microscopía confocal para visualización de localización
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Microscopía confocal para visualización de localización subcelular e interacción
molecular de efectores del patosistema Xam (Xanthomonas axonopodis pv manihotis)
Trabajo de grado presentado por: Laura Sofía Cruz Vanegas1. Director: Cesar
Augusto Medina1. Codirectora: Adriana Jimena Bernal1
1Laboratorio de Interacciones Moleculares de Microorganismos en Agricultura,
LIMMA, Universidad de los Andes
Resumen
Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) es la bacteria responsable del tizón bacteriano
de la yuca que es considerada la enfermedad bacteriana más importante de esta planta.
Anteriormente se han caracterizado algunos efectores tipo (Xop) como importantes para el
desarrollo de la virulencia de esta bacteria. En este trabajo se hizo una aproximación a la
localización subcelular vegetal en plantas de Nicotiana benthamiana de los efectores
XopAO1, XopE4 y XopZ utilizando la proteína reportera YFP. En los resultados se logró
encontrar un patrón diferencial en la localización de las proteínas Xop, en donde XopZ y
XopAO1 parecen ubicarse en el citoplasma de la bacteria y XopE4 en el borde de la célula
que sugiere una localización membranal debido al dominio de miristilación que adquiere este
efector en la célula vegetal. Por otro lado, se estandarizó la técnica de BiFC
(Complementación bimolecular fluorescente) utilizando los plásmidos pSY735:N-tYFP y
pSY736:C-tYFP para visualizar la interacción de las proteínas Hsp90 y Rar1. Con este
resultado se pudo ver que los plásmidos utilizados pueden ser útiles para realizar este
protocolo para visualizar otras interacciones entre proteínas para el patosistema Xam.
Abstract
Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) is the bacterium responsible for cassava
bacterial blight, which is considered the most important bacterial disease of this plant.
Previously, some Xop effectors have been characterized as important for the virulence
development of this bacterium. In this paper it was done the subcellular plant location of the
effectors XopAO1, XopE4 and XopZ in Nicotiana benthamiana plants using the YFP
reporter protein. It was possible to find a differential pattern in the location of the Xop
proteins, where XopZ and XopAO1 seem to be located in the cytoplasm of the bacterium and
XopE4 in the edge of the cell that suggests a membranal location due to the myristylation
domain that this effector acquires in the plant cell. On the other hand, the BiFC (Bimolecular
fluorescence complementation) technique was standardized using the plasmids pSY735: N-
tYFP and pSY736: C-tYFP to visualize the interaction of the Hsp90 and Rar1 proteins, which
have been previously demonstrated to interact. With this result it was possible to see that the
plasmids used can be useful to carry out this protocol to visualize other interactions between
proteins for Xam pathosystem.
Palabras clave
Efectores, localización subcelular, BiFC, virulencia, microscopía confocal.
Introducción
La yuca (Manihotis esculenta) es un cultivo del área tropical importante para la seguridad
alimentaria. Se sabe que la producción de yuca se ha incrementado en un 40% en los últimos
10 años y también se ha estimado que la producción de este cultivo va a aumentar en un
300% en los próximos 15 años (Rosenthal & Ort 2012). El cultivo de yuca se ve afectado por
diferentes, infecciones virales y bacterianas. El tizón bacteriano causado por Xanthomonas
axonopidis pv. manihotis (Xam) es la enfermedad bacteriana más importante de la yuca
debido a que puede causar pérdidas de los cultivos hasta del 80% (Lozano et al., 1986). Esta
bacteria causa una variedad de síntomas que generalmente inician con manchas angulares en
las hojas, seguida por la marchitez de las hojas de la planta, necrosis vascular del tallo,
exudados de goma y muerte descendente de la planta (Lozano et al., 1986). Se conoce que la
manera más importante de diseminación de Xam está dada por la propagación de material
vegetal infectado (Lozano & Sequeira., 1974). El manejo del tizón bacteriano de la yuca se
ha dado principalmente con el uso de cultivares resistentes (Lozano et al., 1986) (López &
Bernal., 2012), África es uno de los sitios más afectados por Xam, pues se ha reportado a esta
bacteria en todos los cultivos yuca de África con diferentes grados de incidencia (Boher &
Verdier., 1994). El primer reporte del tizón bacteriano de la yuca fue en Brazil en 1912 y
posteriormente se encontró en todos los países de Latino América, África y Ásia en donde
había cultivos de yuca (Lozano et al., 1986). En Colombia el primer reporte del se dio en
1971(Lozano & Sequeira., 1974), se determinó que en los 90´s se dio una fuerte migración
de las poblaciones de Xam en el país (Trujillo et al., 2014). Se han caracterizado las
poblaciones genéticas de Xam en el país y se ha encontrado una relación genética cercana
entre cepas que pertenecen al mismo origen geográfico (Restrepo & Verdier., 1997)
La información que existe de los genes relacionados con la defensa en la yuca es muy limitada
por lo cual actualmente se están estudiando los genes de Xam que participan en el proceso de
infección a la yuca (Medina et al., 2018). En el proceso de identificar los genes relacionados
con la defensa de la yuca, se ha determinado que la familia de transportadores de azúcar
SWEET/MtN3 está involucrada en la susceptibilidad de yuca, pues son blanco de las
proteínas TALEs que son necesarias para el crecimiento bacteriano y el desarrollo de
síntomas (Cohn et al., 2014)(Chen et al., 2010). Desarrollar cultivares resistentes de yuca ha
sido un proceso desafiante, pues no se conocen muchos genes resistencia en este cultivo, se
sabe que la yuca tiene resistencia cuantitativa y se han encontrado hasta el momento varios
loci de rasgo cuantitativo (QTL) que están asociados con la resistencia cuantitativa de Xam
(Jorge et al., 2001) (Wydra et al., 2004) (Muñoz-Bodnar et al., 2014). Recientemente se
identificó que el gen que codifica para la proteína RXam1, que es una proteína de tipo RLK
(Receptor like kinase), colocaliza con un (QTL) que explica el 16% de la resistencia de la
planta a la cepa CIO136 de Xam (Jorge et al., 2000), y se encontró que al sobreexpresar a
Rxam1 se lograba aumentar la resistencia de la variedad de yuca susceptible (Tatis et al.,
2018) (Gil et al., 2019)
Xanthomas axonopodis utiliza el Sistema de Secreción Tipo III, que actúa como una “jeringa
molecular” al inyectar proteínas, conocidas como efectores, directamente al interior de la
célula hospedera (Macho et al., 2016). Selectivamente estas proteínas efectoras se encargan
de optimizar el ambiente celular del hospedero para promover el crecimiento de las bacterias
(Grant et al., 2006). En general, cuando las proteínas efectoras no son reconocidas por las
proteínas que le confieren resistencia a la planta hospedera, se genera la suceptibilidad
mediada por efectores o ETS. En el patosistema de se han encontrado algunas proteínas que
se encuentran asociadas a la virulencia de la bacteria y al desarrollo de ETS. En la cepa
CIO151 se pudo determinar que algunas proteínas tipo Xop estaban involucradas en el
máximo desarrollo de la enfermedad en la planta (XopAO1 y XopZ), y se determinó que las
proteínas XopE4 y XopAO1 estaban relacionadas con la supresión de la inmunidad mediada
por efectores en la planta generando ETS (Medina et al., 2018).
Para el estudio de visualización interacción y localización de proteínas en células vegetales
se han propuesto metodologías que utilizan genes reporteros fluorescentes como GFP y que
utilizan la microscopía confocal de barrido laser para realizar la detección. La ventaja de esta
microscopía es que permite obtener secciones ópticas de alta calidad ya que pueden recopilar
imágenes nítidas y bien resueltas de planos seleccionados a lo largo del eje z dentro de
muestras gruesas como lo la hoja de una planta (Hardham., 2012). Una de las técnicas que
utiliza la microscopía Confocal para visualizar la interacción de proteína es BiFC
(Complementación bimolecular Fluorescente), esta técnica se basa en la unión de dos
fragmentos no fluorescentes de YFP o de otros derivados de GFP, en donde cada fragmento
se une a una proteína candidato diferente. Así pues, cuando las dos proteínas interactúan, las
dos partes del cromóforo se unen y se produce la fluorescencia debido a la reconstitución de
la proteína fluorescente funcional dada por la coexpresión de los fragmentos N- terminal y
C-terminal de esta proteina (Bracha-Drori et al., 2004). Una de las ventajas del uso de esta
técnica es la ausencia de ruido de fondo, además de la alta especificidad y estabilidad en la
reconstrucción de los cromóforos. Cabe tener en cuenta que no se puede decir que la técnica
de BiFC determina la unión entre dos proteínas, pues la reconstitución de la proteína
fluorescente se da sólo por la cercanía de los fragmentos de la proteína (C. D. Hu, Chinenov,
& Kerppola, 2002).
Para el estudio de las interacciones proteína-proteína entre patógenos y plantas se han
trabajado ampliamente en la expresión transitoria con Agrobacterium tumefaciens en plantas
de Nicotiana benthamiana (McCullen & Binns, 2006). El trabajo con proteínas expresadas
transitoriamente facilita también la evaluación del ensayo de las proteínas debido a que los
ensayos se pueden efectuar al poco tiempo de realizar la agroinfiltración, en donde
aproximadamente dos días después de esta se consigue ver la expresión de las proteínas, por
métodos como Coinmunoprecipitación o BiFC. Sin embargo, es importante tener en cuenta
que en los estudios de proteínas expresadas transitoriamente pierden su expresión
rápidamente debido a la acción de RNAs silenciadores que bloquean la expresión de los
transgenes (Wydro, Kozubek, & Lehmann, 2006).
El objetivo de este estudio fue hacer una aproximación de la localización subcelular de varios
efectores importantes en la virulencia de Xam y realizar una estandarización de la técnica
BiFC con miras a evaluar la interacción de proteínas involucradas en ETS del patosistema
Xam.
Metodología
Cepas bacterianas y plásmidos usados
Se utilizaron cepas de E.coli DH5α que pertenencen al laboratorio LIMMA de la Universidad
de los Andes y la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 del laboraorio de Richard
Michelmore de la Universidad de California en Davis. Se realizó una extracción de los
plásmidos con los genes que codifican para los T3E de interés (Efectores del sistema de
secreción de tipo 3: xopZ, xopAO1 y xopE4) como se muestra en anexos en la tabla1.
Posterior a esto se realizó una clonación Gateway® por medio de una reacción LR de cada
uno de los genes de interés en un plásmido pAM-35S GW:yfp, utilizando el procedimiento
recomendado por Invitrogen. Como resultado, se obtuvieron los clones pAM-
35SGWyfp:XopZ, pAM-35SGWyfp:XopAO1 y pAM-35SGWyfp:XopE4. Una vez se
obtuvieron los constructos de interés se realizó una transformación en célula de E.coli DH5α,
estas fueron conservadas glicerol. Para BiFC se utilizaron los constructos pSY735:N-t yfp ,
pSY735:N-t yfp:rar1, pSY736:C-t yfp y pSY736:hsp90:C-t yfp, amablemente donados por
el laboratorio de Pamela Ronald en la Universidad de California en Davis.
Agroinfiltración
Se utilizaron plantas de Nicotiana benthamiana con un tiempo de crecimiento de 6 semanas
en turba y se cultivaron a una temperatura de 20oC y un fotoperiodo de 12 horas. Por otro
lado se utilizaron células de A. tumefaciens GV3101 que fueron transformadas previamente
con los plásmidos pAM-35S GW:T3E:yfp individualmente. Las células de A. tumefaciens
cepa GV3101 se sacaron de -80oC en cajas de agar LB con carbenicilina 50ug/ml,
rifampicina 25ug/ml y gentamicina 25ug/ml y se incubaron por dos días a 28oC. Se tomó una
colonia aislada y se realizó un masivo en una caja con los antibióticos previamente
mencionados y se incubó por dos días a 28oC. Pasado el tiempo, se tomó parte del masivo y
se resuspendió en el medio de infiltración (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH 5.6] y 100 µM
acetosiringona). Después de 4 lavados con este medio, se llevó la suspensión a una OD600
de 1 usando un espectrofotómetro Evolution 201 UV-Visible® de Thermo Scientific. La
suspensión resultante se incubó a temperatura ambiente por 3 horas.
Para la agroinfiltración se realizó una pequeña punción en el envés de la hoja con posterior
infiltración presionando levemente con una jeringa de insulina sin aguja (Ma et al., 2012).
Las plantas utilizadas se incubaron durante 48 horas en las condiciones normales de luz,
humendad y temperatura del invernadero.
Visualización por microscopía Confocal
Se hicieron cortes de las hojas infiltradas de aproximadamente 1-2 cm2 y se colocaron en el
microscopio Confocal de Barrido Laser Olympus FV1000. Para este proceso, se visualizó a
la longitud de onda de máxima excitación de YFP (488nm). Por otro lado, se utilizó un canal
de campo claro para visualizar la forma de las células epidermales de las hojas. La
visualización se realizó con el objetivo de 20x/0.75 UPlanSApo y el de 40x/0.6 UCPlan FL
N.
Para el estudio de XopE4 se realizó un experimento de plasmólisis en el cual se infiltraron
hojas de N. benthamiana con una solución de Manitol al 0.08M y se visualizó con el
microscopio con los parámetros anteriormente presentados cada 5 minutos durante 15
minutos una célula vegetal.
Edición de imágenes
Las imágenes obtenidas en los canales de campo claro de y de YFP fueron superpuestas
utilizando el software Image J.
Resultados
Localización Subcelular de proteínas efectoras Xop
En esta primera parte del estudio se logró observar la localización subcelular en las hojas de
N. benthamiana. Se encontró que cada una de las proteínas efectoras estudiadas tiene una
expresión diferencial en la célula vegetal, esto visualizado mediante la proteína reportera
YFP. Como se observa en la Figura 1. Al sobrelapar el canal de fluorescencia con el canal de
campo claro se puede ver que la proteína XopAO1 se expresa en el interior de la célula
vegetal. De igual manera se observa que la proteína XopZ tiene un patrón de expresión en el
interior de la célula vegetal. Para el caso de XopE4, la fluorescencia emitida por YFP
coincide con los límites de la célula vegetal, esto se observa también en la Figura 2. Esta
imagen permite visualizar una sola célula epidermal, se puede ver que la fluorescencia tiene
la misma forma irregular de la célula vegetal.
Figura 1. Células epidermales de Nicotiana benthamiana infiltradas con A. tumefaciens
GV3101. En la parte superior se muestra la expresión de la fluorescencia emitida por YFP.
En la parte inferior el Merge se refiere al sobrelapamiento del canal de fluorescencia con el
canal de campo claro del microscopio. Microscopio confocal de barrido laser 20X
Figura 2. Células epidermales de N. benthamiana infiltradas con A. tumefaciens GV3101
con el plásmido pAM35s:xopE4:yfp. Se observa el canal de emisión de YFP, el canal de
campo claro (BF) y la sobreposición de ambos (Merge). Microcopio Confocal de barrido
laser, objetivo 40X.
Ensayo de plasmólisis en células vegetales para evaluación de la expresión de XopE4
Para comprobar la localización subcelular del efector XopE4 en membrana se realizó un
experimento de plasmólisis de las células vegetales de N. benthamiana. Para esto, las hojas
de N. benthamiana que habían sido previamente infiltradas con A. tumefaciens GV3101 con
el plásmido pAM35s:xopE4:yfp, se les infiltró Manitol al 0,08M para inducir plasmólisis y
se evaluó la fluorescencia emitida por YFP. En el minuto 0 se puede evidenciar el patrón de
expresión que se había visto con las otras visualizaciones de XopE4 en este trabajo (Figura
3), en donde la fluorescencia emitida por la proteína reportera YFP se localiza en el borde de
la célula vegetal. Sin embargo se puede notar en las imágenes que se tomaron a los 10 y 15
minutos después de que se infiltraron las hojas con la solución de manitol, la expresión de
YFP ya no coincide con el borde de la célula vegetal, sino que se encuentra en el centro de
la misma.
Figura 3. Ensayo de plasmólisis en células epidermales de N. benthamiana infiltradas con
A. tumefaciens GV3101 con el plásmido pAM35s:xopE4:yfp. El tejido fue infiltrado con
manitol al 0.08M antes de la visualización por Microcopio Confocal de barrido laser. Los
tiempos denotan los minutos después de la infiltración con manitol. Objetivo usado: 40X.
Ensayo de BiFC
Adicionalmente a la localización subcelular se quiso hacer la estandarización de la técnica
de BiFC utilizando las proteínas Rar1 y Hsp90. Se pudo observar que al hacer la
coinfiltración en las hojas de N. benthamina con A. tumefaciens cepa GV3101 con el
plásmido pSY735:rar1: N-t yfp y con el plásmido pSY736:hsp90:C-t yfp se logró reconstituir
la proteína YFP. En el caso de infiltrar las hojas con uno de los plásmidos que codifica para
una de las proteínas de interés (Rar1 y Hsp90) y con un vector vacío, no se observó una
emisión de fluorescencia debido a que en las hojas sólo se está expresando uno de los
fragmentos de la proteína YFP (Figura 4b y c). Así mismo, al coinfiltrar las hojas con células
que contenían los vectores vacíos pSY735:rar1: N-t yfp y pSY736:ev:C-t yfp no se observó
fluorescencia debido a que los dos fragmentos de la proteína YFP sólo se puede unir cuando
las proteínas de interés (Rar1 y Hsp90) permiten el acercamiento de los dos fragmentos de la
proteína YFP (Figura 4d).
Figura 4. Ensayo de BiFC con Rar1 y Hsp90. Se muestra la coinfiltración de células de A.
tumefaciens con los plásmidos: a) pSY735:rar1: N-t yfp y pSY736:hsp90:C-t yfp. b)
pSY735:rar1: N-t yfp y pSY735:ev:N-t yfp. c) pSY736:ev:C-t yfp. d)Buffer MES. Células
epidermales de N. benthamiana. Microscopio confocal de barrido laser, objetivo 40X.
Discusión y conclusiones
Patrones diferenciales de expresión en la localización de efectores Xop
El estudio de las proteínas involucradas en el desarrollo de la virulencia en el patosístema
Xam es muy importante debido a que contribuye a entender el mecanismo molecular de cómo
la planta responde al ataque y qué utiliza para defenderse. En esta primera parte, el hecho de
lograr visualizar los efectores estudiados en un lugar específico en la célula puede
relacionarse con las diferentes funciones celulares que se conocen de cada uno de ellos.
Para comenzar, XopAO1 es un efector importante para la virulencia de Xanthomonas ya
quepuede suprimir tanto PTI (Pattern triggered immunity) como ETI (Effector Triggered
Immunity). Se conoce que esta proteína comparte el dominio PARP (ADP ribosil polimerasa)
con AvrRpm1, que es una proteína efectora de Pseudomonas syringae pv. maculicula. Se ha
sugerido que por compartir el dominio PARP, XopAO1 y AvrRpm1 pueden tener homología
de función (Medina et al., 2018). A diferencia de XopAO1, se sabe que la localización
subcelular de AvrRpm1 es membranal (Nimchuk et al., 2000). En concreto AvrRpm1 sufre
un proceso de acilación grasa que consiste en la adquisición de dominios de mirostilación y
palmitolación en el N-terminal de la proteína que le permiten asociarse a la membrana de la
célula vegetal y facilitar su unión con la proteína de resistencia RPM1 que se localiza en las
vesículas de la membrana plasmática (Nimchuk et al., 2000). Según la localización subcelular
de AvrRpm1 se esperaba que XopAO1 se encontrara en la membrana plasmática, sin
embargo según los resultados obtenidos en este trabajo la proteína XopAO1 se sugiere que
esta proteína se localiza en el citoplasma de la célula vegetal o en alguno de los organelos
internos. En previos estudios, se determinó que XopAO1 posee una triada catalíca
compartida con AvrRpm1 para el aminoácido H41 (Gonzales, Bernal & Medina., 2015), este
es un dominio que está asociado al anclaje en la membrana de la mitocondria de proteasas de
tipo FtsH-AAA (Lee et al., 2011). El hecho de que XopAO1 posea el aminoácido H41 podría
sugerir entonces que este efector podría estar asociado a la membrana o la mitocondria de la
célula, por lo cual el paso a seguir sería utilizar un marcador para la mitocondria y para
determinar si éste colocaliza con la fluorescencia emitida por XopAO1. Por otro lado se sabe
que el aminoácido H41 de XopAO1 contribuye a la supresión de PTI y promoción del
crecimiento bacteriano en la planta (Gonzales., 2018).
De la proteína XopZ no se conocen actividades bioquímicas específicas y se cree que
tieneuna función de integración con proteínas de la célula hospedera. En el patosistema Xoo
se ha visto que XopZ es capaz de suprimir la inmunidad innata inducida por LipA, que es
una enzima degradadora de la pared celular (Sinha et al., 2013), además de que se ha resaltado
su importancia para la supresión de PTI (Song & Yang., 2010). En Xam se ha visto que XopZ
es importante para el desarrollo completo de la virulencia de la bacteria (Medina et al., 2018).
La proteína LipA se encuentra en el lisosoma, por lo tanto la localización que se encontró en
este trabajo puede soportar la idea de que XopZ se está encontrando en el citoplasma de la
célula vegetal, posiblemente en el lisosoma de la célula vegetal.
En cuanto a XopE4 se sabe que es una proteína efectora que tiene la capacidad de suprimir
ETI sin suprimir PTI (Medina et al., 2018). En este trabajo se logró ver claramente que el
patrón de localización de esta proteína se asocia al borde de la célula. El dominio de
miristilacion que se logró predecir anteriormente para XopE4 (Medina et al., 2018) es similar
al que AvrRpm1 tiene para acilarse cuando se encuentra en la célula vegetal. La presencia de
estos dominios de ácido graso en el N terminal de la proteína es algo que se ha visto en otros
integrantes de la familia XopE, siendo estos XopE1 y XopE2, que poseen un dominio de
miristilacion y se confirmó que se anclan a la membrana plasmática de la célula vegetal
(Thieme et al., 2007). Esto sugiere que XopE4 puede estar asociado a la membrana, lo que
explicaría la ubicación de la fluorescencia de YFP en el borde de la célula. El experimento
de plasmólisis permitió, de igual manera, observar que al darse la contracción de la vacuola
de la célula vegetal, la fluorescencia de emitida por la proteína reportera también se separa
del borde de la célula vegetal, esto puede coincidir con la idea de que XopE4 se encuentra en
la membrana y que esta se separa de la pared cuando ocurre la plasmólisis. Sin embargo, cabe
la posibilidad de que esta no sea la localización de XopE4, para confirmar la localización de
este efector se pretende realizar un ensayo con la tinción de membrana FM™ 4-64 de la
marca Invitrogen®. El papel de los efectores anclados a membrana por mecanismos de
lipidación es desconocido aún, sin embargo se ha determinado que los receptores
citoplasmáticos tipo kinasas (RLCKs) se anclan a la membrana celular por medio de
miristilación y están involucrados en crecimiento, desarrollo e inmunidad vegetal a través de
eventos de transfosforilación (Lin et al., 2013).Por lo tanto es de esperarse que algunos
efectores bacterianos imiten estos mecanismos para inactivar cascadas de señalización
involucradas en la incunidad vegetal.
Interacción entre RAR1 y Hsp90 permite estandarizar la técnica de BiFC
Por otro lado, el uso de la técnica de BiFC fue útil para comprobar la interacción entre las
proteínas Hsp90, una proteína de choque térmico, y la co-chaperona Rar1. Las cuales se
encargan de la estabilización de proteínas R en las plantas (Seo et al., 2008). La localización
de la proteína Hsp90 es ampliamente conocida, pues se sabe que esta proteína chaperona
implicada en el transporte de varias proteínas se puede encontrar sobre la membrana
plasmática (Snigireva et al., 2016)(Schulte et al., 2002), y en este trabajo se pudo observar
mediante la reconstrucción de las dos partes de YFP la localización de la interacción que
previamente se conocía entre Hsp90 y Rar1. Por otro lado, los controles utilizados fueron
fundamentales para poder darle validez al resultado obtenido en las imágenes que presentan
la interacción entre Rar1 y Hsp90, que fueron basados en un trabajo realizado previamente
(Boevink et al., 2014). De esta parte del trabajo se puede resaltar que el uso de los plásmidos
pSY735:N-t yfp y pSY736:C-t yfp permitieron un buen alcance para el desarrollo de esta
técnica. Hasta donde conocemos, este es el primer reporte del uso exitoso de BiFC en
Colombia para demostrar la interacción entre dos proteínas. La metodología utilizada en este
estudio con BiFC puede ser utilizada para confirmar la interacción entre proteínas efectoras
del patosistema Xam que se han trabajado en este estudio, pues al conocer sus localizaciones
subcelulares se puede realizar la técnica de BiFC con proteínas candidato de la planta que se
encuentren allí. Este proceso se quiere realizar con XopE4, pues el hecho de que este efector
tenga un papel principal en ETS puede facilitar su uso para probar sus posibles blancos
celulares mediante esta técnica. La estandarización de la técnica de BiFC es algo bastante
útil, pues presenta varias ventajas sobre las otras metodologías que se usan para confirmar
interacción de proteínas como coinmunoprecipitación y doble híbrido de levadura. En el
primer caso respecto a la coinmunoprecipitación, BiFC no requiere el uso de materiales
especiales, como el uso anticuerpos específicos, lo que la hace una técnica mucho más
sencilla y accesible. Por otro lado respecto a la técnica de doble hibrido de levadura, BiFC
es una manera de confirmar interacciones entre las proteínas que sólo interactúan en su
condición nativa y que en experimentos como doble hibrido de levadura se reportarían como
falsos negativos (Kudla., 2016).
En general, este estudio permitió dar un acercamiento a entender esas funciones celulares
que cumplen las proteínas efectoras tipo Xop al ingresar al tejido vegetal relacionando la
localización subcelular que se pudo determinar y la posible función de la proteína. Esta parte,
aunque no es un resultado definitivo, sí permite soportar algunas de las afirmaciones que se
han hecho respecto a las funciones de las proteínas estudiadas. El caso más importante en
este estudio es el de XopE4, pues mediante la técnica de localización subcelular con
microscopía confocal se visualizó lo que se había propuesto con el conocimiento previo del
dominio de miroistilación que adquiría la proteína. Por otro lado, estas técnicas visualización
de localización e interacción de proteínas con microscopía confocal, pueden en realidad ser
una herramienta muy útil para acelerar el proceso de determinación de la función de otras
proteínas importantes del patosistema Xam sobre las cuales se tiene información, pero cuya
función no es clara. En este momento la investigación que se tiene sobre el patosistema Xam
aún tiene muchas partes por estudiar y entender, y la aproximación que se hizo en este trabajo
puede ser el inicio para ayudar de manera sólida a las otras técnicas que se utilizan para
estudiar a este patosistema.
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Anexos:
Tabla 1. Plásmidos y genes utilizados
Gen Plásmido de origen Fuente
xopZ pDONR207 Universidad de los Andes
xopAO1 pENTR TOPO/SD Universidad de los Andes
xopE4 pDONR207 Universidad de los Andes
Empty vector pSY 735 UC Davis (Ronald Lab)
Empty vector pSY 736 UC Davis (Ronald Lab)
hsp90 pSY 735 UC Davis (Ronald Lab)
rar1 pSY 736 UC Davis (Ronald Lab)
yfp pAM35S Australian National University
(Rathjen Lab)