Mutation screening

mediante PCR

Denaturing High-Perfomance

Liquid Chromatography

(DHPLC) E’ una tecnica di analisi cromatografica ad alta

pressione che consente di discriminare tra homoduplex ed heteroduplex in una popolazione di frammenti di DNA.

La separazione viene ottenuta riscaldando la colonna cromatografica ad una temperatura prossima al Tm del frammento analizzato.

In tali condizioni il legame alla colonna dell’heteroduplex si riduce ed è eluito anticipatamente rispetto all’homoduplex, evidenziando la presenza della variazione.

Analisi degli heteroduplex

Come si lega il DNA alla

resina della colonna.

Il legame del DNA alla resina è

mediato dal TEAA.

Il TEAA interagisce con la

superfice idrofobica della resina

mentre lo ione AMMONIO si

lega con lo ione FOSFATO del

DNA.

l’interazione tra la resina e la

catena alchilica del TEAA e’

ridotta dalla presenza dell’

ACETONITRILE.

DNASep® Cartridge

C18 Alkylated PS/DVB

Polymer

3 micron Particle Size

Very Highly Efficient

pH and Temperature

Stable

Injection guarantee

>4000

Cleanable

Chimica della separazione

(1)

Chimica della separazione

(1)

Chimica della separazione

(2)

Chimica della separazione

(2)

La temperatura

59

Ab

so

rba

nc

e

(25

4n

m)

3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Retention time / min

61

58

57

56

55

54

51

52

53

Wave 3500HT HSD

Pompa

Autocampionatore

Forno HS

UV Detector

Fluorimetro

Centro Grandi Apparecchiature Seconda Università degli Studi di Napoli

Analisi al DHPLC

Amplification Refractory

Mutation System (ARMS)

Degenerate Oligonucleotide-

primed PCR (DOP-PCR)

Rapid amplification of cDNA

Ends (5’-3’ RACE)

Multiplex- PCR

E’ una reazione di PCR in cui più coppie di primers vengono utilizzate insieme per amplificare diversi frammenti la cui lunghezza deve essere tale da poterli agevolmente separare mediante elettroforesi.

Esistono diverse applicazioni diagnostiche basate sulla multiplex-PCR.

Il principale problema è l’ottimizzazione delle condizioni di amplificazione.

Temperatura di annealing dei primers e loro concentrazione.

Durata dell’annealing e della fase estensione

pH, concentrazione Mg2+ ed eventuale aggiunta di additivi che possono migliorare le perfomance dell’enzima

Diagnosi di DMD/BMD

80plex-PCR (1)

Scelta dei primers:Scelta dei primers:

Sequenze esoniche ed introniche dallaSequenze esoniche ed introniche dalla

GenBank GenBank (NM_004006.1)(NM_004006.1)

Lunghezza finale degli ampliconi è stata Lunghezza finale degli ampliconi è stata

scelta per ottenere, sul gel, una serie di scelta per ottenere, sul gel, una serie di

bande elettroforetiche equidistanti bande elettroforetiche equidistanti

(dipendenza della migrazione dal log n(dipendenza della migrazione dal log n°° bp)bp)

DMDDMD BMDBMD

80plex-PCR (2)

DMDDMD

AA BB

BMDBMD

CC DD

80plex-PCR (3)

1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6

1: del ex 431: del ex 43

2: del ex 11, 17, 19, 212: del ex 11, 17, 19, 21

3: del ex 17, 19, 213: del ex 17, 19, 21

4: del ex 50, 524: del ex 50, 52

5: del ex 7, 11, 17, 195: del ex 7, 11, 17, 19

6: del ex 616: del ex 61

1: no del 1: no del

2: del ex 8, 12, 18, 20, 222: del ex 8, 12, 18, 20, 22

3: del ex 12, 18, 20, 223: del ex 12, 18, 20, 22

4: del ex 46, 514: del ex 46, 51

5: del ex 6, 8, 12, 185: del ex 6, 8, 12, 18

6: del ex 626: del ex 62

1: del ex 26, 28, 30, 32,34, 36, 38, 40, 421: del ex 26, 28, 30, 32,34, 36, 38, 40, 42

2: del ex 9, 13, 16, 24, 262: del ex 9, 13, 16, 24, 26

3: del ex 13, 16, 24, 26, 28, 303: del ex 13, 16, 24, 26, 28, 30

4: del ex 484: del ex 48

5: del ex 9, 13, 16 5: del ex 9, 13, 16

6: del ex 606: del ex 60

1: del ex 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 411: del ex 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41

2: del ex 10, 14/15, 23, 25, 27, 292: del ex 10, 14/15, 23, 25, 27, 29

3: del ex 14/15, 23, 25, 27, 293: del ex 14/15, 23, 25, 27, 29

4: del ex 47, 494: del ex 47, 49

5: del ex 10, 14/155: del ex 10, 14/15

6: no del 6: no del

1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6

MIX AMIX A

MIX BMIX B

MIX CMIX C

MIX DMIX D

MLPA (Multiplex Ligation-dependent

Probe Amplification)

Riconoscimento di variazioni del numero di copie in più di 40 distinte sequenze genomiche mediante un’unica reazione di PCR.

Campi applicativi:

Caratterizzazione di delezioni/duplicazioni o variazioni del numero di copie (aneuploidie)

Determinare lo stato di metilazione di promotori o regioni imprinted

Quantificazione relativa di RNA

Riconoscimento di specifiche mutazioni puntiformi o SNPs (single nucleotide polymorphism)

Richiede minime quantità di DNA genomico (circa 20 ng).

Come funziona l’MLPA

Il gene ASPA codifica per l’asparto-acilasi.

Mutazioni in questo gene causano la

Malattia di Canavan (deficit di asparto-

acilasi) o degenerazione spongiosa del

sistema nervoso centrale. E’ una

degenerazione neurologica autosomica

recessiva, che di solito causa morte

precoce.

Identificazione di specifiche

mutazioni puntiformi mediante

MLPA

Analisi mediante MLPA del

gene DMD (1)

Femmina portatrice di una delezione degli esoni 12-30

ìMLPA_p34_3_C^GMsTXT.txt

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

X-032.0

DM

D e

xon 0

1

X-032.0

DM

D e

xon 0

3

X-032.0

DM

D e

xon 0

5

X-032.0

DM

D e

xon 0

7

X-032.0

DM

D e

xon 0

9

X-032.0

DM

D e

xon 2

1

X-032.0

DM

D e

xon 2

3

X-032.0

DM

D e

xon 2

5

X-032.0

DM

D e

xon 2

7

X-032.0

DM

D e

xon 2

9

X-032.0

DM

D e

xon 4

1

X-032.0

DM

D e

xon 4

3

X-032.0

DM

D e

xon 4

5

X-032.0

DM

D e

xon 4

7

X-032.0

DM

D e

xon 4

9

X-032.0

DM

D e

xon 6

1

X-032.0

DM

D e

xon 6

3

X-032.0

DM

D e

xon 6

5

X-032.0

DM

D e

xon 6

7

X-032.0

DM

D e

xon 6

9 c c c

Mapview

Ratio

Mix P034 Paziente A P35

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

X-032.0

DM

D e

xon 1

1

X-032.0

DM

D e

xon 1

3

X-032.0

DM

D e

xon 1

5

X-032.0

DM

D e

xon 1

7

X-032.0

DM

D e

xon 1

9

X-032.0

DM

D e

xon 3

1

X-032.0

DM

D e

xon 3

3

X-032.0

DM

D e

xon 3

5

X-032.0

DM

D e

xon 3

7

X-032.0

DM

D e

xon 3

9

X-032.0

DM

D e

xon 5

1

X-032.0

DM

D e

xon 5

3

X-032.0

DM

D e

xon 5

5

X-032.0

DM

D e

xon 5

7

X-032.0

DM

D e

xon 5

9

X-032.0

DM

D e

xon 7

1

X-032.0

DM

D e

xon 7

3

X-032.0

DM

D e

xon 7

5

X-032.0

DM

D e

xon 7

7

X-032.0

DM

D e

xon 7

9 c c c

Mapview

Ratio

Mix P035

Analisi mediante MLPA del

gene DMD (2)

Maschio affetto (BMD) con duplicazione in emizigosi degli esoni 3-4

Il sequenziamento del DNA

Il metodo oggi comunemente utilizzato è il metodo enzimatico di Sanger.

Prevede la reazione di sintesi del DNA utilizzando dNTP + ddNTP (2’,3’ dideossinucleotidi trifosfati).

L’assenza dell’OH in 3’ impedisce la formazione del legame fosfodiesterico con la base successiva è la sintesi s’interrompe

Se i ddNTP sono opportunamente marcati, dopo separazione elettroforetica, è possibile leggere la corretta successione delle basi.

Next-Generation Sequencing

(NGS)

Il sequenziamento automatico secondo il metodo Sanger ha dominato nella scienza e nell’industria per almeno 20 anni e ha consentito il sequenziamento del genoma umano e la scoperta di almeno 2.500 malattie genetiche.

Il sequenziamento automatico secondo il metodo Sanger è considerato la tecnologia di “prima generazione”, mentre I nuovi metodi di “deep sequencing” sono denominati “next-generation sequencing (NGS)”

I maggiori vantaggi offerti dal next-generation sequencing sono rappresentati dalla capacità di produrre un volume enorme di dati a basso costo.

Le potenzialità del next-generation sequencing sono simili a quelle offerte dall’avvento della PCR, con il solo limite dell’immagginazione dell’utilizzatore.

Tecnologie attualmente

disponibili

Illumina/Solexa (modified Sanger)

Roche/454 (pyrosequencing)

Applied Biosystems SOLID

(sequencing by ligation).

Sequenziamento mediante sintesi (SBS)

Sequenziamento mediante ligazione (SBL)

SOLID

Chimica con terminatori SOLEXA

Chimica del pirosequenziamento

454

Principi della metodica

Si basano sul principio del sequenziamento di 'cluster' clonali.

Il processo, che incomincia con una singola molecola target, prevede la

creazione di targets clonali durante un processo intermedio di

amplificazione. Copie multiple identiche sono infatti necessarie per

avere un alto rapporto segnale-rumore

Tecnologia Illumina/Solexa

Tecnologia ROCHE 454 (1)

Tecnologia ROCHE 454 (1)

APS=adenosine

5´phosphosulfate

PPi=pyrophosphate

Confronto tra le metodiche

Roche (454) Illumina SOLiD

Chemistry Pyrosequencing Polymerase-based Ligation-based

Amplification Emulsion PCR Bridge Amp Emulsion PCR

Paired ends/sep Yes/3kb Yes/200 bp Yes/3 kb

Mb/run 100 Mb 1300 Mb 3000 Mb

Time/run 7 h 4 days 5 days

Read length 250 bp 32-40 bp 35 bp

Cost per run (total) $8439 $8950 $17447

Cost per Mb $84.39 $5.97 $5.81

Sequenziamento dell’exoma di 8 individui di controllo

Sequenziamento dell’exoma di 4 individui non imparentati tra loro affetti dalla sindrome Freeman–Sheldon, artrogripposi distale tipo 2A, un raro disordine autosomico dominante.

Un a mutazione nel gene MYH3, myosin, heavy chain 3, skeletal muscle (17p13.1) causa la malattia.

Risultati