METHODS AND PITFALLS IN METHODS AND PITFALLS IN THE MEASUREMENT OF ANTI-THE MEASUREMENT OF ANTI-

ACTIN ANTIBODIES IN ACTIN ANTIBODIES IN COELIAC DISEASECOELIAC DISEASE

METHODS AND PITFALLS IN METHODS AND PITFALLS IN THE MEASUREMENT OF ANTI-THE MEASUREMENT OF ANTI-

ACTIN ANTIBODIES IN ACTIN ANTIBODIES IN COELIAC DISEASECOELIAC DISEASE

Fabbro Elisa, dottoranda primo anno Laboratorio Clinica Pediatrica

Anticorpi Anti Anticorpi Anti ActinaActina::nuovi marker sierologici nella nuovi marker sierologici nella

celiachiaceliachia

• In letteratura sono stati riscontrati differenti In letteratura sono stati riscontrati differenti valori di sensibilità (82-25%) nella ricerca degli valori di sensibilità (82-25%) nella ricerca degli Anti-Actina (A.A.A.); mentre la specifcità ha Anti-Actina (A.A.A.); mentre la specifcità ha ottenuto valori prossimi al 100%.ottenuto valori prossimi al 100%. ((Am. Am. J .Gastroenterol .2004;99:1551. J .Gastroenterol .2004;99:1551. Clin.Exp .Immunol 2004;137: 386).Clin.Exp .Immunol 2004;137: 386).

• La valutazione retrospettiva degli A.A.A. in sieri La valutazione retrospettiva degli A.A.A. in sieri conservati a -20conservati a -20°C °C ha prodotto valori di ha prodotto valori di sensibilità pari al 43 %.sensibilità pari al 43 %.

• Gli A.A.A. hanno mostrato una significativa Gli A.A.A. hanno mostrato una significativa correlazione con la lesione istologica della correlazione con la lesione istologica della mucosa intestinale.mucosa intestinale.

Obbiettivi:Obbiettivi:

• Allestire una metodica di “Allestire una metodica di “immunofluorescenza immunofluorescenza indiretta” indiretta” per dosare gli A.A.A. al fine di misurare la per dosare gli A.A.A. al fine di misurare la loro sensibilità e specificità, loro sensibilità e specificità, indipendentemente indipendentemente dalla durata di conservazione dei campioni.dalla durata di conservazione dei campioni.

• Misurare la riproducibilità di questo testMisurare la riproducibilità di questo testdi “immunofluorescenza indiretto”di “immunofluorescenza indiretto” mediante mediante confronto dei risultati tra più operatori.confronto dei risultati tra più operatori.

• Verificare il ruolo di fattori sierici Verificare il ruolo di fattori sierici (Actin Binding Protein) leganti leganti l’ Actinal’ Actina, nell’inibizione del legame , nell’inibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo.tra la proteina e il suo anticorpo.

• Realizzare un test immuno-enzimatico su fase solida Realizzare un test immuno-enzimatico su fase solida (ELISA) basato sull’ antigene (ELISA) basato sull’ antigene actinaactina polimero polimero

La famiglia delle La famiglia delle ““Actin Binding Proteins”Actin Binding Proteins” (ABP) è (ABP) è molto eterogenea e comprende proteine in grado molto eterogenea e comprende proteine in grado di legare e di modificare la struttura molecolare di legare e di modificare la struttura molecolare

dell’dell’Actina.Actina.

• GelsolinGelsolinaa

• CofilinaCofilina

E’ possibile che tali molecole sieriche sequestrino E’ possibile che tali molecole sieriche sequestrino l’Actinal’Actina al legame con anticorpi specifci, inducendo al legame con anticorpi specifci, inducendo

risultati falsamenterisultati falsamente negativi•negativi•

Materiali e metodiMateriali e metodiCeliaci diagnosticati tra il Celiaci diagnosticati tra il 2000 e il 20042000 e il 2004 : :102 (12 con lesione 102 (12 con lesione istologica 3a, 40 con lesione istologica 3a, 40 con lesione di tipo3b ,48 con lesione 3c);di tipo3b ,48 con lesione 3c);età media : 20 aa;età media : 20 aa;sesso: 57 femmine, 45 sesso: 57 femmine, 45 maschi;maschi;Controlli : 103 donatori di Controlli : 103 donatori di sangue e 76 soggetti malati.sangue e 76 soggetti malati.

I.I. Allestimento di vetrini Allestimento di vetrini attivati con cellule attivati con cellule “Hep2”“Hep2”

II.II. Trattamento Trattamento fisico-chimico fisico-chimico dei dei sieri per migliorare la sieri per migliorare la sensibilità diagnostica del sensibilità diagnostica del test degli A.A.A.test degli A.A.A.

III.III. Lettura al microscopio a Lettura al microscopio a fluorescenzafluorescenza

1) 1) Risultato:Risultato:

Pz Pz celiaci:celiaci:

№ № =102 =102

ControlliControlli

sani: sani:

№ № =103=103

ControlliControlli

malati:malati:

№ № =76=76

% Positivi% Positivi

Sieri nonSieri non

trattatitrattati48 % 48 %

(№ :49)(№ :49)14,6 %14,6 %

(№:15)(№:15)18,4 %18,4 %

(№:14)(№:14)

Sieri Sieri RiscaldatiRiscaldati

82,4 % 82,4 % (№:84)(№:84)

24,3 %24,3 %

(№:25)(№:25)48,7 %48,7 %

(№:37)(№:37)

Sieri con Sieri con E.D.T.A.E.D.T.A.

76,5 % 76,5 % (№:78)(№:78)

13,5 %13,5 %

(№:14)(№:14)29 %29 %

(№:22)(№:22)

Positività degli A.A.A. nei gruppi di studio e nei tre differenti Positività degli A.A.A. nei gruppi di studio e nei tre differenti metodi di trattamento dei campioni.metodi di trattamento dei campioni.

1 2

3 IgA anti-actina su cellule “Hep2.” Le tre foto (x40) illustrano la reattività di un siero di celiaco (lesione istologica 3b): 1 siero non trattato; 2 siero eriscaldato; 3 siero in EDTA.La positività del test è evidente nei fotogrammi 2-3, mentre risulta essere poco visibile (freccia) nella foto 1. Il pretrattamento del siero con il riscaldamento o con l’EDTA facilita notevolmente l’osservazione al microscopio e rende il test più sensibile.

correlazione tra positività degli A.A.A.correlazione tra positività degli A.A.A.

(sieri riscaldati) e grado di lesione istologica.(sieri riscaldati) e grado di lesione istologica.

LesioneLesione№№

campioncampionii

№№

PositivPositivii

%%

POSITIVI POSITIVI

1212 88 66,7%66,7%

4040 3131 77,5%77,5%

4848 4444 91,7%91,7%

2) Risultato2) Risultato

sensibilità

NT R E0.450.500.550.600.650.700.750.800.850.900.95

specificità

trattamento

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

0.75

0.80

0.85

NT R E

Riproducibilità degli A.A.A.: i risultati di tre operatori

Riproducibilità degli A.A.A.:confronto della lettura tra più

operatoriMetodica Metodica

del del trattamentotrattamento

KappaKappa Forza di Forza di agreemenagreement Landis-t Landis-

KochKoch

RiproduRiproducibilitàcibilità

FleissFleiss

Non trattatoNon trattato 0,590,59 ModerataModerata BuonaBuona

RiscaldatoRiscaldato O,61O,61 SostanzialSostanzialee

BuonaBuona

E.D.T.A.E.D.T.A. 0,640,64 SostanzialSostanzialee

BuonaBuona

KappaKappa Forza della Forza della concordanzaconcordanza

< 0,00 < 0,00 PoveraPovera

0,00 – 0,0200,00 – 0,020 LieveLieve

0,21- 0,400,21- 0,40 DiscretaDiscreta

O,41-0,60O,41-0,60 ModerataModerata

0,61-0,800,61-0,80 SostanzialeSostanziale

0,81-10,81-1 Quasi perfettaQuasi perfetta

KappaKappa RiproducibilitàRiproducibilità

>0,75>0,75 EccellenteEccellente

0,40-0,740,40-0,74 BuonaBuona

0,00-0,0390,00-0,039 MarginaleMarginale

Tab. 1: griglia di valutazione di Landis-Koch

Tab. 2: griglia di valutazione di Fleiss

Attività inibitoria degli Attività inibitoria degli ABPABP

Molecole sieriche che mascherano il legame degli A.A.A. alla proteina

Sequenza del test d’inibizione:Sequenza del test d’inibizione:1. Preincubazione delle cellule 1. Preincubazione delle cellule

con pool di sieri A.A.A. con pool di sieri A.A.A. negativi.negativi.

2. Incubazione con siero di 2. Incubazione con siero di celiaco positivo agli A.A.A. celiaco positivo agli A.A.A.

Attività inibitoria di fattori sierici (Attività inibitoria di fattori sierici (ABP ABP ?) ?) presenti nel siero di soggetti A.A.A. presenti nel siero di soggetti A.A.A.

negativi:negativi:

L’attività inibitoria del pool A.A.A. negativo viene abolita dalla preincubazione con dosi crescenti di actina monomerica (5-10-15-20 μg/ml)

Verificare il ruolo degli Verificare il ruolo degli (ABP) nell’inibizione del legame tra la proteina nell’inibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo.e il suo anticorpo.

Prove di localizzazione 1):incubazione incubazione delle cellule con il solo pool di sieri sani delle cellule con il solo pool di sieri sani

A.A.A. negativiA.A.A. negativi

Prove di localizzazione 2): preincubazione di un preincubazione di un pool di sieri A.A.A. negativi + 2 anticorpo: anti pool di sieri A.A.A. negativi + 2 anticorpo: anti

ADF e anti GelsolinaADF e anti Gelsolina

Conclusioni:Conclusioni:Il nostro studio conferma che:Il nostro studio conferma che:

Il trattamento chimico e fisico migliora la sensibilità del test, Il trattamento chimico e fisico migliora la sensibilità del test, anche in sieri conservati a -20°C per 2-4 anni, a scapito di unaanche in sieri conservati a -20°C per 2-4 anni, a scapito di unaridotta specificità (80%). ridotta specificità (80%).

Alcuni fattori sierici appartenenti alla famiglia delle Alcuni fattori sierici appartenenti alla famiglia delle ABP ABP possono interferire con il legame tra l’ possono interferire con il legame tra l’ actina actina e suo anticorpoe suo anticorpospecifico. specifico.

Esiste una stretta correlazione tra gli A.A.A. e la lesioneEsiste una stretta correlazione tra gli A.A.A. e la lesioneintestinale.intestinale.

Come tutti i test operatore-dipendente anche ilCome tutti i test operatore-dipendente anche ilpresente test è caratterizzato da una bassa riproducibilità.presente test è caratterizzato da una bassa riproducibilità.Per questo motivo andrebbe organizzata una rete diPer questo motivo andrebbe organizzata una rete dilaboratori per la standardizzazione e i controlli di qualitàlaboratori per la standardizzazione e i controlli di qualitàdella ricerca degli A.A.A.della ricerca degli A.A.A.

Cardiomiopatie (CMPD) e A.A.A.:Cardiomiopatie (CMPD) e A.A.A.:una nuova associazioneuna nuova associazione

I DI OPATHI C DI LATED CARDIOMYOPATHY

The idiopathic dilated cardiomyopathyis a severe and chronic disease of the heart-muscle.

The presence of cardiac-specific autoantibodies (α-myosin) in some patients (50%) and in their relatives (16%), does provide evidence for autoimmune pathogenesis.

La cardiomiopatia dilatativa

è caratterizzata da una dilatazione del ventricolo sx dovuta ad una minor resistenza del miocardio nel quale alcune cellule muscolari sono sostituite da tessuto fibroso, con conseguente aumento della cavità cardiaca ma con minor capacità del cuore di pompare sangue.

Probabilmente nelle CMPD idiopatiche esistono alcuni meccanismi di autoimmunità diretti contro proteine del citoscheletro (actina ?)

Cardiomiopatie e A.A.A.:Cardiomiopatie e A.A.A.:una nuova associazioneuna nuova associazione

Positività degli A.A.A. in un gruppo di pazienti con CMPD e Positività degli A.A.A. in un gruppo di pazienti con CMPD e in parenti di primo grado:in parenti di primo grado:

Sieri Sieri RiscaldatiRiscaldati

Probandi:Probandi:

№ № =63=63Parenti:Parenti:

№ №=84=84

% Positivi% Positivi

59,7 %59,7 %

(№:36)(№:36)21,4 %21,4 %

(№:18)(№:18)

A.A.A. : Fattore patogenetico (?)

II

Leggenda: rosso = A.A.A. + bianco = A.A.A.-

marrone = probando

CMPD,Famiglia & Autoimmunità

II

III

Obbiettivi futuri:Obbiettivi futuri:

Continuare il lavoro di screening per la ricerca Continuare il lavoro di screening per la ricerca degli A.A.A. in pazienti con CMPDdegli A.A.A. in pazienti con CMPD