Maximal Methodisch - das Methodenseminar

MAXIMAL METHODISCH

im INTRAnet:

tmikpoh.charite.de/methods

DNA-Sequenzierung

MAXIMAL METHODISCH

Das Methodenseminar25.07.2005 Lena Wronski

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Methoden

Kettenabbruchmethode nach Sanger

Maxam-Gilbert-Methode

Sequenzierung durch Hybridisierung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Methoden

Kettenabbruchmethode nach Sanger

Maxam-Gilbert-Methode

Sequenzierung durch Hybridisierung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Prinzip

enzymatische Neusynthese von DNA

Analyse der neusynthetisierten DNA

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Prinzips des Kettenabruchs

Bausteine der DNA-Neusynthese:

dNTPs (N= A, C, G oder T)

Sequenzreaktion: ddNTPS im Reaktionsmix

bei Einbau keine Verlängerung durch Polymerase Kettenabbruch

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

ddNTPs

Didesoxyribunukleosidiphopsphate

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Markierung des Abbruchpunktes

Markierung des Primers

Markierung der ddNTPs• radioaktiv• mit Fluoreszenzfarbstoffen

(DyeTerminatoren)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Vorteile der DyeTerminatoren

• One-Tube Reaktionen

• keine Termination sites

• keine markierten Primer nötig

• Verhältnis dNTPs/ddNTPs bestimmt

Sequenzlänge

• direkte Sequenzierung von PCR-

Produkten möglich

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Auftrennung der entstandenen Fragmente durch Gelelektrophorese

Kleine DNA-Fragmente laufen schnell, größere bleiben zurück

Vorteil der Laserdetektion:Endpunktdetektiongrößere Fragmente können noch unterschieden werdenlesbare Sequenzlänge nimmt zu

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Ablauf

• DNA-Präparation

• (PCR)

• Aufreinigung des Produkts

• Sequenzreaktion

• Aufreinigung

• Sequenzierung

• Datenauswertung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

DNA-Präparation

• Qualität WICHTIG– unbedingt Kit-Protokollen folgen

• Quantität WICHTIG– Photometer– Gelabschätzung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Aufreinigung von PCR-Produkten

Abtrennung von überschüssigen Primern,

dNTPs, Salzen

• Gelsäulen (z.b.QiaQuick PCR-Purification Kit)• Verdau mit SAP und Exo1• Gelelution• Fällung: 4M Ammoniumacetat• Filtermembran (Centricon, Microcon)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Sequenzierprimer

• 22-24mer• Bindungsstelle ca 50bp vor der

eigentl.Sequenz• Basenzusammensetzung ausgewogen• G/C-Gehalt ~50%• 3‘Ende: G oder C• Tm >50°C• evtl PCR-Primer übernehmen?

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Möglichst vermeiden:

• Primer-Dimere

• Sekundäre Bindungsstellen

• Sekundärstrukturen

• Repeats

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Template-MengeTemplate Erforderliche MengePCR-Produkt

100-200bp

200-500bp

500-1000bp

1000-2000bp

>2000bp

1-3ng

3-10ng

5-20ng

10-40ng

40-100ng

Einzelstrang-DNA 50-100ng

Doppelstrang-DNA 200-500ng

große DNA(BACs, PACs, Cosmide etc)

0,1-1,0ug

Bakterien-DNA 2-3ug

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Reaktionsansatz Sequenzier-PCR

Reagenz Konzentration Volumen

Reaktionsmix 2,5x 4ul

Puffer 5X 2ul

Primer - 3,2pmol

Template - s.Templatemenge

Wasser - ad 20ul

Endvolumen 20ul

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Aufreinigung nach Sequenzierreakton

• Spin Column/PlateZeit zwischen Herstellung und Verwendung?

Ladevolumen?

Zentrifuge, Parameter?

• FällungTemperatur?

Zentrifugation?

Mischen?

Ethanolreste vermeiden!

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Auswertung

• DNA-Star, Sequence Analysis

• Sequencher

• Freeware: CHROMAS (http://www.technelysium.com.au/chromas.html)

AbiView

(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/software/abiview/abiview.html

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Gute Daten

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Basecalling

Algorithmus zur „Filterung der Rohdaten“

Achtung!

Basecaller und DyeSet müssen zusammenpassen!

Dyeset richtet sich nach Art des DyeTerminator Mix!

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Chromatogramm

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Annotations

• Anmerkungen des Analyseprogramms zu

Signalstärke,

Lauflänge

Spacing (Abstand der einzelnen Signale)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Troublesdie häufigsten Phänomene

DNA Template-Menge zu viel zu wenig

Template-Qualität Kontaminationen Inhibitoren Salze

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Troubles die häufigsten Phänomene

Primerqualität

Restprimer

Primer-Dimere

Qualität (Alter? wie oft schon verwendet? Wie oft

aufgetaut/eingefroren?)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

TroubleshootingParameter zur Problemerkennung

ChromatogrammSignalbild

Hintergrund (Rauschen

Reichweite

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

TroubleshootingParameter zur Problemerkennung

Rohdaten

Intensitäten

unspezifische Signale

Annotations

relative Signalstärke

Spacing

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Zur Erinnerung – so sehen gute Rohdaten aus

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Sequenzreaktion fehlgeschlagen

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Zu viel Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Zu viel Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Zu wenig Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Gemischte Sequenzen

-mehrere Templates im Ansatz

-mehrfache Primerbindungsstellen

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Kontamination durch mangelhafte Aufreinigung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Mangelnde Aufreinigung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Rascher Signalverlust

GC-/GT-reiche Regionen, Sekundärstrukturen vorhanden

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Dye Blobs

zu wenig Template/Kontaminationen, die Dye-Klumpen bilden

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

Slippage/“Abrutschen“

Sequenz enthält Repeats, Polymerase „rutscht aus“

Maximal Methodisch - das Methodenseminar