zatim računa količnik. Jedna od ovih ocena

(varijansa između grupa) predstavlja meru efekata nezavisne promenljive udružene sa

varijansom greške. Druga ocena (varijansa unutar grupa) je mera samo varijanse greške.


16

Količnik varijansi između i unutar grupa označava se kao F-vrednost ili F-količnik. Statistički

značajnan F-količnik ukazuje da su prosečne vrednosti posmatranog karaktera za date

populacije veoma različite.

Kanonijska diskriminantna analiza (CDA). Da bi se utvrdilo da li postoji

diferencijacija populacija na osnovu analiziranih karaktera urađena je kanonijska

diskriminantna analiza sa populacijama koje su uzete kao a priori grupna varijabla. Ova

analiza ima za cilj da utvrdi koliko se prethodno definisane grupe (populacije) međusobno

razlikuju i koji karakteri najviše doprinose diskriminaciji populacija.

Klaster analiza. Klaster analiza omogućava grupisanje analiziranih varijabli u grupe

ili klastere tako se da slični uzorci nalaze u istog klasi (klasteru). Klaster analiza bazirana na

matrici Mahalanobisovih distanci koje su izračunate u CDA, a za koju je korišćen

Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) metod hijerarhijskog

klasterovanja urađena je na osnovu svih identifikovanih komponenti voskova i rezultati su

prikazani grafički uz pomoć dendrograma. Ova analiza je korišćena da bi se utvrdila sličnost

između prvobitno neklasifikovanih objekata tj. populacijama u ovom slučaju.


17

4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Hemijski sastav epikutikularnih voskova

Dvogodišnje četine P. nigra ssp. nigra sakupljene su sa 15 odraslih stabala u

populaciji Uvac (Zavojci) na području jugozapadne Srbije, krajem juna 2013. godine (tabela

3.1). Kombinacijom GC i GC/MS analize u epikutikularnim voskovima četina identifikovana

su četiri primarna alkohola i 11 n-alkana u seriji od C21 do C31. Dominante komponente

voskova na nivou ispitivane populacije su četiri n-alkana sa neparnim brojem C atoma: C25,

C27, C23 i C29 (26.47%, 22.90%, 14.11%, 10.59%, respektivno) (tabela 4.1 i slika 4.3). Kao

posledica toga sadržaj ukupnih n-alkana je značajno veći (83.56%) u odnosu na primarne

alkohole (2.58%). Dobijeni hromatogrami su prikazani na slikama 4.1 i 4.2

Šarac i sar. (2016) su detektovali nešto veći opseg n-alkana u epikutikularnim

voskovima P. nigra ssp. nigra na teritoriji Srbije i Bosne i Hercegovine (C21 do C33) i

drugačiji redosled četiri dominantna n-alkana (C27, C25, C29 i C23). Međutim, jasna dominacija

n-alkana u odnosu na primarne alkohole je, takođe, prikazana u ovim populacijama.

Tabela 4.1. Rezultati deskriptivne statistike za 15 komponenti epikutikularnih vosko

Slika 4.1. TIC hromatogram epikutikularnog voska četina P. nigra ssp. nigra iz populacije Uvac

(uzorak SU6)

C23

C25

C27

C29


18

Tabela 4.1. Rezultati deskriptivne statistike za 15 komponenti epikutikularnih voskova P. nigra ssp.

nigra u populaciji Uvac (četiri dominantne komponente su boldirane; Avg - srednja vrednost, Min -

minimalna vrednost, Max maksimalna vrednost, St.Dev - standardna devijacija, CV – koeficijent

varijacije).

R. br. Kakter Avg Min Max St.Dev. CV%

1 1-heksadekanol 1.05 0.00 2.96 0.92 88.35

2 cis-9-oktadecen-1-ol 1.35 0.00 4.66 1.36 100.88

3 trans-9-oktadecen-1-ol 0.13 0.00 0.65 0.24 179.73

4 1-oktadekanol 0.05 0.00 0.82 0.21 387.30

5 C21 2.79 1.09 5.99 1.41 50.60

6 C22 0.43 0.00 1.18 0.45 104.68

7 C23 14.11 4.26 31.83 8.71 61.72

8 C24 2.23 1.02 3.21 0.54 24.20

9 C25 26.47 14.48 38.11 6.60 24.95

10 C26 2.05 1.30 2.87 0.45 21.98

11 C27 22.90 13.15 41.03 7.43 32.44

12 C28 1.01 0.00 1.66 0.43 42.81

13 C29 10.59 5.48 14.93 2.58 24.40

14 C30 0.06 0.00 0.55 0.17 267.67

15 C31 0.92 0.00 3.38 0.97 105.81

primarni

alkoholi 2.58 0.00 6.74 1.95 75.52

n-alkani 83.56 61.82 97.40 11.70 14.00

C23

C25

C27

C29

Slika 4.2. TIC hromatogram epikutikularnog voska četina P. nigra ssp. nigra iz populacije Uvac

(uzorak SU3)


19

4.1.1. Promenjivost pojedinačnih komponenti epikutikularnih voskova

Promenjivost pojedinačnih hemijskih karaktera analizirana je na osnovu rezultata

deskriptivne statistike koji su bazirani na statističkoj obradi podataka svih identifikovanih

komponenti voskova izolovanih sa četina 15 jedinki P. nigra ssp. nigra iz populacije Uvac.

Kao rezultat deskriptivne statistike, izračunate su srednja vrednost, standardna

devijacija i koeficijent varijacije (CV%). Srednja vrednost je pokazatelj prosečne vrednosti

ispitivanih karaktera i omogućava dalje korišćenje statističkih pokazatelja varijabilnosti –

standardne devijacije i koeficijenta varijacije. Standardna devijacija, kao mera apsolutne

varijabilnosti, ukazuje na prosečno odstupanje vrednosti ispitivanog karaktera od srednje

vrednosti. Varijabilnost ispitivanih karaktera se ocenjuje pomoću koeficijenta varijacije i

izražava u procentima (Bojović i Mitrović, 2010).

Slika 4.3. Whisker plot za 15 komponenti epikutikularnih voskova u populaciji Uvac

(P. nigra ssp. nigra)


20

Koeficijent varijacije (CV%). Vrednosti koeficijenta varijacije, za komponente

epikutikularnih voskova P. nigra ssp. nigra u populaciji Uvac, variraju u opsegu od 21.98%

do 387.30% (tabela 4.1). Jako visok koeficijent varijacije CV% >100 pokazuju tri alkohola

(cis-9-oktadecen-1-ol, trans-9-oktadecen-1-ol i 1-oktadekanol) i tri n-alkana (C22, C30 i C31).

Karakteri koji pokazuju visok nivo koeficijenta varijacije (CV% >60) su alkohol 1-

heksadekanol i n-alkan C23. Svi ostali hemijski karakteri pokazuju umeren nivo koeficijenta

varijacije (20 < CV% > 60). Najniži koeficijent varijabilnosti hemijskih karaktera pokazuje n-

alkan C26 (tabela 4.1). Prema tome najveći nivo koeficijenta varijacije pokazuju komponente

koje su detektovane u tragovima (x<1.5%), dok sve ostale komponente voskova, detektovane

u koncentraciji većoj 1.5%, pokazuju umeren nivo koeficijenta varijacije (osim n-alkana C23).

Generalno, možemo reći da je ovakav rezultat u potpunosti i očekivan, s obzirom da su

analizirane jedinke P. nigra ssp. nigra iz samo jedne populacije.

Sadržaj najzastupljenije komponente, n-alkana C25, u populaciji Uvac varira od

14.48% do 38.11%. n-Alkan C25 spada u karaktere sa umerenom varijabilnošću (CV% =

24.95).

Sadržaj druge dominantne komponente, n-alkana C27, varira od 13.15% do 41.03%.

Kao i prva dominantna komponenta, ovaj karakter pokazuje umeren nivo koeficijenta

varijacije (CV% = 32.44).

Sadržaj treće dominantne komponente, n-alkana C23, varira od 4.26% do 31.83%. Za

razliku od prve dominantne komponente, ovaj n-alkan spada u karaktere sa visokom

varijabilnošću (CV% = 61.72)

Sadržaj četvrte dominantne komponente, n-alkana C29, varira od 5.48% do 14.93;

spada u karaktere koji pokazuju umeren nivo koeficijenta varijacije (CV% = 24.40).


21

4.1.2. Diferencijacija analiziranih populacija

Kanonijska diskriminantna analiza (CDA). Za CDA analizu korišćene su sve

identifikovane komponente epikutikularnih voskova u populaciji Uvac (ssp. nigra) i

prethodno publikovani rezultati za 9 populacija crnog bora (ssp. banatica, ssp. nigra i ssp.

pallasiana) sa područja Južnih Karpata i centralnog Balkana (Šarac et al., 2016).

CDA na osnovu 195 jedinki iz 10 populacija P. nigra pokazala je da prva

diskriminantna funkcija objašnjava 42.8% ukupne diskriminacije i da je najviše određena

sadržajem alkohola cis-9-oktadecen-1-ol i n-alkana C28 (tabela 4.2). Druga diskriminantna

funkcija učestvuje u 19.4% ukupne diskriminacije, a najviše je određena sadržajem alkohola

1-oktadekanola i n-alkana C33. Pored ove dve komponente, na drugu diskriminantnu funkciju

značajno utiče i sadržaj alokohola 1-heksadekanola, cis-9-oktadecen-1-ola, trans-9-

oktadecen-1-ola i n-alkana C27.

Tabela 4.2. Standardizovani koeficijenti za prve dve kanonijske ose (CA) varijabilnosti 17

komponenti voskova na osnovu diskriminantne funkcionalne analize sa 10 a priori grupa.

Značajni koeficijenti su boldirani.

Karakter CA1 CA2

1-hexadecanol 0.38 0.50

cis-9-octadecen-1-ol 0.98 -0.75

trans-9-octadecen-1-ol -0.24 0.78

1-octadecanol -0.33 -0.99

C21 -0.12 -0.36

C22 0.02 -0.13

C23 0.04 0.12

C24 -0.19 -0.15

C25 0.14 0.37

C26 0.10 -0.20

C27 -0.19 -0.52

C28 0.77 0.02

C29 -0.31 0.40

C30 -0.04 0.19

C31 0.14 -0.40

C32 0.24 -0.23

C33 -0.10 0.96

eigen-vrednosti 3.55 1.62

% objašnjene varijabilnosti 0.43 0.62


22

Scatterplot, dobijen na osnovu CDA, pokazao je tendeciju formiranje tri grupe

populacija (slika 4.4). Prva grupa se nalazi se u pozitivnom delu prve kanonijske ose (CA1) i

uključuje većinu individua krimskog crnog bora (ssp. pallasiana) iz Makedonije. Preostale

dve grupe populacija nalaze se u negativnom delu CA1, ali su se razdvojile po drugoj

kanonijskoj osi (CA2). Naime, u pozitivnom delu CA2 koncentrisale su se individue

banatskog crnog bora (ssp. banatica) iz Rumunije, dok se u negativnom delu CA2 nalazi

većina jedinki iz srpskih populacija, koje su opisane kao tri različite podvrste (ssp. nigra, ssp.

banatica i ssp. pallasiana), zajedno sa jedinkama ssp. nigra iz Bosne i Hercegovine. Na ovaj

način možemo reći da CA1, koja objašnjava najveći procenat diskriminacije, izdvaja

makedonske populacije ssp. pallasiana od preostalih ispitivanih populacija, dok CA2, koja

učestvuje u manjem procentu diskriminacije izdvaja rumunske populacije ssp. banatica od

populacija crnog bora iz Srbije i Bosne i Hercegovine. Iako jedinke P. nigra iz populacije

Uvac, čiji je hemijski sastav voskova ispitivan u ovom radu, očigledno pripadaju trećoj grupi

Slika 4.4. Kanonijska diskriminantna analiza (CDA) na osnovu sadržaja 17 komponenti

voskova izolovanih iz 195 jedinki P. nigra sa 10 a priori grupa.


23

sa svim ostalim populacijama iz Srbije, može se primetiti blaga tendencija njihovog

izdvajanja i približavnja grupi ssp. banatica iz Rumunije (delimično se preklapaju sa

jedinkama iz populacije Svinjice). Kao posledica toga, gubi se pravilna klinalna diferncijacija

populacija P. nigra u pravcu sever-jug (prikazana u Šarac et al., 2016), ali i pored toga

možemo reći da najjužnije (makedonske) i najsevernije (rumunske) populacije zadržavaju

svoj distinktan položaj u odnosu na populacije crnog bora iz Srbije.

Na dendogramu, koji je dobijen pomoću klaster analize (CA), možemo primetiti

grupisanje analiziranih populacija crnog bora na sličan način (slika 4.5). Najmanji procenat

sličnosti dele makedonske populacije ssp. pallasiana sa ostalim ispitivanim populacijama.

Međutim u okviru druge grupe, populacije ssp. banatica iz Rumunije izdvajaju se u poseban

klaster u odnosu na P. nigra populacije iz Srbije i Bosne i Hercegovine.

Slika 4.5. Dendrogram dobijen klaster analizom 10 populacija P. nigra na osnovu 17

komponenti epikutikularnih voskova


24

Na ovaj način, obe multivarijantne analize, ukazuju na specifičan hemijski profil

epikutikularnih voskova krimskog crnog bora iz Makedonije koji se može pripisati ssp.

pallasiana, a koji odlikuje značajno veći sadržaj alkohola alkohola cis-9-oktadecen-1-ol i n-

alkana C28 (detalji u Šarac et al., 2016). Populacije ssp. banatica iz Rumunije, na osnovu

karakeristika epikutikularnih voskova, pokazuju manji stepen orginalnosti, ali se ipak

izdvajaju u posebnu grupu u odnosu na populacije iz Srbije i Bosne i Hercegovine. Iako su

ove populacije crnog bora sa Južnih Karpata (Rumunija) poznate još sa početka XIX veka

(Rochel, 1828; Schwarzott, 1831), njihov taksonomski položaj je ostao izuzetno kontraverzan

(pregled u Boşcaiu i Boşcaiu, 1999; Šarac, 2016). Naime, u oba izdanja Flore Rumunije

(Beldie, 1952; Ciocârlan, 2000), banatski crni bor je tretiran kao posebna podvrsta crnog bora

(ssp. banatica), dok je u Flori Srbije (Jovanović, 1992) opisan kao varijetet (var. banatica) u

okviru ssp. pallasiana. Takođe, u nešto starijim literaturnim izvorima banatski crni bor je

opisan i kao posebna vrsta (P. banatica, Georgescu, 1936). Sa druge strane, postoji i veliki

broj literaturnih izvora u kojima je ovaj takson tretiran samo kao sinonim ssp. pallasiana

(Gaussen et al., 1964; 1993; Jalas i Suominen, 1973), bez posebnog taksonomskog statusa.

Suprotno ovom gledištu, von Raab-Straube (2014) navodi P. banatica i P. nigra var.

banatica kao sinonime tipske podvrste (ssp. nigra). Na osnovu sastava epikutikularnih

voskova, možemo reći da se populacije banatskog crnog bora iz Rumunije mogu tretirati kao

neki od nižih infraspecijskih taksona crnog bora, ali koji je očigledno bliži ssp. nigra. Prema

tome, naši rezultati su sličniji gledištu von Raab-Straube (2014), u poređenju sa prikazima

ovog kontraverznog taksona u Flori Evrope i Atlasu Flore Evrope (Gaussen et al., 1964;

1993; Jalas i Suominen, 1973).

Grupisanje svih populacija crnog bora sa područja Srbije u jednu grupu, iako su na

osnovu morfoloških karakteristika ove populacije opisane kao tri različita taksona (ssp. nigra,

ssp. pallasiana, var. banatica; Jovanović, 1992), može se objasniti hibridizacijom između

geografski bliskih populacija koje nisu reproduktivno izolovane (Šarac et al., 2016). Takođe,

važno je i napomenuti da područje Srbije predstavlja kontakt zonu istraživanih taksona

odnosno ukjučuje njihove periferne populacije (najjužnije populacije ssp. banatica,

najzapadnije populacije ssp. nigra i najseverniju populaciju ssp. pallasiana) koje su često pod

drugačijim režimom prirodne selekcije i drugih faktora u poređenju sa centralnim

populacijama.


25

4.2. Varijabilnost ugljeničnog preferencijalnog indeksa (CPI) i

prosečne dužine lanca (ACL)

Dva parametra koja se najčešće koriste za opisivanje profila alkana u kutikularnim

voskovima su: ugljenični preferencijalni indeks (CPI - "carbon preference index"), koji

pokazuje odnos zastupljenosti alkana sa neparnim i parnim brojem C atoma i prosečna dužina

lanca (ACL - "average chain lenght"). Rezultati ovih parametara (CPItotal, CPI25-33, CPI25-31 i

ACLtotal) za populaciju Uvac i 9 populacija P. nigra, čiji je hemijski sastav voskova

publikovan u Šarac i sar. (2016), prikazani su u tabeli 4.3.

Ugljenični preferencijalni indeks (CPI). S obzirom da kutikularne voskove

kopnenih biljaka odlikuje snažna dominacija n-alkana sa neparnim brojem C atoma, CPI

vrednosti se najčešće nalaze u opsegu 3-34 (Rommerskirchen et al., 2006; Stojanović et al.,

2003). Prema Oros et al. (1999), CPI vrednosti za n-alkane kod četinara variraju u opsegu od

2.6 kod Sequoia sempervirens do 17.0 kod Tsuga mertensiana. Na osnovu ovoga, generalno

možemo reći da četinare odlikuje relativno visok sadržaj n-alkana sa parnim brojem C atoma

i nešto niže CPI vrednosti (iz prve polovine opsega) u poređenju sa skrivenosemenicama

(Angiospermae). Interesantano je da su u epikutikularnim voskovima najprimitivnijih

golosemenica (Gymnospermae) iz potklase Cycadidae, alkani sa parnim i neparnim brojem C

atoma približno jednako zastupljeni (u pojedinim familijama čak i preovlađuju n-alkani sa

parnim brojem C atoma), što za posledicu ima izuzetno niske CPI vrednosti (0.88-2.70; Vane

et al., 2016) i predstavlja izuzetak među kopnenim biljkama.

Dobijena prosečna vrednost CPItotal (11.7) za 10 ispitivanih populacija P. nigra se

nalazi u okviru opsega koji navodi Oros i sar. (1999) (tabela 4.3). Sa druge strane, znatno se

razlikuje od rezultata publikovanih od strane Bojović i sar. (2012) za manji deo areala P.

nigra (CPItotal = 2.3). Takođe, izuzetno niske vrednosti CPItotal publikovali su i Nikolić sar.

(2012a; 2012b) za n-alkane u epikutikularnim voskovima endemoreliktnih vrsta borova P.

heldreichii i P. peuce (1.6 i 1.9, respektivno). Prema tome CPItotal vrednosti kod P. nigra i P.

heldreichii se značajno razlikuju, iako je reč o dve srodne vrste mediteranskih borova koje su

na osnovu morfoloških, anatomskih i molekularnih dokaza svrstane u isti podrod (Pinus,

Diploxylon) i sekciju (Pinus) (Gernandt, 2005). U ovom radu, vrednosti CPIs su, generalno,

najmanje kod ssp. pallasiana populacija iz Makedonije (Strumica i Kožuf), a najveće kod

ssp. nigra populacija (Orjen, Mileševka i Uvac) (slika 4.6).


26

Tabela 4.3. Varijabilnost ugljeničnog preferencijalnog indeksa (CPI) i srednje dužine lanca C atoma (ACL) u kutikularnim voskovima četina P.

nigra (avg - srednja vrednost, min - minimalna vrednost, max maksimalna vrednost, st.dev - standardna devijacija).

Takson Populacijaa) Copseg Cmax CPItotalb)

avg, min, max, st.dev

CPI25-33c)


CPI25-31d)


ACLtotale)


ssp. banatica Domogled C21-C33 C25 8.1, 0.6, 16.0, 2.9 8.3, 0.5, 11.3, 2.4 8.3, 0.5, 11.4, 2.4 26.5, 25.2, 28.7, 0.8

ssp. banatica Svinjice C21-C33 C27 11.8, 5.8, 18.2, 3.6 10.9, 5.1, 17.6, 3.2 10.9, 5.5, 17.6, 3.2 25.8, 25.1, 26.7, 0.5

ssp. banatica Lazarev kanjon C21-C33 C27 7.3, 4.0, 12.2, 2.2 8.2, 4.6, 13.5, 2.5 8.2, 4.6, 13.5, 2.5 26.1, 25.2, 26.9, 0.5

ssp. banatica Kanjon Jerme C21-C33 C25 13.5, 1.3, 63.9, 14.8 12.3, 1.3, 60.1, 13.4 12.9, 1.3, 60.1, 14.8 26.1, 24.5, 30.1, 1.2

ssp. pallasiana Jarešnik C21-C33 C27 11.3, 4.4, 18.9, 3.6 12.5, 4.7, 26.6, 4.8 12.5, 4.7, 26.6, 4.8 25.6, 24.4, 27.1, 0.6

ssp. pallasiana Kožuf C21-C33 C27 6.1, 1.1, 31.5, 7.7 5.7, 1.1, 21.4, 5.8 5.8, 1.1, 21.4, 5.9 26.4, 24.1, 26.8, 0.6

ssp. pallasiana Strumica C21-C33 C27 3.9, 1.1, 11.2, 3.1 4.1, 1.1, 13.5, 3.4 3.3, 0.8, 11.9, 2.9 26.5, 25.5, 27.6, 0.5

ssp. nigra Uvac C21-C31 C25 14.6, 7.2, 25.6, 5.6 16.9, 8.7, 37.6, 7.6 16.9, 8.7, 37.6, 7.6 25.7, 24.8, 26.4, 0.4

ssp. nigra Mileševka C21-C33 C27 14.7, 7.5, 22.7, 4.2 17.0, 8.5, 30.0, 5.6 17.1, 8.2, 30.0, 5.7 26.3, 25.3, 26.9, 0.4

ssp. nigra Orjen C21-C33 C27 25.8, 10.4, 51.1, 11.1 29.8, 10.2, 48.6, 11.9 29.8,10.2, 48.6. 11.9 25.8, 24.5, 26.3, 0.5

Srednja vrednost C21-C33 C25 i C27 11.7, 0.6, 63.9, 9.1 12.6, 0.5, 60.1, 9.9 12.6, 0.5, 60.1, 10.2 26.1, 24.1, 30.1, 0.7

a) Geografski položaj i stanišne karakteristike populacija su prikazani u Šarac et al. (2016); b) CPItotal = ∑neparan Cn/∑paran Cn (Mazurek i Simoneit, 1984), Cn je koncentracija n-alkana koji sadrži n ugljenikovih atoma; c) CPI25-33 = [∑(C25 – C33)neparan/∑(C24 – C32)paran + ∑(C25 – C33)neparan/∑(C26 – C34)paran]/2 (Bray i Evans, 1961); d) CPI25-31= [∑(C25 – C31)neparan/∑(C24 – C30)paran + ∑(C25 – C31)neparan/∑(C26 – C32)paran]/2 (Bray i Evans, 1961);

e) ACLtotal = (∑Cn x n)/∑Cn (Poynter i Eglington, 1990).


27

Slika 4.6. Varijabilnost ugljeničnog preferencijalnog indeksa (CPI) i prosečne dužine lanca (ACL) u

istraživanim populacijama P. nigra


28

Prema rezultatima ANOVA analize (tabela 4.4) se može videti da sva tri CPIs

(CPItotal, CPI25-33, CPI25-31) poseduju izuzetno visok nivo statističke značajnosti, što ukazuje

da postoji statistički značajna razlika između ispitivanih populacija P. nigra. Na ovaj način,

CPI može imati značajnu ulogu u diferencijaciji istraživanih populacija P. nigra.

Tabela 4.4. Koeficijenti dobijeni ANOVA analizom (nivo statističke značajnosti: ***p<0.001).

Karakteri

CPItotal CPI25-33 CPI25-31 ACLtotal n-C21-24 n-C25-33

F 14.67 21.37 20.23 5.40 3.72 6.18

p *** *** *** *** *** ***

Prosečna dužina lanca (ACL). ACLtotal za n-alkane u voskovima 10 istraživanih

populacija P. nigra iznosi 26.1 (tabela 4.3), i neznanto je veća od rezultata koje su

publikovali Bojović i sar. (2012) za manji deo areala P. nigra (ACLtotal = 25.6). Sa druge

strane, kada uporedimo vrednosti ACLtotal kod P. nigra sa P. heldreichii i P. peuce (Nikolić et

al., 2012a; 2012b), možemo primetiti da ovaj parametar, takođe, ne oslikava njihovu

filogenetsku srodnost. Naime, vrednosti ACLtotal kod P. nigra bliže su P. peuce (ACLtotal =

25.7), vrsti koja pripada podrodu Strobus (Haploxylon), nego P. heldreichii (ACLtotal = 24.4).

Sa druge strane, nešto veće ACL vrednosti su utvrđene su za n-alkane u epikutikularnim

voskovima severnoameričkih borova P. engelmannii, P. montezumae i P. ponderosa (26.8,

27.7 i 29.5, respektivno; Oros et al., 1999).

Rezultati ANOVA analize (tabela 4.4.) pokazali su da postoje statistički značajne

razlike između ispitivanih populacija, iako sa nižom F vrednosti u poređenju sa CPI.

Vrednosti ACLtotal variraju od 25.6 u populaciji Jarešnik (ssp. pallasiana) do 26.5 u

populacijama Domogled (ssp. banatica) i Strumica (ssp. pallasiana) (slika 4.6).


29

4.3. Varijabilnost relativnog odnosa n-alkana srednjeg i dugog

niza

Relativni odnosi n-alkana srednjeg i dugog niza svih ispitivanih populacija P. nigra

pokazuju jasnu dominaciju n-alkana dugog (n-C25-33 = 58.9%) u odnosu na n-alkane srednjeg

niza (n-C21-24 = 17.3%) (tabela 4.5), dok n-alkani kratkog niza (n-C16-20) nisu detektovani u

ovom istraživanju. Sa druge strane, Bojović i sar. (2012) su utvrdili n-alkane kratkog niza (n-

C16-20) u epikutikularnim voskovima P. nigra, iako u najmanjem procentu u poređenju sa n-

alkanima dugog i srednjeg niza. Takođe, najveći procenat n-alkana kratkog niza detektovan je

u voskovima var. gocensis, koji nije ispitivan u ovom radu. Jasna dominacija n-alkana dugog

niza (n-C25-33) je uočena i u epikutikularnim voskovima endemoreliktnih vrsta borova P.

heldreichii i P. peuce (Nikolić et al., 2012a; 2012b).

Najmanji procenat n-alkana srednjeg niza sadrže kutikularni voskovi populacija

Strumica i Kožuf (ssp.

pallasiana) (10.2% i 14.2%,

respektivno), a najveći populacija

Jarešnik (ssp. pallasiana)

(23.9%) i Svinjice (ssp. banatica)

(21.0%).

Najmanji procenat n-

alkana dugog niza sadrže

kutikularni voskovi populacija

Strumica i Kožuf (ssp.

pallasiana) (46.7% i 51.1%,

respektivno), a najveći populacije

Mileševka, Orjen (ssp. nigra)

(67.6% i 65.7%, respektivno) i

Domogled (65.7%) (slika 4.7).

ANOVA (tabela 4.4.) je

pokazala da postoje statistički

značajne razlike između

ispitivanih populacija P. nigra za

Slika 4.7. Varijabilnost relativnog odnosa n-alkana srednjeg

i dugog niza u ispitivanim populacijama P. nigra


30

relativni sadržaj obe grupe n-alkana, ali sa većom F vrednosti za n-alkane dugog niza.

Tabela 4.5. Varijabilnost relativnog odnosa n-alkana kratkog, srednjeg i dugačkog niza u u

epikutikularnim voskovima četina P. nigra (avg - srednja vrednost, min - minimalna vrednost,

max - maksimalna vrednost, st.dev - standardna devijacija).

Takson Populacijaa) Copseg Cmax n-C21-24b)


n-C25-33c)


ssp. banatica Domogled C21-C33 C25 17.1, 6.5, 41.4, 8.7 65.7, 51.9, 84.9, 11.0

ssp. banatica Svinjice C21-C33 C27 21.0, 7.6, 34.9, 8.3 52.7, 31.9, 71.3, 10.9

ssp. banatica Lazarev kanjon C21-C33 C27 18.3, 7.7, 35.8, 7.3 60.6, 38.8, 76.7, 10.6

ssp. banatica Kanjon Jerme C21-C33 C25 19.3, 0.0, 46.5, 11.9 60.3, 37.9, 94.1, 14.5

ssp. pallasiana Jarešnik C21-C33 C27 23.9, 8.4, 46.2, 10.7 54.7, 23.2, 75.5, 14.9

ssp. pallasiana Kožuf C21-C33 C27 14.2, 2.3, 52.8, 10.9 51.1, 13.2, 81.5, 16.9

ssp. pallasiana Strumica C21-C33 C27 10.2, 2.3, 14.8, 3.5 46.7, 21.3, 64.5, 11.0

ssp. nigra Uvac C21-C31 C25 19.6, 6.4, 39.7, 10.4 64.0, 41.6, 91.0, 13.6

ssp. nigra Mileševka C21-C33 C27 14.1, 7.9, 34.9, 8.0 67.6, 55.6, 87.0, 8.9

ssp. nigra Orjen C21-C33 C27 15.4, 3.8, 31.2, 8.5 65.7, 35.4, 83.6, 12.7

Srednja vrednost C21-C33 C25 i C27 17.3, 0.0, 52.8, 9.6 58.9, 13.2, 94.1, 14.1

a) Geografski položaj i stanišne karakteristike populacija su prikazani u Šarac et al. (2016); b) n-C21-24; i c) n-C25-33: Relativni odnosi (%) n-alkana srednjeg i dugog niza, respektivno (Kuhn et al., 2010)


31

5. ZAKLJUČCI __________________________________________________________________________________

1. U epikutikularnim voskovima dvogodišnjih četina P. nigra ssp. nigra iz populacije

Uvac (jugozapadna Srbija) identifikovana su četiri primarna alkohola i 11 n-alkana u

seriji od C21 do C31. Dominante komponente voskova na nivou ispitivane populacije

su četiri n-alkana sa neparnim brojem C atoma: C25, C27, C23 i C29 (26.47%, 22.90%,

14.11%, 10.59%, respektivno). Kao posledica toga sadržaj ukupnih n-alkana je

značajno veći (83.56%) u odnosu na primarne alkohole (2.58%).

2. Vrednosti koeficijenta varijacije, za komponente epikutikularnih voskova P. nigra

ssp. nigra u populaciji Uvac, variraju u opsegu od 21.98% do 387.30%. Međutim,

jako visok i visok nivo koeficijenta varijacije pokazuju samo komponente koje su

detektovane u tragovima (x<1.5%), dok sve ostale komponente voskova pokazuju

umeren nivo koeficijenta varijacije (osim n-alkana C23). Generalno, možemo reći da je

ovakav rezultat u potpunosti i očekivan, s obzirom da su analizirane jedinke iz samo

jedne populacije crnog bora.

3. Za CDA analizu korišćene su sve identifikovane komponente epikutikularnih voskova

u populaciji Uvac (ssp. nigra) i prethodno publikovani rezultati za 9 populacija P.

nigra (ssp. banatica, ssp. nigra i ssp. pallasiana) sa područja Južnih Karpata i

centralnog Balkana; Šarac et al., 2016). Scatterplot, dobijen na osnovu CDA, pokazao

je tendeciju formiranje tri grupe populacija: prva kanonijska osa (CA1), koja

objašnjava najveći procenat diskriminacije (42.8%), izdvojila je makedonske

populacije ssp. pallasiana od preostalih ispitivanih populacija, dok je druga

kanonijska osa (CA2), koja učestvuje u manjem procentu diskriminacije (19.4%)

izdvojila rumunske populacije ssp. banatica od populacija crnog bora iz Srbije

(determinisanim kao tri različite podvrste ssp. nigra, ssp. banatica i ssp. pallasiana) i

i Bosne i Hercegovine (ssp. nigra). Iako se jedinke iz populacije Uvac očigledno

grupišu zajedno sa ostalim populacijama P. nigra iz Srbije, može se primetiti blaga

tendencija njihovog izdvajanja i približavnja grupi ssp. banatica iz Rumunije. Kao

posledica toga, gubi se pravilna klinalna diferncijacija populacija P. nigra u pravcu

sever-jug (Šarac i sar., 2016), ali i pored toga možemo reći da najjužnije


32

(makedonske) i najsevernije (rumunske) populacije zadržavaju svoj distinktan položaj

u odnosu na populacije crnog bora iz Srbije.

4. Klaster analiza (CA) ukazala je na grupisanje analiziranih populacija crnog bora na

sličan način kao i CDA: najmanji procenat sličnosti dele makedonske populacije ssp.

pallasiana sa ostalim ispitivanim populacijama. Međutim u okviru druge grupe,

populacije ssp. banatica iz Rumunije izdvajaju se u poseban klaster u odnosu na P.

nigra populacije iz Srbije i Bosne i Hercegovine. Na osnovu ovakvih rezultata,

možemo reći da se populacije banatskog crnog bora iz Rumunije mogu tretirati kao

neki od nižih infraspecijskih taksona crnog bora, ali koji je očigledno bliži tipskoj

podvrsti (ssp. nigra).

5. Grupisanje svih populacija crnog bora sa područja Srbije u jednu grupu, iako su na

osnovu morfoloških karakteristika ove populacije opisane kao tri različita taksona

(ssp. nigra, ssp. pallasiana, var. banatica), može se objasniti hibridizacijom između

geografski bliskih populacija koje nisu reproduktivno izolovane. Takođe, važno je i

napomenuti da područje Srbije predstavlja kontakt zonu istraživanih taksona odnosno

ukjučuje njihove periferne populacije (najjužnije populacije ssp. banatica,

najzapadnije populacije ssp. nigra i najseverozapadniju populaciju ssp. pallasiana)

koje su često pod drugačijim režimom prirodne selekcije i drugih faktora u poređenju

sa centralnim populacijama.

6. Dobijena prosečna vrednost CPItotal (11.7) za 10 ispitivanih populacija P. nigra se

nalazi u okviru opsega za četinare koji navodi Oros i sar. (1999). Sa druge strane,

znatno se razlikuje od rezultata publikovanih od strane Bojović i sar. (2012) za manji

deo areala P. nigra (CPItotal = 2.3). Takođe, CPItotal vrednosti kod P. nigra i P.

heldreichii se značajno razlikuju, iako je reč o dve srodne vrste mediteranskih borova

koje su na osnovu morfoloških, anatomskih i molekularnih dokaza svrstane u isti

podrod (Pinus, Diploxylon) i sekciju (Pinus). U ovom radu, vrednosti CPIs su,

generalno, najmanje kod ssp. pallasiana populacija iz Makedonije (Strumica i Kožuf),

a najveće kod ssp. nigra populacija (Orjen, Mileševka i Uvac). Prema rezultatima

ANOVA se može videti da sva tri CPIs poseduju izuzetno visok nivo statističke

značajnosti, što ukazuje da postoji statistički značajna razlika između ispitivanih

populacija P. nigra.


33

7. ACLtotal za n-alkane u epikutikularnim voskovima 10 istraživanih populacija P. nigra

iznosi 26.1, i neznanto je veća od rezultata koje su publikovali Bojović i sar. (2012;

prosečna ACLtotal = 25.6). Rezultati ANOVA analize pokazali su da postoje statistički

značajne razlike između ispitivanih populacija, iako sa nižom F vrednosti u poređenju

sa CPI. Vrednosti ACLtotal variraju od 25.6 u populaciji Jarešnik (ssp. pallasiana) do

26.5 u populacijama Domogled (ssp. banatica) i Strumica (ssp. pallasiana) (slika

4.3).

8. Relativni odnosi n-alkana srednjeg i dugog niza svih ispitivanih populacija P. nigra

pokazuju jasnu dominaciju n-alkana dugog (n-C25-33 = 58.9%) u odnosu na n-alkane

srednjeg niza (n-C21-24 = 17.3%), dok n-alkani kraktkog niza (n-C16-20) nisu

detektovani. ANOVA je pokazala da postoje statistički značajne razlike između

ispitivanih populacija P. nigra za relativni sadržaj obe grupe n-alkana, ali sa većom F

vrednosti za n-alkane dugog niza.


34

6. LITERATURA __________________________________________________________________________________

Adams R. P. 2007. Identification of Essential Oil Component by Gas

Chromatography/Quadrupole Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation,

Carol Stream, IL.

Barnes J. D., Percy K. E., Paul N. D., Jones P., McLaughlin C. K., Mullineaux P. M.,

Creissen G., Wellburn A. R. 1996. The influence of UV–B radiation on the

physicochemical nature of tabacco (Nicotiana tabacum L.) leaf surfaces. J. Exp. Bot.

47, 99–109.

Barthlott W., Neinhaus C. 1997. Purity of the sacred lotus or escape from contamination in

biological surfaces. Planta 202, 1–8.

Barthlott W., Neinhuis C., Cutler D., Ditsch F., Meusel I., Theisen I., Wilhelmi H. 1998.

Classification and terminology of plant epicuticular waxes. Bot. J. Linn. Soc. 126,

237–260.

Beldie A. 1952. Genul Pinus L.. In: Săvulescu T., editor. Flora Republicii Române 1.

Academiei R. P. R., Bucureşti, pp. 168-176.

Bojović S., Mitrović S. 2010. Biostatistika. – Institut za šumarstvo, Beograd.

Bojović S., Šarac Z., Nikolić B., Tešević V., Todosijević M., Veljić M., Marin P. D. 2012.

Composition of n-alkanes in natural populations of Pinus nigra from Serbia –

chemotaxonomic implications. Chem. Biodiversity 9, 2761-2774.

Boşcaiu N., Boşcaiu M. 1999. On the presence of Pinus nigra subsp. pallasiana in Romania.

Wiss. Mitt. Niederösterr. Landesmuseum 12, 21-24.

Bray E. E., Evans E. D. 1961. Distribution of n-paraffins as a clue to recognition of source

beds. Geochim. Cosmochim. Acta 22, 2-15.

Chase M. W., Reveal J. L. 2009. A phylogenetic classification of the land plants to

accompany APG III. Bot J Linn Soc 161, 122–127.

Ciocârlan V. 2000. Flora ilustrată a României. Pteridophyta et Spermatophyta. Editura Ceres,

Bucureşti.


35

Delevoy G. 1949. A propos de la systématique de Pinus nigra Arnold. Stn. Rech. Groenendal

Trav. Ser. B, 12-41.

Eigenbrode S. D., Espelie K. E. 1995. Effects of plant epicuticular lipids on insect herbivores.

Annu. Rev. Entomol. 40, 171–194.

Ensikat H. J., Boese M., Mader W., Barthlott W., Koch K. 2006. Crystallinity of plant

epicuticular waxes: electron and X-ray diffraction studies. Chem. Phys. Lipids 144,

45-59.

Farr T. G., Rosen P. A., Caro E., Crippen R., Duren R., Hensley S., Kobrick M., Paller M.,

Rodriguez E., Roth L., Seal D., Shaffer S., Shimada J., Umland J., Werner M.,Oskin

M., Burbank D., Alsdorf D. 2007. The shuttle radar topography mission. Rev.

Geophys. 45, RG2004. 10.1029/2005RG000183.

Fukarek P. 1958. Prilog poznavanju crnog bora. Poljoprivredno-šumarski fakultet, Sarajevo

3, 3-92.

Gaussen H., Heywood V. H., Charter A. O. 1964. Pinus L.. In: Tutin T. G., Heywood V. H.,

Burges N. A., Valentine D. H., Walters S. M., Webb B. A., editors. Flora Europea.

Vol. 1, 1st edn. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 33-34.

Gaussen H., Heywood V. H., Charter A. O. 1993. Pinus L.. In: Tutin T. G., Heywood V. H.,

Burges N. A., Valentine D. H., Walters S. M., Webb B. A., editors. Flora Europea.

Vol. 1, 2nd edn. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 40-44.

Georgescu C. C. 1936. Neue Beiträge zur Systematik der Schwarzföhre. Feddes Repert 41,

181-188.

Gernandt D. S., Geada López G., Ortiz García S., Liston A. 2005. Phylogeny and

classification of Pinus. Taxon 54, 29-42.

Jalas J., Suominen J. 1973. Atlas Florae Europaeae. 2 Gymnospermae (Pinaceae to

Ephedraceae). Helsinki.

Jeffree C. E. 1996. Structure and ontogeny of plant cuticles. In: Kerstiens G., editor. Plant

cuticles. An integrated approach. BIOS Scientific, Oxford, pp. 33–82.

Jeffree C. E. 2006. The fine structure of the plant cuticle. In: Riederer M., Müller C., editors.

Biology of the plant cuticle. Vol. 23. Blackwell, Oxford, pp. 11–144.


36

Jenks M. A., Joly R. J., Peters P. J., Rich P. J., Axtell J. D., Ashworth E. N. 1994. Chemically

induced cuticle mutation affecting epidermal conductance to water vapor and disease

susceptibility in Sorghum bicolor (L.) Moench. Plant Physiol. 105, 1239–1245.

Jetter R., Kunst L., Samuels A. L. 2007. Compostion of plant cuticular waxes. In: Rieder M.,

Müler C., editors. Biology of the plant cuticle. Vol. 23. Blackwell, Oxford, pp. 145-

181.

Jetter R., Riederer M. 1994. Epicuticular crystals of nonacosan-10-ol: in vitro reconstitution

and factors influencing crystal habits. Planta 195, 25-270.

Jovanović B. 1992. P. nigra Arn. In: Sarić M, editor. Flora Srbije 1. Srpska akademija nauka

i umetnosti, Beograd, pp. 200-202.

Kerstiens G. 1996. Signalling across the divide: a wider perspective of cuticular structure –

function relationships. Trends Plant Sci. 1, 125–129.

Koch K., Bhushan B., Barthlott W. 2008. Diversity of structure, morphology and wetting of

plant surfaces. Soft Matter 4, 1943-1963.

Kuhn T. K., Krull E. S., Bowater A., Grice K., Gleixner G. 2010. The occurrence of short

chain n-alkanes with an even over odd predominance in higher plants and soils. Org.

Geochem. 41, 88-95.

Maffei M. 1996. Chemotaxonomic significance of leaf wax n-alkanes in the Umbelliferae,

Cruciferae and Leguminosae (Subf. Papilionoideae). Biochem. Syst. Ecol. 24, 531-

545.

Maffei M., Badino S., Rossi S. 2004. Chemotaxonomic significance of leaf wax n-alkanes in

the Pinales (Coniferales). J. Biol. Res. 1, 3-19.

Marin P. D. 2003. Biohemijska i molekularna sistematika biljaka. NNK international,

Beograd.

Nikolić B. 2008. Varijabilnost sastava terpena i alkana u četinama omorike (Picea

omorica/Panč./Purkynĕ), munike (Pinus heldreichii Christ.) i molike (Pinus peuce

Griseb.). Doktorska disertacija. Biološki fakultet, Beograd.

Nikolić B., Tešević V., Đorđević I., Todosijević M., Jadranin M., Bojović S., Marin P. D.

2012a. Chemodiversity of nonacosan-10-ol and n-alkanes in the needle wax of Pinus

heldreichii. Chem. Biodiversity 9, 80-90.


37


2012b. Population variability of nonacosan-10-ol and n-alkanes in needle cuticular

waxes of Macedonian pine (Pinus peuce Griseb.). Chem. Biodiversity 9, 1155-1165.


2013a. Variability of n-alkanes and nonacosan-10-ol in natural populations of Picea

omorika. Chem. Biodiversity 10, 473-483.

Oros D. R., Standley L. J., Chen X., Simoneit B. R. T. 1999. Epicuticular wax compositions

of predominant conifers of western north America. Z. Naturforsch. 54, 117-124.

Poynter J., Eglington G. 1990. Molecular composition of three sediments from hole 717C:

the Bengal fan. In: Cochran J. R., Stow D. A. V., editors. Proceedings of the Ocean

Drilling Program, Scientific Results Distal Bengal Fan. Vol. 116. College Station, A

& M University, Texas, pp. 155–161.

Quinn G. P., Keough M. J. 2002. Experimental Design and Data Analysis for Biologists.

Cambridge Univ. Press., Cambridge.

Rajčević N., Janaćković P., Dodoš T., Tešević V., Marin P. D. 2014. Biogeographic variation

of foliar n-alkanes of Juniperus communis var. saxatilis Pallas from the Balkans.

Chem. Biodiversity 11, 1923-1938.

Rajevski L. 1950. Nalazište Pinus nigra Arn. var. pallasiana (Lamb.) u okolini Bosilegrada.

Zbornik radova Instituta za ekologiju i biogeografiju, Srpska Akademija Nauka i

Umetnosti, Beograd.

Reicosky D. A., Hanover J. W. 1978. Physiological effects of surface waxes. Light

reflectance for glaucos and nonglaucos Picea pungens. Plant Physiol. 62, 101-104.

Reuter H. I., Nelson A., Jarvis, A. 2007. An evaluation of void filling interpolation methods

for SRTM data. Int. J. Geogr. Inf. Sci. 21, 983-1008.

Rochel A. 1828. Plantae Banatus rariores iconibus et descriptionibus illustratile. Pestini: L.

Landerer de Füskut.

Rommerskirchen F., Plader A., Eglinton G., Chikaraishi Y., Rullkötter J. 2006.

Chemotaxonomic significance of distribution and stable carbon isotopic composition

of long-chain alkanes and alkan-1-ols in C4 grass waxes. Org. Geochem. 37, 1303-

1332.


38

Samuels A. L., Kunst L., Jetter R. 2008. Sealing plant surfaces: cuticular wax formation by

epidermal cells. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 683-707.

Schwarz O. 1938. Über die Systematic und Nomenklatur der europaischen Schwarzkiefern.

Notizbl. Bot. Gart. Berlin-Dahlem XIII, 117, 226-243.

Schwarzott J. C. 1831. Die Hercules Bäder bei Mehadia. – Wien

Stefanovic S., Jager M., Deutsch J., Broutin J., Masselot M. 1998. Phylogenetic relationships

of conifers inferred from partial 28S rRNA gene sequences. Am. J. Bot. 85, 688-697.

Stojanović G., Palić R., Tarr C. H., Reddy C. M., Marinkovic O. 2003. n-Alkanes and fatty

acids of Hypericum perforatum, Hypericum maculatum and Hypericum olympicum.

Biochem. Syst. Ecol. 31, 223-226.

Svoboda P. 1953. Lesni dreviny a jejich porosti. Cast I, Praha (Czech Republic).

Šarac Z. 2014. Utvrđivanje varijabilnosti i diferencijacije prirodnih populacija Pinus nigra

Arnold u Srbiji korišćenjem fitohemijskih i molekularnih markera. Doktorska

disertacija. Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu.

Šarac Z., Bojović S., Nikolić B., Tešević V., Đorđević I., Marin P. D. 2013.

Chemotaxonomic significance of the terpene composition in natural populations of

Pinus nigra J. F. Arnold from Serbia. Chem. Biodiversity 10, 1507-1520.

Šarac Z., Dodoš T., Rajčević N., Bojović S., Marin P. D., Aleksić J. M. 2015. Genetic

patterns in Pinus nigra from the central Balkans inferred from plastid and

mitochondrial data. Silva Fenn. 49, no. 5 article id 1415. 12 p.

Šarac Z., Zlatković B., Jovanović S., Stojanović G., Marin P. D. 2016. Geographically-

related variation in epicuticular wax traits of Pinus nigra populations from Southern

Carpathians and Central Balkans – taxonomic considerations. Chem. Biodiversity (in

press).

Van den Dool H., Kratz P. D. 1963. A generalization of the retention index system including

linear temperature programmed gasliquid partition chromatography. J. Chromatogr.

A, 11, 463-471.

Vane C. H.; Kim A. W., Cave M. R., Li N. 2014. Equal abundance of odd and even n-alkanes

from cycad leaves: can the carbon preference index (CPI) faithfully record terrestrial

organic matter input at low latitudes? Encephalartos (118).


39

Vidaković M. 1955. Značenje anatomske građe iglica kod svojta crnog bora u Jugoslaviji.

Šumarski list, Zagreb 79, 244-253.

Vidaković M. 1957. Oblici crnog bora u Jugoslaviji na temelju anatomije iglica. Glasn. za

šumske pokuse, Zagreb 13, 111-248.

Vidaković M. 1982. Četinjače. Morfologija i varijabilnost. JAZU i Sveučilišna naklada Liber,

Zagreb.

von Raab-Straube E. 2014. Gymnospermae in: Euro+Med Plantbase - the information

resource for Euro-Mediterranean plant diversity. http://ww2.bgbm.org/EuroPlusMed/.

Zlatković B., Šarac Z. 2016. Praktikum iz sistematike biljaka. Prirodno-matematički fakultet,

Univerzitet u Nišu.

Прилог5/1

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Сања Тодоровић

Ментор, МН: Зорица С. Митић

Наслов рада, НР: Хемотаксономска карактеризација Pinus nigra Arnold из

југозападне Србије – ниво епикутикуларних воскова Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2016.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

39 страна; 12 слика; 6 табела

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Ботаника

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Pinus nigra, епикутикуларни воскови, n-алкани, CPI, ACL,

hemotaksonomija УДК 582.475 : 581.573(1-14)(497.17)

Чува се, ЧУ: Библиотека Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: У раду је анализиран хемијски састав епикутикуларних

воскова четина из једне аутохтоне популације Pinus nigra

Arnold ssp. nigra са подручја југозападне Србије (Увац).

Комбинацијом GC и GC/МС анализе идентификована су

четири примарна алкохола и 11 n-алкана у серији од C21 до

C31. Мултиваријационе статистичке анализе (CDA и CA)

показале су да, иако се јединке из популације Увац групишу

заједно са осталим популацијама P. nigra из Србије и Босне и

Херцеговине, може се приметити блага тенденција њиховог

издвајања и приближавња групи румунских популација. CPI за

n-алкане у восковима 10 популација P. nigra варира од 3.9 до

25.8 (у просеку 11.7), док се ACL налази у опсегу од 25.6 до

26.5 (у просеку 26.1). Релативни односи n-алкана средњег и

дугог низа показују јасну доминацију n-алкана дугог низа (n-

C25-33 = 58.9%).

Датум прихватања теме, ДП: 18.05.2016.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Др Бојан Златковић

Члан: Др Владимир Ранђеловић

Члан, ментор: Др Зорица С. Митић

Образац Q4.09.13- Издање 1

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

ОбразацQ4.09.13- Издање 1

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Sanja Todorović

Mentor, MN: Zorica S. Mitić

Title, TI: Chemotaxonomic characterisation of Pinus nigra Arnold from

southwestern Serbia - the level of epicuticular waxes

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2016

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

39 p.; 12 pictures; 6 tables

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Botany

Subject/Key words, S/KW: Pinus nigra, epicuticular waxes, n-alkanes, CPI, ACL,

chemotaxonomy UC 582.475 : 581.573(1-14)(497.17) Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: This paper analyzes the chemical composition of epicuticular waxes

of two-year old needles originating from one native population of

Pinus nigra Arnold ssp. nigra from southwestern Serbia (Uvac).

Multivariate statistical analyses (CDA and CA) have showed that,

even as individuals from the Uvac population are grouped together

with other P. nigra populations from Serbia and Bosnia and

Herzegovina, a slight tendency for their separation and convergence

to the group ssp. banatica from Romania may be noticed. The carbon

preference index (CPItotal) for the n-alkanes in the waxes of ten

populations of P. nigra varied from 3.9 to 25.8 (average of 11.7),

while the average chain length (ACLtotal) ranged from 25.6 to 26.5

(average of 26.1). Relative ratios of n-alkanes of the medium- and

long-chain indicate clear dominance of the n-alkanes of the long-

chain group (n-C25-33 = 58.9%). Accepted by the Scientific Board on, ASB: 18.05.2016. Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Dr. Bojan Zlatković Member: Dr. Vladimir Ranđelović

Member, Mentor: Dr. Zorica S. Mitić

master rad - pmf.ni.ac.rs · su 5-7.5 cm dugi, i 2-3.5 (4) cm široki, skoro sedeći, smešteni pri...

Documents