Caso clnico 3 Problema 3

TutorDr. Enrique CastellnPresentadorKenneth Walker

Universidad de ChileFacultad de MedicinaEscuela de Tecnologa MdicaCurso de Microscopa ElectrnicaMORPHOMETRIC ANALYSIS OF LEYDIG CELLS IN THE NORMAL RAT TESTIS

HIROSHI MORI and A. KENT CHRISTENSEN

From the Department of Anatomy, Temple University School of Medicine, Philadelphia,Pennsylvania 19140. Dr. Mori's present address is the Department of Pathology, Ehime UniversitySchool of Medicine, Matsuyama, Ehime 790, Japan, and Dr. Christensen's present address is theDepartment of Anatomy, The University of Michigan Medical School, Ann Arbor, Michigan 48109.J . CELL BIOLOGY The Rockefeller University Press. February 1980; Volume 84; 340-354INTRODUCCINLas clulas de Leydig son la principal fuente de andrgenos en el hombre.

La caracterstica ultraestructural ms prominente exhibida por estas clulas corresponde a su abundante retculo endoplasmtico liso (REL) y sus numerosas mitocondrias.

La biosntesis de la testosterona es catalizada por enzimas localizadas predominantemente en el REL y en el citoplasma adyacente a ste.

Sin embargo, algunos pasos de la biosntesis ocurren en la membrana mitocondrial interna, de ah su abundancia.El total de clulas de Leydig en 1g de testculo de rata produce 6,7ng de testosterona/min in vivo.

Si pudiramos determinar el nmero de clulas de Leydig en 1 gramo de testculo de rata, podramos calcular el promedio de produccin de testosterona por clula.X cantidad de clulas 1gr de testculo 6,7ng de testosterona/min X clulas de Leydig 6,7ng de testosterona/min 1 clula de Leydig Y ng de testosterona/min Si se pudiese medir el rea de la superficie de las membranas intracelulares donde ocurre la esteroidognesis, podra conocerse la razn promedio de la sntesis de testosterona por unidad de rea.

rea total de las superficies esteroidognicas 6,7ng de testosterona/min1m2 Xng de testosterona/minrea total de las superficies esteroidognicas 1gr de testculo 6,7ng de testosterona/min Estos valores podran dar a conocer la eficiencia bioqumica a nivel de membranasPROBLEMAVarios trabajos se haban publicado hasta ese entonces, los que trataban la morfometra testicular en variados aspectos.

Sin embargo, haca falta un estudio morfomtrico ms amplio respecto a las clulas de Leydig en el testculo normal.

Anteriormente, ya se haban realizado estudios en testculos extrados de ratas con tratamiento hormonal haciendo estimaciones por morfometra.

Sin embargo, las estimaciones se realizaron con un mtodo de preservacin de tejidos de inferior calidad al que se propone a travs de este trabajo.

OBJETIVOObtener informacin cuantitativa respecto a las clulas de Leydig y sus organelos que pueda ser correlacionada con la informacin bioqumica y fisiolgica disponible.

Mejorar los protocolos de preservacin de los tejidos para obtener un anlisis morfomtrico ms preciso.MATERIALES Y MTODOS 4 ratas adultas Sprague-Dowley de pesos 255g, 265g, 345g y 365g Inyeccin intraperitoneal de Trypan Blue 3% dos das antes de sacrificarlosSacrifican ratasFijacin por perfusin de los testculos de la rata

Glutaraldehido al 3% tamponado con 0,1M S-colidina. Se seccionan los testculos perpendicularmente al eje mayor10 trozos de un testculo. 5 trozos para cada tipo de estudio.Microscopa de LuzMicroscopa electrnicaDeshidratacin con etanoles ascendentesInclusin Glicol-MetacrilatoCortes de 2mTincin Fucsina bsica-Azul de toluidinaContratincin con H. WeigertPost-fijacin con OsO4 2% sin tamponarInmersin solucin de Ferrocianuro 1,5%Deshidratacin con etanoles ascendentesImpregnacin e inclusin en Epon 812Cortes 500-900AContraste con acetato de Uranilo 2% y Citrato de plomo

Corte de testculo de rata. ST: tbulo seminnero; BV: vasos sanguneos. Barra: 100 m. 84x

Tejido intersticial testicular: Clulas de Leydig; macrfagos (M); BV: capilares. Barra: 10 m.

Micrografa electrnica a bajo aumento de clulas de Leydig de testculo fijado por perfusin. Barra: 1 m.

Citoplasma de dos clulas de Leydig, mostrando retculo endoplasmtico liso (SER), retculo endoplasmtico rugoso (RER), mitocondria (Mit), peroxisomas (Per), y lisosomas (Lys). Barra: 1 m. 19400 xPROCEDIMIENTO MORFOMTRICOMORFOMETRAEl uso de mtodos cuantitativos a microscopa de luz y electrnica (llamados morfomtricos o estereolgicos) permiten la evaluacin de estructuras en tres dimensiones a partir de imgenes bidimensionales

Clculo de densidad volumtricaMICROSCOPA DE LUZPara la estimacin de la densidad volumtrica de los tbulos seminferos y del tejido intersticial, se estudiaron cinco cortes por animal con una cuadrcula de 441 puntos.

La densidad volumtrica de una estructura X se estima como

(La suma de los puntos que estn sobre la estructura X)

(Totalidad de los puntos sobre una entidad a eleccin que contenga a la estructura X) El Volumen de la cpsula testicular se calcul como

(Ancho medio de la cpsula del testculo) x (rea de superficie del testculo)

El conteo para determinar la densidad volumtrica de las clulas de Leydig, fue hecho con una lente objetiva de 40x y una cuadrcula de 441 puntos.El calculo de la densidad numrica por la ecuacin de Floderus es preciso solo si los ncleos son esfricos.

En este estudio se observaron ncleos elipsoidales. Sin embargo, el error que puede causar esta caracterstica no es lo suficientemente significativo y puede obviarse.

MICROSCOPA ELECTRNICADebido a que las clulas de Leydig se encuentran dispersas en el tejido y solo representan el 2,7% del rea del corte, no fue prctico realizar evaluaciones al azar.

Debido a lo anterior, se hizo cortes consecutivos y se montaron en una misma grilla.

Los autores se aseguraron de que la misma clula de Leydig no estuviese en ms de una sola microfotografa.Densidad volumtrica de organelosDensidad superficial de organelosMicrofotografas10.800X72.000X4 ratas adultos Sprague-Dowley3 ratas1 rataDensidad superficial de membrana plasmtica de clulas de LeydigProveer informacin adicional de densidad volumtrica de organelos para su comparacin10 bloques x 320 bloques x 1DENSIDAD VOLUMTRICA EN ORGANELOS

Determinacin de densidad volumtrica de mitocondriasClculo de la densidad de superficie (Sv)l Nmero de intersecciones para el organeloPT Nmero de puntos al final de las lneas que caen en la clula de LeydigZ Promedio de la longitud de las lneas individuales en trminos de la escala de la micrografa

Anteriormente habamos calculado la densidad volumtrica de la clula de Leydig en el tejido testicular.

Ahora podemos relacionarla con la Sv multiplicndolas para obtener la densidad de superficie de la mitocondria por volumen de tejido testicular.

Clculo de la densidad numricaMicrofotografas en cortes de 0,5 m de grosor indicaron que las mitocondrias de las clulas de Leydig son en su mayora cilndricas y con sus dos extremos hemisfricos.

Para encontrar el nmero promedio de mitocondrias por clula, el volumen total de mitocondrias por clula es dividido por el volumen promedio de una sola mitocondria

La multiplicacin del promedio de mitocondrias por clula y la densidad numrica de clulas de Leydig es igual a la densidad numrica de mitocondrias.

Errores sistemticos de medicinFACTORES DETERMINANTES Fijacin Deshidratacin e inclusin Corte Distorsin ptica Papel de impresin Efectos del espesor de corte Tamao y localizacin de la muestra

FIJACIN

Causa del aumento de volumen: presin de perfusinDESHIDRATACIN E INCLUSIN

MOMETReduccin22,2%11,4%Volumen incrementado en un 20,1% despus de la fijacin por perfusin.

rea incrementada en un 9,6% despus del corte

Factores de correccin fueron aplicados solo a la densidad superficial y dimetro de estructuras

CORTEGMAEPONVariacin de ancho9,4%-Variacin de longitud4,8%10,7%

Variacin total del rea de corte 14,7%10,7%

MOMETEspesor1.76 m 0.03 SEM51 nm 0.52 SEMDISTORSIN PTICA Y PAPELDistorsin ptica despreciable.

Papel produce un aumento del rea en un 2,2%ESPESOR DEL CORTELas ecuaciones de morfometra utilizadas en este estudio son estrictamente precisas slo para cortes infinitamente finos

Debido a que los cortes para MET tienen un espesor finito, los volmenes y reas superficiales tienden a ser sobreestimados

Weibel y Paumgartner proporcionaron mtodos para obtener factores de correccin apropiados dependiendo del tamao y la forma de las estructuras y el espesor de corte

Estos mtodos fueron aplicados para obtener factores de correccin para las densidades volumtricas y superficiales de organelos de las preparaciones de MET y para la densidad volumtrica de los ncleos vistos a MORESULTADOS

Volumenrea superficial1209 m3

1517 m2Razn axialDimetro promediorea superficial1,376,34 149 m2Clula de LeydigNcleo (elipsoidal) de clula de LeydigREL es el organelo ms abundante de la clula de LeydigREL tiene 6,9 veces ms rea superficial que la membrana plasmtica y constituye aproximadamente el 60% del rea de superficie total de la clula de LeydigEl complejo de Golgi fue incluido en el conteo del REL por no ser un organelo abundante y ser a veces, muy difcil diferenciarlo del RELREL es muy poco abundante y casi indistinguibleEn una clula de Leydig promedio, hubo aproximadamente 622 mitocondriasRepresenta el 0,3% del volumen testicular, lo cual significa que en 1 g de testculo podra haber 3 mg de mitocondrias de clulas de LeydigLa membrana interna (sitios donde residen las principales enzimas de la biosntesis de esteroides) tiene una superficie 1,8 veces ms grande que la membrana externa, pero esta superficie es menor que la del SER en un factor de 3,6. En una clula de Leydig promedio hay aproximadamente 312 peroxisomas ocupando un volumen celular de 1,2%El citoplasma constituye del 61,9-70,6% del volumen citoplasmtico. Contiene ribosomas libres y polisomas, microfilamentos, microtbulos, y otros componentes citoplasmticosCONCLUSION