modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique 19 septembre 2007 luc paillard, cnrs umr...
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Modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique
19 septembre 2007Luc Paillard, CNRS UMR 6061
Que sont les régulations post-transcriptionnelles?
AAAAAA
AAAAAA
Que sont les régulations post-transcriptionnelles?
AAAAAA
AAAAAA
Régulation de la traduction
Régulation de lastabilité des ARNm
(Régulation de lastabilité des protéines)
Un niveau de contrôle de la concentrationcellulaire en chaque protéine
« How is gene expression controlled in eukaryotes?As in prokaryotes, control is exerted primarily
at the level of transcription »
Lubert Stryer, Biochemistry III, 1988
Importance du contrôle post-transcriptionnelchez les eucaryotes
Des pathologies humaines sont associéesà des défauts de contrôle post-transcriptionnel
Des altérations de facteurs de régulationpost-transcriptionnelle provoquentdes perturbations phénotypiques
Des altérations de régulations post-transcriptionnelles
provoquent des perturbations phénotypiquesMise en place de l’axe antéro-postérieur chez la drosophile
Des pathologies humaines sont associées
à des défauts de contrôle post-transcriptionnel
Thalassémies ( ou ) et instabilité des ARNm ou globine
Oncogenèse et stabilisation d’ARNm de cytokines/proto-oncogènes
Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des
régulations post-transcriptionnelles?
Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNmTranscription, stabilité des ARNm
Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des
régulations post-transcriptionnelles?
Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNmTranscription, stabilité des ARNm
« Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomesTraduction des ARNm
Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des
régulations post-transcriptionnelles?
Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNmTranscription, stabilité des ARNm
« Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomesTraduction des ARNm
Protéome (2DE, MS et dérivés) : niveau d’accumulation des protéinesTraduction, stabilité des protéines
Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des
régulations post-transcriptionnelles?
Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNmTranscription, stabilité des ARNm
« Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomesTraduction des ARNm
Protéome (2DE, MS et dérivés) : niveau d’accumulation des protéinesTraduction, stabilité des protéines
Relations Transcriptome/traductome/Protéome
1. Levures en phase de croissance
Gygi et al MCB 1999 19, 1720
Marquage métabolique (Met-35S) des cellulesSéparation des protéines par 2DE
Quantification des spots, identification
Niveaux d’expression de 106 protéines
1. Levures en phase de croissance
Gygi et al MCB 1999 19, 1720
Données de SAGE
Niveaux d’expression des ARNm correspondants
1. Levures en phase de croissance
Gygi et al MCB 1999 19, 1720
Corrélation entre niveau d’expression des ARNm et des protéines
1. Levures en phase de croissance
Gygi et al MCB 1999 19, 1720
Corrélation entre niveau d’expression des ARNm et des protéines
Corrélation très mauvaise!
2. Réponse à un changement de milieu de culture
Griffin et al MCP 2002 1, 323
Culture de levures en galactose
Transfert en galactose ou éthanol
Ratio Gal/Eth mesuré pour 245 produits de gènes :protéine (ICAT : MS en conditions quantitatives),ARNm (microarray)
log du ratio des protéines=f(log du ratio des ARNm)(log=0 pour un produit de gène dont l’abondance ne change pas)
2. Réponse à un changement de milieu de culture
R2=0.21!Griffin et al MCP 2002 1, 323
Conclusion
1. Les régulations post-transcriptionnelles sont un niveauMAJEUR de régulation de l’expression génétique
2. (En conséquence, les analyses transcriptomiquespeuvent être insuffisantes)
Bref survol des modalités de régulations post-transcriptionnelles
ORF AAA….AAA5' 3'
AUG STOP
5'UTR 3'UTR
Structure de l'ARNm eucaryote :
Coiffe Queue poly(A)
Régions non codantes
Rappels sur la traduction eucaryote
Initiation
Recrutement de la petite sous-unité ribosomique (40S) à l ’extrémité 5 ’Scanning jusqu ’à la rencontre de l ’AUG initiateurJonction de la grosse sous-unité (60S) = ribosome (80S)
Elongation
Lecture codon par codon
Terminaison
Relargage du peptideLe ribosome? Influence du contexte du codon stop
La 5’UTR contrôle la traduction1, Les uORF (upstream ORF)
5’UTR de l’ARNm Gcn4 de levure :
Gaba et al EMBO J 2001 20, 6453
4 uORF avant l’ATG initiateur
Réinitiation possible « dans certaines conditions » en 3’ d’une uORFCes conditions contrôlent la traduction de GCN4
La 5’UTR contrôle la traduction1, Les uORF (upstream ORF)
Plusieurs (nombreux) ARNm contiennent des uORF, même chez les métazoaires
Fonction???
La 5’UTR contrôle la traduction2, Fixation d’une protéine dans la 5’UTR
La fixation d’une protéine à proximitéde la coiffe (<40nt) inhibe la traduction
Exemple : Contrôle de la traduction de la ferritine parla séquence IRE et la protéine IRP
La 5’UTR contrôle la traduction3, Les IRES (Internal Ribosome Entry Site)
Initiation indépendante de la coiffe (et de eIF4E)
Traduction de certains ARNmquand les autres sont réprimés (stress, cycle cellulaire…)
La 3’UTR contrôle la stabilité1, Le récepteur de la transferrine
L'IRP (Iron Response Protein) lie l'IRE (Iron Response Element)si la concentration cellulaire de fer libre est faible
L’ARNm récepteur de la transferrine contient 5 IRE dans sa 5’UTR (et un site de clivage endonucléolytique)
Complexe IRE-IRP : inhibition de dégradationContrôle de la concentration intracellulaire en fer libre
La 3’UTR contrôle la stabilité2, Les ARE (A/U Rich Element)
Mise en évidence : 1986. ARNm de cytokines, proto-oncogènes…
Cinétique de dégradation, en Northern, d’un ARNm rapporteursous contrôle d’un promoteur inductible
Sans ARE Avec ARE
Xu et al. MCB 2001 21, 6960
La 3’UTR contrôle la stabilité2, Les ARE (A/U Rich Element)
3 classes d’ARE
Classe Exemple Description
I c-fos, c-myc (AUUUA) répartis
II GM-CSF, TNF (AUUUA) chevauchants
III c-jun Pas de (AUUUA)
La 3’UTR contrôle la stabilité2, Les ARE (A/U Rich Element)
Les ARE agissent en fixant une protéine (ARE-BP) hnRNPD/AUF1, HuR, TTP…
Effet positif ou négatif de la fixation de la protéine
La 3’UTR contrôle la stabilité3, La queue poly(A)
Un ARNm polyadénylé est généralementplus stable qu’un ARN désadénylé
La 3’UTR contrôle aussi la traduction1, Les ARE (A/U Rich Element)
Transfection d’un plasmide codant un ARN EGFP(avec ou sans ARE dans la 3’UTR)
Mesure de l’ARN (Northern) et dela protéine (western) EGFP
Grosset et al. JBC 2004 279, 13254
Vecte
ur v
ide
EGFP
EGFP
-ARE
La 3’UTR contrôle aussi la traduction2, La queue poly(A)
Tarun et Sachs (1995) Genes Dev 9, 2997
Incubation dans extrait de levure
Mesure de luminescence
+/-cap +/-poly(A)
Même expérience en présenced ’anticorps anti PABP
Pas de stimulation de la traductionpar la queue poly(A)
Luciferase
La 3’UTR contrôle aussi la traduction2, La queue poly(A)
Searfoss et al 2001, MCB 21, 4900
Transfection dans les levures
Mesure de luminescence
+/-cap +/-poly(A)Luciferase
"wt"
pab1
La queue poly(A) stimule la traduction de façon dépendante de la PAB1
Mais tout cela est lié!1, ARE et état d’adénylation
Cinétique de dégradation, en Northern, d’un ARNm rapporteurcontenant un ARE sous contrôle d’un promoteur inductible
Diminution de taille avant dégradation
Peng et al. MCB 1996 16, 1490
Mais tout cela est lié!2, ARE, état d’adénylation, traduction, stabilité…
AREAUG STOP
AAAA...AAAAA
Ri
+-
+5'
(et c’est encore pire…)
ARE-BP
La 3’ UTR contrôle la traduction ET la stabilité
Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codantsUne histoire récente…
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
miRNA RNAisiRNA
Et alors?
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
Mécanismes biochimiques
Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codantsUne histoire récente…
Biosynthèse des miRNA
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519Reconnaissance d’un ARN
double brin par Argonaute!
Fonction des miRNA
L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN
1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt :
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
Conséquence : inhibition de latraduction de l’ARNm cible
Voie miRNA « classique » chez l’animal
Fonction des miRNA
L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN
2. Hybridation sur la totalité des 22 nt :
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
Conséquence : dégradationde l’ARNm cible
Voie miRNA « classique » chez la plante
Fonction des miRNA
L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN
2. Hybridation sur la totalité des 22 nt :
Conséquence : dégradation de l’ARNm cible
Voie miRNA « classique » chez la plante…
… Mais si l’on apporte un ARN double brin parfaitementcomplémentaire d’un ARNm cible chez l’animal, cela provoque
sa dégradation… voie « siRNA » chez l’animal
Mise en évidence du RNAi
Injection d'ARN sens, antisens ou double brin dans
la gonade
Phénotype de la descendance?
Fire et al. (1998) Nature 391, 806
Prix NOBEL 2006
Reprenons…
miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génomede la cellule (sous forme d’un précurseur qui est maturé)
Environ 200 chez l’humain
S’apparie imparfaitement à un ARN cible et inhibe satraduction (animal), ou s’apparie parfaitement et provoque
sa dégradation (plante) (Il y a des exceptions…)
En général, un miRNA s’apparie aux 3’UTR d’un ou plusieurs ARNmUne 3’UTR peut être liée par plusieurs miRNA
siRNA : ARN double brin (2*22nt) apporté par l’expérimentateurdans une cellule animale
S’apparie parfaitement à un ARNm cible et provoque sa dégradation
Le RNAi, un mode de régulation post-transcriptionnel au service de
l’expérimentateurApplication en thérapeutique?
Downward BMJ 2004 328, 1245