molecular taxonomy of microorganisms · molecular taxonomy of microorganisms dr.ssa silvia lampis...
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MOLECULAR TAXONOMY
OF
MICROORGANISMS
Dr.ssa Silvia Lampis
Ricevimento: mercoledi 14.00-15.00
Main aspects 1. Microorganisms constitute two out of the three domains of life on
earth.
2. They exhibit vast biodiversity and metabolic versatility. This enables the microorganisms to inhabit and thrive in even the most extreme environmental conditions, making them all pervading. 3. The magnitude of biodiversity observed among microorganisms substantially supersedes that exhibited by the eukaryotes. 4. These characteristics make the microbial world a very lucrative and inexhaustible resource for prospecting novel bioactive molecules.
• Microorganisms are omnipresent, extraordinarily diverse and perform
specialized roles in the environment.
• They impart many harmful effects such as spoilage and health damages
besides their beneficial role in the production of antimicrobials and bioactive
compounds, bioremediation of toxic chemicals and involvement in food,
beverages and pharmaceutical industries.
• Microbes have been present for over 3.8 billion years, however, their
existence became obvious 300 years ago and yet still only 1% of total
microbes are well known.
Taxonomic information of an unknown microbe is highly essential to establish its biodiversity,
relationship among other organisms in the ecosystem and its functional aspects (Gevers, 2005)
Over 99% of the microbial world still remains to be explored.
The primary reason for this is that the culture-dependent methods
used in the laboratories are grossly insufficient, as they support the growth of under 1% of the microorganisms found in nature.
This limitation necessitated the development of techniques to circumvent culture dependency and gain access to the outstanding majority of the
microorganisms. The development of culture-independent techniques has essentially reshaped the study of microbial diversity and community
dynamics. Application of genomic and metagenomic approaches is
contributing substantially towards characterization of the real microbial diversity.
The amenability of these techniques to high throughput has opened the doors to explore the vast number of "uncultivable" microbial forms in
substantially lesser time..
The prevalent conventional techniques are not sufficient to provide a complete draft for microbial taxonomy as these conventional tools describe only shape, color, size, staining properties, motility, host-range, pathogenicity and assimilation of C sources A comprehensive approach is required to furnish the information and subsequent derivation of a microbiological lineage. Considerable advancement in the study of microbial taxonomy in the past few decades has taken place such as: -Chemotaxonomy -Numerical taxonomy -DNA-DNA hybridization -DNA amplification and sequencing -Whole genome sequencing Despite of this tremendous progress and development of genome based techniques, any individual technique cannot be relied upon solely as a source of taxonomic information.
Another problem associated with microbial taxonomy analysis is the existing of some common taxa that cannot be cultured probably do to their protection strategy, viable but not culturable (VBNC) state. In contrast, culture independent techniques targeting a single gene also cannot provide adequate resolution for proper microbial identification
NO SINGLE TOOL INFERS DEFINITIVE ASSESSMENT OF THE MICROBIAL COMMUNITY
POLIPHASIC APPROACH
Involving a combination of molecular biology techniques and conventional microbiological methods is necessary to obtain a better understanding of microbial diversity
MAIN QUESTIONS
1. WHAT TYPE OF MICROORGANISMS ARE PRESENT ? 2. WHAT DO THESE MICROORGANISMS DO ? 3. HOW DO THE ACTIVITIES OF THESE MO RELATE TO ECOSYSTEM FUNCTIONS 3. HOW CAN I EXPLOIT THEM?
MICROORGANISMS AND THEIR NATURAL ENVIRONMENT
Microbial cells live in nature in association with other cells
L’insieme di più popolazioni che occupano lo stesso habitat e sono metabolicamente correlate
MICROBIAL CONSORTIUM
POPULATIONS INSIEME DI NUMEROSI ORGANISMI DELLA STESSA SPECIE
Composte da gruppi di cellule che derivano da divisioni cellulari successive a partire da una singola cellula parentale
Habitat is the place where a microbial population lives
sono costituite da diverse popolazioni microbiche (consorzi) che interagiscono tra di loro in un
determinato ambiente.
MICROBIAL COMMUNITIES
I componenti e il num di cellule che costituiscono una comunità microbica dipendono dalle risorse e dalle condizioni presenti in quel determinato habitat
ECOSYSTEM è costituito dagli organismi viventi unitamente ai
costituenti chimici e fisici dell’ambiente di cui fanno parte
Le popolazioni in una comunità microbica interagiscono tra loro in modo benefico e/o dannoso
In molti casi vi è cooperazione: per esempio i prodotti di scarto delle attività metaboliche di alcune cellule possono fungere da nutrienti per altre cellule
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MICROORGANISMS and their NATURAL ENVIRONMENT
Un ECOSISTEMA è controllato in modo significativo dalle TRASFORMAZIONI
MICROBICHE
I microorganismi, conducendo i loro processi metabolici, rimuovono nutrienti dall’ambiente circostante.
Allo stesso tempo, liberano nell’ambiente i loro prodotti di scarto
Nel tempo, un ECOSISTEMA gradualmente cambia, sia CHIMICAMENTE che FISICAMENTE
attraverso le trasformazioni microbiche dei nutrienti
MICROBIAL ECOLOGY studio dei microrganismi nei loro habitat naturali
STRATEGIES FOR THE ANALYSIS OF MICROBIAL COMMUNITY COMPOSITION
CULTURE-DEPENDENT
CULTURE-INDEPENDENT
Permettono l’ISOLAMENTO dei microrganismi mediante l’impiego di terreni selettivi specifici per la
crescita seguito da una CARATTERIZZAZIONE mediante
saggi fisiologici e metabolici
Tecniche che prescindono dalla coltivabilità di un microrganismo.
Consentono di monitorare la COMPOSIZIONE e le DINAMICHE di popolazione delle comunità microbiche presenti in varie matrici (acqua, suolo, reflui, alimenti etc.) senza ricorrere a
isolamenti preventivi
Conventional methods Molecular methods
Permettono di analizzare le caratteristiche biochimiche e genetiche delle cellule che compongono la comunità
MICROSCOPIC METHODS Utilizzando sonde fluorescenti permettono l’identificazione in situ dei microrganismi (FISH)
Le tecniche molecolari permettono la caratterizzazione sia della frazione coltivabile che di quella non coltivabile presente in un campione ambientale. Con le tecniche di coltivazione standard è invece possibile identificare solo quei microorganismi capaci di crescere su determinati terreni selettivi
La quantità di campione necessaria per lo studio della comunità microbica utilizzando tecniche molecolari è minore rispetto a quella necessaria per l’approccio classico
Solo con le tecniche culture-dependent è possibile avere a disposizione il microorganismo isolato per studi di carattere fisiologico e metabolico. È importante cercare di ottimizzare le tecniche di pre-arricchimento e arricchimento selettivi per riuscire a recuperare le popolazioni microbiche meno dominanti, stressate e non coltivabili, che sono presenti a bassa carica
CULTURE-INDEPENDENT methods
i) Direct lysis of bacterial cells from environmental samples
ii) The extraction of the nucleic acids from the sample
iii) The analysis of targeted sequences or of the whole body of genetic information
Two main types of molecular technique are available to study bacterial communities using DNA directly extracted from the soil: — molecular approaches which usually investigate parts of this information by focusing on genome sequences which are targeted and amplified by PCR that are called ‘partial community DNA analysis’; — molecular approaches which try to investigate all the genetic information in the extracted DNA and that are called ‘whole community DNA analysis’
ACIDI NUCLEICI
A. Tecniche che si basano sull’analisi delle sequenze di DNA indipendentemente da conoscenze pregresse circa la struttura della comunità microbica di interesse. In particolare le tecniche che si basano sulla PCR si sono rivelate un mezzo estremamente veloce ed efficace per l’identificazione, la caratterizzazione e il monitoraggio dei microorganismi in generale e dei batteri in particolare
B. Tecniche di ibridazione che impiegano sonde molecolari,
utilizzate quando esistono informazioni pregresse riguardo alla comunità microbica di interesse
Schematic representation of the different molecular approaches for assessing the genetic diversity and structure of bacterial communities. DNAs are directly extracted from environmental samples and subsequently analysed either by characterizing particular sequences targeted and amplified by PCR (approaches called ‘partial community DNA analysis’) or by characterizing all the genetic information (approaches called ‘whole community DNA analysis’). PCR products can be analysed by cloning or genetic fingerprint. Genetic fingerprint consists in a rapid and simple electrophoretic analysis of the PCR products enabling the analysis of the genetic structure of the community. Characterization of cloned sequences enables assessment of the genetic diversity of a community and can reveal the phylogenetic affiliation of the community members. Similarly, the sequencing of bands of fingerprint profiles can lead to identification of particular populations. Whole community DNA analyses such as cross-DNA hybridization and DNA fractionation by density gradient can help to assess the genetic structure of a community, whereas reassociation kinetics estimates genetic diversity in terms of the number of different genomes present in a community.
figure 1
PARTIAL & WHOLE COMMUNITY ANALYSIS TECHNIQUES
PARTIAL COMMUNITY ANALYSIS METHODS
These approaches consist in the analysis of PCR-amplified sequences.
The most commonly used target sequences are the genes of the
ribosomal operon, and particularly the rrs gene (16S rRNA) and the
spacer between the rrs and rrl genes (intergenic spacer (IGS) 16S-23S).
These methods include:
— ‘genetic fingerprinting’, which provides a global picture of the genetic
structure of the bacterial community;
— PCR fragment cloning followed by restriction and/or sequencing
analysis, which enable assessment of the diversity of the community in
terms of the number of different species and, to a lesser extent, the relative
abundance of these species.
TECNICHE DI PCR FINGERPRINTING
In generale le metodiche molecolari basate sull’utilizzo della PCR permettono di distinguere entità microbiche strettamente correlate dal punto di vista genetico attraverso l’ottenimento di specifiche impronte molecolari (molecular fingerprinting)
PCR con primers per marker genici di interesse TASSONOMICO
16S rRNA, 23S rRNA, regione intergenica 16S-23S
18S e 26S rRNA, ITS
rRNA RIBOSOMALI
I rRNA possono essere considerati dei veri e propri CRONOMETRI MOLECOLARI
perché caratterizzati dalla presenza al loro interno di zone più o meno conservate,soggette a differente variabilità durante il
processo evolutivo.
L’informazione contenuta nei rRNA fa si che il sequenziamento dei geni che codificano per le suddette macromolecole permetta l’individuazione,su base genetica, di generi e/o specie, anche nel caso di batteri di difficile classificazione
Molecole essenziali per la vita delle cellule Costituiscono la parte non proteica dei ribosomi
Elementi chiave della sintesi proteica
IL GENE 16S rRNA
LA SEQUENZA DEL GENE CHE CODIFICA PER IL16S rRNA NEI MICROORGANISMI PROCARIOTI (EUBATTERI E
ARCHEBATTERI) SI E’ RIVELATA UN OTTIMO STRUMENTO TASSONOMICO
È una sequenza universale tra i batteri Non è soggetta a trasmissione orizzontale Presenta regioni conservate e regioni variabili intersperse discriminanti le diverse specie batteriche
Le regioni al 5’ e 3’ del 16S rDNA sono fortemente conservate mentre quelle interne presentano una maggiore variabilità. I primers per le reazioni di PCR possono essere disegnati su tutte e due le regioni fornendo informazioni differenti: -Se disegnati al 5’ e 3’ permettono amplificazione e sequenziamento di regioni conservate che consentono l’identificazione del genere -Se disegnati sulle regioni ipervariabili è possibile ottenere anche l’identificazione della specie
RDP – Ribosomal Database Project – allineamento e identificazione
The genetic fingerprints provide complex band profiles (i.e. a high number of different bands per profile) which yield a representative of the genetic structure of the community as a whole or of a section of it, defined by the selected primers. These profiles are not directly interpretable in terms of richness and evenness, since one band may originate from different species and one cell may be represented by several bands. This is particularly true with ribosomal sequences, since a single bacterial species may have several different rRNA sequences and different bacterial species may have closely related rDNA sequences.
T-RFLP (Terminal-Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
È una tecnica che si basa sulla digestione con endonucleasi di restrizione di prodotti di PCR ottenuti direttamente dal DNA totale estratto dalla matrice ambientale di interesse
Detti frammenti vengono generati da primers complementari a sequenze consenso del 16S rRNA gene, marcati all’estremità ‘5
Gli ampliconi digeriti provenienti da tutti i batteri presenti all’interno di una comunità sono separati o con elettroforesi su gel o con elettroforesi capillare. Solo i frammenti che portano l’estremità marcata vengono rilevati e contemporaneamente analizzati da un sequenziatore automatico.
La T-RFLP unisce il vantaggio di poter essere facilmente applicabile per l’analisi di più campioni con quello di fornire in breve tempo informazioni a carattere tassonomico mediante il
diretto sequenziamento degli ampliconi
Svantaggio: tecnica molto costosa
ARDRA – Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis
Consiste nello studio dei profili elettroforetici ottenuti dopo digestione con enzimi di restrizione
della sequenza di 16S rDNA ottenuta mediante PCR
Tecnica efficace, veloce, semplice ed economica per l’identificazione della composizione di comunità microbiche complesse
• Permette analisi simultanea di un elevato numero di microorganismi • Fornisce importanti informazioni sulle popolazioni microbiche presenti in ambienti differenti descrivendo il loro grado di biodiversità e il loro comportamento nel tempo • Riesce a discriminare i microorganismi a livello di specie
COSTRUZIONE DI LIBRARY di 16S/18S rDNA
1. Estrazione del DNA totale dalla matrice ambientale di interesse 2. Amplificazione dell’intero gene16S/18S rDNA o di una regione
interna di interesse 3. Inserimento del gene in vettore di clonaggio (pGEM, pBS) e
ottenimento di un numero di cloni compreso tra 100 e 200 4. Screening dei cloni ottenuti mediante analisi RFLP sull’inserto
(metodica ARDRA)
CLONAGGIO E SEQUENZIAMENTO DEL 16S/18S rDNA
ARDRA – Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis
L’ARDRA può essere utilizzata per lo screening di microorganismi coltivabili e non coltivabili
1. Isolamento dei batteri dall’ambiente naturale mediante le tradizionali tecniche di coltura/ottenimento del DNA totale dalla matrice
2. Amplificazione del 16S/18S rDNA dei singoli isolati via PCR 3. Digestione degli ampliconi ottenuti mediante l’impiego di
endonucleasi 4. Separazione elettroforetica dei prodotti della digestione per
ciascun amplicone e ottenimento di profili elettroforetici tipici (impronta) per ciascun amplicone digerito
5. Suddivisione dei profili ottenuti per ciascun amplicone in gruppi definiti OTU (Operational Taxonomic Units)
6. Sequenziamento del 16S/18S rDNA per il capostipite di ogni OTUs
7. Allineamento delle sequenze ottenute con quelle presente in banca dati mediante programma BLAST
8. Assegnazione dell’appartenenza a genere e specie
Su 16S/18S/26S
PROFILO ARDRA - ESEMPIO
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
Tecnica comunemente impiegata per studi di ecologia microbica
È UNA TECNICA SEPARATIVA ELETTROFORETICA CHE PERMETTE DI IDENTIFICARE SINGOLE VARIAZIONI DI
SEQUENZA IN UN FRAMMENTO DI DNA
1. Estrazione del DNA totale dalla matrice ambientale 2. Amplificazione di regioni ipervariabili del 16S o altri geni
codificanti per rRNA 3. Separazione elettroforetica su gel di poliacrilammide in
presenza di un denaturante chimico(urea e formammide)
La separazione si ottiene sfruttando la diversa mobilità elettroforetica, su gel di poliacrilammide contenente un gradiente lineare di denaturante, di molecole di DNA a doppio filamento di medesima lunghezza ma differente sequenza nucleotidica
Come avviene la separazione elettroforetica
Frammenti con sequenze diverse possiedono profili di denatuazione differenti e cessano di migrare lungo il gel in corrispondenza di posizioni non uguali
La denaturazione dei frammenti di DNA procede per domini di melting ovvero stretch di paia di basi aventi la stessa temperatura di denaturazione (Tm).
Una volta che il dominio avente la temperatura di denaturazione più bassa raggiunge il punto nel gel a cui corrisponde la sua Tm, si assiste al passaggio da una conformazione a elica ad una conformazione parzialmente svolta del frammento di DNA
ARRESTO DELLA MIGRAZIONE DELLA MOLECOLA IN QUEL DETERMINATO PUNTO DEL GEL
Quale tipo di informazione si ottiene
L’analisi PCR-DGGE fornisce una serie di profili elettroforetici con una distribuzione caratteristica di
bande, ciascuna riconducibile ad una specie batterica, descrivendo nel suo complesso la struttura tassonomica e
il grado di diversità della comunità microbica associata alla matrice ambientale in studio
I primers utilizzati
All’estremità 5’ del primer forward viene aggiunto un clamp (stringa di basi nuceotidiche) in GC di circa 30-40 paia di basi, caratterizzato da una Tm più elevata rispetto a qualsiasi altra regione del frammento del DNA 16S amplificato.
Il GC-clamp quindi funge da dominio ad alta temperatura di melting impedendo così la completa dissociazione del filamento di DNA in molecole a singolo filamento
Questa sequenza viene co-amplificata nella reazione di PCR e incorporata nei frammenti
LA DGGE VIENE CONSIDERATA UN POTENTE STRUMENTO IN GRADO DI MONITORARE ILCOMPORTAMENTO DELLE COMUNITA’
BATTERICHE A SEGUITO DI CAMBIAMENTI AMBIENTALI IN QUANTO POSSONO ESSERE ANALIZZATI SIMULTANEAMENTE MOLTI
CAMPIONI COLLEZIONATI A DIVERSI INTERVALLI DI TEMPO, COSA CHE NON PUO’ ESSERE FATTA ALTRETTANTO AGEVOLMENTE CON
PROCEDIMENTI DI CLONAGGIO
• conoscere la composizione di una comunità microbica complessa
• seguire nel tempo l’evoluzione di una comunità microbica, per esempio a seguito di un intervento di bonifica o a causa di una pressione sellettiva esercitata da un agente contaminante
• monitorare la persistenza di alcuni ceppi microbici all’interno di una comunità complessa a seguito di inoculo massivo (bioaugmentation)
• monitorare la presenza di genotipi di interesse all’interno della comunità microbica e la loro evoluzione nel tempo
Per conoscere la composizione di una comunità microbica complessa:
le bande caratteristiche dei profili possono essere tagliate da gel e successivamente sequenziate per avere una correlazione filogenetica dei membri della comunità microbica
1. Taglio delle bande maggiormente rappresentative 2. Eluizione della banda da gel 3. Ri-amplificazione del frammento di interesse 4. Sub-clonaggio del frammento in un opportuno vettore 5. Sequenziamento e confronto in banca dati
il profilo DGGE può essere ibridato con sonde gruppo-specifiche per determinare la presenza di una specifica popolazione batterica
D1 G H D2 D3
I II III I II III
E1 E2 E3 F1 F2 F3
I II III I II III I II III I II III I II III I II III I II III
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
LIMITI
• La DGGE è in grado di evidenziare solo gli amplificati ottenuti dalle specie predominanti presenti nella comunità, infatti non è possibile ottenere la separazione di tutti i frammentidi16S rRNA (o di altri geni target)ottenuti dall’intera gamma di microorganismi presenti all’interno di una matrice complessa
Numerosi studi hanno mostrato che solo le popolazioni batteriche rappresentanti l’1% o aliquote maggiori della
comunità microbica possono essere evidenziate mediante PCR-DGGE
• Con la DGGE è possibile separare solo frammenti di piccole dimensioni, idealmente fino a 500 bp
• spesso si osserva la migrazione nella stessa posizione di frammenti di DNA di diversa sequenza ma con comportamento di melting molto simile che rende difficile il recupero di essi dal gel di poliacrilammide
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
CHIMERAS - A hybrid DNA molecule generated by ligating
DNA restriction fragments from different sources.
Transcription and translation of the chimeric DNA plasmid
results in a chimeric protein.
HETERODUPLEX - A DNA molecule, the two constitutive
strands of which derive from distinct sources and hence are
likely to be somewhat mismatched
DG-DGGE (Double Gradient – Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
Il doppio gradiente è costituito dal gradiente chimico e da un gradiente di porosità (% di poliacrilammide)
La presenza del gradiente in porosità aumenta il grado di risoluzione delle singole bande
Il gradiente in porosità viene realizzato parallelamente a quello di denaturante
RT-DGGE (Reverse Trascriptase – DGGE)
In questa variante migrano nel gel di poliacrilammide i cDNA derivanti dalla retrotrascrizione dell’RNA estratto dal campione
Questa analisi fornisce importanti informazioni sulla vitalità dei microrganismi che compongono la comunità microbica di interesse
TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis)
In questo caso il gradiente non è costituito da un agente chimico ma dalla temperatura. Un apposito dispositivo infatti crea un gradiente di temperatura nello spazio. Gli ampliconi ottenuti con PCR vengono ancora una volta separati sfruttando la loro diversa Tm
SSCP (Single-Stranded Conformational Polymorphism)
Come la DGGE è una tecnica che permette di studiare le diversità di comunità microbiche complesse attraverso l’analisi dei geni 16S rDNA
I prodotti di PCR ottenuti vengono digeriti con esonucleasi in modo da ottenere singoli filamenti
In condizioni non denaturanti i singoli filamenti assumono una diversa conformazione in base alla loro sequenza nucleotidica
Quindi, a causa della loro diversa mobilità elettroforetica, le diverse conformazioni possono essere separate per elettoforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti
Le analisi SSCP richiedono un’elevata ottimizzazione delle condizioni operative e basse temperature di lavoro. La capacità discriminatoria della SSCP, generalmente più efficiente per frammenti fino a 400 bp, dipende dalla posizione delle variazioni nella sequenza del gene studiato
I prodotti possono essere rilevati marcando uno o entrambi i primers con composti fluorescenti
CULTURE-INDEPENDENT methods
FISH (Fluorescence In situ Hybridisation)
È una metodica frequentemente utilizzata in microbiologia ambientale per lo studio di comunità microbiche complesse
L’ibridazione,basata sull’impiego di oligonucleotidi marcati con composti fluorescenti, viene indotta su cellule intere fissate
Le cellule bersaglio vengono osservate con un microscopio a epifluorescenza
L’impiego di sonde molecolari prevede la conoscenza del gene da studiare. Quando il gene target è il 16S possono essere costruite sia sonde universali in grado di appaiarsi con gli rRNA di eubatteri o archebatteri su regioni conservate,sia sonde specie-specifiche aventi come bersaglio le regioni altamente variabili dell’rRNA
La FISH può essere applicata sia per monitorare la presenza di particolari gruppi di microorganismi in una matrice
complessa, sia per individuare la presenza di una determinata specie batterica
The sample is first fixed to stabilize the cells and permeabilize the cell membranes. The labelled oligonucleotide probe is then added and allowed to hybridize to its intracellular targets before the excess probe is washed away. The sample is then ready for single-cell identification and quantification by either epifluorescence microscopy or flow cytometry.
FISH
CARD-FISH (Catalyzed Reporter Deposition)
The principle of CARD is as follows: in the presence of hydrogen
peroxide, horseradish peroxidase (HRP) converts tyramide into a
radical intermediate.
This radical tyramide nonspecifically reacts with aromatic compounds such as
tyrosine and tryptophan, in cells or blocking reagents. This radical reaction occurs
only near the HRP molecule and on a very short timescale. As a result, a
great number of tyramides are deposited around the HRP molecule. Tyramides
with conjugates (e.g., fluorescein, cyanine dyes, Alexa fluor dyes, biotin, etc.) for
the CARD amplification system are commercially available from several
companies. Alternatively, tyramide conjugates can be prepared by simple and
rapid chemical reactions
IBRIDAZIONE SU MICROARRAY
TECNOLOGIA GENOMICA utilizzata per lo studio dell’espressione genica e per la ricerca di mutazioni puntiformi
MICROARRAY: supporto solido (plastica, vetro) cui sono adesi in modo covalente e in una disposizione ordinata acidi nucleici che funzionano come sonde
Estrazione del DNA o RNA dal ceppo batterico Frammentazione e marcatura con fluorocromi Ibridazione con le sonde fissate sul microarray Analisi con uno scanner a fluorescenza per rilevare quale sonda ha ibridato
1. Quali sequenze e quali geni sono presenti anche nel ceppo o campione ambientale analizzato
2. Quanti e quali geni sono espressi in quel ceppo
IBRIDAZIONE SU MICROARRAY
In contesto microbiologico-ambientale:
Collezioni di geni funzionali
Collezioni di geni marcatori tassonomici (16S rDNA)
Interi genomi di ceppi di riferimento
Per evidenziare la presenza di geni che codificano enzimi coinvolti nei processi biogeochimici
Per identificare le specie presenti in un campione ambientale
Metodo molto potente in quanto permette di descrivere una comunità batterica in ‘tempo reale’
Per valutare le differenze nel contenuto genomico tra un ceppo di riferimento e un ceppo naturale isolato nell’ambiente
METAGENOMICA
ISOLAMENTO DIRETTO DI DNA DALL’AMBIENTE E SUO SUCCESSIVO CLONAGGIO E SEQUENZIAMENTO
è un potente strumento per la scoperta della genetica e fisiologia dei microrganismi non coltivabili
isolamento del DNA genomico dall’ambiente clonaggio del DNA in apposito vettore trasformazione di un ceppo ricevente screening della libreria metagenomica così ottenuta
Selezione dei cloni per PCR o ibridazione (per la presenza di marcatori filogenetici o di geni di interesse)
Sequenziamento casuale massivo
Selezione dei cloni per espressione di un fenotipo particolare (specifiche attività enzimatiche o produzione di antibiotici)
L’ANALISI STATISTICA
Quantificazione della diversità genetica
Misura della distanza genetica
Analisi della struttura genetica
Analisi delle relazioni genetiche tra le popolazioni
Confronto dei profili (aplotipi): numero di bande diverse o in comune
Misura del rapporto tra le bande condivise tra i due campioni rispetto alle bande totali presenti
Per correlare la diversità osservata alle variabili presenti nell’ambiente e quindi dare significato biologico-funzionale alle differenze osservate
AMOVA (analisi della varianza molecolare)
Analisi multivariata
Stima della distanza tra sequenze con numero di nucleotidi differenti
UPGMA
I trattamenti statistici utilizzati includono quattro diversi livelli di analisi
L’evoluzione è il processo per il quale i cambiamenti che intervengono in una linea di discendenti portano, nel tempo, alla formazione di nuove varietà, ed eventualmente di nuove specie di organismi. L’evoluzione avviene in ogni sistema autoreplicantesi in cui la variazione è il risultato del processo di mutazione e la selezione si basa sulla capacità adattativa differenziale. Così nel tempo evolvono sia le cellule sia i virus.
Le relazioni evolutive tra gli organismi sono oggetto di studio della filogenesi. Le relazioni filogenetiche tra cellule possono essere dedotte confrontando l’informazione genetica (sequenza nucleotidica o amminoacidica) che esiste nei loro acidi nucleici o nelle proteine. Le macromolecole che formano il ribosoma , RNA ribosomali, sono strumenti eccellenti per valutare le relazioni evolutive.
ATTTTGTTCACTAATAGGGGGCGATTGGGCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATCGGCCACACCGTGGCAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTGCTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTGAGATAGGGTTTCTGGGATTGGCTTACCGTCGCCGGCTTGCAGCCCTCTGTCCCTACCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCGGTCTCCTTAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACGCGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCGACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTCTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGCGAACTTAACGCGTTAGCTTCGATACTGCGTGCCAATTGCACCCCAACATCCAGTTCGCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGTGTCAGTGTTGGTTCCAGGTAGCTGCCTTTCGCCAATGAGATGTTCCTTCCCGATCTCTACGCATTTCCACTGCTACACCGGGAATTTCCGCTACCCTTCTACCACACTTCTAGTTGTCAGTTTCCACCTGCAGTTCCCAGGGTTGGAGGCTCAGGGCTTTTCCACAACAGACTTAAACAAACCCACCCTACGCACGCCTTTAGCGCCCAGGTAATTCCGGAGTTACGGCTTGCACCCCTTTCGTATTACCGGCGGCTGCCTGGACGAAGTTACCGGTGCCTTATTCTTTGGAACCGTCTATCCCGACCAAGATTACGCTTGAATCCTTTCCACAAGCCTTTACAACTCGGAGCCTCTATTTCA
GenBank Overview What is GenBank? GenBank ® is the NIH genetic sequence database, an annotated collection of all publicly available DNA sequences (Nucleic Acids Research, 2013 Jan;41(D1):D36-42). GenBank is part of the International Nucleotide Sequence Database Collaboration , which comprises the DNA DataBank of Japan (DDBJ), the European Molecular Biology Laboratory (EMBL), and GenBank at NCBI. These three organizations exchange data on a daily basis. The complete release notes for the current version of GenBank are available on the NCBI ftp site. A new release is made every two months. GenBank growth statistics for both the traditional GenBank divisions and the WGS division are available from each release. An example of a GenBank record may be viewed for a Saccharomyces cerevisiae gene.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
Choose a BLAST program to run.
Program Program Description
nucleotide blast Search a nucleotide database using a nucleotide query
Algorithms: blastn, megablast, discontiguous megablast
protein blast Search protein database using a protein query
Algorithms: blastp, psi-blast, phi-blast, delta-blast
blastx Search protein database using a translated nucleotide
query
tblastn Search translated nucleotide database using a protein
query
tblastx Search translated nucleotide database using a translated
nucleotide query
1) Connect to the NCBI BLAST Homepage with your browser.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
2) In the Nucleotide section on the page choose the link to the Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) search algorithm
3) Enter your DNA sequence into the Search text box Copy your DNA sequence by either selecting the sequence with the mouse and using the Copy command in the Edit menu of your browser. Click on the Search dialog box in the NCBI window and paste your DNA sequence into the box by choosing the Paste command under the Edit menu, or the paste keyboard command. If you only want to search with a subset of your sequence you can select these bases by putting in the appropriate numbers in the Set subsequence dialog boxes. However it is often easier just to edit the sequences that you want in text edit program (Word), and paste them in. .
4) Seelct the default (nr) database in the Choose database menu box. There are many different databases that you can choose among to do your searches. Some databases only contain DNA or protein sequences for a specific organism, such as humans or mouse. Others contain different types of DNA (genomic vs cDNA sequences, etc.). To search only a specific database, click on the Database Menu box and while holding on the mouse button, scroll to the database you want, and release the mouse button. The nr is the default value. The nr nucleotide database search includes all Non-redundant GenBank + EMBL + DDBJ + PDB sequences (but no EST, STS, GSS, or HTGS sequences). The nr peptide sequence database includes all non-redundant GenBank CDS (coding sequence) translations + PDB + SwissProt + PIR + PRF. Note that the program is smart enough to determine which nr database to search according to which blast program you run (e.g. peptide database for blastp, nucleotide database for blastn). If you want to search the EST sequences, you have to do a separate blast
5) Click on the BLAST! button to perform the search. To run the Blast search click on the BLAST! button. However, if desired, there are other options that you may want to alter before doing your search to reduce or increase the number of matches or to change the output from of the data from the search. A short description of these options is shown below.
Task
s
R
a
n
k
Name Strain Authors Taxonomy Access
ion
Pairw
ise
Simil
arity
(%)
Diff/
Total
nt
Comp
leten
ess
(%)
meg
aBLA
ST
score
BLASTN
score
1
Lysobacter
yangpyeong
ensis
GH19-
3(T)
Weon et al.
2006
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Lysobacter;
Lysobacter yangpyeongensis;
DQ191
179
47.47
47.47
622/1
184 99.7 0
2 Lysobacter
oryzae
YC6269
(T)
Aslam et al.
2009
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Lysobacter;
Lysobacter oryzae;
EU376
963
47.17
47.17
626/1
185 97.0 0
3 Lysobacter
daejeonensis
GH1-
9(T)
Weon et al.
2006
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Lysobacter;
Lysobacter daejeonensis;
DQ191
178
45.95
45.95
640/1
184 99.7 0
4
Stenotropho
monas
pavanii
ICB
89(T)
Ramos et al.
2011
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae;
Stenotrophomonas; Stenotrophomonas pavanii;
FJ7486
83
45.62
45.62
640/1
177 100 0
5 Pseudomona
s pictorum
ATCC
23328(
T)
Gray and
Thornton
1928
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae;
Stenotrophomonas; Pseudomonas pictorum;
AB021
392
45.62
45.62
640/1
177 98.7 0
6 Pseudomona
s hibiscicola
ATCC
19867(
T)
Moniz 1963
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae;
Stenotrophomonas; Pseudomonas hibiscicola;
AB021
405
45.54
45.54
641/1
177 98.8 0
7
Stenotropho
monas
koreensis
TR6-
01(T)
Yang et al.
2006
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae;
Stenotrophomonas; Stenotrophomonas koreensis;
AB166
885
45.42
45.42
644/1
180 99.7 0
8 Lysobacter
bugurensis
ZLD-
29(T)
Zhang et al.
2011
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Lysobacter;
Lysobacter bugurensis;
http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/ezt_identify
