Polymerase chain reaction of peripheral blood as a tool for

the diagnosis of visceral leishmaniasis in children

Por: Clara Pilar Vélez Gómez

Estudiante 3er semestre

INTRODUCTION

Proper use of PCR for diagnosis of leishmaniasis has proven to be a great help in allowing the doctor a clearer focus and direct to the patients.

The PCR can establish from small samples of DNA a clear and precise diagnosis of the disease, and this is much more reliable than electron microscopy and cultivation by the small amount of sample needed to perform it.

This technique decreases the risk of complications caused by invasive sampling, in children is particularly useful due to the being a less aggressive method reduces pain and discomfort for them represents the taking of other samples.

INTRODUCTION

Visceral leishmaniasis

Family Trypanosomatidae. 

PCR•A short region of a DNA molecule, is copied many times by a DNA polymerase enzyme.

•The PCR objective is the direct amplification to a gene or DNA fragment or indirect amplification from an RNA present in mixtures of various sources. 

•This copy is given from a very low concentration of DNA and can reap millions of copies in a short time

PCR/leshmaniasis

PCR has been shown to be a useful method for the diagnosis of VL because Leishmania DNA may be present in only minimal quantities in biological specimens

various biological samples may be employed in the reaction, including bone marrow, skin biopsies, lymph nodes, or buffy coat

To evaluate the efficacy of Polymerase chain reaction of peripheral blood as a tool for the diagnosis of visceral

leishmaniasis in children

GENERAL OBJETIVE

PACIENTES

Estudio de análisis prospectivo

En niños con diagnóstico de la LV

Hospital Universitario de la Universidad Federal de Mato Grosso do Sul (NHU-UFMS)

Marzo 2008 a marzo 2009.

PACIENTES

Se estudiaron 45 pacientes que presentaban: características clínicas serología positiva (≥ 1 / 80) dieron negativo en los

resultados del examen parasitológico o serológicas, pero que presentan una respuesta favorable al tratamiento especializado

Microscopia directa

Identificar amastigotes de

leshmania

Preparar frotis en el porta objetos a

partir de aspirados de médula ósea

fijado con metanol

teñidas con Giemsa analizados por especialistas

Asignar el resultado

Cultivo

Muestras de aspirado

de M.O

•Se cultivaron en medio NNN (Novy-Nicolle MacNeal), en una fase líquida de medio Schneider

•suplementado con 20% de suero fetal bovino

Incubar •A 24oC  

Examinar

•Semanalmente por microscopía

Identificar

•Presencia del parásito, por un total de ocho semanas

Extracción PCR-DNA

Aislar el ADN de 300 L de aspirado de médula ósea o sangre periférica

GenomicPrepTM

Reacción

La secuencia de ADN amplificado por PCR fue la región conservada de la molécula de minicírculos

Un control negativo sin ADN en la mezcla y un control positivo que contiene 20 fg de ADN de Leishmania fueron incluidos en cada experimento. 

PCR se realizó en un volumen total de reacción de 25 μL bajo las siguientes condiciones:

Reacción

30 ciclos de 30 cada/1

Se descompone por desnaturalizaci;on a 94*C

Recocer a 54*C

Extención a 72*C

Amplificación - electroforesis

Marcador: escalera de ADN de 100 pb (Promega).

Las muestras se considera positiva para Leishmania cuando un fragmento de ADN por PCR de 120 pb se detectó.

Reacción

PCR-RFLP

Longitud de los fragmentos de restricción polimorfismo: se analizaron por RFLP de acuerdo con el

protocolo.

PC

R Ingerida en productos lacteos • Se digere por: 1 U

de HaeIII (Invitrogen)

• 3 Horas a 37*C frag

men

tos

de

rest

ricc

ión

Separados en un gel de poliacrilamida al 10%

Vis

ua

liza

ció

n Con plata tinción

Resultados

PCR en sangre periférica vs microscopia directa de médula ósea por aspiración:

35 niños (77,8%) presentaron resultados positivos con ambos métodos.

De los 9niños con resultados negativos de PCR de sangre periférica, 8 tuvieron resultados positivos de la microscopía directa. 

PCR de sangre periférica vs PCR de médula ósea por aspiración:

39 de cada 45 pacientes (86,7%) fueron un resultado positivo con ambos métodos.

Los 4 niños con resultados negativos de PCR de aspirado de médula ósea mostró resultados positivos de PCR de sangre periférica.

Resultados

PCR de sangre periférica vs cultivo de la médula ósea por aspiración:

11 pacientes (24,4%) presentaron resultados positivos con ambos métodos

De los 33 niños con los resultados del cultivo negativo, 32 tuvieron resultados positivos de PCR de sangre periférica.

Resultados

DISCUSSION

Thiago Leite Fraga

• We have demonstrated that PCR of peripheral blood is more sensitive for VL detection than microscopy of bone marrow aspirate (95.6% vs. 80%).

• Agree

Yvone Maia Brustoloni

• In our patients, the culture test demonstrated low sensitivity in detecting promastigotes. The value of using cultures for diagnosis may have been reduced because of the frequency of sample contamination.

• Agree

Rosimar Baptista Lima

• When the sensitivity of a method is evaluated, the inclusion of patients in the study in the absence of a goldstandard diagnostic technique may have important consequences.

• Agree

Maria Elizabeth Cavalheiros

Dorval

• The findings described here suggest that it may be advantageous to employ PCR of peripheral blood in place of traditional methods used for the diagnosis ofVL, including direct microscopy and culture tests.

• Agree

Personal conclusion

The PCR taken from a peripheral blood sample was shown to be highly specific in diagnosing VL

I can see that in patients who the microscopy and culture were not specific to confirm the diagnosis, the PCR could confirm the presence or absence of the infectious agent

The PCR taken from a peripheral blood sample showed to be very useful in diagnosing VL

The PCR is the less invasive method that allows rapid confirmation of the diagnosis of VL increasing the likelihood of patient survival

GRACIAS