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Hospital Padre Hurtado Laboratorio Central

Hospital Padre Alberto Hurtado Laboratorio de Química Clínica - Urgencia

MANUAL DE TÉCNICAS

UNIDAD DE APOYO CLÍNICO LABORATORIO CLÍNICO

2009

ENTRADA EN VIGENCIA: 2000 PRIMERA REVISION : 14/08/2003 SEGUNDA REVISION : 25/07/2007 TERCERA REVISION : 27/10/2009


Con fecha 27 de Octubre del 2009 se certifica que los Procedimientos incluidos en el “Manual de Técnicas de Laboratorio Clínico” se encuentran aprobados por la Unidad de Laboratorio Clínico desde el año 2000 con última actualización en el año 2009.

Fecha entra vigencia Fecha última actualización

Nº de actualizaciones

Fecha Próxima revisión

AÑO 2000 Octubre 2009 3 Octubre 2014

ACTUALIZADO POR: • Dra. Loretto Vergara M. Jefe de Laboratorio y Banco de Sangre • TM. Ximena Meza Coordinadora de Laboratorio REVISADO POR: Gerencia de Calidad APROBADO POR:

_____________________ Dra. Loretto Vergara M.

Jefa Laboratorio y Banco de Sangre

Hospital Padre Hurtado


UNIDAD DE APOYO CLÍNICO HOSPITAL PADRE HURTADO LABORATORIO CLÍNICO SECCIÓN: LABORATORIO DE BIOQUIMICA-URGENCIA

NITROGENO UREICO

CÓDIGO: REV. Nº: (3) PÁGINA: 1 DE 2

1.- Nitrógeno Ureico (BUN): Test enzimático in vitro para la determinación cuantitativa de urea en suero, plasma y orina humanos con analizadores analíticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción: El riñón tiene tres funciones principales:

• Eliminación de las sustancias tóxicas producidas durante el metabolismo o ingeridas directamente • Regulación del medio líquido interno • Producción de hormonas

Cuando los riñones fallan aguda o crónicamente, los productos finales del metabolismo del nitrógeno se acumulan aumentando los niveles de nitrógeno no proteico. Esto se refleja en una elevación del nitrógeno ureico en sangre (BUN) y de la creatinina. 1.1 Obtención de la Muestra

• Suero, recogido en tubo sin anticoagulante • Plasma obtenido de tubo con heparina de litio, sodio o EDTA potásico • Orina sin añadir conservante.

1.2 Reactivos: Listos para el uso R1: Tampón/ NADH. R2: Tampón/enzimas/sustrato La estabilidad de los reactivos una vez abiertos es: R1: 28 días en refrigeración. R2: 28 días en refrigeración. 1.3 Principio del Test: Test UV cinético A la muestra se adiciona R1 (tampón /NADH). Luego de adiciona R2 (tampón/enzima/substrato) iniciando la reacción: La urea es hidrolizada por la ureasa a CO2 y amoniaco. Urea + H2O --- ureasa -----� 2 NH4 + CO2


UNIDAD DE APOYO CLÍNICO HOSPITAL PADRE HURTADO LABORATORIO CLÍNICO SECCIÓN: LABORATORIO DE BIOQUIMICA-URGENCIA

NITROGENO UREICO


A continuación, el amoniaco formado reacciona con α - oxoglutarato y NADH bajo la acción de la GLDH formándose glutamato y NAD+. A continuación, la disminución de la extinción debida al consumo del NADH se mide cinéticamente a una longitud de onda de 340nm y 700 nm. 1.4 Rango de Referencia Urea Suero/Plasma: 10-50 mg/dL Orina matinal: 847-2967 mg/dL Orina de 24 hrs.: 10-35 g/ 24hrs. BUN Suero/Plasma: 6-20 mg/dL (adultos) 4-19 mg/dL (niños) Orina de 24 hrs. : 12-20 g/ 24hrs. 1.5 Interferentes Iones amonio endógenos interfieren en la determinación del BUN. No existe interferencia significativa con hemólisis, ictericia y lipemia (hasta 2000 mg/dL).


UNIDAD DE APOYO CLÍNICO HOSPITAL PADRE HURTADO LABORATORIO CLÍNICO SECCIÓN: LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y URGENCIA

GLUCOSA (GLUCOSA HK)


2.- Glucosa: Test enzimático in vitro para la determinación cuantitativa de la glucosa en suero y plasma humanos con autoanalizadores de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción

El diagnóstico de los trastornos del metabolismo de los hidratos de carbono se apoya en parte en la medición de la glucosa plasmática, ya sea en ayunas o tras estimulación o pruebas de supresión. Los resultados de la glucosa plasmática pueden clasificarse como hiperglicémicos o hipoglicémicos. Existe una larga lista de enfermedades y síndromes que se asocian con un nivel elevado de glucosa plasmática en ayunas. La hiperglicemia puede estar dada por una ausencia total de secreción de insulina, lo que ocurre en ocasiones tras una prencreatectomía total o presentarse en forma intermitente durante periodos de estrés , como sucede por ejemplo tras una infección grave, deshidratación o embarazo. La hiperglicemia puede ser secundaria a otras enfermedades endocrinológicas o incluso a un anticuerpo contra el receptor insulínico. La hipoglucemia se define como un síndrome caracterizado por bajos niveles plasmáticos de glucosa en asociación con un grupo de síntomas que se alivian con la ingesta de alimentos o hidratos de carbono.

El síndrome hipoglicémico puede presentarse sin existir una lesión anatómica y con un nivel normal de glucosa plasmática en ayunas ( por ejemplo: hipoglucemia reactiva); o con bajos niveles plasmáticos de glucosa en ayunas (hipoglucemia inducida por alcohol o por fármacos). También se puede presentar un hipoglucemia cuando existe una lesión anatómica (Insulinoma, enfermedades hepáticas graves, etc). 2.1 Obtención de la Muestra:

• Suero, obtenido en tubos sin anticoagulante. • Plasma con heparina o EDTA. • Plasma con fluoruro o acetato de yodo.

2.2 Reactivos: Listo para el uso R1: Tampón MES: 5.0 mmol/L, pH 6.0; Mg2+: 24mmol/L; ATP:>4.5 mmol/L; NADP:>7.0 mmol/L; conservante. R2: Tampón HEPES: 200 mmol/L, pH 8.0; Mg2+: 4 mmol/L; HK(levadura): >300ukat/L; G-6-PDH(E. coli): >300ukat/L; conservante. Estabilidad del reactivo una vez abierto refrigerado en el analizador 8 semanas.



GLUCOSA (GLUCOSA HK)


2.3 Principio del Test: Test por radiación ultravioleta. Método de referencia enzimático empleando hexoquinasa La hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa a glucosa -6-fosfato por ATP. Glucosa +NADP+ ----HK------> G-6-P + ADP La glucosa -6- fosfato deshidrogenada oxida el glucosa -6-fosfato en presencia de NADP a gluconato-6-fosfato. No se oxidan otros hidratos de carbono. La velocidad de formación de NADPH durante la reacción es directamente proporcional a la concentración de glucosa y puede medirse fotométricamente, entre 340/700nm. G-6-P + NADP+ ----G-6-PDH----> gluconato 6-P + NADPH + H 2.4 Rango de Referencia suero/plasma Adulto : 70-105 mg/dL Niños : 60-110 mg/dL Neonatos: 40-60 mg/dL 2.5 Interferentes

• No presenta interferencias significativas por bilirrubinas conjugada hasta aprox 60 mg/dL y bilirrubina no conjugada hasta 60 mg/dL.

• No presenta interferencia significativa por lipemia ni hemólisis.



BILIRRUBINA TOTAL BILIRRUBINA DPD


3.- Bilirrubina Total : Test in vitro para la determinación cuantitativa de bilirrubina total en suero y plasma de adultos y neonatos en analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción

La bilirrubina se forma en el sistema reticuloendotelial durante la degradación de los eritrocitos maduros. El grupo hemo procedente de la hemoglobina y de otras hemoproteínas es separado y metabolizado a bilirrubina que se transporta al Hígado en forma de complejo con la albúmina sérica. En el hígado, la bilirrubina se conjuga al ácido glucurónico para ser solubilizada y posteriormente transportada a través del conducto biliar, siendo eliminada por el tacto digestivo. La producción de bilirrubina en lo adultos sanos alcanza un promedio de 250-350 mg por día.

La hiperbilirruninemia por bilirrubina no conjugada (BNC indirecta) aparece en la hiperproducción de pigmentos en trastornos hemolíticos y cuando hay una captación o conjugación hepática defectuosa. Durante la hemólisis, la elevación de BNC va acompañada de una elevación comparable de de bilirrubina conjugada en la bilis, reflejando un aumento en el ritmo de conjugación por el hígado.

La actividad de la enzima bilirrubin- UDP- glucoroniltransferasa hepática y la excreción de glucorónidos biliares están reducidas en algunos casos del Síndrome de Gilbert y en la enfermedad de Crigler- Najjar. La bilirrubina no conjugada está aumentada, con un a concentración normal de bilirrubina conjugada.

La bilirrubina saciada a la enfermedad hepática está producida por un deterioro de la excreción de los pigmentos conjugados, lo que aumenta su reflujo hacia el suero. La bilirrubina conjugada representa del 75-80% de la elevación de la bilirrubina, pero la bilirrubina no conjugada constituye solamente una pequeña fracción del resto. 3.1 Obtención de la Muestra: Suero obtenido con tubo estándar de muestra (tapa roja) Plasma con heparina o EDTA. Conservar la muestra alejada de la luz y procesar de inmediato. 3.2 Reactivos: R1: Detergente/ácido clorhídrico R2: Diazorreactivo (3,5-sal de diclorofenildiazonio).



BILIRRUBINA TOTAL BILIRRUBINA DPD


Preparación de los reactivos: R1y R2 El contenido está listo para el uso Estabilidad del reactivo: Abierto y refrigerado en el analizador: 12 semanas. 3.3 Principio del Test: Test colorimétrico. En presencia de un disolvente apropiado, la bilirrubina total se acopla a un ión diazonio en un medio fuertemente ácido, con la sal de 3,5-diclorofenildiazonio (DPD) a la azobilirrubina correspondiente. Bilirrubina + ión diazonio ----ácido------� Azobilirrubina La intensidad del rojo del pigmento azoico formado es directamente proporcional a la concentración de la bilirrubina total y se mide fotométricamente. 3.4 Rango de Referencia Adultos: hasta 1.1 mg/dL. Niños : hasta 1.1 mg/dL. 3.5 Interferentes y Limitaciones

• En casos aislados, en los que la bilirrubina total de una muestra se comporta como bilirrubina directa, se miden valores de bilirrubina directa algo mayores que la bilirrubina total.

• La lipemia interfiere en el test

• La hemólisis interfiere en muestras de adultos, pero no interfiere en muestras neonatales hasta aprox. 350 mg/dL de hemoglobina.



BILIRRUBINA DIRECTA MÉTODO DIAZO


4.- Bilirrubina Directa Test in vitro para la determinación cuantitativa de bilirrubina directa en suero y plasma de adultos y neonatos en analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción

La bilirrubina se forma en el sistema reticuloendotelial durante la degradación de los eritrocitos maduros. El grupo hemo procedente de la hemoglobina y de otras hemoproteínas es separado y metabolizado a bilirrubina que se transporta al Hígado en forma de complejo con la albúmina sérica. En el hígado, la bilirrubina se conjuga al ácido glucurónico para ser solubilizada y posteriormente transportada a través del conducto biliar, siendo eliminada por el tacto digestivo. La producción de bilirrubina en lo adultos sanos alcanza un promedio de 250-350 mg por día.

La hiperbilirruninemia por bilirrubina no conjugada (BNC indirecta) aparece en la hiperproducción de pigmentos en trastornos hemolíticos y cuando hay una captación o conjugación hepática defectuosa. Durante la hemólisis, la elevación de BNC va acompañada de una elevación comparable de de bilirrubina conjugada en la bilis, reflejando un aumento en el ritmo de conjugación por el hígado.

La actividad de la enzima bilirrubin- UDP- glucoroniltransferasa hepática y la excreción de glucorónidos biliares están reducidas en algunos casos del Síndrome de Gilbert y en la enfermedad de Crigler- Najjar. La bilirrubina no conjugada está aumentada, con un a concentración normal de bilirrubina conjugada.

La bilirrubina saciada a la enfermedad hepática está producida por un deterioro de la excreción de los pigmentos conjugados, lo que aumenta su reflujo hacia el suero. La bilirrubina conjugada representa del 75-80% de la elevación de la bilirrubina, pero la bilirrubina no conjugada constituye solamente una pequeña fracción del resto. 4.1 Obtención de la Muestra Suero, plasma heparinizado o EDTA. Efectuar determinación inmediatamente. 4.2 Reactivos R1: Ácido sulfanílico: 35 mmol/L; HEDTA: 4,0 mmol/L; ácido oxálico: 40 mmol/L, pH 1,2. R2: Nitrito de sodio: 3,9 mmol/L, pH 6,0. Preparación de los reactivos: R1y R2 El contenido está listo para el uso



BILIRRUBINA DIRECTA MÉTODO DIAZO


Estabilidad del reactivo: Abierto y refrigerado en el analizador: 12 semanas. 4.3 Principio del Test La bilirrubina conjugada y la δ bilirrubina (bilirrubina directa) reaccionan directamente con el ácido sulfanílico diazotado en un tampón ácido para (dar un azolorante) formar azobilirrubina de color rojo Ácido sulfanílico + NaNO2 -------� Ácido sulfanílico diazotado Bilirrubina + ácido sulfanílico diazotado -------� azobilirrubina La intensidad cromática es proporcional a la concentración de la bilirrubina directa en la muestra y se determina midiendo el incremento de la absorbancia.

4.4 Valores de Referencia Adultos y Niños: hasta 0.3 mg/dL 4.5 Interferentes y Limitaciones

� Hemólisis � Lipemia � Proteger la muestra de la luz y el sol



FOSFATASA ALCALINA ALP2 acc. to IFCC


5.- Fosfatasa Alcalina Test in vitro para la determinación cuantitativa de la fosfatasa alcalina en suero y plasma humanos con analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción

La actividad de la fosfatasa alcalina está presente en varios tejidos, que incluyen hígado, hueso, riñón, intestino y placenta. La fosfatasa alcalina en suero está presente n isoenzimas no fijadas o en complejos con lipoproteínas. Su papel exacto difiere de u lugar a otro, y en el hígado su papel no está claro. La mayor parte de la FA en suero, en los pacientes normales, está constituido por FA hepática y ósea.

La fosfatasa alcalina se eleva rápidamente y sus valores pueden exceder diez veces el límite superior de normalidad, cuando el flujo de bilis está deteriorado o se desarrollan lesiones expansivas, aunque éstas sean pequeñas, pero numerosas, como granulomas, o grandes y únicas como metástasis tumoral. Cuando el flujo de bilis se detiene, ya sea por una colestasis intrahepática u obstructiva, la fosfatasa alcalina se eleva hasta el doble del límite superior normal o más, siguiendo de manera aproximadamente paralela la tasa de elevación de bilirrubina en suero. La fosfatasa alcalina está elevada moderadamente también en los casos de ictericia producidas por lesiones hepáticas.

Cuando la colestasis se resuelve, la fosfatasa alcalina cae hasta niveles normales, pero más lentamente que la bilirrubina. 5.1 Obtención de la Muestra Suero recogido en tubos estándares de muestra (sin anticoagulante). Plasma con heparina de litio, sodio o amonio. 5.2 Reactivos R1: 2-amino-2 metil-1- propanol: 1,724 mol/L, pH 10,44, acetato de magnesio: 3,83 mmol/L, sulfato de zinc: 0,766 mmol/L; ácido N-(2-hidroxietil) etilendiaminotriacético: 3,8 mmol/L. R2: p-nitrofenilfosfato: 132,8 mmol/L; pH 8,44. Preparación de los reactivos: R1y R2 El contenido está listo para el uso Estabilidad del reactivo: Abierto y refrigerado en el analizador: 12 semanas.



FOSFATASA ALCALINA ALP2/ acc. to IFCC

Gen.2


5.3 Principio del Test Test – colorimétrico según un método estandarizado. P-nitrofenilfosfato + H2O ----ALP-----�fosfato + p - nitrofenol Mg2+ + Zn+

En presencia de iones de magnesio y de cinc, las fosfatasas desdoblan, el p- nitrofenilfosfato en fosfato y p-nitrofenol. El p-nitrofenol liberado es directamente proporcional a la actividad catalítica de la fosfatasa y se mide fotométricamente, midiendo el aumento de la absorbancia. 5.4 Rango de Referencia Adultos: 37-117 U/L ( 37°C) Niños (3-15 años): 90-300 U/L (37°C) 5.5 Interferentes y Limitaciones

• Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada hasta aprox. 25 mg/dL. • Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox. 1000 mg/dL. • Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox. 2000 mg/dL.



ALANIN AMINO TRANSFERASA

(ALTL/GPT) CON PIRIDOXAL FOSFATO


6.- Alanina-amino-transferasa (ALT/GPT) Test in vitro para la determinación cuantitativa de alanina-amino-transferasa (ALT) en suero y plasma humanos con analizadores automáticos de Química Clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción Esta enzima cataliza la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un hidrato de carbono para formar un aminoácido diferente. La aspartato aminotransferasa (AST/GOT) y alanín aminotransferasa (ALT/GPT) han sido utilizadas como indicadores de lesión hepatocelular. Las enzimas tienen vidas medias en sangre de 17 y 47 respectivamente. La ALT se encuentra primordialmente en el citoplasma del hepatocito. Teóricamente, en una lesión hepatocelular leve, cuando la membrana plasmática está dañada, se liberan al suero AST y ALT provenientes del citoplasma de la célula. En una lesión hepatocelular más grave, la lesión ya es a nivel de la mitocondria del hepatocito, lo que provoca la liberación de la AST desde la mitocondria, elevando la proporción AST: ALT. La ALT suele estar aumentada en mayor grado que la AST en los pacientes con hepatitis vírica aguda o crónica. La proporción ASAT: ALAT es a menudo menor de 1 en pacientes con lesión hepatocelular aguda. La actividad de la ALT es más específica para detectar enfermedad hepática en los pacientes no alcohólicos y asintomáticos 6.1 Obtención de la Muestra Suero recogido en tubos estándares, sin anticoagulante. Plasma con heparina o EDTA. 6.2 Reactivos R1: Tampón TRIS/enzima L -alanina/albúmina (bovina). R2: 2- oxoglutarato. Preparación de los reactivos: R1y R2 El contenido está listo para el uso Estabilidad del reactivo: Abierto y refrigerado en el analizador: 12 semanas.



ALANIN AMINO TRANSFERASA

(ALTL/GPT) CON PIRIDOXAL FOSFATO


6.3 principio del Test El presente ensayo sigue las recomendaciones formuladas por la IFCC pero ha sido mejorado en cuanto al rendimiento y la estabilidad. La ALT/GPT cataliza la reacción entre la L-alanina y el 2-oxoglutarato. El piruvato formado se reduce por NADH en una reacción catalizada por la lactato deshidrogenada (LDH) para formar L- lactato y NAD+.

L-Alanina + --2-oxoglutarato ----ALT---� piruvato + L-glutamato Piruvato + NADH + H+ ----LDH--� L- lactato + NAD+

La velocidad de oxidación de NADH, es directamente proporcional a la actividad catalítica de la ALT. Se determina midiendo la disminución de la absorbancia. 6.4 Rango de Referencia Varones: hasta 41U/L (37 °C) Mujeres: hasta 31 U/L (37°C) 6.5 Interferentes y Limitaciones

• Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada y no conjugada hasta aprox. 60 mg/dL

• Sin interferencias significativas por 100 mg/dL de hemoglobina. La contaminación por eritrocitos puede provocar valores elevados.

• Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox. 1000 mg/dL



ASPARTATO AMINO

TRANSFERASA (ASTL/GOT) CON PIRIDOXAL FOSFATO


7.- Aspartato-amino-transferasa (AST/GOT) Test enzimático in vitro para la determinación cuantitativa de la aspartato-amino-transferasa (AST) en suero y plasma humanos con analizadores automáticos de Química Clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). . Introducción

Esta enzima cataliza la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un hidrato de carbono para formar un aminoácido diferente. La aspartato aminotransferasa (AST/GOT) y alanín aminotransferasa (ALT/GPT) han sido utilizadas como indicadores de lesión hepatocelular. Las enzimas tienen vidas medias en sangre de 17 y 47 respectivamente. La ASAT está presente en muchos órganos; aparte del hígado, incluyendo el corazón y el músculo. El 80 % de la AST de los hepatocitos está en las mitocondrias.

Los pacientes con abuso crónico de alcohol, independiente del grado de su hepatopatía subyacente, tienen elevaciones más constantes de la ASAT mitocondrial que otros pacientes. La proporción entre ASAT mitocondrial y ASAT total parece discriminar la hepatitis alcohólica de otras enfermedades hepáticas.

La ASAT se utiliza para vigilar la terapéutica con fármacos potencialmente hepatotóxicos. 7.1 Obtención de la Muestra Suero, Obtenido de tubos estándares (sin anticoagulante) Plasma con heparina o EDTA 7.2 Reactivos R1: Tampón TRIS/enzima L- Aspartato, MDH (Microorganismos) LDH (Microorganismos); Albúmina bovina. R2: 2-oxoglutarato; NADH. Preparación de los reactivos: R1y R2 El contenido está listo para el uso Estabilidad del reactivo: Abierto y refrigerado en el analizador: 12 semanas



ASPARTATO AMINO

TRANSFERASA (ASTL/GOT) CON PIRIDOXAL FOSFATO


7.3 Principio del Test El presente ensayo sigue las recomendaciones formuladas por la IFCC pero ha sido mejorado en cuanto al rendimiento y la estabilidad. La AST de la muestra cataliza la transferencia de un grupo amino entre la L-aspartato y 2-oxoglutarato para obtener oxaloacetato y L-glutamato. A continuación y en presencia de la malato deshidrogenasa (MDH), el oxaloacetato reacciona con NADH para formar NAD+

L-aspartato + --2-oxoglutarato ----AST---�� oxaloacetato + L-glutamato La enzima AST cataliza esta reacción de equilibrio. En la reacción indicadora asociada catalizada por la malatodeshidrogenasa se determina el aumento de oxaloacetato. Oxaloacetato + NADH + H+ ---MDH---�� L-malato + NAD+

Durante esta reacción se oxida NADH a NAD. La velocidad de la oxidación de NADH es directamente proporcional a la actividad catalítica de la AST .la que se determina fotométricamente, midiendo la disminución de la absorbancia. 7.4 Rango de Referencia Varones: hasta 38 U/L (37°C) Mujeres: hasta 32 U/L (37°C) 7.5 Interferentes y Limitaciones

• La hemólisis interfiere en el test, ya que la actividad de la AST se libera de los eritrocitos.

• Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada y no conjugada hasta aprox. 60 mg/dL.

• Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta 1000 mg/dL



PROTEINAS TOTALES


8.- Proteínas Totales Test in vitro para la determinación cuantitativa de proteínas totales en suero y plasma humanos con autoanalizadores automáticos de química clínica. (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción Las proteínas plasmáticas se sintetizan principalmente en el hígado, las células plasmáticas, los ganglios linfáticos, el bazo y la médula espinal. En caso de enfermedad, tanto la concentración de las proteínas totales como sus fracciones individuales pueden divergir considerablemente de sus valores normales. La hipoproteinemia puede deberse a enfermedades y alteraciones como la hemorragia, el esprue, el síndrome nefrótico, quemaduras graves ,el síndrome de retención de sales y Kwashiorkor(carencia aguda de proteínas). La hiperproteinemia puede observarse en casos de deshidratación severa y en casos de enfermedades como el mieloma múltiple. El porcentaje relativo de las proteínas plasmáticas puede modificarse al cambiar una sola fracción de estas proteínas. En este caso, la cantidad total de proteínas frecuentemente se mantiene inalterada. La relación entre albúmina y globulina se usa frecuentemente como índice de la distribución entre las fracciones de albúmina y globulina. Esta relación sufre grandes alteraciones frente a afecciones como la cirrosis hepática, la glomerulonefrítis, el síndrome nefrótico, la hepatitis aguda, el lupus eritemetoso, así como en algunas infecciones agudas y crónicas. La medición de la proteína total se utiliza en el diagnóstico y tratamiento de una variedad de enfermedades hepáticas, renales, de la médula ósea así como de otros trastornos metabólicos o nutricionales. 8.1 Obtención de la Muestra Suero, obtenido en tubos estándar de muestra (tubo sin anticoagulante) Plasma con heparina o EDTA 8.2 Reactivos R1: Reactivo para blanco R2: Reactivo biuret Preparación de los reactivos R1: El contenido está listo para el uso. R2: El contenido está listo para el uso.



PROTEINAS TOTALES


Conservación y estabilidad de los reactivos R1 y R2: abierto en el compartimiento de refrigeración del analizador 12 semanas. . 8.3 Principio del Test (prueba calorimétrica) En solución alcalina, el cobre bivalente reacciona con el enlace peptídico de las proteínas formando el color púrpura característico del complejo biuret. El tartrato sódico-potásico impide la precipitación de hidróxido de cobre, mientras que el yoduro potásico se inhibe la autoreducción del cobre. Proteína + Cu2 + --- SOLUCIÓN----� Complejo Cu-proteína ALCALÍNA

La intensidad cromática es directamente proporcional a la concentración de proteínas que puede medirse fotométricamente. 8.4 Rango de Referencia Adultos : 6.6 – 8.7 g/dL Niños > 3 años: 6.0 – 8.0 g/dL 8.5 Interferentes y Limitaciones

• Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada y no conjugada hasta aprox. 25 mg/dL. • Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox. 650 mg/dL • Sin Interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox. 2000 mg/dL



ALBUMINA (VERDE DE BROMOCRESOL)


9.- Albúmina Test in vitro para la determinación cuantitativa de albúmina en suero y plasma humanos con autoanalizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción Además de la información aportada por la cuantificación de las proteínas totales, la cuantificación de la albúmina proporciona información respecto al estado de nutrición, a la capacidad sintetizadora del hígado o a la nefropatía por pérdida de proteínas. Permite también al médico interpretar los niveles altos o bajos de calcio y magnesio, ya que la albúmina fija alrededor de la mitad de cada uno de estos iones. Los cálculos de la diferencia entre la proteína total y ala albúmina dan el valor de todas las globulinas, una mezcla de las otras fracciones que individualmente pueden elevarse hasta varias veces en los trastornos graves. 9.1 Obtención de la Muestra Suero, recogido en tubos estándares de muestra, sin anticoagulante. Plasma con heparina o EDTA. Separar el suero o el plasma del coagulo sanguíneo en el plazo de 1 hr. Y efectuar la determinación inmediatamente. Las muestras que contienen precipitado deben centrifugarse antes de efectuar el test. 9.2 Reactivos R1: Tampón citrato, conservante R2: Tampón citrato, verde de bromocresol y conservante. Preparación de los reactivos: R1: Reactivo listo para el uso R2: Reactivo listo para el uso Conservación y estabilidad de los reactivos: R1 y R2 Abierto en el compartimiento de refrigeración del analizador 12semanas.



ALBUMINA (VERDE DE BROMOCRESOL)


9.3 Principio del Test Test – color con método de punto final Con un pH de 4.1 la albúmina tiene carácter catiónico suficiente como para formar un compuesto con el colorante aniónico verde de bromocresol (BCG) formando un complejo azul verdoso. Albúmina +BCG ----pH 4,1----� complejo albúmina-BCG La intensidad cromática del color azul verdoso es directamente proporcional a la concentración de albúmina y se mide fotométricamente. 9.4 Rango de Referencia Adultos : 3.4 – 4.8 g/dL R. Nacidos 0– 4 días: 2.8 – 4.4 g/dL 4días – 14 años : 3.8 – 5.4 g/dL 14 – 18 años : 3.2 – 4.5 g/dL 9.5 Interferencias y Limitaciones Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada y no conjugada hasta aprox. 60 mg/dL. Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox. 1000 mg/dL. Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta 2000 mg/dL.



ACIDO URICO


10.- Ácido Úrico Test enzimático in vitro para la determinación cuantitativa de ácido úrico en suero, plasma y orina humanos con analizadores automáticos de química clínica. Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción El ácido úrico es el principal producto del metabolismo de las purinas en el hombre , y se forma a partir de la xantina por acción de la xantinooxidasa. El adulto medio tiene un contenido total aproximado de 1.2 gr. de ácido úrico en el cuerpo, lo cual puede considerarse una reserva miscible con un recambio alto. El ácido úrico de esta reserva procede de tres orígenes:

1. catabolismo de nucleoproteínas ingeridas 2. catabolismo de nucleoproteínas endógenas 3. transformación directa de los nucleótidos endógenos de la purina.

Aproximadamente, un 60% de esta reserva es repuesta diariamente por formación y excreción

concomitante. La mayor parte del ácido úrico tiene lugar en el hígado, el cual presenta gran actividad xantinooxidasa. Es probable que la mayor parte o la totalidad de la excreción restante tenga lugar a través de las secreciones biliares, pancreáticas y gastrointestinales con posterior degradación por la flora intestinal.

Entre las etiologías más comunes de la hiperuricemia se cuentan el fallo renal, la cetoacidosis, el exceso de lactato y el uso de diuréticos. La hiperuricemia tiene también una relación positiva con la hiperlipidemia, obesidad, aterosclerosis, diabetes mellitus, hipertensión, clase social, ejercicio, etc.

La gota es un trastorno del metabolismo de las purinas o de la excreción renal del ácido úrico caracterizado por:

1. Hiperuricemia 2. Precipitación de urato monosódico en forma de depósitos por todo el cuerpo, excepto por el

sistema nervioso central, aunque muestra una especial predilección por las articulaciones y el cartílago peri articular, el hueso, las bolsas sinoviales y el tejido subcutáneo

3. Ataques clínicos recidivantes de artritis que responden típicamente responde a la colchicina o a los antiinflamatoriosno esteroidales.

4. Nefropatía y a menudo nefrolitiasis.



ACIDO URICO


10.1 Obtención de la muestra: Suero obtenido en tubos estándar de muestra sin anticoagulante Plasma con heparina o EDTA. Estabilidad: 5 días a 2-8 °C; 6 meses a - 20°C 10.2 Reactivos R1: Tampón/ enzima/ TOOS* Tampón Fosfato: 0.05 mol/L, pH 7.8; TOOS: 7 mmol/L; éter poliglicólico de alcohol graso: 4.8 %; ascorbato-oxidasa >5U/mL. R2: Tampón /enzima/ 4-aminofenazona Tampón fosfato: 0.1 mol/L, pH 7.8; hexacianoferrato de potasio (II): 0.3 mmol; 4-aminofenazona > 3 mmol/L, uricasa > 0.5 U/mL; peroxidasa (POD)> 1 U/mL. Preparación de los reactivos R1 y R2: El contenido del frasco está listo para el uso Conservación y estabilidad de los reactivos R1 y R2: abierto en el compartimento de refrigeración del analizador 8 semanas. 10.3 Principio del Test Método enzimático-colorimétrico. A la muestra se le adiciona el reactivo 1 (tampón / enzima/ TOOS). Se le adiciona el reactivo 2 (tampón/ enzima/ 4-aminofenazona) y se inicia la reacción. 2H2O + O2 ---

Uricasa----� alantoína + CO2 + H2O2

El ácido úrico es desdoblado por la uricasa en alantoína y peroxido de hidrógeno. 2 H2O2 + H+ + TOOSa + 4- aminofenazona ------Peroxidasa----�colorante de quinona-diimina + 4 H2O



ACIDO URICO


10.3 Principio del Test Método enzimático-colorimétrico. A la muestra se le adiciona el reactivo 1 (tampón / enzima/ TOOS). Se le adiciona el reactivo 2 (tampón/ enzima/ 4-aminofenazona) y se inicia la reacción. 2H2O + O2 ---

Uricasa----� alantoína + CO2 + H2O2

El ácido úrico es desdoblado por la uricasa en alantoína y peroxido de hidrógeno. 2 H2O2 + H+ + TOOSa + 4- aminofenazona ------Peroxidasa----�colorante de quinona-diimina + 4 H2O TOOSa = N- etil- N-(2- hidroxi–3–sulfopropil)–3-metilanilina La intensidad cromática del colorante rojo formado es directamente proporcional a la concentración del ácido úrico y se mide fotométricamente. 10.4 Rango de Referencia Suero/ plasma: Hombres: 3.4 – 7.0 mg/dL Mujeres: 2.4 – 5.7 mg/dL Orina: Matinal: 37 – 92 mg/dL De 24 horas: 200-1000 mg/24 horas 10.5 Interferencias y Limitaciones Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada y no conjugada hasta aprox 40 mg/dL Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox. 1000 mg/dL Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox. 2000 mg/dL El ácido ascórbico < 30 mg/dL no interfiere en el test. Se han ensayado in vitro medicamentos y se han encontrado interferencias (valores de ácido úrico demasiado bajos) en el intervalo terapéutico por α - metildopa, desferoxamina, y dobesilato de calcio. La uricasa reacciona específicamente con el ácido úrico. Otros derivados de purina pueden inhibir la reacción del ácido úrico.



CREATININA

JAFFE METODO COMPENSADO


11.- Creatinina Test cinético in vitro para la determinación cuantitativa de creatinina con compensación en suero, plasma y orina con analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción La sustancia endógena más utilizada en la valoración clínica de la filtración glomerular es la creatinina. La creatinina es un producto de degradación de la creatina corporal, el cual se forma a un ritmo relativamente constante en el músculo y que corresponde al principal depósito del fosfato de creatina. Así, la producción de creatinina y su excreción se relacionan directamente con la masa muscular. 11.1 Obtención de la Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra, sin anticoagulante. Plasma con heparina o EDTA Estabilidad: 7 días a 2-8 °C Es posible congelar las muestras para almacenarla a largo plazo Orina: recoger la orina sin añadir conservante Estabilidad: 4 días a 2-8 °C Es posible congelar la muestra para almacenarla a largo plazo 11.2 Reactivos R1: Hidróxido de Potasio900 mol/L; fosfato 135mmol/L; pH> 13,5 R2: Ác. Pícrico 38 mmol/L Preparación de los reactivos El contenido está listo para el uso Conservación y estabilidad R1 y R2: abierto en el compartimiento de refrigeración del analizador 12 semanas.



CREATININA

JAFFE METODO COMPENSADO


9.3 Principio del Test: test color cinético Reacción cinética Jaffe amortiguada sin desproteinización. Creatinina + ácido pícrico ----SOLUCIÖN ALCALINA -----� complejo creatinina- ácido pícrico En solución alcalina, la creatina forma con el picrato un complejo de color amarillo- rojizo. Su intensidad cromática es directamente proporcional a la concentración de creatinina y se mide fotométricamente. 10.4 Rango de Referencia 1.-Suero/plasma Hombres: 0.70 – 1.20 mg/dL Mujeres : 0.50 - 0.90 mg/dL 2.-Primera orina matinal Hombres: 39 – 259 mg/dL Mujeres : 28 – 217 mg/dL 10.5 Interferencias y Limitaciones

• Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada hasta aprox 10 mg/dL

• Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox. 750 mg/dL 750 mg/dL.

• Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox. 2000 mg/dL

• Sin interferencia significativa por acetona hasta 50 mg/dL, acetoacetato hasta 20 mmol/L, y β - hidroxibutirato hasta 25 mmol/L.

• Los antibióticos con cefalosporina llevan a valores falsamente positivos.



CALCIO


11.- Calcio Test in vitro para la determinación cuantitativa de calcio en suero, plasma y orina humanos con analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción El calcio ocupa el quinto lugar entre los más abundantes elementos minerales del cuerpo humano. Aproximadamente, el esqueleto contiene un 98% del calcio presente en el adulto en forma de hidroxiapatita, formada por una res cristalina compuesta de calcio, fósforo e hidróxido. Del calcio restante, alrededor de la mitad se halla presente en el líquido extracelular y el resto, en una diversidad de tejidos, particularmente en el músculo esquelético. El hecho de que menos de un 1% de la reserva esquelética total del calcio puede intercambiarse fácilmente con el líquido extracelular reviste una importancia crítica en relación con la homeostasis del calcio. Además de la importancia en la mineralización del esqueleto, el calcio desempeña un papel vital en procesos como la coagulación de la sangre, conducción neuromuscular, el mantenimiento del tono normal y la excitabilidad del músculo esquelético y cardiaco. El calcio está también implicado en la síntesis glandular y la regulación de las glándulas exocrinas y endocrinas, la preservación de la integridad de la membrana celular y su permeabilidad. El calcio existe en el suero en tres formas distintas:

1. Calcio libre o ionizado, que es la forma fisiológicamente activa y representa el 50% del calcio total. 2. Alrededor del 5% del calcio total forma complejos con toda una variedad de aniones, particularmente

fosfato y citrato. 3. El 45% restante de calcio está fijado a proteínas del plasma, es parcialmente a la albúmina, pero

también a las globulinas en un grado bastante limitado. 11.1 Obtención de la Muestra 1.-Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) 2.-Plasma con heparina. El plasma debe analizarse inmediatamente. No emplear plasma con oxalato, EDTA o citrato 3.- Orina de 24 horas: introducir 10 ml de ácido clorhídrico (6mol/L) en un frasco de recogida o acidificar la orina (pH < 2.0) después de recogerla para disolver las sales de calcio.



CALCIO


11.2 Reactivos R1: CAPS (Acido 3-[cicloexilamino] -1-propanosulfónico):525 mmol/L; NaOH: 400mmol/L; pH 11,3. R2: o- cresolftaleína – complexona: 0.5 mmol/L; 8-hidroxiquinolina: 30.0 mmol/L.

Preparación de los reactivos: El contenido está listo para el uso Conservación y Estabilidad de los Reactivos Abierto, en el compartimiento de refrigeración del analizador 12 semanas. 11.3 Principio del Test Método según Schwarzenbach con o-cresolftaleína complexona. Los iones de

calcio reaccionan con la o-cresolftaleína complexona(o-CPC) en condiciones alcalinas para formar un complejo color violeta. Las interferencias por hierro y magnesio se minimizan por la adición de 8-hidroxiquinolina.

Ca2+ + o- CPC: ---pH alcalino--�complejo de calcio o- CPC La intensidad cromática del complejo violeta formado es directamente proporcional a la concentración de calcio y se mide fotométricamente. 11.4 Rango de Referencia Suero/plasma: 8.6 – 10.2 mg/dl Orina 24 hrs.: 100 – 320 mg/24 hrs. (con alimentación normal) 11.5 Interferencias y Limitaciones Suero/ plasma:

• Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada y no conjugada hasta aprox. 60 mg/dL • Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox. 1000 mg/dL. • Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta 2000 mg/dL.



FOSFORO


12.- Fósforo test in vitro para la determinación cuantitativa de fósforo en suero, plasma y orina humanos con analizadores automáticos de química clínica. Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción El fósforo es un elemento muy abundante en el cuerpo humano. Alrededor del 85% del fósforo del adulto se hallan presentes en el hueso en forma de hidroxiapatita. El fósforo restante se halla en su mayor parte combinado con lípidos, proteínas, hidratos de carbono y otras sustancias orgánicas, para desempeñar papeles vitales como fosfolípidos, ácidos nucleicos, nucleótidos, constituyentes de las membranas y del citoplasma celular y compuestos importantes en el almacenamiento e intercambio de energía. 12.1 Obtención de la Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra, sin anticoagulante Plasma con heparina o EDTA Estabilidad: 8 horas a 20- 25 °C 24 horas a 2 – 8 °C 1 año a –20°C con una sola congelación 11.2 Reactivos R1: Acido sulfúrico: 0.36 mol/L; detergente R2: Molibdato amónico: 3.5 mmol/L: ácido sulfúrico: 0.36 mol/L, cloruro de sodio 150 mmol/L Preparación de los Reactivos: El contenido está listo para el uso Estabilidad de los Reactivos Abierto en el compartimento de refrigeración del analizador 12 semanas.



FOSFORO


11.3 Principio del Test Molibdato UV. El fosfato inorgánico forma, con el molibdato de amonio en presencia de ácido sulfúrico, un complejo de fosfomolibdato de amonio con la fórmula (NH4)3[PO4 (MoO3)12]. Este complejo se mide fotométricamente en la zona ultravioleta (340 nm) Fosfato + molibdato amónico ----H2 SO4-----� fosfomolibdato de amonio (NH4)3[PO4 (MoO3)12]. 11.4 Rango de Referencia Suero/ plasma: 2.7 – 4.5 mg/dL Orina matinal: 40 – 136 mg/dL Orina 24 hrs: 400 – 1300 mg/24 horas 11.5 Interferencias y Limitaciones Suero/ Plasma

• Sin interferencia significativa por ictericia hasta aprox. 56 mg/dL de bilirrubina conjugada • Interferencia positiva significativa hasta aprox. 300 mg/dL de hemoglobina. Esta interferencia se

debe al fosfato inorgánico que se forma por acción de las fosfatasas sobre el fosfato orgánico. Los fosfatos se liberan al hemolizarse los eritrocitos.

• Sin interferencia significativa hasta aprox. 2500 mg/dL de triglicéridos. • Se han analizado in vitro 35 fármacos de uso frecuente y no se han encontrado interferencias.


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MAGNESIO


12.- Magnesio test in vitro para la determinación cuantitativa de magnesio en suero, plasma y orina humanos con analizadores automatizados de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción

El magnesio es uno de los cationes más abundantes del cuerpo y resulta esencial para muchos procesos fisicoquímicos. Como catión intracelular, el magnesio ocupa el segundo lugar en abundancia después del potasio, y su concentración en el líquido intracelular es aproximadamente diez veces superior a la del líquido extracelular. El magnesio es un activador de diversas enzimas que incluyen fosfatasas, transfosforilasas, pirofosfatasas, carboxilasas y hexoquinasa. Asimismo también es esencial para la preservación de la estructura macromolecular del DNA y RNA y ribosomas. 12.1 Obtención de la Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante). Plasma con heparina de litio. Orina. No pueden utilizarse muestras hemolizadas. 12.2 Reactivos R1: TESa : 145mol/L; pH 7,5; clorofosfonazo III: 0,2 mmol/L; EGTA: 10 mmol/L

R2: TES: 10 mmol/L; pH 7,5; EDTA: 16 mmol/L. TESa: a) Ácido N-tris-(hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico. Preparación de los reactivos: El contenido está listo para el uso Conservación y estabilidad Abierto en el compartimiento de refrigeración del analizador 12 semanas.


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MAGNESIO


12.3 Principio del Test Método colorimétrico empleando clorofosfonazo-III. El clorofosfonazo III (CFZ III) se une al Magnesio y produce un incremento en la absorbancia. El EGTA [ácido etilenbis (oxietilenonitrilo) tetraacético] Se emplea para impedir que el calcio se fije al CPZ III Mg2++ CPZ III ----pH7,5-----� Compuesto Mg-CPZ III Las interferencias inespecíficas en la absorbancia se reducen por la incorporación de EDTA (ácido etilendiamintetracético), que elimina el magnesio del complejo magnesio-CPZ III y permite la medición exacta del blanco de la muestra. Compuesto Mg-CPZ III + EDTA ----pH7,5-----� Mg-EDTA + CPZ III La diferencia de la absorbancia entre el complejo magnesio-CPZ III y el complejo tratado con EDTA corresponde a la absorbancia causado por el magnesio solo. 12.4 Rango de Referencia Suero/ plasma: 1.58 – 2.55 mg/dL Orina 24 horas: 60 – 210 mg/24 horas 12.5 Interferentes y Limitaciones Suero/ plasma:

• Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada hasta aprox. 65 mg/dl y bilirrubina no conjugada hasta aprox. 37 mg/dL

• La hemólisis interfiere en el test ya que en este caso el magnesio es liberado de los eritrocitos. • Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox. 800 mg/dL • En 34 fármacos de uso frecuente ensayados in vitro no se encontró interferencia.



GAMMA GLUTAMIL

TRANSFERASA


13.- Gamma-glutamiltransferasa (GGT) Test in vitro para la determinación cuantitativa de gamma- glutamiltranferasa (GGT) en suero y plasma humanos con los analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción Esta enzima cataliza la transferencia de un grupo γ-glutamil, procedente de un péptido γ-glutamil, a otro péptido a un aminoácido. Está presente en la membrana celular y en las fracciones microsomales y puede estar implicada en el transporte de aminoácidos a través de las membrana celulares. El riñón y, en menor grado, el hígado y el páncreas son ricos en γGT. La principal utilidad clínica de la medición de la GGT reside en el estudio de la enfermedad hepatobiliar. Los valores encontrados son paralelos a los de la fosfatasa alcalina en la ictericia obstructiva (posthepática) y la enfermedad infiltrativa del hígado. Puesto que la GGT es una enzima microsómica, sus niveles hísticos aumentan en respuesta a la inducción de dichas enzimas. Este fenómeno podría explicar los elevados niveles séricos en alcohólicos crónicos y en pacientes que toman drogas hepatotóxicas. 13.1 Obtención de la Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra, sin anticoagulante Plasma con heparina de litio, amonio, sodio, o EDTA tripotásico. Estabilidad: 7 días a 20 – 25 °C

6 días a 2 – 8 °C 1 año a – 20°C

13.2 Reactivos R1: Tampón TRIS: 492 mmol/L, pH 8.25 (25°C); glicilglicina: 492 mmol/L, conservante.

R2:L-γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida 22,5mmol/L, acetato: 10 mmol/L; pH 4.5 (25°C),:

Preparación de los reactivos: El contenido está listo para el uso Conservación y estabilidad de los reactivos Abierto en el compartimiento de refrigeración del analizador 12 semanas.



GAMMA GLUTAMIL

TRANSFERASA


13.3 Principio del Test color enzimático La muestra se mezcla con el R1 (tampón glicina). Posteriormente se adiciona el R2 dando inicio a la reacción. γγγγGT

L-γγγγ-glutamil–3carboxi-4–nitroanilida + glicilglicina-----� L- γγγγ-glutamil-glicina+5–amino-2-nitrobenzoato La gamma-glutamiltransferasa transfiere el grupo γ-glutamil de la L-γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida a glicilglicina. La cantidad de 5- amino- 2- nitrobenzoato que es liberado es proporcional a la actividad de GGT y se determina midiendo fotométricamente el aumento de la absorbancia. 13.4 Rango de Referencia Medido a 37 °C Hombres: 8-61 U/L Mujeres: 5-36 U/L 13.5 Interferencias y Limitaciones

• Sin interferencia significativa por bilirrubina no conjugada hasta aprox. 40 mg/dL y bilirrubina conjugada hasta 50 mg/dL

• Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta 200 mg/dL • Sin interferencia significativa por triglicéridos.



AMILASA


15.-Amilasa Test enzimático in vitro para la determinación cuantitativa de α amilasa en suero, plasma y orina humanos con analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción

Esta enzima, predominantemente originada en la glándula pancreática (forma P) y salival (forma S), hidroliza las unidades de glucosa con enlace α-1,4 en el glucógeno y la amilopectina. Se encuentra elevada en la pancreatitis, lesiones de las glándulas salivales (como parotiditis), úlceras pépticas perforadas, apendicitis, roturas de embarazo ectópico, aneurisma disecante de la aorta y enfermedad de las vías biliares. La amilasa es la única proteína capaz de ser aclarada por los riñones 15.1 Obtención de la Muestra Suero/ plasma Suero recogido en tubos estándar de muestra, sin anticoagulante Plasma con heparina o EDTA Orina: La α- amilasa es inestable en orina ácida. Realizar el test de inmediato o alcalinizar las muestras para su almacenamiento. 15.2 Reactivos R1: Tampón HEPES: 52.4 mmol/L, pH 7.0 cloruro sódico: 87 mmol/L cloruro de magnesio :12.6 mmol/L; cloruro cálcico: 0.08 mmol/L; α- glucosidasa > 4 U/mL; conservante. R2: Tampón HEPES: 52.4 mmol/L; pH 7.15; 4,6-etilideno-G7PNP: 22 mmol; conservante.

Preparación de los reactivos: El contenido está listo para el uso Conservación y estabilidad de los reactivos Abierto en el compartimiento de refrigeración del analizador 12 semanas



AMILASA


15.3 Principio del Test (simplificado) Test- color enzimático según IFCC

5-etilideno-G7PNP+5H2O --αααα-amilasa --�2etilideno–G5+2G2PNP+2etilideno-G4+2G3PNP+etilideno-G3+G4PNP Oligosacáridos definidos como el 4,6 etilideno-(G7) p-nitrofenil (G1)-α, D-maltoheptaósido (etilideno- G7PNP) se desdoblan por acción de las α amilasas. Los fragmentos G2PNP, G3PNP y G4PNP que se han formado, se hidrolizan completamente a p-nitrofenol y glucosa bajo la acción de la α glucosidasa.

2G2PNP+2G3PNP +G4PNP + 14 H2O---αααα-glucosidasa ---�5 PNP + 14G PNP= p- nitrofenol G= Glucosa La intensidad cromática del p-nitrofenol formado, que es directamente proporcional a la actividad de α-amilasa, se mide fotométricamente. 15.4 Rango de Referencia Suero/plasma : 28-100 U/L Orina espontánea: <460 U/L 15.5 Interferencias y Limitaciones

• No pipetear con la boca, evitar el contacto del reactivo con la piel porque la saliva y el sudor contienen α- amilasa.

• Sin interferencia significativa por bilirrubina no conjugada hasta aprox. 60 mg/dL • Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox. 500 mg/dL • Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox. 3000 mg/dL • La glucosa no interfiere hasta 2000 mg/dL. • El ácido. Ascórbico no interfiere hasta 100 mg/dL. • No se registraron interferencias con el test con 31 fármacos de uso frecuente probados in vitro.



ACIDO LACTICO


16 Ácido Láctico Test para la determinación cuantitativa de L-lactato en sangre completa o líquido cefalorraquídeo con analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción Prácticamente la totalidad del ácido láctico del plasma está presente en forma de L-lactato e ión hidrógeno. El lactato es el producto final del metabolismo anaerobio y su nivel se relaciona con la disponibilidad del oxígeno. Cuando falla el suministro de oxígeno, el sistema del citocromo no puede funcionar como intermediario en el proceso de transferencia del hidrógeno al oxígeno molecular. En esta situación, se acumula dinucleótido de nicotinamida-adenina reducido (NADH), que es oxidado por la lactato-deshidrogenasa con formación de lactato. En el hombre en reposo, el hígado y, en cierto grado, los riñones son los principales órganos responsables del lactato a glucosa, o de su oxidación a CO2 y H2O. En presencia de concentraciones elevadas, el músculo esquelético y cardiaco también puede oxidar el lactato. El shock es quizá la causa mejor conocida de la acidosis láctica; sin embargo, en algunos casos , el shock puede ir precedido por una excesiva producción de lactato. Las alteraciones tales como la insuficiencia cardiaca congestiva grave, el edema pulmonar y la pérdida sanguínea son causas comunes de acidosis láctica. 16.1 Obtención de la muestra No emplear suero. Emplear plasma de sangre recogida por técnica estándar de punción venosa en tubos en tubos con heparina de sodio o litio y transportar sobre hielo. El líquido cefalorraquídeo puede usarse directamente. Notas: 1.- El nivel de lactato aumenta rápidamente bajo esfuerzos físicos. El tiempo requerido para volver a valores normales de lactato depende del buen estado físico del paciente. Para ello suelen ser suficientes treinta minutos de reposo. 2. -Las muestras de sangre deben extraerse de una vena libre de estasis. Sin embargo, una hemostasis mínima (menos de 30 segundos) no afectará los niveles de lactato. Evite en lo posible el uso de torniquete.



ACIDO LACTICO


3.- La glicólisis en muestras de sangre puede aumentar rápidamente niveles de lactato. Las células contribuyen a ala glicólisis y su retiro rápido es esencial para el análisis exacto del lactato.. El plasma heparinizado es aceptable, pero las precauciones que se deben tener es retrasar la glicólisis guardando la sangre completa en el hielo y después separando el plasma de las células en el plazo de 15 minutos de la colección. Estabilidad: Plasma separado: 2 horas a 20-25°C 2 días a 2-8 °C LCR: 3 horas a 20-25°C 24 horas a 2-8 °C 1 mes a –20°C 16.2 Reactivos R1: Tampón, enzimas

Dador de hidrógeno; oxidasa de ascorbato (pepino): > 30U/mL; t tampones; conservantes. R2. Tampón, enzimas

4-aminopirina: 1 mg/mL: LOD (microorganismos): >15 U/mL; peroxidasa: >24 U/mL; tampones; conservantes.

Preparación de los reactivos: El contenido está listo para el uso Conservación y estabilidad de los reactivos Abierto en el compartimiento de refrigeración del analizador 12 semanas 16.3 Principio del Test El L- lactato es oxidado a piruvato por la enzima específica lactato oxidasa (LOD) L-lactato + O2 = LOD=== � piruvato + 2H2O2



ACIDO LACTICO


La peroxidasa (POD) se emplea para generar un colorante utilizando el peroxido de hidrógeno producido en la primera reacción. H2O2 + dador de H + 4-aminoantipirina+ == POD=� cromógeno + 2H2O La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de L-lactato. 16.4 Rango de referencia Plasma: 0.5-2.2 mmol/L venoso LCR: 1.1-6.7 mmol/L neonatos 1.1-4.4 mmol/L 3-10 días de edad 1.1-2.8 mmol/L > 10 días de edad 1.1-2.4 mmol/L adulto 16.5 Interferencias y limitaciones Sin interferencia significativa por bilirrubina no conjugada y conjugada hasta 60 mg/dL y 28 mg/dL respectivamente. Sin interferencia significativa de la hemoglobina hasta 1000 mg/dL. Sin interferencia significativa de la lipemia hasta 2000 mg/dL. Se ensayaron in vitro treinta y cinco productos farmacéuticos de uso frecuente. La dopamina (10 mg/L), levodopa (20 mg/L) y metildopa (20mg/L) redujeron perceptiblemente los resultados de lactato.


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AMONIO


17.-Amonio test para la determinación cuantitativa de amonio (NH3) en plasma con analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). 17.1 Obtención de la muestra Plasma con heparina de sodio, litio o EDTA bipotásico no hemolizada. Extraer la muestra de una vena sin estasis y centrifugarla lo antes posible en un tubo tapado. Estabilidad: poner la muestra sobre hielo y proceder inmediatamente al ensayo 17.2 Reactivos R1: Tampón BICINAa: 330mmol/L, pH 8.3; 2-oxoglutarato: 50mmol/L; GLDH (microbiana): >234ukat/L R3: NADPH: > 1.0 mmol/L; GLDH; conservantes. BICINAa =N,N bis(2-hidroxietil)-glicina Preparación de los reactivos: Listo para el uso Conservación y estabilidad: Abierto y refrigerado en el analizador12 semanas. 17.3 principio del test Ensayo enzimático cinético colorimétrico La glutamato dehidrogenasa (GLDH) cataliza la aminación reductiva del 2-oxoglutatrato con NH4 y NADPH para forma glutamato y NADP+. NH4 + 2-oxoglutarato + NADPH ----GLDH---� L-glutamato + NADP+ + H2O La cantidad de NAPH formado equivale a la cantidad de amoniaco presente en la muestra, pudiendo medírsela fotométricamente mediante la disminución resultante de la absorbancia. 17.4 Rango de referencia Varones: (16.0-60.0 µmol/L) Mujeres: (11.0-51.0 µmol/L) 17.5 Interferentes y Limitaciones

• Sin interferencia de bilirrubina conjugada y no conjugada de hasta aprox. 60 mg/dL. • Sin interferencia significativa por hemólisis hasta una concentración de aprox. 50 mg/dL de

hemoglobina. • Sin interferencia significativa por lipemia hasta una concentración aprox. de 500 mg/dL de

triglicéridos.



COLESTEROL


18.- Colesterol Test enzimático para la determinación cuantitativa del colesterol en suero y plasma humanos con analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción Los principales lípidos del plasma humano son el colesterol, los ésteres del colesterol, los triglicéridos, los fosfolípidos y los ácidos grasos no esterificados. Los lípidos se transportan en el plasma y otros compartimentos extracelulares del cuerpo en forma de lipoproteínas, que son complejos macromoleculares compuesto de un núcleo lipídico hidrófobo, un fosfolípido hidrofílico y una superficie proteica. El colesterol es un importante componente estructural de las membranas celulares y un precursor para la biosíntesis de los ácidos biliares y las hormonas esteroidales. En los seres humanos, del 60 al 70% del colesterol es transportado por lipoproteínas de baja densidad (LDL), del 20 al 35%, por lipoproteínas de alta densidad (HDL) y del 5 al 12%, por lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL).

La cardiopatía coronaria (CHD) está relacionada con una serie de factores de riesgo como por ejemplo, el tabaco, la hipertensión arterial y la hiperlipidemia. De estos factores de riesgo, el colesterol es particularmente importante. La evidencia de diferentes fuentes (genéticas, experimentales, resultados de ensayos clínicos), demuestra de manera consistente una relación fuerte e independiente entre el colesterol plasmático y la cardiopatía coronaria. El descenso de los niveles de colesterol produce una reducción estadísticamente significativa de la incidencia de infartos de miocardio. Normalmente, una reducción del 1% en los niveles de colesterol produce una reducción de 2-3% del riesgo de cardiopatía coronaria.

18.1 Obtención de la muestra

• Suero recogido en tubos estándar de muestra, sin anticoagulante. • Plasma con heparina o EDTA. No emplear plasma con citrato, oxalato o fluoruro.

Es posible emplear muestras extraídas en ayunas o no. Las muestras que contienen precipitado deben centrifugarse antes de efectuar el test. 18.2 Reactivos R1: Tampón Pipes 225 mmol/L, pH 6.8 Mg2+: 10mmol/L; colato sódico: 0.6 mmol/L; 4-aminofenazona >0.45 mmol/L; fenol > 12.6 mmol/L; éter poliglicólico de alcohol graso: 3%; colesterol esterasa >1.5 U/ml;

colesteroloxidasa >0.45 U/mL; peroxidasa > 0.75 U/mL; estabilizadores; conservantes. Pipes: Pipierazina-1,4 bis (2-ácido etanosulfónico) Preparación y Estabilidad del reactivo: Listo para usar. Abierto y refrigerado en analizador 12 semanas.



COLESTEROL


18.3 Principio del test color enzimático A la muestra se le adiciona el reactivo 1 (reactivo de colesterol) y se inicia la reacción. Con colesterol esterasa y colesteroloxidasa, el colesterol se determina enzimáticamente. Ester de colesterol + H2O---- Colesterol-esterasa ----� colesterol + RCOOH Bajo la influencia del colesterol esterasa, los ésteres del colesterol se desdoblan a colesterol libre y ácidos grasos. Colesterol + O2 --

Colesteroloxidasa ---� colest-4-ene-3-ona + H2O2 El colesterol se transforma a �4-colestenona y peroxido de hidrógeno mediante la acción del oxigeno y colesteroloxidasa. 2 H2O2 + 4-aminofenazona + fenol----- Peroxidasa -----�colorante de quinonaimina + 4H2O

Bajo la acción catalítica de la peroxidasa, el peroxido de hidrógeno formado reacciona con 4-aminofenazona y fenol para formar un colorante rojo cuya intensidad de color es directamente proporcional a la concentración de colesterol. Este colorante puede medirse fotométricamente. 18.4 Rango de referencia Intervalo ideal de colesterol < 200 mg/dL Intervalo Límite para colesterol elevado: 200-239 mg/dL Colesterol alto: >240 mg/dL 18.5 Interferencias y limitaciones

• Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada hasta aprox. 25 mg/dL y bilirrubina no conjugada hasta aprox 10 mg/dL

• Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox.700 mg/dL • Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox 2500 mg/dL.



HDL COLESTEROL


19.- HDL- Colesterol Test enzimático in vitro para la determinación cuantitativa directa del colesterol HDL en suero y plasma humanos con analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción

Las lipoproteínas plasmáticas son partículas esféricas que contienes cantidades variables de colesterol, triglicéridos, fosfolípidos y proteínas.

Los fosfolípidos, colesterol libre y las proteínas constituyen la superficie de las partículas lipoproteícas, mientras que su cuerpo “core” contiene una mayor proporción de colesterol eterificado y triglicéridos. Las partículas solubilizan y transportan el colesterol en el torrente sanguíneo.

La proporción relativa de proteína y lípido determina la densidad de estas lipoproteínas y proveen las bases sobre las cuales establecen una clasificación. Estas clases son: quilomicrones, proteínas de muy baja densidad (VLDL), proteínas de baja densidad (LDL) y proteínas de baja densidad (HDL).

Numerosos estudios clínicos han demostrado que las diferentes clases de lipoproteínas tienen distintos y variados efectos en el riesgo de enfermedad coronaria.

La función principal de las HDL en el metabolismo lipídico es la captación y transporte de colesterol desde los tejidos periféricos al hígado en un proceso conocido como trasporte reverso de colesterol o mecanismo cardioprotector.

Bajos niveles de HDL colesterol está asociado a un alto riesgo de enfermedad cardiaca. Por este motivo la determinación de HDL colesterol es una herramienta útil en la identificación de individuos de alto riesgo. 19.1 Obtención de la muestra

• Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante). • Plasma con heparina de litio y heparina sódica.

Para la determinación pueden emplearse muestras extraídas en ayunas o después de la ingesta alimentaria. Con plasma EDTA se obtienen recuperaciones disminuidas. Las muestras que contienen precipitado deben centrifugarse antes de efectuar el test.



HDL COLESTEROL


19.2 Reactivos R1: Tampón HEPES: 10.07 mmol/L; CHES 96.95 mmol/L; pH 7.4; sulfato de dextrano 1.5g/L ;nitrato de magnesio hexahidratado >11.7mmol/L; HSDA 0.96mmol/L; ascorbato oxidasa >50ukat/L; peroxidasa 16.7ukat/L R2: Tampón HEPES: 10.07 mmol/L; pH: 7.0; PEG colesterol estearasa:>3.33ukat/L; PEG colesterol oxidasa:>127 ukat/L; peroxidasa>333ukat/L; 4-amino-antipirina: 2.46 mmol/L Preparación y Estabilidad del reactivo: Listo para usar. Abierto y refrigerado en analizador 12 semanas. 19.3 Principio del Test: Test homogéneo, enzimático, colorimétrico. Esteres del colesterol HDL + H2O --- PEG-colesterol- Esterasa-----� colesterol RCOOH Bajo la influencia de colesterolesterasa, los ésteres de colesterol se desdoblan a colesterol libre y ácidos grasos. Colesterol HDL+O2 ----

PEG-colesteroloxidasa---� �4- colestenona + H2O2 El colesterol se transforma a �

4- colestenona y peroxido de hidrógeno mediante oxígeno y colesteroloxidasa. 2H2O2 + 4-aminofenazona + HSDA*+ H+ + H2O ---- Peroxidasa ---� colorante violeta azul + 5H2O HSDA*: N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina Bajo la acción catalítica de la peroxidasa, el peroxido de hidrógeno formado reacciona con 4-aminofenazona y HSDA para formar un colorante violeta azul cuya intensidad de color que es directamente proporcional a la concentración de colesterol HDL se mide fotométricamente. 19.4 Rango de Referencia Riesgo No Moderado Alto Varones mg/dL >55 35-55 <35 mmol/L >1.45 0.9-1.45 <0.9 Mujeres mg/dL >65 45-65 <45 mmol/L >1.68 1.15-1.68 <1.15



HDL COLESTEROL


19.5 Interferencias y Limitaciones

• Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox. 1000 mg/dL.

• Sin interferencia significativa por lipemia hasta 1000 mg/dL. Hasta el momento no existe un modelo que permita imitar la interferencia por triglicéridos ya que, en la muestra de pacientes, los triglicéridos se comportan de manera impredecible dependiendo de las cualidades de los ácidos grasos esterificados. Frecuentemente, las muestras de pacientes con altas concentraciones de triglicéridos son lipémicas. El usuario no puede verificar la validez de las interferencias por triglicéridos en las muestras.

• En casos aislados pueden presentarse valores falsamente elevados del colesterol HDL ante altas

concentraciones de inmunoglobulinas.

• Ya que las hepatopatías influyen en el metabolismo lipídico, los valores de colesterol HDL y LDL son de importancia limitada en el diagnóstico. En algunos pacientes con hepatopatías el valor medido de HDL- plus puede ser significativamente menor a un valor obtenido con el método de referencia para colesterol HDL.

• No se ha encontrado interferencia con 20 fármacos de uso frecuente.



TRIGLICERIDOS


20.- Triglicéridos GPO-PAP Test enzimático in vitro para la determinación cuantitativa de triglicéridos en suero y plasma humanos con los analizadores automática de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción Los triglicéridos son lípidos absorbidos en la dieta y también producidos en forma endógena a partir de carbohidratos. Su medición es importante en el diagnóstico y manejo de hiperlipidemias. Estas enfermedades pueden tener origen genético o ser secundarias a otras tales como nefrosis, diabetes mellitus y disfunciones endocrinas. El aumento de triglicéridos se ha identificado como u factor de riesgo en enfermedades ateroscleróticas. 20.1 Obtención de la Muestra

• Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) • Plasma con heparina o EDTA.

Las muestras que contienen precipitado deben centrifugarse antes de efectuar el test. 20.2 Reactivos R1: Tampón Pipies*: 50 mmol/L, pH 6.8; Mg2+: 40 mmol/L; colato sódico: 0.20 mmol/L; ATP > 1.4 mmol/L; 4- aminofenazona > 0.13 mmol/L; 4-clorofenol: 4.7 mmol/L; hexacianoferrato de potasio (II): 1µmol/L; eterpoliglicólico de alcohol graso: 0.65%; lipasa lipoproteica (Pseudomona spec.)>5.0 U/mL.; glicerocinasa >0.19 U/mL; glicerofosfato-oxidasa >2.5 U/mL; peroxidasa > 0.10 U/mL. Preparación y Estabilidad del reactivo: Listo para usar. Abierto y refrigerado en analizador 12 semanas. 20.3 Principio del Test Test enzimático A la muestra se le adiciona el reactivo el R1 (Tampón/4-clorofenol/enzimas), dando inicio a la reacción: Triglicéridos + 3 H2O -- LPL----� glicerol + 3 RCOOH Glicerol + ATP --- GK--� glicerol-3-fosfato +ADP Mg2+ Glicerol-3-fosfato + O2 ---

GPO ----�dihidroxiacetonafosfato + H2O2 H2O2 +4-aminofenazona + 4-clorofenol --Peroxidasa-�4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona + 2H2O + HCL



TRIGLICERIDOS


20.4 Rango de Referencia Intervalo normal: < 200 mg/dL 20.5 Interferencias y Limitaciones

• Sin interferencias significativas por bilirrubina conjugada hasta aprox. 12 mg/dL y bilirrubina no conjugada hasta aprox. 27 mg/dL

• Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox.600 mg/dL

• Con muestras extremadamente lipémicas (valores de triglicéridos mayores a 300) se pueden obtener

resultados normales. Estas muestras deben diluirse 1+4 con una solución de cloruro de sodio al 0.9%. multiplicar el resultado por 5 o bien, tratándose de los analizadores cobas 6000 o c311, repetir el ensayo con un menor volumen de muestra.



DESHIDROGENASA LACTICA


21.- LDH Test cuantitativo in vitro para la determinación de deshidrogenasa láctica (LDH en suero y plasma humanos en equipos automatizados de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción

Las isoenzimas LDH se miden para saber el origen (ubicación) de la lesión tisular. La enzima LDH se encuentra en muchos tejidos del cuerpo, especialmente en el corazón, en el hígado, en los riñones, en el músculo esquelético, en las células sanguíneas cerebrales y en los pulmones. Su función es interconvertir el piruvato y el lactato. En el ejercicio muscular las células musculares transforman la glucosa en lactato, el lactato se libera a la sangre, y puede ser recogido por el hígado que lo vuelve a transformar en glucosa que se libera a la sangre para ser utilizada nuevamente como energía por los tejidos. La LDH se presenta en 5 formas, llamadas isoenzimas, que difieren ligeramente en su estructura. La LDH-1 se encuentra en mayores concentraciones en el músculo cardíaco y en los glóbulos rojos sanguíneos, la LDH-2 es más alta en los glóbulos blancos sanguíneos, la LDH-3 es más alta en los pulmones, la LDH-4 es más alta en los riñones, en la placenta y en el páncreas y la LDH-5 es más alta en el hígado y en el músculo esquelético.

21.1 Obtención de la Muestra • Suero recolectado en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) • Plasma con heparina o EDTA

21.2 Reactivos R1: N-metilglucamina: 400mmol/L; lactato de litio: 62mmol/L; pH 9.4. R2: NAD 62mmol/L. Preparación y Estabilidad del reactivo: Listo para usar. Abierto y refrigerado en analizador 12 semanas. 21.3 Principio del Test Ultravioleta según método estandarizado. L-Lactato + NAD = LDH ==� Piruvato + NADH + H+ La enzima lactato deshidrogenasa cataliza la conversión de piruvato a lactato; oxidando NADH a NAD+ en este proceso. La velocidad de disminución de NADH es directamente proporcional a la actividad de LDH. 21.4 Rango de Referencia Adultos (37°C): 240-480 U/L 21.5 Interferencias y Limitaciones

• La hemólisis interfiere con el test debido a la liberación de LDH desde los eritrocitos al plasma. • Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada y no conjugada hasta aprox. 60 mg/dL. • Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox. 1800 mg/dL.



CREATINQUINASA


22.- CK (creatinquinasa) Test in vitro para la determinación cuantitativa de la creatinquinasa (CK) en suero y plasma humanos con analizadores automáticos de química clínica (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción

Las alteraciones enzimáticas han demostrado su utilidad desde la década del 50, donde Karmen describió el ascenso de las transaminasas glutamicooxaloacética en 4 de 5 pacientes infartados. Debe tenerse clara la secuencia de ascenso de cada enzima, esto permite su uso en el momento correcto de la evolución natural de la enfermedad y las mas útiles suelen ser la CK, CK-MB, LDH y actualmente la TROPONINA juega un papel fundamental.

La CREATIN KINASA (CK) esta presente en el músculo cardíaco y aumenta tempranamente en el infarto agudo del miocardio; sin embargo, se encuentra también en el músculo esquelético, y en el cerebro, y se describen aumentos de ella en ciertas situaciones clínicas como el trauma muscular, el uso de la vía intramuscular, la rabdomiolisis, la intoxicación etílica, el embolismo pulmonar y la insuficiencia renal, de allí la importancia del uso de las isoenzimas (MM, BB y MB) para mejorar la calidad diagnóstica del infarto del miocardio (5) Restrepo, M. , Mejia, A.. Infarto agudo del miocardio en Fundamentos de Medicina crítica, capitulo 3, Editorial corporación para ediciones en Colombia, 1990, 73 – 105. La CK-MB es denominada cardioespecífica, sin embargo se plantean algunas controversias en cuanto a su relación con el IM y las más importantes son: 1) puede ser liberada en procesos isquémicos, pero no está distribuida de forma similar en todo el miocardio y su metabolismo puede variar entre los individuos, por lo tanto la medición de sus niveles también puede variar (7); 2) se encuentra en pequeñas cantidades en la lengua, intestino delgado, diafragma, útero y próstata (5)( Restrepo, M. , Mejia, A.. Infarto agudo del miocardio en Fundamentos de Medicina crítica, capitulo 3, Editorial corporación para ediciones en Colombia, 1990, 73 – 105... Sin embargo, a través del tiempo la CK-MB ha demostrado su utilidad, sobre todo si se plantea que su aumento se inicia a las 4– 6 horas, lo que da cierta rapidez a la conclusión diagnóstica; su pico es a las 12 horas y sobre todo el retorno a la normalidad entre las 24 y 48 horas, lo que permitiría evaluar nuevos episodios de lesión o extensiones del mismo por un nuevo ascenso o prolongación del ascenso en el tiempo.

22.1 Obtención de la muestra

• Suero recogido en tubos estándar de toma de muestra (sin anticoagulante). • Plasma con heparina o EDTA



CREATINQUINASA


22.2 Reactivos R1:Tampón Imidazol: 58mmol/L, pH 6.0; D-glucosa: 40mmol/L;; AMP 10 mmol/L; pentafosfato de diadenosín: 24 µmol/L; NADP: 9.5 mmol/L (levadura); N-acetilcisteína: 40 mmol/L; Mg2+ R2: EDTA: 3.0 mmol/L; pH 9.1; HK>600ukat/L; G6PDH >600ukat/L; ADP: 12,0mmol/L; fosfato de creatina180mmol/L; N- metildietanolamina: 69 mmol/L Preparación y Estabilidad del reactivo: Listo para usar. Abierto y refrigerado en analizador 12 semanas. 22.3 Principio del Test UV A la muestra se le adiciona R1 (tampón/enzima/coenzima). Luego se adiciona R2 (tampón/substrato) comenzando de esta manera la reacción: Creatinfosfato + ADP = CK ==�creatina + ATP D-Glucosa + ATP = HK==� glucosa-6-P + ADP Glucosa-6-P + NADP+ == G6PDH ====� D-6-fosfogluconato + NADPH + H+ En cuanto a cantidades equimolares, NADPH y ATP se forman a igual velocidad. La velocidad de la formación de NADPH medida fotométricamente es proporcional a la actividad de la CK. 22.4 Rango de Referencia Método estándar 94 (37°C) Varones: <170 U/L Mujeres: < 145 U/L 22.5 Interferencias y Limitaciones

• Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada y no conjugada hasta aprox. 60 mg/dL. • Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox. 200 mg/dL. • Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox.2000 mg/dL.



ISOENZIMA MB DE LA

CREATINQUINASA


23.- CK MB (isoenzima MB de la creatinquinasa) Test inmunoinhibitorio in vitro para la determinación cuantitativa de la isoenzima MB de la creatinquinasa en suero y plasma humanos con analizadores automáticos (Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción

Las alteraciones enzimáticas han demostrado su utilidad desde la década del 50, donde Karmen describió el ascenso de las transaminasas glutamicooxaloacética en 4 de 5 pacientes infartados. Debe tenerse clara la secuencia de ascenso de cada enzima, esto permite su uso en el momento correcto de la evolución natural de la enfermedad y las mas útiles suelen ser la CK, CK-MB, LDH y actualmente la TROPONINA juega un papel fundamental.

La CREATIN KINASA (CK) esta presente en el músculo cardíaco y aumenta tempranamente en el infarto agudo del miocardio; sin embargo, se encuentra también en el músculo esquelético, y en el cerebro, y se describen aumentos de ella en ciertas situaciones clínicas como el trauma muscular, el uso de la vía intramuscular, la rabdomiolisis, la intoxicación etílica, el embolismo pulmonar y la insuficiencia renal, de allí la importancia del uso de las isoenzimas (MM, BB y MB) para mejorar la calidad diagnóstica del infarto del miocardio (5) Restrepo, M. , Mejia, A.. Infarto agudo del miocardio en Fundamentos de Medicina crítica, capitulo 3, Editorial corporación para ediciones en Colombia, 1990, 73 – 105. La CK-MB es denominada cardioespecífica, sin embargo se plantean algunas controversias en cuanto a su relación con el IM y las más importantes son: 1) puede ser liberada en procesos isquémicos, pero no está distribuida de forma similar en todo el miocardio y su metabolismo puede variar entre los individuos, por lo tanto la medición de sus niveles también puede variar (7); 2) se encuentra en pequeñas cantidades en la lengua, intestino delgado, diafragma, útero y próstata (5)( Restrepo, M. , Mejia, A.. Infarto agudo del miocardio en Fundamentos de Medicina crítica, capitulo 3, Editorial corporación para ediciones en Colombia, 1990, 73 – 105... Sin embargo, a través del tiempo la CK-MB ha demostrado su utilidad, sobre todo si se plantea que su aumento se inicia a las 4– 6 horas, lo que da cierta rapidez a la conclusión diagnóstica; su pico es a las 12 horas y sobre todo el retorno a la normalidad entre las 24 y 48 horas, lo que permitiría evaluar nuevos episodios de lesión o extensiones del mismo por un nuevo ascenso o prolongación del ascenso en el tiempo.

23.1 Obtención de la Muestra

• Suero, recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) • Plasma con heparina o EDTA.



ISOENZIMA MB DE LA

CREATINQUINASA


23.2 Reactivos R1: Tampón imidazol: 58 mmol/L, pH 6.0; N-acetilcisteína: 40 mmol/L; EDTA: 3 mmol/L; AMP: 10mmol/L; diadenosínpentafosfato: 24µmol/L; NADP: 29.5mmol/L; Mg2+: 20 mmol/L; D-glucosa: 40 mmol/L R2: EDTA: 3 mmol/L; pH 9.1; HK>600ukat/L; G6PDH>600ukat/L; ADP: 12 mmol/L; fosfato de creatina 180mmol/L; N-metildietanolamina: 69mmol/L. Preparación y Estabilidad del reactivo: Listo para usar. Abierto y refrigerado en analizador 12 semanas. 23.3 Principio del Test UV inmunológico A la muestra se le adiciona R1 (tampón/coenzima/anticuerpo). Posteriormente se le agrega R2 (tampón/substrato) dando inicio a la reacción. La CK MB humana consiste en dos subunidades, CK M y CK B, ambas con un sitio activo. Un anticuerpo policlonal dirigido contra la CK M inhibe casi completamente (el 99.6%) la actividad catalítica de estas subunidades sin influir en las subunidades CK B. La actividad resultante de la CK B, que equivale a la mitad de la actividad de la CK MB, se determina, al igual que la actividad total de la CK, según el método CK NAC. La actividad catalítica de la isoenzima CK MB puede calcularse a partir de la actividad de la Ck B medida, multiplicándola por 2, ya que la isoenzima CK BB aparece muy raramente en suero y la actividad catalítica de las subunidades CK M y CK B apenas se distinguen. 23.4 Rango de Referencia Infarto al miocardio : La probabilidad de una lesión del miocardio es elevada si se cumplen las siguientes condiciones: CK hombres (37°C): > 190 U/L CK mujeres (37°C): > 167 U/L CK – MB: > 24 U/L 23.5 Interferencias y Limitaciones

• La hemólisis interfiere en el test • Sin interferencias significativas por bilirrubina conjugada hasta aprox. 60 mg/dL y bilirrubina no

conjugada hasta aprox. 20 mg/dL • Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox. 800 mg/dL • En pacientes con predisposición a la formación de macro CK pueden medirse valores altos de CK

MB. Como estos pacientes generalmente no sufren infartos de miocardio, en estos casos se requieren medidas diagnósticas posteriores.



PROTEINA C REACTIVA


24.- PCR (Proteína C Reactiva) Test inmunoturbidimétrico para la determinación cuantitativa in vitro de PCR en suero y plasma humanos con analizadores de química clínica Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Introducción Es un reactante de fase aguda. Después de un estímulo adecuado, infección ó traumatismo por ejemplo, y a través de mediadores polipéptidos llamados citoquinas se producen numerosos cambios o respuestas. Uno de ellos y que se detecta al cabo de unas horas es el incremento de las proteínas llamadas reactantes de la fase aguda. Se trata de proteínas que ó ya existen en pequeña cantidad normalmente, ó se producen “de novo”. El hígado las sintetiza y en gran cantidad, aumentando su nivel en sangre de una manera notable. La proteína primeramente descubierta y caracterizada fue la Proteína C Reactiva (PCR). Se la llamó así por su capacidad de reaccionar con el polisacárido C del Streptococcus pneumoniae. También es el reactante de fase aguda mejor estudiado y de mayor aplicación clínica, en el presente. Más recientemente la puesta a punto de técnicas de PCR de alta sensibilidad o ultrasensibles está en evolución y probablemente se generalizará su uso en la clínica. La importancia y aplicación de la técnica aumentará ya que de momento se muestra útil y aporta información sobre la evolución de coronariopatías en personas aparentemente sanas. A menudo el aumento de la PCR va paralelo al aumento de la VSG, pero el incremento de la PCR suele preceder al de la VSG y desciende antes que esta última al desaparecer la causa. La PCR no está influida al revés que la VSG por factores dependientes de los hematíes (anemia, policitemia, esferocitosis, microcitosis, macrocitosis) tampoco por la hipergammaglobulinemia ni por la insuficiencia cardiaca. (© Médica de Tarragona 10/06/03) 24.1.- Obtención de la Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante). Plasma con heparina de litio o EDTA 24.2 Reactivos R1: Tampón Tampón Tris/HCl*: 100 mmol/L, pH 7.5; cloruro sódico: 300 mmol/L; polietilenglicol: 2.0 %; conservante. R2: Anticuerpos anti- PCR/ tampón Anticuerpos anti PCR humana (cabra): dependiente del título; tampón Tris/HCl*: 100 mmol/L, pH 8.0; cloruro sódico: 300 mmol/L; polietilenglicol: 2.0 %; conservante.



PROTEINA C REACTIVA


Preparación y Estabilidad del reactivo: Listo para usar. Abierto y refrigerado en analizador 12 semanas. 24.3 Principio del Test Inmunoturbidimétrico A la muestra se le adiciona el R1 (tampón). Luego con la adición del R2 se da inicio a la reacción. Anticuerpos anti-PCR reaccionan con el antígeno de la muestra formando un complejo antígeno-anticuerpo que se mide turbidimétricamente después de la aglutinación. La adición de PEG posibilita un rápido punto final, aumenta la sensibilidad y reduce el riesgo de medir valores falsos negativos en muestras con exceso de antígeno. 24.4 Valores de Referencia Valores IFCC: < 0.5 mg/dL (< 5.0 mg/L). Concentraciones < 1 mg/dL excluyen muchas enfermedades inflamatorias agudas, pero no generalmente un proceso inflamatorio. Valores > 50 mg/dL en enfermedades agudas son indicio de una alta y extensiva actividad inflamatoria. 24.5 Interferencias y Limitaciones Sin interferencia significativa por bilirrubina conjugada y no conjugada hasta aprox. 60 mg/dL. Sin interferencia significativa por hemoglobina hasta aprox. 700 mg/dL. Sin interferencia significativa por triglicéridos hasta aprox. 200 mg/dL. Factores reumatoides < 1200 UI/mL no interfieren En caso de concentraciones de PCR superiores a 50 mg/dL puede producirse el efecto pro-zona.



FACTOR REUMATOIDEO


25.-Factor Reumatoídeo: Test látex para la determinación semicuantitativa in vitro del factor reumatoídeo en suero humano. 25.1 Obtención de la Muestra: Suero fresco obtenido por la centrifugación de sangre total 25.2 Reactivos � Reactivo Látex para 100 determinaciones � Control positivo: Suero humano positivo para el factor reumatoídeo � Control negativo: Suero humano negativo para el factor reumatoídeo. � Buffer diluyente de glicina concentrado � Pipetas estériles / placas de aglutinación

Preparación de los reactivos: Listos para ser usados. Buffer diluyente Adicionar 1 parte de buffer con 9 partes de agua destilada. La dilución posee un pH 8.0 - 8.2. Estabilidad del Reactivo: Hasta fecha de caducidad. 25.3 Principio del Test Singer y Plotz describieron un método de detección de factor reumatoídeo usando una fina suspensión de gránulos plásticos unida a gamma globulina humana las que serán aglutinadas en presencia de factor reumatoídeo. 25.4 Rango de Referencia Negativo (sin aglutinación): <8 UI/mL Positivo (presencia de aglutinación): > 8 UI/mL



FACTOR REUMATOIDEO


Determinación semicuantitativa El test semicuantitativo puede llevarse a cabo de la misma forma que el test un test cuantitativo usando diluciones del suero en tampón fosfato, suero fisiológico o tampón glicina como se describe a continuación:

25.5 Interferentes y Limitaciones Sueros lipémicos, hemáticos y contaminados deben ser eliminados debido a que interfieren en la reacción.

Dilución 1/2 1/4 1/8 1/16Muestra de suero 100 ulsuero fisiológico 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul

100 ul100 ul

100 ul

Volumen de muestra 50 ul 50 ul 50 ul 50 ul8 x n° de dilucion 8x2 8x4 8x8 8x16UI/ml 16 32 64 128



ANTIESTREPTOLISINA O


26 - ASO (anti estreptolisina O). Test látex para la determinación semicuantitativa in vitro ASO en suero humano. 26.1 Obtención de la Muestra Suero fresco obtenido por la centrifugación de sangre total 26.2 Reactivos � Reactivo Látex para 100 determinaciones � Control positivo: Suero humano positivo para ASO � Control negativo: Suero humano negativo para ASO. � Buffer diluyente de glicina concentrado � Pipetas estériles / placas de aglutinación

Preparación de los reactivos: Reactivo Látex: listo para el uso Control positivo: listo para el uso Control negativo: listo para el uso Buffer diluyente Adicionar una parte de buffer con nueve partes de agua destilada. La dilución posee un pH 8.0 - 8.2. Estabilidad del Reactivo. El reactivo debe estar bien tapado y guardarse refrigerado a 2-8 °C. 26.3 Principio del Test En la infección aguda producida por estreptococo, se producen anticuerpos anti-estreptolisina O, antígeno liberado por la bacteria. Información sobre la extensión y el grado de infección de infección puede ser proporcionada por la medición de este anticuerpo en suero humano.



ANTIESTREPTOLISINA O


26.4 Rango de Referencia Negativo (sin aglutinación): <200 UI/mL Positivo (presencia de aglutinación): > 200 UI/mL Determinación semicuantitativa El test semicuantitativo puede llevarse a cabo de la misma forma que el test un test cuantitativo usando diluciones de el suero en tampón fosfato, suero fisiológico o tampón glicina como se describe a continuación:

26.5 Interferentes y Limitaciones Sueros lipémicos, hemáticos y contaminados deben ser eliminados debido a que interfieren en la reacción.

Dilución 1/2 1/4 1/8Muestra de suero 100 ulsuero fisiológico 100 ul 100 ul 100 ul

100 ul100 ul

Volumen de muestra 50 ul 50 ul 50 ul200x n° de dilucion 200x2 200x4 200x8UI/ml 400 800 1600



ELECTROLITOS PLASMÁTICOS


27.- Electrolitos Plasmáticos. Test Basado en el método de ión selectivo para la determinación cuantitativa de iones sodio, potasio y cloruro en equipo COBAS 6000 y COBAS c501. y equipo b-221 de gases y electrolitos. Introducción Los electrolitos son iones que existen en los líquidos corporales. En el líquido extracelular (LEC) el catión principal es el Na+ y el anión principal el Cl- . El metabolismo resulta afectado en cierto grado por las concentraciones relativas y absolutas de estos electrolitos, que constituyen importantes factores determinantes de la osmolaridad, del estado de hidratación, y del pH del líquido tanto intracelular como extracelular. El K+ es el principal catión intracelular, solo el 2% del total de K+ total del cuerpo es extracelular. 27.1 Obtención de la Muestra:

• Suero recogido en tubo estándar de muestra ( sin anticoagulante ) • Plasma recogido en tubo con heparina de litio • Sangre total.

27.2 Preparación del Paciente

• Ayuno 27.3 Principio del Test El método de análisis está basado en el uso de electrodos ión selectivo. El analizador posee 4 electrodos: sodio, potasio, cloro y referencia. Cada electrodo posee una membrana ión selectiva llevando a cabo una reacción especifica con el ión correspondiente contenido en la muestra a analizar. La membrana es un intercambiador de iones que reacciona a la carga eléctrica del ión causando un cambio en el potencial eléctrico en la membrana que guarda relación con la concentración iónica de la muestra según la ecuación de Nernst. 27.4 Rangos de Referencia Valor Normal en Suero Sodio: 135-145 mEq/L Potasio: 3.5-4.5 mEq/L Cloro: 98-110 mEq/L



ELECTROLITOS PLASMÁTICOS


Valor Normal en Neonatos Sodio: 135-145 mEq/L Potasio: 3.6-6.7 mEq/L Cloro: .101-111 mEq/L 27.5 Interferentes y Limitaciones del Test

• Hemólisis: Aumenta el Potasio • Lipemias: Puede dar pseudo hipernatremias

27.6 Valores de Pánico Resultados con los siguientes valores deben ser avisados inmediatamente al servicio respectivo. Sodio: < de 125 mEq/L > de 155 mEq/L Potasio: < de 2.5 mEq/L > de 6.0 mEq/L



ORINA COMPLETA


28.- Orina Completa / Sedimento Urinario Introducción El estudio de las muestras de orina sirve tanto para el diagnóstico como para el monitoreo del tratamiento de enfermedades renales o del tracto urinario, y la detección de enfermedades metabólicas o sistémicas no directamente relacionadas con el sistema urinario, mediante la utilización de tiras reactivas y la observación al microscopio de la orina. Actualmente se realiza en equipo automatizado Urisys 2400. 28.1 Obtención de la Muestra Luego de realizar un buen aseo genital, depositar 20 ml de orina del segundo chorro (la primera de la mañana) en un envase limpio proporcionado por el laboratorio. Cerrar cuidadosamente y rotular con el nombre y los dos apellidos. 28.2 Reactivos Tira Reactiva Urisys 2400 (caset para 400 determinaciones) de 10 parámetros: Leucocitos: 0.4 % p/p de éster aminoácido-derivado pirrólico; 0.2% p/p de sal de diazonio; 40.9% p/p de solución reguladora; 58.5% p/p de ingredientes no reactivos. Nitritos: 1.4% p/p de ácido p-arsanílico; 1.3% p/p de 1-2-3-4-tetrahidrobenzo (h)-quinolin-3-ol; 10.8% p/p de solución reguladora; 86.5% p/p de ingredientes no reactivos. Urobilinógeno: 0.2% p/p de p-dietilaminobenzaldehido; 99.8% p/p de ingredientes no reactivos. Proteínas: 0.3% p/p de azul de tetrabromofenol; 97.3% de solución reguladora; 2.4% p/p de ingredientes no reactivos. PH: 0.2% de rojo de metilo; 2.8% p/p de azul de bromo timol; 97% p/p de ingredientes no reactivos. Sangre: 6.8% p/p dihidroperóxido de diisopropilbenceno; 4% p/p de 3.3’,5.5’ tetrametilbencidina; 48% p/p de solución reguladora; 41.25 % p/p de ingredientes no reactivos. Densidad: 2.8% p/p de azul de bromotimol; 68.8% p/p de poli(éter metil vinílico, sal sódica del ácido maleico); 28.4% p/p de hidróxido de sodio. Cetonas: 7.1% p/p de nitroprusiato de sodio; 92.9% p/p de solución reguladora. Bilirrubina: 0.4% p/p de sal de diazonio 2,4 dicloroanilina; 37.3% p/p de solución reguladora; 62.3% p/p de ingredientes no reactivos. Glucosa: 16.3% p/p de glucosa oxidasa (1,3 U.I.); 0.6% p/p de peroxidasa (3.300 U.I.); 7,0% p/p de yoduro de potasio; 60.7% p/p de solución reguladora; 15.4% p/p de ingredientes no reactivos.



ORINA COMPLETA


28.3 Procedimiento del Test.

1. Orina Completa:

� Homogeneizar la muestra de orina � Llenar un tubo del sistema Kova hasta 10 ml. � Introducir una cinta reactiva � Secar el excedente de orina sobre un papel absorbente � Colocar la cinta reactiva en el equipo lector de cintas reactivas � Centrifugar el tubo de orina a 1500 rpm por 5 min � Introducir una pipeta plástica Kova � Eliminar el sobrenadante invirtiendo el tubo � En la parte inferior del tubo debe quedar 1 ml de orina concentrada. � Resuspender el sedimento con la pipeta plástica � Colocar una gota en un portaobjeto y encima un cubreobjeto � Observar bajo un aumento (40 X) � Realizar recuento de los elementos observando por lo menos 10 campos (sedimento

urinario) 28.4 Rango de referencia

Aspecto: Transparente Densidad: 1.010-1.025 Glucosuria Negativo C. Cetónico: Negativo Albuminuria: Negativo Bilirrubina: Negativo Sangre: Sangre Urobiligóneno: Negativo pH: ácido Nitritos: Negativos

28.5 Interferentes Debe realizarse un buen aseo genital, previo a la toma de muestra



LIQUIDO CEFALORAQUIDEO


29.- Citoquímico de Líquido Cefalorraquídeo 29.1.- Introducción: El papel principal de la punción lumbar es el diagnóstico de la meningitis bacteriana, micótica y amebiana. El LCR normal es cristalino, con un aspecto y una viscosidad comparables a los del agua. Los recuentos celulares del LCR deben ser levados a cabo de inmediato: un estudio sugiere que el 40% de leucocitos pueden estar lisados tras 2 horas a temperatura ambiente. 29.2.- Tipo de Muestra: Liquido cefalorraquídeo 29.3.- Volumen de Muestra: Mínimo 1 ml. 29.4.- Procedimiento

1. Homogeneizar la muestra por inversión ( 10 veces). 2. Observar el aspecto del líquido: claro, levemente turbio, turbio, etc.. 3. Sacar la cantidad necesaria con un capilar para cargar la cámara y hacer recuento total de células;

contar 4 mm2, sumar los 4 grupos de las esquinas de 16 cuadraditos cada uno y multiplicar por 2.5. El resultado es la cantidad de leucocitos/ mm3.

4. Si es purulento o hemorrágico diluir con suero fisiológico y multiplicar el resultado por la dilución. 5. Sacar en una copa HITACHI aproximadamente 400 µl y centrifugar a 1500 rpm por 10 minutos. 6. Observar el color: Incoloro, levemente xantocrómico, xantocrómico, rojizo u otro. 7. Determinar del sobrenadante glucosa y proteína (UCSF) en COBAS 6000 y COBAS c501). 8. Con el sedimento homogeneizado del LCR, realizar frotis para tinción GRAM y para recuento

diferencial, tinción rápida e informar el porcentaje de mononucleares y porcentaje de polimorfo nucleares.

29.5.- Valores Normales Leucocitos: 0-5 x mm3 el rango normal para RN es un poco más alto 0-30 mononucleares. Proteínas: 15-45 mg/dL Glucosa: 60-70 % de la glucosa plasmática. 29.6.- Factores de Error

1. Muestras hemorrágicas por punción traumática y coagulada. 2. Demora en el traslado de la muestra al laboratorio.



CITOQUIMICO DE LIQUIDO

PLEURAL


30.- Citoquímico de Líquido Pleural y Otros 30.1 Introducción Las 2 capas de la pleura suelen estar separadas por una pequeña cantidad de líquido que facilita el movimiento de una contra la otra. Se ha estimado que la cantidad de líquido es de 1 a 15 ml. Las acumulaciones de líquido en el espacio pleural se denominan derrame. Los trasudados son acumulaciones de líquido debidas a un aumento de la presión hidrostática de los capilares pleurales o a una disminución de la presión oncótica plasmática. Las causas incluyen la insuficiencia cardiaca congestiva, la cirrosis hepática y el síndrome nefrótico. Los exudados suelen ser causados por un por un aumento de la permeabilidad capilar o una disminución de la reabsorción linfática. Las causas que influyen en la aparición de los exudados incluyen las infecciones plurales, las neoplasias y los procesos inflamatorios no sépticos como la enfermedad reumática. 30.2.- Muestra Cinco ml líquido pleural con (ANTICOAGULANTE) en un tubo (COLOR) 30.3.- Procedimiento

1. Homogeneizar la muestra por inversión (10 veces) 2. Observar aspecto del líquido: claro, levemente turbio, hemorrágico, purulento, coagulado u otro. 3. Sacar la cantidad necesaria con un capilar para cargar la cámara y hacer recuento total de células;

contar 4 mm2 , sumar los 4 grupos de la esquinas de 16 cuadraditos cada uno y multiplicar por 2.5. El resultado corresponde al número de leucocitos por mm3.

4. Si es purulento o muy hemorrágico diluir el líquido con suero fisiológico y multiplicar el resultado por la dilución.

5. Sacar en una copa HITACHI aproximadamente 400 µl y centrifugar a 1500 rpm por 10 minutos. 6. Observar el color: incoloro, levemente, rojizo u otro. 7. Determinar del sobrenadante glucosa y proteína total, albúmina y LDH y si se lo piden pH, colesterol

total en COBAS 6000 y COBAS c501). 8. Con el sedimento homogeneizado del líquido realizar frotis para tinción de GRAM y para recuento

diferencial, tinción rápida e informar el % de mononucleares y de polimorfonucleares.



GASES EN SANGRE


31.- Determinación de Gases en Sangre 33.1.-Introducción La indicación para la toma de gases sanguíneos será realizada en todo aquel paciente que se requiera hacer una valoración de la función pulmonar en términos de la oxigenación, ventilación y del estado ácido base, o sea establecer el diagnóstico de las alteraciones de su equilibrio, en términos de acidosis o alcalosis y de su etiología ya sea respiratoria o metabólica. 31.2.- Tipo de muestra

• Sangre arterial o venosa en capilar o jeringa heparinizada. La muestra debe ser tomada y transportada inmediatamente sobre hielo.

31.3.- Reactivos Buffer 1 (pH 7.383) Buffer 2 (pH 6.841) pH – reference Solución de lavado Solución de limpieza Gas calibrador 1 (oxígeno y CO2) Gas calibrador 2 (CO2) 31.4.- Valores medidos pH 6.0 a 8.0 pCO2 0 a 200 pO2 -10 a 742 31.5.-Valores calculados Bicarbonato actual HCO3

- 1 a 100 Exceso de base BE -40 a 40 CO2 Total CO2 0 a 100 Saturación oxigeno Sat O2 0 a 100%



GASES EN SANGRE


31.6.- Valores normales pH pCO2 HCO3

- BE Arterial 7.40 + 0.03 40 + 4 24 + 2 + 4 Venoso 7.35 + 0.03 46 + 4 25 + 2 + 4 31.7.- Factores de error

• Muestras coaguladas • Muestras con burbujas • Muestras transportadas sin hielo • Demasiado tiempo transcurrido entre la toma de muestra y procesamiento de la misma.



DETERMINACION DE SUB

UNIDAD BETA CUALITATIVA


32.- Determinación de BHCG cualitativa 32.1.- Introducción La gonadotrofina coriónica es una sialoglicopproteína con un PM de aproximadamente 46.000 daltons. HCG es inicialmente secretada por las células del trofoblásticas de la placenta, poco después de la fertilización. 32.2.- Tipo de muestra Suero (3 ml) obtenida por centrifugación de sangre total sin anticoagulante. 32.3.- Procedimientos

1. Sacar del refrigerador el reactivo y dejarlo que alcance la temperatura ambiente. 2. Centrifugar la muestra de sangre a 3000 rpm por 5 minutos. 3. Sacar la placa del envase. 4. Adicionar 3 gotas de suero en el posillo con la marca S. 5. Leer el resultado a los 5 minutos.

C C C

T T T

POSITIVA NEGATIVA INVALIDA

C

T

S



LIQUIDO AMNIOTICO


33.- Liquido Amniótico 33.1.1- Introducción La amniocentesis cumple objetivos terapéuticos y diagnósticos, de su estudio se pueden establecer parámetros:

a) Bienestar fetal: a partir de las 20 semanas de gestación. b) Madurez fetal: a partir de las 34 semanas de gestación. c) Edad gestacional: a partir de la 34 semanas de gestación.

33.1.2.- Muestra: cinco ml (mínimo) de líquido amniótico 33.1.3.- Procedimiento Test de Clement El estudio indica madurez pulmonar por medio de sustancias tensioactivas presentes en el líquido amniótico, se analiza la estabilidad de la espuma con diluciones crecientes de líquido amniótico. 1.- Utilizar 4 tubos 2.- Agitar suavemente la muestra por inversión 3.- Agregar reactivos y muestras según el siguiente cuadro

Tubo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Líquido amniótico 1ml 0.75 ml 0.5 ml 0.25 ml Suero fisiológico --- 0.25 ml 0.5 ml 0.75 ml Etanol 95° 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 4.- Tapar los tubos y agitar vigorosamente los tubos por 20 segundos y dejar 15 minutos en posición vertical. 5.- Analizar la formación en la parte superior del líquido como anillo continuo de espuma. 33.1.4.- Informe: Informar número de tubos positivos del total. (Ej.: 1 tubo positivo de 4) 33.1.5 Valor Normal: Al menos 3 tubos positivos de 4 33.1.6.- Limitaciones Interfieren muestras con sangre y meconio. 33.2.1.- Procedimiento de Células Naranjas Indica la madurez epidémica fetal 1.-Colocar una gota de líquido amniótico previamente homogenizado en un portaobjeto. 2.- Colocar una gota de azul de Nilo 0.9% y mezclar con el líquido amniótico. 3.- Contar 100 células e informar el porcentaje de células naranjas.



LIQUIDO AMNIOTICO


33.2.2.-Valor normal Porcentaje de células anaranjadas Edad Gestacional < 20% < 37 semanas de gestación 20 – 60 % 37 – 40 semanas de gestación > 60% > 40 semanas de gestación 33.3.1.-Recuento de Leucocitos Agitar la muestra por inversión y realizar recuento en cámara. 1.- Cargar la cámara de recuento. 2.- Dejar reposar unos minutos. 3.- Contar las 4 esquinas de la cámara y multiplicar por 2.5. Valor normal: < de 50 células por mm3 para descartar infección intramniótica, junto a glucosa y posteriormente el cultivo. 33.4.1.- Glucosa Centrifugar la muestra y realizar la determinación en Cobas 6000 ó c501. Valor normal: < 45 mg/dL 33.5.1.- Creatinina Centrifugar la muestra y realizar la determinación Actualmente en uso COBAS 6000 y COBAS c501). Valor normal: Inicio de gestación 0.8 – 1.1 mg/dL Término 1.8 – 4.0 mg/dL



BILIRRUBINA MICROMETODO


34.- Bilirrubina Total por Micro método (Bilita ) (Bilirrubinómetro BIL 100) 34.1 Introducción

Alrededor de un 40 a 60% de los recién nacidos de término (RNT) presentan ictericia en los primeros días de vida. En el recién nacido aparece ictericia cuando la bilirrubina sérica sobrepasa los 6 a 7 mg/dL. En el periodo neonatal precoz, la mayor parte de las veces, es un hecho fisiológico, pero en cualquier otra edad es siempre un signo patológico. En el recién nacido, el problema ha sido motivo de preocupación dado las cifras altas de bilirrubinemia se han asociado a daño grave del sistema nervioso central. En la gran mayoría de estos casos hay una causa patológica de hiperbilirrubinemia. La principal causa es la hemólisis y la primera conocida fue la Enfermedad Hemolítica de isoinmunización Rh. (escuela.med.puc.cl/paginas/publicaciones/ManualPed/RNIctericia.html) 34.2 Muestra Dos capilares heparinizados con sangre capilar sellado en un extremo con plasticina. 34.3 Procedimiento

1. Centrifugar capilares en micro centrífuga por 5 minutos a 12.000 rpm. 2. Retirar el porta capilar hasta tope (aparece en pantalla 0). 3. Debe haber capilar con agua destilada en posición A. 4. Poner el capilar con la muestra, evitando tocar con los dedos la parte central del capilar, donde se

encuentra el plasma, en posición B, debiendo quedar el plasma dentro de las dos líneas paralelas. 5. Introducir el porta capilar hasta la línea blanca y esperar 0. 6. Cerrar hasta el fondo y esperar el resultado. 7. Se leen los dos capilares y se saca el promedio. 8. Si el equipo da una alarma sonora y aparece EEE, retirar el porta capilar y volver a empezar desde el

punto 2. 9. Informar el resultado.

34.4 Valor Normal: En recién nacidos: 1.0 – 12.0 mg/dL. 34.5 Valor de Pánico Deben ser avisados de inmediato al servicio respectivo: > 18.0 mg/dL.



ESPECTROFOTOMETRIA DEL

LIQUIDO AMNIOTICO


35.- Espectrofotometría del líquido amniótico 35.1 Introducción

El líquido amniótico de algunas embarazadas con incompatibilidad Rh, tienen coloración amarillenta, debido a la presencia de bilirrubina y otros productos intermedios del metabolismo del Hem. Cuando se comparan las absorbancias de líquidos amnióticos de fetos normales y de fetos eritroblastóticos, se observa una distorsión de estos últimos. El grado de distorsión a 450 nm ha sido usado para predecir la gravedad de la condición hemolítica.

Normalmente, en el curso del último trimestre del embarazo existen trazas de bilirrubina en el líquido amniótico, que en el transcurso del mismo disminuyen paulatinamente y progresivamente, hasta prácticamente desaparecer en la fase final. Los fetos afectados de eritroblastocis, se acompañan de cifras elevadas a lo largo del embarazo cuya medida espectrofotométrica resulta esencial para conocer el grado de hemólisis del feto y poder seguir su evolución. La tasa de bilirrubina y su evolución en el tiempo, permite al obstetra adoptar la conducta más propicia para conservar el producto de la concepción. 35.2 Muestra Líquido amniótico en tubo sin anticoagulante y cubierto con papel calco para protegerlo de la luz. 35.3 Procedimiento

La determinación se realiza en el líquido amniótico protegido de la luz, efectuando lecturas a diferentes longitudes de onda las que van generalmente entre los 350 y 700 nm, contra blanco de agua destilada.. Las lecturas pueden realizarse con intervalos de 10 nm.

Los valores así obtenidos se llevan a papel semilogaritmico. Centrifugar la muestra a 3000 rpm por 10 a 20 min. Si el sobrenadante no es límpido, filtrar. Examinar el filtrado en un espectrofotómetro en el rango de 300 a 600 nm, con preferencia a intervalos de 10 nm en el rango crítico entre 350 a 525 nm. Usar agua destilada como blanco. Construir una curva en papel semilogaritmico con los valores obtenidos, donde las coordenadas logarítmicas, corresponden a valores de absorbancia y las abscisas aritméticas a las distintas longitudes de onda. Con la unión de los puntos se obtiene una curva. Trazar una línea que una los dos puntos de mayor depresión que por lo general están entre los 350 y 550 nm..Obtener el delta A 450 (D.O neta), que es la diferencia entre el valor leído a 450 nm y el valor teórico a 450 nm, dado por la línea trazada entre 350 y 550 nm.



TRIYODOTIRONINA T3


36.- Triyodotironina (Cobas 6000 Módulo e601) 6.1 Introducción

La triyodotironina (T3) es la principal hormona responsable de los efectos de las hormonas tiroideas sobre los distintos órganos diana. La mayor parte de la T3 se forma de manera extra tiroidea en el hígado por 5’ desyodación enzimática de la T4. Por esto la concentración de T3 en suero refleja más bien el estado funcional del tejido periférico que la tasa de secreción de la tiroides. La conversión disminuida de T4 a T3 provoca la reducción de la concentración de T3. Este fenómeno ocurre bajo la influencia de fármacos tales como el propanolol, los glucocorticoides o la amiodarona, así como en enfermedades extra tiroideas graves y se lo denomina “síndrome de la T3 baja”. Si bien la T3, al igual que la T4, se encuentra en más de un 99% unida a proteínas de transporte, su afinidad respecto de las proteínas es alrededor de 10 veces menor a la de la T4. 36.2 Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestras o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con Heparina de sodio, litio o amonio Plasma con EDTA tripotásico Plasma con citrato sódico Plasma con fluoruro sódico 36.3 Reactivos M: Micropartículas recubiertas de estreptavidina R1: Anticuerpo anti –T3 policlonal (oveja) marcado con quelato de rutenio. ANS R2: T3 biotinilada 36.4 Principio del Test Principio de competición con una duración total de 18 min. 1ª incubación: 30 µl de muestra y un anticuerpo específico anti T3 marcado con quelato de rutenio reacciona con el ANS (ácido 8- anilino-1-naftalensulfónico) para liberar la T3 ligada de la muestra. 2ª incubación: tras la incorporación de T3 marcada con biotina y de micropartículas recubiertas de estreptavidina, los puntos de fijación aún libres del anticuerpo marcado se ocupan formándose un complejo



TRIYODOTIRONINA T3


Anticuerpo- hapteno. El complejo total se fija por interacción entre la biotina y la estreptavidina a la fase sólida. La mezcla de reacción es trasladada a la célula de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente por el reactivo ProCell. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un fotomultiplicador. Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración realizada en el sistema a partir de una calibración de dos puntos y una curva principal incluida en el código de barras del reactivo. 36.5 Valores de Referencia 1.3-3.1 nmol/l o bien 0.8-2.0 ng/ml 36.6 Interferencias y Limitaciones El test no se ve afectado por ictericia (bilirrubina < 599µmol/l o <35 mg/dl), hemólisis (Hb <1.2 mmol/l ó 2.0g/dl), lipemia (<1800 mg/dl) ni biotina <82 nmol/l ó 20ng/ml. En pacientes en tratamiento con altas dosis de biotina (> 5 mg/día), la extracción de la muestra no debería efectuarse antes de 8 horas tras la última administración. La fenitoína, la fenilbutazona y los salicilatos provocan la liberación de la T3 de las proteínas de fijación, si bien reduce el nivel hormonal total de T3 con una concentración normal de FT3. Si la concentración de las proteínas de fijación (TBG, albúmina) es patológica, los niveles de T3 total pueden situarse fuera del intervalo normal, por más que el estado metabólico del paciente sea eutiroideo, como sucede por ejemplo en enfermedades extratiroideas, a embarazadas o bajo suministro de anticonceptivos. En ese caso se recomienda de determinar las concentraciones de FT3 o FT4



TETRAYODOTIRONINA

TIROXINA T4


37.- Tiroxina T4 (Cobas 6000 Módulo e601) 37.1.- Introducción

La hormona Tiroxina (T4) es el principal producto de secreción del tiroides y forma parte integrante del mecanismo de regulación entre hipotálamo, hipófisis anterior y tiroides. La T4 influye de manera anabólica sobre el metabolismo, formándose en el tiroides en una reacción que acopla dos moléculas de DIT (3,5-diyodotirosina). Ligada a la tiroglobulina, la T4 se almacena en el lumen de los folículos tiroideos y se secreta según se necesite por la acción de la HET.

La mayor parte de la tiroxina total (T4) en suero (>99%) está ligada a proteínas. La concentración de las proteínas transportadoras séricas está sujeta a influencias exógenas y endógenas. Por lo tanto, al evaluar la concentración de las hormonas tiroideas, también debe tomarse en cuenta el estado de las proteínas ligantes. De lo contrario, las alteraciones en dichas proteínas (como p. Ej. Durante el embarazo, por la administración de fármacos conteniendo estrógenos o ante un síndrome nefrótico) podrían llevar a interpretaciones erróneas del estado metabólico tiroideo.

La determinación de T4 se indica en los siguientes casos. En la detección de hipertiroidismo, del hipertiroidismo primario y segundario y para controlar la terapia de supresión de HET. 37.2.- Obtención de la muestra Suero recogido en tubos estándar de de muestras o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con heparina de sodio o de litio, EDTA tripotásico. 37.3.- Reactivos M: Micropartículas recubiertas de estreptavidina R!: Anticuerpo policlonal anti T4 de oveja marcado con quelato de rutenio 100 ng/ml. R2: T4 biotinilada 20 ng/ml. 37.4.- Principio del Test Principio de competición con una duración de 18 minutos. 1ª Incubación: la muestra (15 µl) y un anticuerpo específico anti T4 marcado con quelato de rutenio reacciona con el ANS (ácido 8-anilino-1-naftalensulfónico) para liberar la T4 ligada de la muestra. 2ª Incubación: tras la incorporación de T4 marcada con biotina y de micropartículas recubiertas con estreptavidina, los puntos de fijación aún libres del anticuerpo marcado se ocupan formándose un complejo anticuerpo-hapteno. El complejo total se fija por interacción entre la biotina y la estreptavidina a la fase sólida.



TETRAYODOTIRONINA

TIROXINA T4


La mezcla de reacción es trasladada a la célula de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas

se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo ProCell. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un foto multiplicador. Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración realizada en el sistema a partir de una calibración de dos puntos y una curva principal incluida en el código de barras del reactivo. 37.5.- Valores de Referencia 5.1-14.1 µg/dl o bien 66-181 nmol/l 37.6.- Interferencias y Limitaciones El test no se afectado por ictericia (bilirrubina >37 mg/dl), hemólisis (Hb >2.3g/dl), lipemia (triglicéridos >2.500 mg/dl) ni biotina >100ng/ml. En pacientes con tratamiento con altas dosis de biotina (> 5mg/día), la extracción de la muestra no debería efectuarse antes de 8 horas tras la administración. El presente test no debe aplicarse en pacientes bajo tratamiento con hipolipemiantes que contienen D-T4. Si se desea evaluar la función tiroidea de estos pacientes se debe suspender el tratamiento durante 4 a 6 semanas a fin de establecer su estado fisiológico.



TIROXINA LIBRE FT4


38.- Tiroxina Libre FT4 (Cobas 6000 Módulo e601) 38.1 Introducción

La hormona tiroidea (T4) forma parte del sistema regulador del tiroides e influye en todo el metabolismo. La mayor parte de la tiroxina total está ligada a proteínas transportadoras (TBG, proteína, albúmina). La tiroxina libre (FT4) constituye el componente fisiológicamente activa de la tiroxina.

La determinación de la tiroxina libre se ha convertido en un método esencial de diagnóstico clínico de rutina. La T4 libre se mide conjuntamente con la HET frente a la sospecha de una disfunción tiroidea. La determinación de la T4 libre también se indica en la supervisión de la terapia tiro supresora.

La determinación de la T4 libre tiene la ventaja de no depender de las variaciones en la concentración ni la capacidad de fijación de las proteínas ligantes y por ello no requerir la determinación adicional de un parámetro de fijación ( captación de tiroxina, globulina fijadora de tiroxina). Son numerosos los métodos disponibles para evaluar las concentraciones de las hormonas tiroideas libres. La medición directa de la T4 libre y la T3 libre mediante diálisis de equilibrio o ultra filtración sirve principalmente de método de referencia para la estandarización de procedimientos inmunológicos empleados en el diagnóstico de rutina. 38.2.- Obtención de la muestra Suero sin diluir recogido en con tubos estándar de muestras o con gel de separación Plasma con heparina de litio, sodio o amonio Plama con EDTA tripotásico Plasma con citrato sódico Plasma con fluoruro sódico 38.3.- Reactivos M: Micropartículas recubiertas de estreptavidina R!: Anticuerpo policlonal anti T4 de oveja marcado con quelato de rutenio 50 ng/ml. R2: T4 biotinilada 2.5 ng/ml. 38.4.- Principio del Test Principio de competición con una duración de 18 minutos. 1ª Incubación: la muestra (15 µl) y un anticuerpo específico anti T4 marcado con quelato de rutenio reacciona con el ANS (ácido 8-anilino-1-naftalensulfónico) para liberar la T4 ligada de la muestra.



TIROXINA LIBRE FT4


2ª Incubación: tras la incorporación de T4 marcada con biotina y de micropartículas recubiertas con estreptavidina, los puntos de fijación aún libres del anticuerpo marcado se ocupan formándose un complejo anticuerpo-hapteno. El complejo total se fija por interacción entre la biotina y la estreptavidina a la fase sólida. La mezcla de reacción es trasladada a la célula de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo ProCell. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un fotomultiplicador. Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración realizada en el sistema a partir de una calibración de dos puntos y una curva principal incluida en el código de barras del reactivo 38.5.- Valores teóricos: 0.93-1.7 ng/dl o bien 12-22 pmol/l 38.6 Limitaciones e Interferencias El test no se afectado por ictericia (bilirrubina >41 mg/dl), hemólisis (Hb >2g/dl), lipemia (triglicéridos >2.000 mg/dl) ni biotina >100ng/ml. En pacientes con tratamiento con altas dosis de biotina (> 5mg/día), la extracción de la muestra no debería efectuarse antes de 8 horas tras la administración. El presente test no debe aplicarse en pacientes bajo tratamiento con hipolipemiantes que contienen D-T4. Si se desea evaluar la función tiroidea de estos pacientes se debe suspender el tratamiento durante 4 a 6 semanas a fin de establecer su estado fisiológico.



HORMONA ESTIMULADORA DE

LA TIROIDES (HET) TSH


39.- Tirotropina TSH (Cobas 6000 Módulo e601) 39.1.- Introducción La hormona estimulante de la glándula tiroides (HET, tirotropina) es una glucoproteína con un peso molecular aproximado de 30.000 dalton que está compuesta de dos subunidades. La subunidad β es portadora de la información inmunológica específica de la HET, mientras que la cadena α contiene información específica de la especie con una secuencia de aminoácidos idéntica a la cadena α de la HL HEF y GCH. La TSH se produce en las células basófilas específicas de la hipófisis anterior y está sujeta a un ritmo circadiano de secreción. La liberación hipofisiaria de TSH constituye el principal mecanismo regulador de la acción biológica de las hormonas tiroideas. El efecto de la TSH sobre las fases de formación y secreción las hormonas tiroideas es tanto estimulante como proliferante.

La determinación de la TSH sirve como test inicial en el diagnóstico tiroideo. Pequeñas variaciones en la concentración de la fracción libre de las hormonas tiroideas implican importantes alteraciones del nivel de TSH. Esto se hace de la TSH un parámetro altamente sensible y específico para la interpretación de la función tiroidea, idóneo para la detección y/o exclusión de alteraciones en el mecanismo de regulación central del hipotálamo, hipófisis, y la tiroides. 39.2.- Obtención de la muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra o tubos conteniendo gel de separación Plasma con heparina de litio, sodio o amonio Plasma con EDTA tripotásico Plasma con citrato sódico Plasma con fluoruro sódico 39.3.- Reactivos M: Micropartículas recubiertas de estreptavidina R!: Anticuerpo monoclonales biotinilados anti TSH. R2: Anticuerpos anti TSH 39.4.- Principio del Test Principio de competición con una duración de 18 minutos. 1ª Incubación: la muestra (50 µl) y un anticuerpo monoclonal biotinilado anti TSH marcado con quelato de rutenio forma un complejo sándwich



HORMONA ESTIMULADORA DE

LA TIROIDES (HET) TSH


2ª Incubación: tras la incorporación de micro partículas recubiertas con estreptavidina, el complejo se fija a la fase sólida por la interacción de entre biotina y estreptavidina. La mezcla de reacción es trasladada a la célula de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo ProCell. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un fotomultiplicador. Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración realizada en el sistema a partir de una calibración de dos puntos y una curva principal incluida en el código de barras del reactivo. 39.5.- Valores de Referencia: 0.27-4.2 µUI/ml 39.6.- Interferencias y Limitaciones El test no se ve afectado por ictericia (bilirrubina <701µmol/l o <41 mg/dl), hemólisis (Hb <0.621 mmol o <1 g/dl), lipemia (Colesterol <1500 mg/dl) ni biotina < 60 ng/ml. En pacientes en tratamiento con altas dosis de biotina (>5 mg/día), la extracción de la muestra no debería efectuarse antes de 8 horas tras la última administración. No se ha encontrado interferencias con Factores reumatoides (hasta 3250 U/ml) ni en muestras de pacientes en diálisis.



HORMONA ESTIMULANTE DE

LOS FOLICULOS (FSH)


40.- Hormona Folículo Estimulante (FSH) (Cobas 6000 Módulo e601) 40.1- Introducción La hormona folículo estimulante, FSH, junto a la HL pertenece a la familia de las gonadotrofinas. Ambas hormonas regulan y estimulan de manera sinérgica el crecimiento y la función de las gónadas (ovarios y testículos). La FSH es una glucoproteína que consta de dos subunidades (las cadenas α y β). Su peso molecular aproximado es de 32.000 dalton. Las gonadotrofinas regulan el ciclo de la menstruación femenina. Las células gonadotropas de la hipófisis anterior liberan de forma pulsátil la FSH y la LH. Las concentraciones de las hormonas en circulación están controladas por hormonas esteroides a través de su retroacción negativa en el hipotálamo. En los ovarios, la FSH y la LH estimulan el crecimiento y la maduración del folículo y, con ello, la biosíntesis de estrógenos en los folículos. Hacia la mitad del ciclo, la concentración de FSH alcanza un pico, aunque en menos grado que la LH. Los valores de FSH están elevados durante la menopausia debido a modificaciones de la función ovárica así como por la disminución de la secreción de estrógenos. La determinación de la concentración de FSH sirve para el reconocimiento de trastornos funcionales en el eje hipotálamo, hipófisis, gónadas. La determinación combinada de HL y FSH está indicada en los siguientes casos: enfermedades congénitas con aberraciones cromosómicas, en caso de ovarios poliquísticos y del síndrome climatérico, así como para detectar las causas de amenorrea. 40.2.- Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o en tubos con gel de separación Plasma con heparina (litio, sodio, amonio) y EDTA tripotásico 40.3.- Reactivos M: Micropartículas recubiertas con estreptavidina R1: Anticuerpo anti Hormona Folículo Estimulante unido a biotina R2: Anticuerpo anti Hormona Folículo Estimulante, marcados con rutenio. 40.4.- Principio del Test Técnica sándwich con una duración total de 18 minutos. 1ª Incubación: 40 µl de muestra, un anticuerpo biotinilado monoclonal específico anti Hormona Folículo Estimulante y un anticuerpo específico monoclonal anti Hormona Folículo Estimulante marcado con quelato de rutenio forman un complejo sándwich.



HORMONA ESTIMULANTE DE

LOS FOLICULOS (FSH)


2ª Incubación: Después de la incorporación de micropartículas recubiertas de estreptavidina, el complejo formado se fija a la fase sólida por la interacción entre biotina y estreptavidina. La mezcla de reacción es trasladada a la celda de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo ProCell. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un fotomultiplicador. Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración de dos puntos y una curva master incluida en el código de barras del reactivo. 40.5.- Valores de Referencia Mujeres Fase folicular: 3.5 - 12.5 mIU/ml Fase ovular: 4.7 - 21.5 mIU/ml Fase lútea: 1.7 - 7.7 mIU/ml Post menopausia: 26 - 135 mIU/ml Hombres: 1.5 - 12.4 mIU/ml 40.6.- Interferencias y Limitaciones El test no se ve afectado por ictericia (bilirrubina <1094µmol/l o <64 mg/dl), hemólisis (Hb <0.621 mmol o <1 g/dl), lipemia (Colesterol <1900 mg/dl) ni biotina < 60 ng/ml. En pacientes en tratamiento con altas dosis de biotina (>5 mg/día), la extracción de la muestra no debería efectuarse antes de 8 horas tras la última administración. No se ha encontrado interferencias con Factores reumatoides (hasta 2250 U/ml).



HORMONA LUTEINIZANTE

LH


41.- Hormona Luteinizante (LH) (Cobas 6000 Módulo e601) 41.1.- Introducción

La hormona Luteinizante pertenece, junto a la hormona FSH a la familia de las gonadotrofinas. Ambas hormonas regulan y estimulan de manera sinérgica el crecimiento y la función de las gónadas (ovario y testículos).

La LH, al igual que la FSH y HCG, es una glucoproteína que consta de dos subunidades α yβ. Esta proteohormona, compuesta de 121 aminoácidos y tres cadenas de azúcar, tiene un peso molecular de 29.500 Dalton.

La gonadotrofinas regula el ciclo de la menstruación femenina. Las células gonadotrofas de la hipófisis anterior liberan de forma pulsátil la FSH y la LH, que son

transportadas a los ovarios por la circulación sanguínea. En los ovarios, las gonadotrofinas estimulan el desarrollo y maduración de los folículos y, con ello, las biosíntesis de estrógenos y de la progesterona.

Las mayores concentraciones de LH se encuentran durante el denominado pico de la mitad del ciclo e induce la ovulación y formación del cuerpo lúteo cuyo principal producto de secreción es la progesterona. En las células de Leydig de los testículos, la LH estimula la producción de testosterona.

La determinación de la concentración de LH sirve para el reconocimiento de trastornos funcionales en el hipotálamo, hipófisis, y gónadas.

La determinación combinada de LH Y FSH está indicada en los siguientes casos: enfermedad congénita con aberraciones cromosómicas (como P7E el síndrome de Turner) en caso de ovarios poliquísticos y del síndrome climatérico, frente a una sospecha de insuficiencia de las células de Leydig, así como para detectar las causas de amenorrea.

41.2.- Muestras Suero recogido en tubos estándar de toma de muestra (sin anticoagulante) o tubos con gel de separación

Plasma con: heparina (Litio, sodio, amonio). EDTA tripotásico Fluoruro sódico. 41.3.-Reactivos M: Micropartículas recubiertas de estreptavidina R1: anticuerpos anti LH unidos a biotina R2: anticuerpos anti LH marcados con quelato de rutenio



HORMONA LUTEINIZANTE

LH


41.4.- Principio del Test 1ª Incubación: 20 µl de muestra, un anticuerpo monoclonal biotinilado específico anti LH y un anticuerpo monoclonal específico anti LH marcado con un quelato de rutenio reaccionan para formar un complejo sándwich. 2ª incubación: Después de la incorporación de micropartículas recubiertas de estreptavidina, el complejo formado se fija a la fase sólida por la interacción de la biotina y estreptavidina. La mezcla de reacción es trasladada a la celda de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo ProCell. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con el fotomultiplicador. Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración realizada en el sistema a partir de una calibración de dos puntos y una curva master incluida en el código de barras del reactivo. 41.5.- Valores de Referencia Mujeres Fase folicular: 2.4-12.6 mIU/ml Fase ovular: 14 - 96 mIU/ml Fase lútea: 1.0-11.4 mIU/ml Post menopausia: 7.7 - 59 mIU/ml Hombres: 1.7 - 8.6 mIU/ml 41.6.- Interferencias y Limitaciones El test no se ve afectado por ictericia (bilirrubina <1129 µmol/l o <66 mg/dl), hemólisis (Hb <0.621 mmol o <1 g/dl), lipemia ( Colesterol <1900 mg/dl) ni biotina < 50 ng/ml.. En pacientes en tratamiento con altas dosis de biotina (>5 mg/día), la extracción de la muestra no debería efectuarse antes de 8 horas tras la última administración. No se ha encontrado interferencias con Factores reumatoides (hasta 1500 U/ml).



PROLACTINA


42.- Prolactina (Cobas 6000 Módulo e601) 42.1 Introducción

La prolactina se sintetiza en la hipófisis anterior y es secretada de forma pulsátil. Se trata de una hormona compuesta por 198 aminoácidos con un peso molecular de aprox. 22-23 Kilodalton. La prolactina se encuentra en el suero en 3 formas diferentes. Su forma monómera es inmunobiológicamente activa “little” representa aprox. 80%, lo forma dímera “big”-biológicamente inactiva, representa el 5-20%, mientras que la forma tetramérica”big-big” con baja actividad biológica, el 0.5-5%. El órgano diana de la prolactina es la glándula mamaria, cuyo desarrollo y diferenciación estimula. Altas concentraciones de prolactina inhiben la génesis esteroide de los ovarios, así como la producción y secreción de las gonadotrofinas hipofisiarias. Durante el embarazo, la concentración de prolactina aumenta debido a la producción elevada de los estrógenos y de la progesterona. Tras el parto, el efecto estimulante de la prolactina en la glándula mamaria permite la lactancia. La hiperprolactinemia es la causa primordial de alteraciones en la fertilidad en ambos sexos. La determinación de prolactina está indicada para el diagnóstico de ciclos anovulatorios, amenorrea hiperprolactinémica y galactorrea, ginecomastia y azoospermia. Además, la determinación de prolactina es útil ante la sospecha de carcinoma de mama y de tumor hipofisiario. 42.2.-Muestras Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) y tubos que contengan gel de separación. Plasma: Con heparina de litio, EDTA tripotásico 42.3.- Reactivos M: micropartículas recubiertas de estreptavidina R1: Anticuerpos anti-prolactina unido a biotina R2: Anticuerpos anti-prolactina marcados con quelato de rutenio 42.4.- Principio del Test Técnica sándwich con una duración de 18 minutos. 1ª Incubación: 10 µl de muestra y un anticuerpo biotinilado específico anti- prolactina forman un primer complejo.



PROLACTINA


2ª Incubación: Tras añadir un anticuerpo específico monoclonal anti-prolactina marcado con quelato de rutenio se forma un complejo sándwich que, con la ayuda de micropartículas cubiertas de estreptavidina, se fija a la fase sólida por la interacción de la biotina y la estreptavidina. La mezcla de reacción es trasladada a la celda de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo ProCell. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un fotomultiplicador. Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración realizada en el sistema a partir de una calibración de dos reactivo. 42.5.- Valores de Referencia Hombres: 86-324 µUI/ml Mujeres no embarazadas: 102-496 µUI/ml 42.6 Interferencias y Limitaciones El test no se ve afectado por ictericia (bilirrubina <513 µmol/l o <30mg/dl), hemólisis (Hb <0.932 mmol o <1.5 g/dl), lipemia (Colesterol <1500 mg/dl) ni biotina < 40 ng/ml. En pacientes en tratamiento con altas dosis de biotina (>5 mg/día), la extracción de la muestra no debería efectuarse antes de 8 horas tras la última administración. No se ha encontrado interferencias con Factores reumatoides (hasta 1100 U/ml).



GONADOTROFINA CORIONICA

HUMANA + SUBUNIDAD ββββ BHCG


43.- Gonadotrofina Coriónica Humana (Cobas 6000 Módulo e601) 43.1.- Introducción Test inmunológico in vitro destinado a la determinación cuantitativa de la suma de la gonadotrofina coriónica humana ya la subunidad β de la HCG en suero y plasma humanos. El test β HCG es una ayuda en: La detección precoz y el seguimiento del embarazo. El presente análisis se combina asimismo con otros parámetros para evaluar el riesgo de trisomía 21 (Síndrome de Down). En este caso, se requiere investigaciones posteriores para diagnosticar las aberraciones cromosómicas. En oncología contribuye al tratamiento de pacientes con enfermedades trofoblásticas. El test β HCG contribuye a detectar y controlar las células tumorales productoras de HCG tanto de origen ovárico, placentario como testicular.

La gonadotrofina coriónica humana HCG pertenece, al igual que la LH, FSH Y TSH a la familia de las glucoproteínas y consiste en dos subunidades (cadenas α y β), asociadas a la hormona intacta. Las cadenas α son casi idénticas en las 4 hormonas glucoproteicas, mientras que las cadenas β, responsables de las diferentes funciones hormonales específicas, están compuestas de manera heterogénea. Durante el embarazo la placenta produce HCG mientras que, fuera del embarazo, es generado por los tumores del trofoblasto, de células germinales con tejido trofoblástico y por ciertos tumores no trofoblásticos. En el suero de las mujeres embarazadas la HCG se encuentra mayoritariamente en forma intacta. Valores elevados son indicio de coriocarcinomas, molas hidatidiformes o embarazos múltiples. Valores disminuidos indican amenaza de aborto, aborto incompleto, embarazo ectópico, gestosis o muerte embrionaria intra uterina. 43.2 Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con: Heparina de Litio, sodio o amonio EDTA bisódico y tripotásico Citrato sódico Fluoruro sódico 43.3.- Reactivos M: Micropartículas recubiertas con estreptavidina R1: Anticuerpos anti HCG unido a biotina R2: anticuerpos anti HCG marcados con quelato de rutenio.



GONADOTROFINA CORIONICA

HUMANA + SUBUNIDAD ββββ BHCG


43.4.- Principio del Test Técnica sándwich con una duración de 18 minutos. 1ª Incubación: 10 µl de muestra, un anticuerpo biotinilado monoclonal específico anti HCG y un anticuerpo específico monoclonal HCG marcado con quelato de rutenio forman un complejo sándwich. 2ª Incubación: Después de la incorporación de las micropartículas recubiertas de estreptavidina, el complejo formado se fija a la fase sólida por la interacción entre biotina y estreptavidina. La mezcla de reacción es trasladada a la celda de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo ProCell. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un fotomultiplicador. Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración realizada en el sistema a partir de una calibración de dos reactivo. 43.5.- Valores de referencia Mujer Pre menopausica: < 1 mU/ml. Post menopausica: < 7 mU/ml. Hombre: <2 mU/ml.. 43.6.- Limitaciones e interferencias El test no se ve afectado por ictericia (bilirrubina <410 µmol/l o <24 mg/dl), hemólisis (Hb <0.0621 mmol o <1.0 g/dl), lipemia (Colesterol <1400 mg/dl) ni biotina < 80 ng/ml. En pacientes en tratamiento con altas dosis de biotina (>5 mg/día), la extracción de la muestra no debería efectuarse antes de 8 horas tras la última administración. No se ha encontrado interferencias con Factores reumatoides (hasta 3400 U/ml).



TROPONINA T


44.- Troponina T (Cobas 6000 Módulo e601) 44.1.- Introducción

Troponina T /TnT) constituye uno de los componentes del aparato contráctil de la musculatura estriada. Si bien la TnT cumple la misma función en todos los músculos estriados, la TNT propia de la musculatura cardiaca (TnT cardiaca, peso molecular 39.7 KD) se diferencia claramente de la TnT de la musculatura esquelética. Debido a su alta especificidad tisular, la TnT cardiaca (cTnT) es un marcador cardiaco específico muy sensible al daño miocárdico. Frente a un infarto agudo de miocardio (IM), la concentración sérica de TnT aumenta ya a las 3 a 4 horas tras la aparición de los primeros síntomas y puede permanecer elevada durante un máximo de 14 días. La troponina T es un marcador independiente que permite pronosticar el desenlace clínico a corto, mediano o largo plazo del síndrome coronario agudo (SCA). Además, cuatro estudios clínicos multicéntricos efectuados con más de 7000 pacientes han demostrado que la troponina T ayuda a identificar a aquellos pacientes que responden positivamente al tratamiento antitrombótico. Debido al hecho comprobado de que la troponina cardiaca constituye el mejor marcador para predecir la resolución clínica de pacientes con SCA y, ya que además representa una herramienta útil para modelar el tratamiento antitrombótico, la sociedad europea de cardiología y el colegio Americano de Cardiología han resuelto revisar la definición tradicional del infarto de miocardio (IM). Según la nueva definición, se diagnostica un IM cuando al aparecer los síntomas clínicos de isquemia aguda, las concentraciones de troponina cardiaca en sangre superan el percentil 99 del límite de referencia (población sana). La imprecisión del coeficiente de variación) respecto del percentil 99 de los test de troponina se ha definido como inferior o igual al 10%. 44.2.- Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o tubos conteniendo gel de separación. Plasma: Con EDTA bi-tripotásico de sodio 44.3.- Reactivos M: micropartículas recubiertas con estreptavidina R1: Anticuerpos anti-troponina T biotinilada R2: anticuerpo anti-troponinaT, marcados con quelato de rutenio



TROPONINA T


44.4.- Principio del Test Técnica sándwich con una duración de 18 minutos. 1ª Incubación: 15 µl de muestra, un anticuerpo biotinilado monoclonal específico anti-troponina T y un anticuerpo específico monoclonal anti- troponina T marcado con quelato de rutenio forman un complejo sándwich. 2ª Incubación: Después de la incorporación de micropartículas recubiertas de estreptavidina, el complejo formado se fija a la fase sólida por la interacción entre biotina y estreptavidina.

La mezcla de reacción es trasladada a la célula de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo ProCell. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un fotomultiplicador. Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración realizada en el sistema a partir de una calibración a dos puntos y una curva principal (calibración de 5 puntos) incluida en el código de barras del reactivo. 44.5.- Valores de referencia: Troponina T: < 0.01 µg/l o bien < 0.01 ng/ml 44.6.- Limitaciones e interferencias El test no se ve afectado por ictericia (bilirrubina <462 µmol/l o <27 mg/dl), hemólisis (Hb <0.062 mmol o <1.0 g/dl), lipemia ( Colesterol <1500 mg/dl) ni biotina < 50 ng/ml.. En pacientes en tratamiento con altas dosis de biotina (>5 mg/día), la extracción de la muestra no debería efectuarse antes de 8 horas tras la última administración. No se ha encontrado interferencias con Factores reumatoides (hasta 2000 U/ml).



INMUNOGLOBULINA M IGM/IgM


45.- Inmunoglobulina M (Cobas 6000 y c501) 45.1.-Introducción La Inmunoglobulina M, constituye el 6% de las inmunoglobulinas plasmáticas, la IgM es el primer anticuerpo específico que aparece en suero después de una infección. Es capaz de activar el complemento y con ello ayuda a eliminar las bacterias. Tras la infección y comparando con la IgG, el nivel de IgM vuelve a disminuir rápidamente. Este hecho permite el diagnóstico diferencial entre infecciones agudas y crónicas al comparar los títulos de Ig M e Ig G. si se encuentra elevada la IgM se trata de una infección aguda, mientras que si predomina la IgG se trata de una infección crónica (por ej. En la rubéola y hepatitis vírica). Niveles elevados de IgM policlonal se hallan en infecciones víricas, bacterianas en hepatopatías, el escleroderma, la artritis reumatoide, la fibrosis quísticas y en la adicción a la heroína. Las concentraciones de IgM monoclonal aumentan en Macroglobulinemia de Waldenstrom. Están disminuidos en inmunodeficiencias congénitas y adquiridas, también en enteropatías con pérdida de proteínas y por quemaduras extensas. Una síntesis reducida de IgM se observa en los síndromes de inmunodeficiencia congénita y adquirida. Debido a que la síntesis de IgM comienza tardíamente, la concentración sérica de IgM en niños es inferior a la de los adultos. 45.2.- Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con: Heparina de Litio, sodio EDTA bisódico y tripotásico 45.3.-Reactivos R1: Tampón TRIS: 20mmol/L, pH 8.0; NaCl: 200mmol/L; polietilenglicol: 3.6%. R2: Anticuerpos anti-IgM humana; Tampón TRIS: 20mmol/L, pH 8.0; NaCl: 150 mmol/L. 45.4.- Principio del Test Prueba Inmunoturbidimétrica. Los anticuerpos anti-IgM reaccionan con el antígeno de la muestra formando un complejo antígeno-anticuerpo que se mide turbidimétricamente después de la aglutinación. Al añadir PEG, la reacción avanza rápidamente hacia el punto final, incrementándose así la sensibilidad de la prueba y reduciendo simultáneamente el riesgo de obtener resultados falsos negativos por muestra con exceso de antígeno.



INMUNOGLOBULINA M IGM/IgM


45.5.- Valores de referencia. (Valores de referencia conforme a estandarización de proteínas) Adultos 40-230 mg/dL Niños y Jóvenes 0-1 año 0-145 mg/dL 1-3 años 19-146 mg/dL 4-6 años 24-210 mg/dL 7-9 años 31-208 mg/dL 10-11 años 31-179 mg/dL 12-13 años 35-239 mg/dL 14-15 años 15-188 mg/dL 16-19 años 23-259 mg/dL 45.6.-Limitaciones e interferencias No presenta interferencia significativa con bilirrubina, hemólisis o lipemia. Al igual que otros test turbidimétricos o nefelométricoas, el presente test puede no proporcionar resultados exactos para muestras de pacientes con una gammapatía monoclonal, pues debido a sus características individuales, este tipo de muestra solo puede determinarse por electroforesis.



INMUNOGLOBULINA G IGG/IgG


46.- Inmunoglobulina G (Cobas 6000 y c501) 46.1.-Introducción Aproximadamente el 80% de las inmunoglobulinas séricas son inmunoglobulina G. la defensa contra organismos, la neutralización directa de toxinas y la inducción de la fijación del complemento constituyen sus funciones principales. La IgG es la única inmunoglobulina que puede atravesar la barrera placentaria proporcionando una inmunidad pasiva al feto y al recién nacido. Esta inmunidad disminuye gradualmente, hasta que al cabo de unos 6 meses el inmunosistema del niño comienza a funcionar, para alcanzar a sintetizar con 18 meses concentraciones aproximadas a las de los adultos. Niveles elevados de IgG policlonal se observan en Lupus eritematoso diseminado, hepatopatías crónicas (hepatitis infecciosa y cirrosis de Laennec), enfermedades infecciosas y la fibrósis quística. La síntesis de IgG esta disminuida en los síndromes de inmunodeficiencia congénita y adquirida y en agammaglobulinemia (enfermedad de Bruton). Concentraciones disminuidas de IgG se encuentran en enteropatías con perdida proteica, el síndrome nefrótico y por quemaduras con perdida de piel. 46.2.- Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con: Heparina de Litio, sodio EDTA bisódico y tripotásico 46.3.- Reactivos R1: Tampón TRIS: 20mmol/L, pH 8.0; NaCl: 200mmol/L; polietilenglicol: 3.6%. R2: Anticuerpos anti-IgG humana; Tampón TRIS: 20mmol/L, pH 8.0; NaCl: 150 mmol/L. 46.4.- Principio del Test Prueba Inmunoturbidimétrica. Los anticuerpos anti-IgG reaccionan con el antígeno de la muestra formando un complejo antígeno-anticuerpo que se mide turbidimétricamente después de la aglutinación. Al añadir PEG, la reacción avanza rápidamente hacia el punto final, incrementándose así la sensibilidad de la prueba y reduciendo simultáneamente el riesgo de obtener resultados falsos negativos por muestra con exceso de antígeno.



INMUNOGLOBULINA G IGG/IgG


46.5.- Valores de referencia. (Valores de referencia conforme a estandarización de proteínas) Adultos 700-1600 mg/dL Niños y Jóvenes 0-1 año 232-1411 mg/dL 1-3 años 453- 916 mg/dL 4-6 años 504-1464 mg/dL 7-9 años 572-1474 mg/dL 10-11 años 698-1560 mg/dL 12-13 años 759-1549 mg/dL 14-15 años 716-1711 mg/dL 16-19 años 549-1584 mg/dL 46.6.-Limitaciones e interferencias No presenta interferencia significativa con bilirrubina, hemólisis o lipemia. Al igual que otros test turbidimétricos o nefelométricoas, el presente test puede no proporcionar resultados exactos para muestras de pacientes con una gammapatía monoclonal, pues debido a sus características individuales, este tipo de muestra solo puede determinarse por electroforesis.



INMUNOGLOBULINA A IGA/IgA


47.- Inmunoglobulina A (Cobas 6000 y c501) 47.1.-Introducción La inmunoglobulina A, constituye el 13% de las inmunoglobulinas plasmáticas, y actúa protegiendo la piel y las mucosas frente a microorganismos. Por su capacidad para fijar toxinas y en combinación con la lisozima, desarrolla propiedades antibacterianas y antivíricas. Es la inmunoglobulina que predomina en secreciones corporales tales como el calostro, la saliva y el sudor. La IgA secretada sirve de defensa en infecciones locales y juega un papel importante en la fijación de antígenos provenientes de alimentos en el intestino. En el suero la IgA se encuentra en forma de monómero, dímero o trímero, mientras que en las secreciones del organismo está presente exclusivamente como dímero con una cadena adicional (componente de la secreción). La determinación de Ig A, se encuentra elevada en hepatopatías crónicas, infecciones crónicas, enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide, lupus eritematoso), en la sarcoidosis y el síndrome de Wiscott-Aldrich, así como también en algunos mielomas IgA. Sus niveles se encuentran disminuidos en inmunodeficiencias congénitas y adquiridas, también en gastroenteropatías con pérdida de proteínas y por quemaduras extensas. 47.2.- Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con: Heparina de Litio, sodio EDTA bisódico y tripotásico 47.3.- Reactivos R1: Tampón TRIS: 20mmol/L, pH 8.0; NaCl: 200mmol/L; polietilenglicol: 3.6%. R2: Anticuerpos anti-IgA humana; Tampón TRIS: 20mmol/L, pH 8.0; NaCl: 150 mmol/L. 47.4.- Principio del Test Prueba Inmunoturbidimétrica. Los anticuerpos anti-IgA reaccionan con el antígeno de la muestra formando un complejo antígeno-anticuerpo que se mide turbidimétricamente después de la aglutinación. Al añadir PEG, la reacción avanza rápidamente hacia el punto final, incrementándose así la sensibilidad de la prueba y reduciendo simultáneamente el riesgo de obtener resultados falsos negativos por muestra con exceso de antígeno.



INMUNOGLOBULINA A IGA/IgA


47.5.- Valores de referencia. (Valores de referencia conforme a estandarización de proteínas) Adultos 70-400 mg/dL Niños y Jóvenes 0-1 año 0.00-83 mg/dL 1-3 años 20-100 mg/dL 4-6 años 27-195 mg/dL 7-9 años 34-305 mg/dL 10-11 años 53-204 mg/dL 12-13 años 58-358 mg/dL 14-15 años 47-249 mg/dL 16-19 años 61-348 mg/dL 47.6.-Limitaciones e interferencias No presenta interferencia significativa con bilirrubina, hemólisis o lipemia. Al igual que otros test turbidimétricos o nefelométricoas, el presente test puede no proporcionar resultados exactos para muestras de pacientes con una gammapatía monoclonal, pues debido a sus características individuales, este tipo de muestra solo puede determinarse por electroforesis.



COMPLEMENTO C3


48.- Complemento C3 (Cobas 6000 y c501) 48.1.- Introducción El sistema del complemento se activa por una vía clásica y por una vía alternativa. Ambas desembocan en un segmento Terminal común. Dado que el factor C3 del complemento es el factor común de las dos vías, su concentración y la de sus productos de degradación (incluyendo C3c) sirven para indicar el grado de activación del complemento. Cuando los valores disminuyen, significa que se produjo una activación. Una diferenciación mas precisa se consigue determinando C4, si en estos casos la concentración de C4 es normal, significa que la activación tenga lugar por la ruta alternativa. Valores disminuidos acompañan numerosas enfermedades inflamatorias e infecciosas. Las causas principales son el lupus eritematoso sistémico (LES), la artritis reumática, la endocarditis bacterial subaguda, viremia, infecciones de origen parasitario o sepsis bacterial. 48.2.- Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con: Heparina de Litio, sodio 48.3.- Reactivos R1: Tampón TRISa: 100mmol/L, pH 8.0; polietilenglicol: 3.0%. R2: Anticuerpos anti-C3/C3b/C3c humana; Tampón TRIS: 33mmol/L. Tampón TRISa = Tris(hidroximetil)-aminometano 48.4.- Principio del Test: Test inmunoturbidimétrico Muestra y adición de R1 (tampón) Adición de R2 (anticuerpo anti C3) e inicio de la reacción: Los anticuerpos en el reactivo reaccionan con los antígenos de la muestra formando un complejo antígeno-anticuerpo que se mide turbidimétricamente después de la aglutinación. 48.5.- Valores de referencia: 90-180 mg/dL 48.6.-Limitaciones e interferencias No presenta interferencia significativa con bilirrubina, hemólisis o lipemia. Al igual que otros test turbidimétricos o nefelométricoas, el presente test puede no proporcionar resultados exactos para muestras de pacientes con una gammapatía, particularmente del tipo IgM.



COMPLEMENTO C4


49.- Complemento C4 (Cobas 6000 y c501) 49.1.- Introducción El sistema del complemento se activa por una vía clásica y por una vía alternativa. El factor C4 participa en la activación por la vía clásica. Si bien la disminución de C4 es normal, raras veces falta totalmente. El C4 esta disminuido o falta por completo en enfermedades del inmunocomplejo, el lupus eritematoso sistémico (LES), la tiroiditis autoinmune y la dermatomiositis juvenil. Niveles reducidos de C4 se encuentran en infecciones tales como la meningitis bacteriana y la vírica, la sepsis por estreptococos y estafilococos, así como en la neumonía. La determinación adicional de C4 en pacientes con valores disminuidos del factor C3 del complemento permite una mayor diferenciación. Si la concentración proteica de C4 es normal es probable que la activación se efectué por la vía alternativa. La formación de C4, por ser una proteína de fase aguda, se acelera durante los procesos inflamatorios. 49.2.- Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con: Heparina de Litio, sodio 49.3.- Reactivos R1: Tampón TRISa: 100mmol/L, pH 8.0; polietilenglicol: 3.0%. R2: Anticuerpos anti-C4 humana; Tampón TRIS: 33mmol/L. Tampón TRISa = Tris (hidroximetil)-aminometano 49.4.- Principio del Test: Test inmunoturbidimétrico Los anticuerpos en el reactivo (anticuerpo anti C4) reaccionan con los antígenos de la muestra formando un complejo antígeno-anticuerpo que se mide turbidimétricamente después de la aglutinación. 49.5.- Valores de referencia: 10-40 mg/dL 49.6.-Limitaciones e interferencias No presenta interferencia significativa con bilirrubina, hemólisis o lipemia. Al igual que otros test turbidimétricos o nefelométricoas, el presente test puede no proporcionar resultados exactos para muestras de pacientes con una gammapatía, particularmente del tipo IgM.



CARBAMAZEPINA (CBZ)

DROGAS DE USO TERAPÉUTICO


50.- Carbamazepina CBZ 50.1.- Introducción La carbamazepina es un anticonvulsivante, que se emplea particularmente para el tratamiento de la neuralgia trigeminal, de todas las formas de epilepsia parcial, las crisis generalizadas con convulsiones toniclónicas y crisis parciales simples y complejas. El mecanismo específico de la Carbamazepina consiste en deprimir la transmisión en el núcleo anterior ventral del tálamo. El control de los niveles de Carbamazepina, evaluado junto a otra información clínica, proporciona a los médicos un instrumento efectivo para ajustar la dosis y obtener un efecto terapéutico óptimo evitando al mismo tiempo concentraciones fuera del rango esperado para la droga. 50.2.- Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con: Heparina de Litio, sodio 50.3.- Reactivos R1: Hapteno biotinilado de carbamazepina; tampón de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES),pH 6.4. R2: Anticuerpo monoclonal anti-carbamazepina; micropartículas de látex recubiertas de estreptavidina: 0.08% 50.4.- Principio del Test: El test de carbamazepina es un inmuno análisis homogéneo de aglutinación de micropartículas. Consiste en un sistema de dos reactivos empleado para la detección de la carbamazepina en suero. En esta técnica, el hapteno del fármaco biotinilado sirve de unión para 1) el anticuerpo anti- carbamazepina y 2) las bolas de látex recubiertas de estreptavidina. El hapteno y la carbamazepina libre reaccionan competitivamente en la muestra de suero con una cantidad limitada de anticuerpo específico anti-carbamazepina. La señal disminuye proporcionalmente a la cantidad de droga presente en la muestra. 50.5.- Valores de referencia: 8-12 µg/ml 50.6.-Limitaciones e interferencias No presenta interferencia significativa con bilirrubina, hemólisis o lipemia.



ACIDO VALPROICO (AVP)



51.- Ácido Valproico 51.1 Introducción El ácido valproico (AVP; ácido 2-propilpentanoico; depakene) es un anticonvulsivo relativamente nuevo que se usa normalmente en el tratamiento de los ataques tónicos-clónicos generalizados, siendo también efectivo para tratar convulsiones de ausencia. Actúa con particular eficacia en los ataques mioclónicos y los ataques atónicos. Y constituye el fármaco por excelencia en el tratamiento de la epilepsia fotosensible. Si bien el APV se emplea conjuntamente con otros fármacos antiepilépticos, estudios recientes han demostrado las ventajas de una monoterápia con AVP. Además, la utilidad del APV en el tratamiento de trastornos afectivos, especialmente en trastornos bipolares sin respuesta al Litio, se encuentra cada vez mas documentada. En concentraciones terapéuticas, más del 90% del APV en el torrente sanguíneo se encuentra ligado a proteínas plasmáticas. 51.2.- Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con: Heparina de Litio, sodio 51.3.- Reactivos R1: Anticuerpo monoclonal anti-ácido Valproico, G6P, NAD y albúmina de suero bovino. R2: Ácido valproico marcado con G6pdh de origen bacteriano y albúmina de suero bovino en un tampón. 51.4.- Principio del Test: El test aplica una técnica inmuno enzimática homogénea utilizada en los análisis cuantitativos de ácido valproico (libre y ligado a proteínas) en suero y plasma humanos. Se basa en la competencia entre el fármaco de la muestra y el fármaco marcado con la enzima 6-fosfato de glucosa deshidrogenasa (G6PDH) por los sitios de fijación del anticuerpo. La actividad de la enzima disminuye en la medida que se une al anticuerpo, lo cual permite medir la concentración del fármaco en función de la actividad de la enzima. La enzima activa convierte el nicotinamida-adenina-di nucleótido (NAD) oxidado a NADH, produciendo modificaciones en la absorbancia que se miden espectrofotométricamente. La G6PDH endógena no interfiere porque la coenzima es activada únicamente con la enzima bacteriana, empleada en el test. 51.5.- Valores de referencia: 40-100 µg/ml 51.6.-Limitaciones e interferencias No presenta interferencia significativa con bilirrubina, hemólisis o lipemia.



FENITOINA



52.- Fenitoína (difenilhidantoína) 52.1.- Introducción El uso de la Fenitoína (difenilhidantoína) se encuentra ampliamente difundido en el control de las convulsiones de los pacientes que sufren de epilepsia con crisis tanto tónicoclónicas generalizadas (especialmente motoras), descargas corticales focales y epilepsia del lóbulo temporal. El seguimiento de las concentraciones séricas del fármaco resulta esencial para obtener un control máximo de las convulsiones con concentraciones mínimas del fármaco en sangre. El nivel óptimo varía dependiendo de las condiciones individuales de absorción y metabolismo del fármaco. 52.2.- Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con: Heparina de Litio, sodio 52.3.- Reactivos R1: Conjugado de fenitoína; tampón PIPES (piperazina-N, N’-bis ácido etanosulfónico), pH 7.3 R2: Anticuerpo monoclonal anti-fenitoína (ratón); micropartículas de látex; tampón MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico), pH 7.4. 52.4.- Principio del Test: La prueba se basa en la interacción cinética de las micropartículas en solución (KIMS). El anticuerpo anti-fenitoína se fija de forma covalente a micropartículas, mientras que el derivado del fármaco se une a una macromolécula. La interacción cinética de las micropartículas en solución se induce al unirse el conjugado del fármaco al anticuerpo que recubre las micropartículas y se inhibe por la presencia de fenitoína en la muestra. El conjugado de la droga y la fenitoína de la muestra en juego compiten por fijarse al anticuerpo anti-fenitoína que recubre las micropartículas. La interacción cinética de micropartículas resultante es indirectamente proporcional a la cantidad de droga presente en la muestra. 52.5.- Valores de referencia: Por aceptación general, entre: 10-20 µµµµg/mL 52.6.-Limitaciones e interferencias No presenta interferencia significativa con bilirrubina, hemólisis o lipemia.



FENOBARBITAL



53.- Fenobarbital (FNB) 53.1.- Introducción: El fenobarbital, se ha empleado para el tratamiento de epilepsia, especialmente para el control de crisis motoras focales, sensoriales o tónico clónica generalizadas. El fenobarbital disminuye principalmente la excitabilidad de las neuronas, reduciendo con ello el potencial de excitación postsináptica. La monitorización de la concentración del FNB, es importante para ajustar la dosis, debido al estrecho índice terapéutico, y a la gran variabilidad individual en la absorción, metabolismo y aclaramiento del fármaco. 53.2.- Muestra Suero recogido en tubos estándar de muestra (sin anticoagulante) o tubos conteniendo gel de separación. Plasma con: Heparina de Litio, sodio 53.3.- Reactivos R1: Solución de trabajo del donante enzimático (DE) donante enzimático (microbiano)-fenobarbital: 38µµµµg/L; ββββ-D-Galactopiranósido de rojo de clorofenol: 1.64 g/L; anticuerpo anti-Fenobarbital (monoclonal de ratón):16.1 mg/L; tampón de ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico (MOPS); sales de tampón. R2: Solución de trabajo del aceptor enzimático (AE) aceptor enzimático (microbiano): 0.171g/L; tampón de ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico (MOPS); sales de tampón; anticuerpos de cabra anti-ratón: 18 mg. 53.4.- Principio del Test: El test esta basado en la enzima bacteriana β−galactosidasa, presente gracias a un método de ingeniería genética en dos fragmentos inactivos del aceptor enzimático (AE) y el donante enzimático (DE). Estos fragmentos se reasocian para formar una enzima plenamente activa que en el ensayo desdobla el substrato, generando una coloración que puede ser medido espectrofotométricamente. El formato de desplazamiento del test se emplea para aumentar la sensibilidad y precisión reduciendo al mismo tiempo el ruido de fondo y aumentando paralelamente el cuociente señal-ruido. En el presente test, el fenobarbital de la muestra desplaza una fracción del complejo anticuerpo del donante enzimático-conjugado de fenobarbital. Posteriormente, se añade el reactivo del aceptor enzimático y los reactantes se incuban para permitir que se complementen con el DE libre y el conjugado del fenobarbital. La cantidad de enzima activa formada y el cambio de absorbancia resultante son directamente proporcionales a la cantidad de fenobarbital presente en la muestra. 53.5.- Valores de referencia: Por aceptación general, entre: 15-40 µµµµg/ml 53.6.-Limitaciones e interferencias No presenta interferencia significativa con bilirrubina, hemólisis o lipemia.


CAPITULO 2 TÉCNICAS

HEMATOLÓGICAS


UNIDAD DE APOYO CLÍNICO HOSPITAL PADRE HURTADO LABORATORIO CLÍNICO SECCIÓN: HEMATOLOGÍA

FROTIS SANGUINEO


Frotis Sanguíneo: Objetivo: La práctica de de una extensión sanguínea es muy importante en hematología, ta que muchas hemopatías se diagnostican con solo observar las características morfológicas de las células circulantes. Por eso la calidad de la extensión debe ser impecable, y dado que siempre constituye un medio para controlar la presencia de eventuales alteraciones sanguíneas detectada mediante los sistemas automáticos de análisis. El frotis sanguíneo se realiza para tener una buena visualización de los elementos figurados con microscopía óptica, lo que permite observar la presencia de elementos maduros e inmaduros con las características propias de forma, tamaño y número, correspondiente a las distintas líneas celulares en estudio. Es importante resaltar que en cualquier caso la calidad de la extensión es decisiva para poder apreciar la morfología eritrocitaria, y muy importante para poder llevar a cabo el recuento diferencial de leucocitos. Ejecutor: Técnico Paramédico, Tecnólogo Médico. Muestra: • Sangre venosa o arterial con anticoagulante (EDTA) • Volumen mínimo 1 ml de sangre total con (EDTA K2) Materiales: 1. Porta objetos 75/25 mm. 2. Agitador mecánico 3. Guantes de látex o similar 4. Capilares sin heparina 5. Lápiz dermatográfico o lápiz grafito N° 2 6. Cubre objetos 18x18 ó 24x24 mm. Procedimiento: 1. Homogenizar la muestra en el agitador por tres minutos. 2. Colocar una gota de sangre con el capilar sin heparina, a 1 cm del borde esmerilado del porta objetos. 3. Mientras se sujeta firmemente con los dedos índice y pulgar el porta objetos, con la otra mano se toma el

cubreobjeto. 4. Colocar el cubre objetos justo delante de la gota situada en la superficie del porta objetos, formando un

ángulo de aproximadamente 45°, desplazarlo hacia atrás hasta alcanzar la gota de sangre. 5. Esperar que por capilaridad se distribuya la gota uniformemente. 6. Deslizar suavemente y a velocidad moderada el cubre objetos sobre la gota de sangre hasta que quede

bien extendida sobre la superficie del porta, para obtener una película fina y homogénea. 7. Luego se deja secar en forma horizontal a temperatura ambiente un mínimo de 30 minutos. 8. Anotar el N° correspondiente a la muestra, en la parte posterior de la zona gruesa del frotis (o zona

esmerilada) con lápiz dermatográfico o grafito.



FROTIS SANGUINEO


Manejo de resultados de la extensión: 1. Grosor de la extensión, este dependerá de la cantidad de sangre en la gota, de la concentración de

hemoglobina, del ángulo empleado para realizar la extensión y la velocidad con que esta se haya realizado.

2. Así, si se emplea un ángulo superior a 45°, la extensión será gruesa y corta, mientras que si se emplea un ángulo inferior, será larga y fina.

3. Igualmente, a mayor velocidad mayor grosor y viceversa. 4. Teniendo en cuenta estas variables, el grosor de una extensión puede ser modificado de acuerdo con la

concentración de hemoglobina (hematocrito), de forma que en pacientes con anemia es recomendable aumentar el ángulo, en pacientes con hematocrito elevado es recomendable disminuirlo.

Frotis de referencia: 1. Una buena extensión realizada mediante esta técnica debe tener entre 3-4 cm. de longitud, con un mínimo

aceptable de 2.5cm. el frotis presenta tres áreas: • Zona gruesa, en la región inmediata al punto de partida de la extensión (cabeza), en ella se

aprecia un aumento del número de linfocitos. • Zona fina corresponde al final de la extensión y termina con un área donde las células adoptan

una disposición acordonada (barbas) en esta región se observa un exceso de granulocitos y monocitos.

• Zona ideal, está situada entre las dos anteriores (zona intermedia) y en ella existe un reparto equilibrado de las células.

Fuentes de error: 1. Recién nacidos: Efecto; las células se observan mal distribuidas y teñidas (no existe corrección) 2. Crió aglutininas: Efecto; los eritrocitos se unen entre si y forman agregados, se corrige calentando la

muestra de sangre por 5 minutos a 37° y realizar nuevamente el extendido. 3. Lipemia: Efecto; aparición de espacios claros sin teñir (no existe corrección) 4. Gammapatía Monoclonal: Efecto; disposición de los eritrocitos en pilas de monedas (no existe

corrección) 5. Exposición Prolongada de las células sanguíneas al anticoagulante (mas de 3 horas) antes de realizar el

frotis: • Plaquetas hidratadas (aumento de tamaño) • Citoplasma de leucocitos vacuolados, refuerzo de granulación azurófila, desestructuración de la

cromatina en todas las células. • Crenación de eritrocitos



TINCIÓN DE MAY-GRÜNWALD-

GIEMSA


May-Grünwald-Giemsa: Objetivo:

Se usa para teñir las células sanguíneas u otras, con el fin de realizar el recuento diferencial. El empleo combinado de los colorantes May-Grünwald-Giemsa se conoce con el nombre de Tinción Panóptica de May-Grünwald-Giemsa. Esta tinción resalta de manera especial las granulaciones leucocitarias y mejora la coloración de los eritrocitos. Esta tinción, es de uso recomendado para los programas de evaluación externa de la calidad. El May-Grünwald, es el reactivo que diferencia y tiñe las sustancias acidófilas (color rojo), las basófilas (color azul). El Giemsa tiñe la cromatina y gránulos azurófilos. Ejecutor: Técnico Paramédico, Tecnólogo Médico. Muestra: • Frotis sanguíneo • Frotis de Médula Ósea • Frotis de Líquidos (Pleural y Ascítico) Materiales: 1. May-Grünwald 2. Giemsa 3. Agua desmineralizada (pH 6.8-7.0) 4. Cubetas de tinción(40mL) 3 unidades 5. Canastillo para porta objetos 6. Cronómetros 7. Maderas con ranuras de 2 mm. Procedimiento: 1. Preparar 200 ml de solución May-Grünwald, en la cubeta de tinción 2. Agitar el reactivo antes de medir el volumen 3. Medir el agua desmineralizada (pH 6.8-7.0) también 200 ml 4. Preparar solución Giemsa diluida, primero medir 200mL de agua desmineralizada (pH 6.8-7.0), y agregar

20 ml de Giemsa, previamente agitada por inversión. 5. Dejar reposar 15 minutos 6. Colocar los frotis en canastillos de tinción 7. Introducir los frotis en el canastillo que tiene la solución May-Grünwald por 5 minutos 8. Luego lavar los frotis con agua desmineralizada (pH 6.8-7.0) por 1 minuto 9. cubrir los frotis con Giemsa 10. Lavar con agua corriente suavemente por 1 minuto 11. Dejar secar al aire espontáneamente, inclinando la lámina para que escurra el agua.




GIEMSA


Tinción de calidad: 1. Una buena extensión de sangre, bien teñida debe poseer una coloración rosada en su parte mas delgada y

azul púrpura en su parte mas gruesa, y cuando se observa al microscopio debe permitir una fácil apreciación de las estructuras celulares en los leucocitos, del tamaño color y forma de los eritrocitos, así como del contenido granular de las plaquetas.

2. Además, la intensidad de la coloración debe ser uniforme a lo largo de toda la extensión y no debe observarse precipitados ni vacuolización de las células.

3. El núcleo de leucocitos debe ser más púrpura que azul y los eritrocitos deben poseer una tonalidad rosada.

Fuentes de error: 1. Coloración excesivamente azul:

a) Causas debidas al espécimen: • Presencia de una paraproteína (gammapatía monoclonal) • Empleo de heparina como anticoagulante • Intensa leucocitosis con elevado número de células blásticas • Hematocrito excesivamente bajo b) Causas metodológicas: • Extensión excesivamente gruesa • Extensión envejecida (el plasma al secarse colorea de azul el fondo) • Tampón excesivamente alcalino • Tiempo de tinción demasiado prolongado • Lavado insuficiente • Tiempo de secado insuficiente • Corrección comprobar el pH del tampón empleado, aumentar el tiempo de lavado y/o disminuir el

tiempo de tinción.

2. Coloración excesivamente rosada: • Extensión muy delgada • Tampón demasiado ácido • Tiempo de tinción insuficiente • Lavado excesivo • Empleo de colorantes envejecidos(>4 semanas) • Corrección: comprobar el pH del tampón empleado, y si es necesario ,preparar nueva solución de

colorante con metanol no aireado (abrir un frasco nuevo)




GIEMSA


3. Presencia de precipitados:

• Uso de porta objetos sucio o con polvo adherido a su superficie • Uso de soluciones de colorante sin filtrar cuando no se emplean reactivos comerciales • Evaporación del metanol de la solución colorante • Lavado insuficiente o realizado en condiciones defectuosas

4. Presencia de artefactos: • Acción del anticoagulante (sangre con EDTA > a 3 hrs.): vacuolización monocitos, segmentación

nuclear, satelitismo plaquetario, crenación. • Suciedad, deterioro o presencia de grasa en el porta objetos: micro burbujas, falsa imágenes de

gérmenes, partículas de polvo y ralladuras del porta objetos. • Fijación inadecuada por empleo de metanol no absoluto o hidratado, imagen de eritrocitos

hidratados.



RECUENTO DE RETICULOCITOS

(MANUAL)


Recuento de Reticulocitos:

Objetivo: Consiste en contar los Reticulocitos mediante el microscopio óptico convencional, después de

incubar la sangre en presencia de un colorante vital, que se fija al ARN y que da lugar a un precipitado violeta oscuro que tienden a formar estructuras de aspecto filamentoso o reticulado. Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros o jóvenes, en condiciones normales los reticulocitos permanecen en la médula ósea durante unos 2-3 días y terminan su maduración en la sangre periférica después de unas 24 hrs. de abandonarla. Pese a ello los reticulocitos circulantes presentan un grado variable de madurez, de modo que mientras los más jóvenes poseen abundantes filamentos, los más maduros. Suelen presentar escasos precipitados granulares que pueden pasar inadvertidos, el recuento de reticulocitos es la prueba más simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoyética de la médula ósea. Ejecutor: Técnico Paramédico, Tecnólogo Médico.

Muestra: 1) Sangre venosa o arterial con anticoagulante (EDTA) 2) Volumen mínimo 1 ml de sangre total con (EDTA K2)

Materiales: • Microscopio óptico • Agitador mecánico • Guantes de látex o similar • Porta objetos 25 x 75 mm • Capilares sin heparina • Tubos Khan • Baño termorregulado a 37° • Solución colorante: Azul Cresil Brillante 1% Azul Cresil Brillante 1 gr. Citrato trisódico (Na3C6H5O7-2H2O) 0.4 gr. Solución Cloruro Sódico al 0.9% 100 ml Mezclar, se disuelve el azul Cresil brillante en la solución de cloruro de sodio y se agrega al citrato de sodio, luego filtrar Procedimiento: • Homogenizar la muestra en el agitador por 5 minutos • Agitar por inversión suavemente 10 veces • Preparar 2 tubos por muestra • Tomar 2 capilares de la tinción y depositarlos en el tubo de Khan



RECUENTO DE RETICULOCITOS

(MANUAL)


• • De la muestra previamente agitada tomar 2 capilares completos y mezclarlos con la tinción • En caso de hematocrito < 20% agregar el doble de sangre total • Incubar a 37° por 10 minutos • Mezclar suavemente y extender los frotis, luego de esto dejar secar a T° ambiente

Calculo de Resultados: 1. Observar al microscopio, agregando una gota de aceite de inmersión, utilizando el objetivo de 100x,

contar los glóbulos rojos y reticulocitos por campo. 2. La zona de lectura es aquella donde los glóbulos rojos se encuentran bien distribuidos e individualizados. 3. Contar por lo menos 1000 eritrocitos y calcular el porcentaje como sigue:

Reticulocitos (%) = N° Reticulocitos contados x 100 N° Eritrocitos contados

4. Informar el valor promedio de las dos lecturas.

Valores de referencia (según OMS) Hombres: (20 a 50 años): 0.5-2.8 % Mujeres: (20 a 50 años): 0.5-2.5% Niños y Adultos jóvenes (4 a 19 años): 0.2-2.2% RN (Sangre de cordón): 3.2-6.0% Fuentes de error: 1. Relación sangre colorante insuficiente (anemias intensas) 2. Realizar el recuento sobre un mínimo reducido de eritrocitos 3. Realizar el recuento en áreas en donde los eritrocitos se encuentran mal distribuidos. 4. Confundir los precipitados de ARN con cuerpos de Heinz, de Howell Jolly o precipitados del colorante. 5. En caso de esplenectomía, confundir las inclusiones intraeritrocitarias con reticulocitos.



HEMATOCRITO

(MICROMÉTODO)


Hematocrito (Micrométodo): Objetivo:

El hematocrito es el volumen que ocupan los eritrocitos expresados como un porcentaje del volumen de sangre total existente en una muestra determinada, mediante su separación por centrifugación. Ejecutor: Técnico Paramédico, Tecnólogo Médico.

Muestra: 3) Sangre venosa o arterial con anticoagulante (EDTA), o sangre capilar recogida con tubos capilares de

Heparina. 4) Volumen mínimo 1 mL de sangre total con (EDTA K2), o bien 2 capilares heparinizados. Materiales: 1) Microcentrífuga 2) Lector de hematocrito 3) Capilares de 75 mm (diámetro de 1.1-1.2mm)

a) Capilares sin anticoagulante, que se usan para realizar micrométodo de muestra con EDTA. b) Capilares que contienen 2 IU de heparina y son usados en la obtención de sangre capilar.

4) Plasticina 5) Guantes de Látex o similar. Procedimiento: • Homogenizar la muestra por inversión (suavemente) • Llenar 2 capilares sin heparina, hasta las ¾ partes de el con sangre total. • Limpiar con algodón seco los bordes de los capilares. • Sellar uno de los extremos con plasticina • Poner los capilares en centrífuga, con la plasticina hacia fuera, uno frente al otro. • Registrar el N° de la muestra y la posición dentro de la centrífuga, en orden de trabajo. • Centrifugar por 5 minutos a 12000rpm. • Si el hematocrito es > 50%, se debe centrifugar 5 minutos más, para disminuir el plasma atrapado. Cálculo de resultados: 1) Leer inmediatamente los capilares, ajustando a cero en el lector donde termina la plasticina, y a 100

donde termina el plasma. 2) Informar el porcentaje obtenido, que es el nivel donde terminan los glóbulos rojos y comienza la capa de

blancos.



HEMATOCRITO

(MICROMÉTODO)


Valores de Referencia: Hombre (18 a 50 años): 45 +/- 5% Mujeres (18 a 50 años): 42 +/- 5 % Mujeres (Embarazada): 39 +/- 5 % Recién Nacidos : 54 +/- 10% Niños (hasta 10 años): 38 +/- 5% Fuentes de Error: 1) Manejo defectuoso de la muestra.

a) Empleo de una relación sangre anticoagulante incorrecta, el exceso de EDTA diminuye falsamente el hematocrito.

b) La faltade suficiente anticoagulante, puede producir una coagulación parcial c) Extracción de sangre en condiciones defectuosas (hemoconcentración, hemodilución,hemolisis) d) Oxigenación excesiva de la sangre (genera un falso descenso del hematocrito) e) Retraso en la determinación del hematocrito > 6 hrs.(falso aumento de hematocrito) f) Muestra tomada directamente de catéter o vía por donde pasa suero (hemodilución) g) Cuando la T° amb. es alta y se usa heparina como anticoagulante , conservar a 4°C hasta la

determinación h) Homogenización defectuosa de la sangre antes de llenar el capilar.

2) Fallo en la realización de la técnica a) Errores en la identificación de los tubos. b) Empleo de tubos no muy limpios o húmedos c) Variaciones en el calibre del tubo empleado o uso de capilares con medidas incorrectas. d) Llenado insuficiente de los tubos con la sangre total. e) Empleo de una fuerza centrífuga insuficiente. f) Recalentamiento de la centrífuga por uso excesivo 40°C (causa de hemólisis) g) Fallo del sellado y perdida del contenido del tubo capilar.



HEMATOCRITO (ELECTRÓNICO)


Hematocrito (Electrónico): Objetivo:

El hematocrito es el volumen que ocupan los eritrocitos expresados como un porcentaje del volumen de sangre total existente en una muestra determinada, mediante su separación por centrifugación. En la actualidad, todos los analizadores hematológicos automatizados, suministran dentro del contexto del Hemograma, un valor de hematocrito electrónico calculado por el propio sistema a partir del valor del VCM (obtenido por conductividad) y la concentración de eritrocitos. Ejecutor: Técnico Paramédico, Tecnólogo Médico.

Muestra: 1) Sangre venosa o arterial con anticoagulante (EDTA) 2) Volumen mínimo 1 mL de sangre total con (EDTA K2) Materiales: 1) Contador hematológico 2) Agitador mecánico 3) Guantes de látex o similar. Procedimiento: 1) Homogenizar la muestra en el agitador por 5 minutos 2) Agitar por inversión suavemente 10 veces 3) Procesar muestra según instructivo del autoanalizador empleado. Cálculo de Resultados: • El equipo automáticamente entrega el valor del hematocrito. Valores de Referencia: Hombre (18 a 50 años): 45 +/- 5% Mujeres (18 a 50 años): 42 +/- 5 % Mujeres (Embarazada): 39 +/- 5 % Recién Nacidos : 54 +/- 10% Niños (hasta 10 años): 38 +/- 5%



HEMATOCRITO (ELECTRÓNICO)


Fuentes de Error: 1) Falsos aumentos del valor del hematocrito

a) Falsos aumentos del Volumen Corpuscular Medio (VCM) • Empleo de sangre envejecida • Leucocitosis intensa • Estados de hiperosmolaridad. b) Aumento ficticio de la concentración de eritrocitos. • Panaglutinación celular por efecto del EDTA

2) Falsos descensos del valor del hematocrito. a) Falsa disminución del VCM • Empleo excesivo del anticoagulante líquido EDTA • Temperatura ambiente muy elevada • Estados de hiposmolaridad. b) Disminución ficticia de la concentración de eritrocitos • Hemólisis in vitro • Microcitosis extrema (<50fl) c) Presencia de crioaglutininas

3) Alteraciones del hematocrito por defecto del autoanalizador • Sistema electrónico defectuoso • Equipo mal calibrado • Aspiración defectuosa de la muestra • Depósitos de proteínas en el orificio de apertura • Alteraciones del líquido de lavado. •



ERITROSEDIMENTACIÓN O

VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN(VSG)


Velocidad de Eritrosedimentación Globular (VSG):

Objetivo:

Si se deja reposar verticalmente la sangre con anticoagulante en un tubo o en una pipeta especial, se observa como los eritrocitos sedimentan espontáneamente de manera que por encima de ellos se forma una columna de plasma- este proceso se denomina eritrosedimentación. La eritrosedimentación es un fenómeno empírico que se altera en muchas situaciones de manera inespecífica, pero que alerta sobre la posible existencia de enfermedad o lesión orgánica. La eritrosedimentación constituye un indicador de reactantes de fase aguda y su aumento se correlaciona con otros reactantes tales como ciertas citocinas como las interleucinas 1-6 y la proteína C reactiva, aunque el momento de aparición de estos aumentos no suele guardar una relación muy exacta con la del aumento de la eritrosedimentación. Esta obedece a varios factores, entre los que destacan las interacciones electrostáticas que existen entre los eritrocitos debido a su carga de superficie. En esta última intervienen de forma determinante las proteínas del plasma, de manera que mientras algunas favorecen (fibrinógeno y globulina), otras las disminuyen (albúmina), el mecanismo que rige este fenómeno depende de cuatro factores relacionados entre si: 1. tamaño y rigidez de los eritrocitos (volumen corpuscular medio, VCM) 2. diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma 3. viscosidad del plasma 4. temperatura Ejecutor: Técnico Paramédico, Tecnólogo Médico. Muestra: Sangre venosa o arterial con anticoagulante (EDTA K2), 2olumen mínimo 1 mL . Materiales: 1. Tubo Tapval con citrato sódico 3.2 % 2. Agitador Mecánico 3. Equipo Eriline AR 4. Lápiz dermatográfico o plumón permanente. 5. Guantes de látex o vinílicos 6. Gradillas Procedimiento: 1. Homogenizar la muestra en el agitador por 5 minutos 2. Agitar por inversión suavemente 10 veces 3. Mezclar la muestra con EDTA con el citrato que se encuentra en el tubo Tapval utilizado. 4. Colocar en el agitador mecánico en posición invertida por 5 minutos. 5. Procesar muestra según instructivo del lector de VHS.






Valores de Referencia: Niños y Adolescentes: (0 - 15 años) 5-15 mm/hr Hombres (17- 50 años) 1-10 mm/hr. (51- 60 años) 3-12 mm/hr. (61- 70 años) 2-14 mm/hr. Mujeres (17- 50 años) 3-12 mm/hr. (51- 60 años) 4-19 mm/hr. (61- 70 años) 5-20 mm/hr. Fuentes de Error: 1. Causa de aumento:

Causas fisiológicas: • Embarazo a partir del tercer mes • Envejecimiento (ocasional) • Crecimiento (ocasional)

Causas patológicas • Aumento moderado (incrementos propios de la reacción de fase aguda): • Anemia intensa • Fiebre reumática • Artritis reumática • Lupus eritematoso sistémico • Enfermedad renal • Enfermedad tiroidea. • Infarto del miocardio • Neoplasias • Tuberculosis • Sífilis • Aumento intenso: • • Arteritis de la temporal • Polimialgia reumática • Vasculítis necrosante • Hiperfibrinoginémia • Macroglobulinemia de Waldeström • Mieloma múltiple • Crioaglutininas






Causas metodológicas

• Elevación de la temperatura ambiente • Dilución de la sangre • Error de homogenización de la sangre y anticoagulante

2. Causas de disminución

• Debido al espécimen: • • Policitemia vera • Insuficiencia cardíaca congestiva • Síndrome de hiperviscosidad • Hipofibrinogenemia • Hipoproteinemia • Anemia de células falciformes • Causas metodológicas:

• Utilización tardía de la sangre • Cambió del anticoagulante • Error de homogenización de la sangre con el anticoagulante • Disminución de la temperatura ambiente.



PRUEBAS DE COAGULACIÓN: CURVA DE CALIBRACIÒN DEL TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)


Curva de Calibración del Tiempo de Protrombina (TP) Objetivo:

Con el fin de favorecer la reproducibilidad de los resultados obtenidos y su estandarización se aconseja realizar una curva de calibración cada vez que ocurra una modificación en: 1. El número de lote de la tromboplastina. 2. La instrumentalización utilizada (coagulómetro, micropipeta, etc.) 3. La técnica empleada 4. La carta control 5. La aleatoriedad de los resultados Ejecutor: Tecnólogo Médico Muestra:

1. Calibrador comercial DG-REF, Grifols

Materiales: 1. Coagulómetro automatizado (AMAX 200) 2. Tampón owren (DG-OWREN) 3. Guantes de látex o similar 4. Gradillas 5. Micropipetas 6. Cronómetro 7. Reactivos:

a. Tromboplastina liofilizada: DG-PT (GRIFOLS): Contiene extracto de cerebro de conejo, deshidratado con acetona (40-50%), tampón, iones calcio y conservantes. Estabilidad: todos los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, conservados a 2-8oC

b. Agua desmineralizada calidad inyectable.(Ampollas 5 mL) c. DG-REF Grifols (Calibrador comercial)

8. Reconstitución de DG-PT: Reconstituir 1 vial con 5 mL de agua desmineralizada calidad de inyectable. Dejar en reposo 10 minutos para una completa reconstitución y mezclar suavemente para homogenizar el contenido antes de su uso. Siempre que la deje en reposo debe mezclarla suavemente antes de usar. Estabilidad: 8 hrs. a 37 oC; 1 día a18-25 oC; 3 días 2-8 oC. siempre que se manipule y conserve adecuadamente, evitando contaminar el contenido y exposiciones prolongadas a temperaturas que no son propias de conservación. No congelar.



PRUEBAS DE COAGULACIÓN: CURVA DE CALIBRACIÒN DEL

TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)


Procedimiento: 1. Preparar los calibradores de PT de la Siguiente manera: TUBO 1 2 3 4 DG-OWREN __ 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml CALIBRADOR 1 ml 0.5 ml (100%) 0.5 ml (50%) 0.5 ml (25%) % ACTIVIDAD 100% 50% 25% 12.5% 2. Efectuar la prueba por duplicado, antes de 30 minutos de haber preparado las diluciones Cálculo de Resultados: 1. Representar los valores de segundos obtenidos para cada dilución del calibrador de PT frente al

porcentaje de actividad (%) en un papel milimetrado. Trazar una curva de regresión recíproca lineal. El porcentaje de actividad de las muestras y controles se obtiene interpolando los segundos en la curva de calibración correspondiente.

2. El equipo automáticamente entrega segundos, % e INR de la muestra analizada, según la curva de calibración ingresada de acuerdo al instructivo del equipo.

3. Registrar tiempos, fechas de realización, número de lote, ISI, fecha de vencimiento, Equipo empleado y profesional responsable.



PRUEBAS DE COAGULACIÓN:



Tiempo de Protrombina (TP) Objetivo:

La exploración de la coagulación se basa en la realización de dos pruebas globales, el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de Tromboplastina parcial activada (TTPA), que se complementan con una valoración de la fibrinoformación mediante la determinación funcional del fibrinógeno o la realización del tiempo de trombina. Sobre la base de los resultados de estas pruebas podemos realizar una aproximación diagnóstica cuya confirmación puede requerir la determinación específica de factores de la coagulación.

La prueba del tiempo de protrombina consiste en añadir a una muestra de plasma, Tromboplastina y calcio ligeramente en exceso. El tiempo de coagulación depende de la actividad de los factores de la coagulación implicados (II; V; VII y X) y también esta influenciado por defectos cualitativos o cuantitativos del fibrinógeno. Ejecutor: Tecnólogo Médico Muestra: • Sangre venosa o arterial con anticoagulante citrato de sodio 3.2 % 0.109 mmol/L • Volumen mínimo: 1 mL de sangre total con citrato de sodio 3.2 % Materiales: 1. Coagulómetro automatizado (AMAX 200) 2. Tampón owren (DG-OWREN) 3. Guantes de látex o similar 4. Gradillas 5. Centrifuga Megafuge. 6. Micropipetas 7. Cronómetro 8. Reactivos:

a. Tromboplastina liofilizada: DG-PT (GRIFOLS): Contiene extracto de cerebro de conejo, deshidratado con acetona (40-50%), tampón, iones calcio y conservantes. Estabilidad: todos los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, conservados a 2-8oC

b. Agua desmineralizada calidad inyectable.(Ampollas 5 mL) 9. Reconstitución de DG-PT: Reconstituir 1 vial con 5 mL de agua desmineralizada calidad de inyectable.

Dejar en reposo 10 minutos para una completa reconstitución y mezclar suavemente para homogenizar el contenido antes de su uso. Siempre que la deje en reposo debe mezclarla suavemente antes de usar. Estabilidad: 8 hrs. a 37 oC; 1 día a18-25 oC; 3 días 2-8 oC. siempre que se manipule y conserve adecuadamente, evitando contaminar el contenido y exposiciones prolongadas a temperaturas que no son propias de conservación. No congelar.






Procedimiento: 1. Centrifugar los tubos tapados a temperatura ambiente por 10 minutos a 3000 rpm.(plasma pobre en

plaquetas < 10000 plaquetas x ul. 2. Procesar en equipo AMAX 200, antes de 4 horas de extraída la muestra (muestra conservada a

temperatura ambiente), según su instructivo. Cálculo de Resultados: 1. El equipo automáticamente entrega segundos, % e INR de la muestra analizada. 2. El % de actividad de las muestras, se obtiene interpolando el TP en segundos en la curva de calibración

correspondiente. 3. INR (Ratio Normalizado Internacional): INR = R elevado al ISI. Donde R (Ratio) = TP en segundos/TP

normal en segundos. ISI (Índice de Sensibilidad Internacional). Valores de Referencia (Según OMS): Valor de Referencia: Mayor a 70 % de Actividad- Fuentes de Error: 1. Procesamiento de las muestras después de 2 horas. 2. Muestras coaguladas 3. Pérdida de la relación sangre anticoagulante 4. Muestras contaminadas con heparina 5. Muestras con hemólisis 6. Incorrecta manipulación de las muestras 7. Implementación incorrecta de la técnica 8. Contaminación del reactivo 9. Rellenar viales con restos de reactivos que superen el tiempo de conservación recomendado.




TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIALMENTE ACTIVADA

(TTPA)


Tiempo de Tromboplastina Parcialmente Activada (TTPA) Objetivo:

La exploración de la coagulación se basa en la realización de dos pruebas globales, el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de Tromboplastina parcial activada (TTPA), que se complementan con una valoración de la fibrinoformación mediante la determinación funcional del fibrinógeno o la realización del tiempo de trombina. Sobre la base de los resultados de estas pruebas podemos realizar una aproximación diagnóstica cuya confirmación puede requerir la determinación específica de factores de la coagulación. El proceso coagulativo abarca las vías extrínseca e intrínseca, ambas necesarias para una hemostasia normal. El TTPA es un test de screening en el que están implicados los siguientes factores plasmáticos de la coagulación: II, V, VIII, IX, X, XI y XII, y el Fibrinógeno, así como la fase de contacto (Calicreina, Kininógeno de alto peso molecular), el Factor Plaquetario 3 e iones Calcio. El TTPA se basa en la activación del plasma por parte de un activador de contacto en presencia de fosfolípidos como substituto del factor plaquetario 3, posteriormente se agregan iones calcio en exceso. El tiempo de coagulación obtenido será proporcional a los factores implicados, la presencia en la muestra de inhibidores específicos y no específicos del sistema intrínseco, así como el tratamiento con fármacos que afectan la síntesis de algunos de esos factores (TACO) o que potencian su inhibición (Heparina), producirán un alargamiento de los tiempos de coagulación. Ejecutor: Tecnólogo Médico Muestra: • Sangre venosa o arterial con anticoagulante citrato de sodio 3.2 % 0.109 mmol/L • Volumen mínimo: 1 ml de sangre total con citrato de sodio 3.2 % Materiales: 1. Coagulómetro automatizado (AMAX 200) 2. Guantes de látex o similar 3. Gradillas 4. Centrifuga Megafuge. 5. Micropipetas 6. Cronómetro 7. Reactivos:

a. Cefalina Líquida: DG-APTT (Grifols): Contiene Ácido Elágico (0.10 mmol/L) como activador de contacto, extracto clorofórmico de cerebro de conejo (0.006% Fosfolípidos), tampón y estabilizante líquido transparente de color amarillento.

b. Cloruro de Calcio (0.025 mmol/L (DG-CaCl2 0.025 M)




TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIALMENTE ACTIVADA

(TTPA)


8. Reconstitución de DG-APTT: Listo para usar. Atemperar y mezclar por inversión antes de usar. Estabilidad una vez abierto: 30 días a 2-8 oC, siempre y cuando se mantenga el vial debidamente cerrado con el obturador y la tapa cuando no se use, y se manipule adecuadamente evitando contaminar el contenido y exposiciones prolongadas a temperaturas que no son propias de conservación. En caso de que no se cerrara correctamente, puede producirse una disminución de la estabilidad del reactivo. Puede aparecer un sedimento verdoso de Ácido Elágico/Lípidos cuando está en reposo, que desaparece al mezclar el contenido del vial. Si se observan cambios de color en el reactivo y/o aparición de precipitados insolubles, desechar el vial. No congelar. Estabilidad entre 2-8 oC: Es estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta.

Procedimiento: 1. Centrifugar los tubos tapados a temperatura ambiente por 10 minutos a 3000 rpm.(plasma pobre en

plaquetas < 10000 plaquetas x ul). 2. Procesar en equipo AMAX 200, antes de 4 horas de extraída la muestra (muestra conservada a

temperatura ambiente), según su instructivo. Cálculo de Resultados: 1. El equipo automáticamente entrega segundos de la muestra en estudio. Valores de Referencia: 1. Los valores del APTT pueden reportarse en segundos. En este caso, los resultados deben reverenciarse

frente a un intervalo de normalidad del test de APTT, calculado a partir de 20 muestras de donantes sanos, el promedio +/- 2 DS.

Fuentes de Error: 1. Procesamiento de las muestras después de 2 horas. 2. Muestras coaguladas 3. Pérdida de la relación sangre anticoagulante 4. Muestras contaminadas con heparina 5. Muestras con hemólisis 6. Incorrecta manipulación de las muestras 7. Implementación incorrecta de la técnica 8. Contaminación del reactivo 9. Rellenar viales con restos de reactivos que superen el tiempo de conservación recomendado. 10. La conservación de la muestra de plasma a bajas temperaturas, así como la extracción de la sangre poco

cuidadosa pueden favorecer la liberación del Factor Plaquetario 4, que neutraliza la heparina, por ello deben extremarse los cuidados en la extracción de la muestra y conservarla a temperatura ambiente.

11. Para la correcta monitorización de la Heparina: (la heparina tiene una vida media de 1.5 hrs.), por lo que el momento de la extracción es muy importante.



TIEMPO DE SANGRÍA

(TS)


Tiempo de Sangría (TS): Objetivo: La lesión de cualquier vaso sanguíneo produce la adhesión de las plaquetas tanto al subendotelio del vaso expuesto como al colágeno expuesto, en esta primera fase de adhesión ocurre la fase de agregación plaquetaria que se produce en el lugar de la herida , formándose el tapón plaquetario primario, por lo tanto, para que ocurra este proceso se realiza una pequeña incisión normada frente a largo y profundidad, lo que permite proporcionar una medida de la funcionalidad de las plaquetas en la hemostasia de vasos de pequeño calibre. Ejecutor: Técnico Paramédico, Tecnólogo Médico. Muestra: El paciente no debe ingerir Ácido Acetil Salicílico al menos siete días antes del examen . Materiales: 1. Banda de papel filtro. 2. Algodón 3. Alcohol al 70 % 4. Cinta adhesiva 5. Esfingomanómetro 6. Cronómetro 7. Dispositivo Estandarizado (Simplate o Surgicutt) Procedimiento: 1. Coloque el brazo del paciente sobre un soporte estable, de forma que la superficie anterior del antebrazo,

quede expuesta. 2. Coloque el manguito del Esfingomanómetro en la parte superior del brazo y aplique una presión de 40

mm/Hg. 3. El tiempo que puede transcurrir desde que se aplica la presión deseada con el Esfingomanómetro hasta

que se realiza la incisión debe oscilar entre los 50-60 segundos. Manténgase la presión seleccionada de forma exacta y constante durante toda la prueba.

4. Limpie con alcohol la superficie de la piel donde se va a realizar la incisión. 5. Saque el dispositivo del paquete estéril teniendo cuidado de no contaminarlo, evitando tocar la ranura de

salida de la cuchilla, o dejarlo en superficies no estériles. 6. quite la grapa de cierre de seguridad del dispositivo, no apriete el gatillo o toque la ranura de la cuchilla.



TIEMPO DE SANGRÍA

(TS)


7. Sostenga firmemente el dispositivo entre el dedo pulgar y el dedo medio. 8. coloque el dispositivo sobre el antebrazo del paciente presionando suavemente, de manera que los bordes

de éste toquen ligeramente la piel. La zona de elección para la realización del test es la cara anterior del brazo, a unos 5 cms debajo del pliegue cubital y verticalmente a este.

9. Presione levemente el gatillo de salida de la cuchilla con el dedo índice poniendo, simultáneamente el cronometro en marcha, la cuchilla producirá una incisión de 5 mm de largo y de 1 mm de profundidad.

10. Retire el dispositivo del antebrazo del paciente inmediatamente después de haber apretado el gatillo. 11. Cada 30 segundos limpiar la sangre con el papel absorbente. 12. Coloque el papel absorbente cerca de la incisión. No toque directamente la incisión con el papel de

manera de no alterar la formación del tapón plaquetario. 13. Limpie la sangre cada 30 segundos hasta que deje de manchar el papel filtro, pare el cronómetro cuando

la sangre deje salir, y determine el tiempo de sangrado. 14. Quite el manguito del Esfingomanómetro y limpie la zona donde se ha practicado la incisión con un

algodón y suero fisiológico. La posible aparición de cicatrices puede disminuirse aproximando los bordes de la piel con una cinta adhesiva antialérgica (afrontamiento) que deberá mantenerse por 24 hrs.

Cálculo de Resultados: 1. El tiempo de sangría, es el tiempo que transcurre, desde el momento en que se hizo el corte, hasta la

última mancha en el papel filtro. Valores de Referencia: Hasta 9 minutos. Fuentes de Error: 1. Ejercer una presión menor o más alta de lo indicado. 2. No respetar los intervalos para poder manchar el papel filtro. 3. Pasar a llevar el tapón formado con el papel filtro utilizado. 4. Si se pasa a llevar un vaso de mediano calibre. 5. Hematocrito menor a 25 % y plaquetas menores a 100.000.


INDICE GENERAL MANUAL DE TÉCNICAS

Página Nitrógeno Ureico 3 Glucosa (Glucosa HK) 5 Bilirrubina Total Bilirrubina DPD 7 Bilirrubina Directa Método Diazo 9 Fosfatasa Alcalina Alp2 acc. to IFCC 11 Alanin Amino Transferasa (ALTL/GPT) con Piridoxal F osfato 13 Aspartato Amino Transferasa (ASTL/GOT) con Piridoxal Fosfato 15 Proteínas Totales 17 Albúmina (Verde de Bromocresol) 19 Acido Úrico 21 Creatinina Jaffe Método Compensado 23 Calcio 26 Fósforo 28 Magnesio 30 Gamma Glutamil Transferasa 32 Amilasa 34 Acido Láctico 36 Amonio 39 Colesterol 40 HDL Colesterol 42 Triglicéridos 45 Deshidrogenasa Láctica 47 Creatinquinasa 48 Isoenzima MB de la Creatinquinasa 50 Proteína C Reactiva 52 Factor Reumatoideo 54 Antiestreptolisina O 56 Electrolitos Plasmáticos 58 Orina Completa 60 Líquido Cefalorraquídeo 62 Citoquímico de Líquido Pleural 63 Gases en Sangre 64 Determinación de Sub Unidad Beta Cualitativa 66 Líquido Amniótico 67 Bilirrubina Micrométodo 69 Espectrofotometría del Líquido Amniótico 70 Triyodotironina T3 71 Tetrayodotironina Tiroxina T4 73 Tiroxina Libre FT4 75 Hormona Estimuladora de la Tiroides (HET) TSH 77 Hormona Estimulante de los Folículos (FSH) 79 Hormona Luteinizante LH 81 Prolactina 83 Gonadotrofina Coriónica Humana + Sub Unidad ββββ BHCG 85 Troponina T 87 Inmunoglobulina M IGM/IgM 89 Inmunoglobulina G IGG/IgG 91 Inmunoglobulina A IGA/IgA 93


Complemento C3 95 Complemento C4 96 Carbamazepina (CBZ) Drogas de uso Terapéutico 97 Ácido Valproico (AVP) Drogas de uso Terapéutico 98 Fenitoína Drogas de uso Terapéutico 99 Fenobarbital Drogas de uso Terapéutico 100 CAPÍTULO 2 Técnicas Hematológicas 101 Frotis Sanguíneo 102 Tinción de May-Grünwald-Giemsa 104 Recuento de Reticulocitos (Manual) 107 Hematocrito (Micrométodo) 109 Hematocrito (Electrónico) 111 Eritrosedimentación o Velocidad de Sedimentación (VSG) 113 Pruebas de Coagulación: Curva de Calibración del Tiempo de Protrombina (TP) 116 Pruebas de Coagulación: Tiempo de Protrombina (TP) 118 Pruebas de Coagulación: tiempo de Tromboplastina Parcialmente Activada (TTPA) 120 Tiempo de Sangría (TS) 122 Índice 124

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