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Molekulare Diagnostik

1Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Assoc. Prof. Dr. Juliane Bogner-Strauss

DNA-Fingerprint(Syn. DNA Profiling)

Dient dazu Individuen genetisch zu unterscheidenDazu braucht man genetischen Polymorphismus (Bsp. Blutgruppen-Polymorphismus/Landsteiner).

Als Polymorphismus (‚Vielgestaltigkeit‘) bezeichnet man das Auftreten einer oder mehrerer Genvarianten (sprich: eines oder mehrerer Allele) innerhalb einer Population. Definitionsgemäß muss die Auftretenshäufigkeit der Genvariante (die Allelfrequenz) über 1% sein, andernfalls ist es eine Mutation.



DNA-Fingerprint(Syn. DNA Profiling)

Dieses Verfahren erzeugt für das Genom eines Individuums ein spezifisches DNA-Fragmentmuster.

Diese Muster bezeichnet man als:Genetischer Fingerabdruck



Verwendung des Fingerprints• Vaterschaftstest (allg. Abstammungsverhältnisse)

50-100ng DNA reichen: aus 1-2 µl Blutaus Spuren von Samenflüssigkeitaus Haarwurzel(n)

• Forensische Analysen• Diagnostik von Gendefekten• Reinheitsüberwachung von Zelllinien• Identifizierung von Spender und Empfängerzellen bei

Knochenmarkstransplantationen• Eiigkeitsbestimmung von Zwillingen



DNA-FingerprintEs gibt drei Methoden genetischer Fingerprints:• RFLP (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus)• VNTRPs (Variable number of tandem repeats Polymorphismus)• STRPs (Short tandem repeats Polymorphismus)

Verwendete Methoden zur Bandenvisualisierung:• PCR• Southern Blot



Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)

• spezielle Klasse von DNA-Sequenz Polymorphismen• lokal auftretende DNA-Sequenz Veränderungen durch:

einzelne BasenaustauscheDNA UmlagerungenDNA InsertionenDNA Deletionen

• RFLP, wenn durch Basenaustausch die Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym betroffen ist



Restriktionsenzym• Es gibt etwa 600• Werden aus Bakterien gewonnen, daher ihre Namensgebung

als Bsp. EcoRI aus E. Coli Bakterien• Sie erkennen meist Palindrome (OTTO) mit 4, 6 oder 8

Basenpaaren• Der Schnitt kann gerade sein (engl. blunt ends, deut. stumpfe

oder glatte Enden, z. B. SmaI).CCCIGGGGGGICCC

• Der Schnitt kann auch versetzt sein (engl. sticky ends, deut. klebrige Enden, z. B. EcoRI). GIAATTCCTTAAIGKlebrige Enden sind leichter ligierbar (mittels Ligase zu verbinden).



RFLP verursacht

• Auftreten oder Verschwinden von Schnittstellen• Schneiden der genomischen DNA führt also zu:

verkürzten DNA-Fragmentenverlängerten DNA-Fragmenten

• Veränderung des Fragmentmusters der geschnittenen genom. DNA nach Gelelektrophorese

• Verwendbar als genetische Marker (Vererbung nach Mendel)

• Heterozygote Individuen besitzen das mutierte (RFLP) und das normale Gen



RFLP Analyse mittels PCR• Die Chromosomen A und B

unterscheiden sich in der Schnittstelle T. Mittels PCR wird jetzt die DNA amplifiziert und mit einem Enzym geschnitten (bei T).

• Bei Individuen AA keine Restriktionsschnittstelle

• Bei Individuen AB, trägt ein Allel die Schnittstelle T, das andere nicht.

• Bei Individuen BB tragen beide Allele die Schnittstelle T.

• Menge an DNA entsprechend!!!

PCR dient nur der DNA-Anreicherung



VNTRPs (Variable number of tandem repeats Polymorphismus)

Verschiedene Individuen einer Population besitzen an bestimmten Stellen im Genom unterschiedlich viel tandemartig wiederholte Minisatelliten: Repetitive Sequenz-Satelliten DNA!

z.B. kommt eine Nukleotidfolge (10-100 Nukleotide) bei einem Individuum 15-mal, beim anderen 22-mal vor.

Enzyme schneiden zwar bei allen an denselben Stellen, aber dazwischen liegen unterschiedlich viele Tandemrepeats.



VNTRPs mittels PCR

a.) DNA mit unterschiedlich vielen Tandemrepeats

b.) PCR mittels individuell gesetzter Primer

c.) Gelelektrophorese liefert unterschiedlich lange DNA Fragmente aufgrund der unterschiedlich vielen repetitiven Sequenzen

Vorteil: durch PCR wird DNA angereichert. Schneiden der DNA ist nicht nötig!!!



Southern Blot• Wird vor allem verwendet,

wenn extrem wenig DNA vorhanden ist

• Bei DNA Fingerprints notwendig, weil sonst viel zu viele Fragmente am Gel wären (EtBr Färbung würde überlappende Banden geben)

• Nachteile: Gefahr durch Radioaktivität:Phosphor-32Dauer: 2 Tage



VNTRPs mittels Southern Blotb.) zeigt 6 verschiedene Chromosomen, die mittels

den Enzymen H1 und H3 an denselben Stellen geschnitten werden. Dazwischen liegen unterschiedl. viele TandemrepeatsAuftragen aufs Gel, Blotten, Hybridisieren, Röntgenfilm (Southern Blot)!

a.) das Chromosom E besitzt nur 3 Tandemrepeats und damit liefert es geschnitten das kürzerste DNA Fragment.

Wahrscheinlichkeit, dass 2 versch.Personen, das gleiche Bandenmusterhaben ist nur sehr gering (Gerichtsmedizin)

H1 = Hinfl 1H3 = HaeIII



STRPs (Short tandem repeats Polymorphismus)

Verschiedene Individuen einer Population besitzen an bestimmten Stellen im Genom unterschiedlich viele tandemartig wiederholte Mikrosatelliten:

Wiederholungen 2-4bp (gatagatagatagatagatagata)(vgl. VNTRPs 10-100 bp)

Bzgl. dieser STRPs sind so gut wie alle Individuen einer Population heterozygot und daher untereinander verschieden. Wird daher für kommerzielle Tests verwendet.



DNA Fingerprint mittels VNTRPs-Vaterschaftstest

• Abb. zeigt Vaterschaftstest. Die Pfleile zeigen an, wo sich das Profil des Kindes von jenem des V2 unterscheidet, damit kommt V2 nicht als Vater in Frage.

• Technik: DNA der Probanden wird mit Enzymen geschnitten, auf Agarosegel aufgetrennt, auf Trägerfolie geblottet und mittels bestimmter radioaktiv markierter Sonde(n) hybridisiert und sichtbar gemacht. Nicht radioaktiv nicht möglich, da viel zu viele Fragmente vorhanden sein würden (Überlappung).



Familienzugehörigkeit????• Wie sind die Eltern

und die Kinder verwandt?

• Wie können sie die Verwandtschaft erklären?



DNA-Fingerprint-Diskussion• Sollte man DNA Proben von Freigesprochenen aufbewahren??• Was halten sie von einer nationalen DNA-Datenbank??• DNA Analysen sind in der Lage über Gendefekte, Funktionsstörungen und

Krankheiten Auskunft zu geben. Sinnvoll in der Präimplantationsdiagnostik??

-Genet. Defekt in Embryos -Alter der Eltern-Geschlechtswunsch für Embryos-Bsp. Großbritanien-IVF um erkranktes Kind zu retten (PGD (Preimplantation Genetic Diagnosis) um passendes befruchtetes Ei zu implantieren)

Sinnvoll für Versicherungen??-Ausschluß von chronisch Erkrankten?-höhere Raten für chronisch Erkrankte?

Sinnvoll für Arbeitgeber??-Krankenstand

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