1

New Tools, New Targets Novel Approaches for Identifying and Characterizing 

Epigenetic Modifications Webinar 

25 June 2014  [0:00:00]  Slide 2  Sean Sanders:  Hello everyone and a very warm welcome to the Science/AAAS webinar, 

New  Tools,  New  Targets:  Novel  Approaches  for  Identifying  and Characterizing  Epigenetic Modifications. My  name  is  Sean  Sanders  and I'm Editor for Custom Publishing at Science. 

   Epigenetic  enzymes  are  currently  among  the  most  important 

pharmaceutical targets due to their involvement in numerous key cellular processes  and  the  etiology  of  many  devastating  diseases  including cancer, neurodegenerative disease, and developmental disorders. Efforts are underway in many laboratories to identify and validate new so‐called reader, writer, and eraser enzymes, as well as their histone substrates in order to generate new therapeutics. 

   While various molecular biology techniques were initially used to identify 

and validate epigenetic enzymes and their substrates, novel approaches are  now  available  to  perform  pharmacological  characterization  of histone‐modifying  enzymes.  During  this  webinar,  our  experts  will  talk about methods  to  characterize histone‐modifying enzymes and present their  own  research  data  obtained  using  some  novel  experimental approaches. 

   It's my pleasure  to  introduce  those speakers  to you  today and  they are 

Mr. Bill  Janzen  from  the University of North Carolina at Chapel Hill and Dr.  Yan‐Ling  Zhang  from  the  Broad  Institute  of  MIT  and  Harvard  in Cambridge, Massachusetts ‐‐ a very warm welcome to you both. 

 Slide 1    Before we get  started,  I have  some  information  for our audience. Note 

that you can resize or hide any of the windows  in your viewing console. 

2

The widgets at the bottom of the console control what you see. Click on these  to  see  speaker  bios,  additional  information  about  technologies related to today's discussion, or to download a PDF of the slides. 

   Each  of  our  guests  will  give  a  short  presentation  followed  by  a  Q&A 

session, during which  they will address questions  submitted by our  live online  viewers,  so  if  you're  joining  us  live,  start  thinking  about  some questions now and submit them at any time by typing them into the box on  the  bottom  left  of  your  viewing  console  and  clicking  the  "submit" button. 

   If you don't see this box, click the red Q&A widget at the bottom of the 

screen.  Please  remember  to  keep  your  questions  short  and  concise  as that will give them the best chance of being put to our panel. 

   You can also log in to your Facebook, Twitter, or LinkedIn accounts during 

the webinar  to post updates or  send  tweets about  the event.  Just click the relevant widgets at the bottom of the screen. For tweets, you can add the  hashtag  #ScienceWebinar.  Finally,  thank  you  to  PerkinElmer  for sponsoring today's webinar. Now,  I'd  like to  introduce our  first speaker, Mr. Bill Janzen. 

 Slide 3    Mr.  Janzen worked  in both  industry and academia during his nearly 20 

years in the drug discovery arena. Since 2008, he has been a professor of the practice and Director of Assay Development and Compound Profiling at the Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery at the University of North Carolina at Chapel Hill. 

   A very warm welcome to you, Mr. Janzen. Thanks so much for being here.  Dr. William Janzen:  Thank  you,  Sean,  and  hello  everyone.  I'd  like  to  thank  Sean  and  the 

organizers for the opportunity to speak to you today. I want to tell you a little bit about what we've done at the University of North Carolina in the area  of  Epigenetic  Probe Discovery,  but  first,  I'd  like  to  talk  a  little  bit about epigenetics. 

 Slide 4    The  literal  translation of epigenetics obviously means  "above genetics". 

Epigenetics  is really a  form of genetic control which  is driven by  factors other than DNA sequence. Epigenetic changes primarily switch genes on 

3

or  off  and  determine  chromatin  structure,  and  this  in  turn  can  then control which proteins are transcribed. 

   Here, the term "heritable" refers to a stable cellular or organism‐specific 

event,  but  there  is  some  evidence  that  we  can  see  intergenerational epigenetic changes as well. 

 Slide 5    Epigenetics  has  a  number  of  important  areas  in  biology.  The  most 

commonly discussed one  is  in cell differentiation. The precursor cells or embryonic  stem  cells  obviously  have  to  differentiate  into  a  variety  of different cell and tissue types as an organism is formed all from the same genetic code, and this is an epigenetically‐driven process. 

   Epigenetics is also heavily involved in gene silencing. Genes can be active 

genes, which  are  being  transcribed;  poised  genes,  genes which  are  on DNA  or which  have  promoters  ready  to  transcribe  them  from DNA;  or silenced.  This  is  driven  through  both  changes  in methylation  states  of DNA and changes in the histone tails in chromatin nucleosomes. 

 Slide 6    Epigenetics  in  biology  can  be  demonstrated  through  X  chromosome 

silencing. In X chromosome silencing, it's very important because female mammals have two X chromosomes that one of these genes be silenced. This  is  necessary  so  that  they  won't  have  twice  the  number  of  X chromosome  gene expression  events  and misregulation of  this process can  lead  to many diseases,  for example, autoimmune  thyroid disorders and primary billiary cirrhosis. 

 [0:05:16]  Slide 7    It's  also  important  in  biology  and  is  shown  through  the  effects  of 

maternal care.  It's been shown that maternal grooming of offspring has been  shown  to  persistently  alter  histone  acetylation  and  transcription factor levels primarily NGFIA and binding to the GR promoter, which lead to differences in later stress response from the offspring. 

 Slide 8  

4

  Perhaps one of the best demonstrations of epigenetic effects is shown in the  "Dutch  famine"  effect  from  humans.  Nearly  six  decades  after  the "Dutch  famine"  or  "Hongerwinter"  of  1943  through  1947,  Lumey  and colleagues isolated DNA from Hongerwinter individuals and found below average methylation of the insulin‐like growth factor 2 gene (IGF2), which codes for growth hormones critical to gestation. 

   Exposure  to  famine  during  gestation  resulted  in  a  number  of 

abnormalities  including  reduced  stature, and  interestingly,  it was  found that  this  reduced  stature  was  passed  on  generationally  although  the effect  is  lessened,  so  the  research  is  ongoing  to  see  how  many generations this would then be carried. 

   It  also  resulted  in  a  number  of  other  changes  including  increases  in 

impaired glucose tolerance, obesity, coronary heart disease, atherogenic lipid profiles, schizophrenia, and a number of other effects. On the same vein,  a  number  of  Swedish  research  scientists  recently  showed  that paternal access to food can influence the health of the children. 

   Deaths  related  to  diabetes  decreased  for  children when  excess  food  is 

available to the father during a critical period of development, but if food is  plentiful  during  that  period  for  the  paternal  grandfather,  the  risk  is actually increased. So obviously, this is a very complex process. 

 Slide 9    Perhaps the most visual evidence of epigenetic changes is in coloration in 

felines.  On  Valentine's  Day  2002,  the  cloning  of  the  first  cat  was announced by researchers at the College of Veterinary Medicine at Texas A&M. Copy Cat or CC was developed in partnership with a biotechnology company  called Genetic  Savings &  Clone.  It was  immediately  apparent that CC did not physically resemble Rainbow, her DNA donor mother. 

   Now,  this  is  actually  another  great  example  of  X  inactivation. 

Tortoiseshell  and  calico  cats  are  always  female,  and  black  and  orange alleles of fur coloration gene reside on the X chromosome. Because one allele is inactivated in every cell and the process is random, the coat will exhibit patches of both colors and the pattern cannot be predicted. 

   This obviously also is not very good for Genetic Savings & Clone. It pretty 

much spoiled their business model and I think they went out of business at that time. 

 Slide 10 

5

   But  our  interest  today  is  the  chemical  biology  regulation  of  chromatin 

and  how  we  can  use  chemical  biology  to  understand  chromatin regulation. 

   Chromatin, as we all know, involve the DNA helix wrapped tightly around 

nucleosomes.  Nucleosomes  also  have  histone  tails,  which  can  be modified. This is where the term "writers, readers, and erasers" has come in.  On  the  histone  tails,  we  can  have  a  number  of  different  marks, acetylation marks, phosphorylation, ubiquitination, or methylation.  

   The  writers  or  readers  of  this  code  are  demonstrated  here.  For 

acetylation, these are the histone acetyltransferases, the bromodomains, and  the  histone  deacetylases.  For methylation,  the  PKMT,  the  protein methyltransferases,  the  Royal  family  binders,  and  the  demethylases, which  also  remove  that  methyl  mark.  For  phosphorylation,  these obviously are kinases and phosphatases.  

 Slide 11    Here  at  the  University  of  North  Carolina  in  the  Center  for  Integrative 

Chemical Biology and Drug Discovery ‐‐ and I apologize for the long name ‐‐ we  have  a  broad mission  to  interact with  faculty members  to  bring either drug or probe discovery projects through the pipeline. 

   We  have  targets  coming  from  two  potential  sources,  target  proposals 

from UNC faculty or responsive collaborations, but what I'm going to talk about  today are  the  center‐initiated projects  in  chemical biology which focus around the epigenetics or more perspective science. 

   We are well‐equipped to prosecute these projects with a good group of 

biologists, biochemists, 18 medicinal  chemists and  three  computational chemists, and a  library of over 300,000 small molecules, the goal of this being the development of small molecule probes for epigenetics. 

 [0:10:03]  Slide 12    So  one  of  the  obvious  questions  is,  "Why  chemical  probes?" We  have 

many molecular  biology  techniques which  can  knock  down  proteins  or change their function, but chemical probes offer a number of advantages, the temporal resolution of being able to add a chemical compound and see a response rather than being forced to create a cell which is missing 

6

that  response;  mechanistic  flexibility  to  alter  targets  separate  of  the functions of the protein; ease of delivery, once a compound  is shown to be  cell  permeable  or  has  a  potential  oral  activity,  it  can  be  delivered easily to a biological system; and then of course the application to  later drug discovery. 

   As we develop these probes, we're always trying to ensure that they have 

drugable  characteristics  so  that  if  a  therapeutic  intervention  target  is identified, we can move forward into lead discovery. 

 Slide 13    The second question that arises from that is, "What is a quality chemical 

probe?" Obviously,  chemical  probes  need  to  be  very  selective.  In  fact, more effort needs to be spent on selectivity and the understanding of the mechanism of a probe than of a drug. 

   Drugs can be highly nonselective and still be very, very potent and very 

good therapeutic measures, but in order to use a probe to understand a biological system, we need to understand its selectivity very carefully, so they  need  to  be  profiled  both  in  vitro  and  hopefully  in  vivo.  Their mechanism of action needs to be understood. 

   We need  to understand what  is  the  identity of  the  active  species,  and 

finally, proven utility as a probe. There needs to be cellular activity data to  address at  least one of  the hypotheses of  the  role of  the molecular target. 

   Most  importantly,  they need  to be available. A probe  is  really not very 

much used to the broader scientific community unless  it's available with no restrictions on its use, so everything we're doing in the epigenetic area is  intellectual  property  free  and  published,  and  the  probes  are  freely available through commercial suppliers. 

 Slide 14    So coming back again to our picture of the epigenetic code and histone 

tails, we made the decision early on to focus on methylation as an area where we felt we could have an  impact, so our focus has been chemical probes  for  the Royal  family binders  to methyl  tails on histone  and  the PKMT family. 

 Slide 15  

7

  I'm  going  to  talk  mostly  about  our  program  in  methyl‐lysine  reader families.  There  are  six  primary  families  that  have  been  identified,  the Chromo domains, Tudors, MBTs, PHDs, PWWPs, and WD40 domains. The MBT domains are where we began this research. All these domains have very  specific  binding  to  methylation  states  of  the  histone  tail.  For example, MBT domains will bind either a mono or dimethyl, but will not bond tri or unmethylated. 

 Slide 16    So we began this work by developing an AlphaScreen Assay Platform. For 

those  of  you  not  familiar  with  AlphaScreen,  it  involves  a  donor  and acceptor bead. When the donor bead  is excited by specific wavelengths of  light, a singlet oxygen  is released. That singlet oxygen has a transition distance  in an aqueous environment of approximately 200 nanometers. So  if an acceptor bead has been brought within that distance through a binding event, it will then emit light. 

   The  way  we  have  built  our  program  is  that  we  create  methyl‐lysine 

reader  proteins  which  have  specific  binding  tags  that  are  both  used during purification and used  for  coupling  to  the bead.  Shown here  is a 6×His  tag with a nickel bead  so  that  the bead can  then bind directly  to that protein. When the protein binds an acceptor motif on a peptide, that peptide then has a biotinylation tag which can be bound to a streptavidin donor bead, thus bringing these within the close proximity. 

   We found this to be very effective especially since many of these binder 

proteins have  low  affinities  and  the AlphaScreen platform  allows us  to work  with  lower  levels  of  protein  than  fluorescence  polarization  and some of the other techniques that could be used. 

 Slide 17    This  work  was  first  published  in  2010  by  Tim Wigel  who  was  then  a 

postdoc  in  my  laboratory,  and  we  have  continued  to  expand  this platform. 

 Slide 18    The  work  I'm  showing  you  here  is  primarily  that  of  Tim,  Victoria 

Korboukh, and Brandi Baughman. Brandi is currently a postdoc in the lab. Victoria  is also a former postdoc who's going on to an  industry position, but this  is now being expanded to create a panel which we can use  in a chemical biology approach. 

8

 [0:15:10]    We  have  five MBT  domains,  five  Tudor  domains,  arguably  eight  PHD 

domains,  although  as  you  can  see  from  this,  six  of  those  eight  are different derivatives of  a  single protein, UHRF1, where we have  a  very heavy research focus at this point, and one Chromo domain. 

   The way our program works is that all compounds that are synthesized or 

that  are  of  interest  in  the  reader  program  are  screened  through  all members  of  this  panel  usually  in  an  IC50  format  so  that  we  gather potency. 

   So we  do  primary  screen  in  an  AlphaScreen  and  then  those  are  then 

confirmed  both  in  secondary  assays  to  ensure  specificity,  and  then through ITC fluorescence polarization or SPR plasmon resonance reads to show  that  the compound actually does bind directly  to  the protein. We then follow that with cell‐based assays to potentially move forward to in vivo assessment. 

   For our  counterscreen,  the peptides  are  shown  in  the blue box on  the 

lower left side of your screen. We do have multiple labels that we can use and can bind both GST and His‐tags for our proteins, but one of the areas we have to be very careful about  is to ensure that the compounds that we're  finding  are  in  fact  affecting  binding  and  are  not  affecting  the release  of  singlet  oxygen  or  quenching  of  the  light  from  the  acceptor bead. 

   To do this, we use peptides. The top two are shown in the box where we 

have  a  direct  biotin  and  either His  or GST  tag  so  that we  can  directly couple  the  two  beads  and  show  that  the  compound  is  not  having  an effect on that  interaction. We also have an unmethylated peptide so we can  show  specificity  for  the methylation mark  and  unlabeled  peptides that we can use as competition agents. 

 Slide 19    This program has been running for a number of years. Over the  last five 

years, we've collected approximately 800,000 wells of data. As you can see on the top graph shown here, these show the number of compounds read per day. 

   The  very  large  spike  in  the  beginning  of  this  graph  shows where  Tim 

Wigel at one point over a  three‐day period  ran our 100,000 compound 

9

diversity library and to give us initial starting point data for this program, but you can see that we've had average runs of approximately 4000 wells a day through the life of the program. 

   You  can also  see  the breakdown by  the different proteins  in  the  lower 

side  of  this.  Clearly,  the  L3MBTL1  program  has  been  one  of  the most prolific, but also MBTD1 and the other MBT programs. Again, this is data that was primarily generated by Brandi, Victoria, and Tim. 

   Another  important  factor  is  the  fact  that we do  run  things primarily  in 

potency curves, so  this data does represent 51,000 potency curves  that we have available for data mining. From this, we've been able to do quite a bit of probe discovery. 

 Slide 20    Our  primary work  has,  as  I mentioned,  been  in  the MBT  domains  and 

we've been able to publish several structure‐activity relationship papers and small molecule ligands of methyl‐lysine binding domains. Shown here are two programs primarily from Martin Herold, also a former postdoc in the lab. 

 Slide 21    And also a much deeper understanding of  the computational nature of 

binding  to  L3MBTL1,  but  probably  the  biggest  success  has  been  in  the generation of actual probes. 

 Slide 22    In  2013,  Lindsey  Ingerman  James  published  this  article  in  Nature 

Chemical  Biology  showing  the  probe  UNC1215  as  a  potent  selective antagonist of L3MBTL3. 

   This was a very  interesting program because this began as a compound 

designed to bind tandem Tudor domains by taking a motif that had been shown  to bind L3MBTL1 and a number of  the other MBT domains. The thought  was  if  we  created  essentially  a  dimer  or  doubling  of  this compound,  it would  be  able  to  bind  tandem  Tudor  domains  and  have greater efficacy. 

   What we found  instead  is that  it was very, very potent against L3MBTL3 

and from that, Lindsey has now been able to show that L3MBTL3 actually 

10

binds as a dimer to this molecule, so essentially it binds two molecules of L3MBTL3 in order to inactivate. 

 [0:20:08]  Slide 23    The other area that we've worked in the epigenetics area has been in the 

area  of  histone methyltransferases.  This work was  published  earlier  in Chemistry & Biology in 2010, also by Tim Wigel. This is an effort that has been  led  by  Jian  Jin,  one  of my  faculty  colleagues  at  the University  of North Carolina. I just want to quickly touch on a couple of his successes. 

 Slide 24    He has been able to publish multiple probes that selectively  inhibit G9a 

and  GLP.  This  has  been  work  that's  been  in  collaboration  with  the Structural Genomics Consortium. Rather than read all the names on this very large publication, I do want to just point out Masoud Vedadi, who is the  first  author  here,  and  also  obviously  Jian  Jin,  our  director  Stephen Frye, Peter Brown, a number of people who contributed  to  this, as you can see. 

   The first publication was on UNC638 as a selective probe of G9a, but that 

was  later then optimized to UNC642, which was  improved PK properties and was an in vivo probe. 

 Slide 25    Jian has also been able to develop UNC1999 and orally bioavailable probe 

of the methyltransferase EZH2 and EZH1, again, in collaboration with the SGC.  This  is work  from  Kyle  Konze,  Anqi Ma,  and  a  number  of  other chemists and our collaborators at the Structural Genomics Consortium. 

 Slide 26    With that, I'd like to end. I'd like to thank the entire group at UNC Center 

for Chemical Biology, particularly Stephen Frye who  is not shown  in this picture because he is our team photographer and was taking the picture.  

   I'd  like to thank the University of Lineberger University Cancer Research 

Fund for funding, the Eshelman School of Pharmacy, as well as National Institutes of Health for funding this work. I will conclude at this point and allow us to move on to our next speaker. 

11

 Sean Sanders:  Great!  Thank  you  so much, Mr.  Janzen,  excellent  presentation. As  you 

mentioned, we are going to move on to our second speaker.  Slide 27    Just  a quick  reminder  to  those watching  live,  you  can  still  submit  your 

questions at any time. Just type them into the question box on the left of your screen and click "submit". 

   Our  second  speaker  today  is Dr. Yan‐Ling  Zhang. Dr.  Zhang  is  currently 

the director of In Vitro Pharmacology in the Therapeutics Platform at the Broad Institute of MIT and Harvard. 

 Slide 28    In this role, she focuses on the development of biologically‐relevant, high 

throughput  biochemical  and  phenotypic  assays  to  enable  high throughput  screening  for  a  variety  of  drug  targets  for  psychiatric disorders,  and  is  currently  also  interested  in  developing  a  high throughput calcium dynamics assay to monitor synaptic networks. 

   A very warm welcome to you, Dr. Zhang.  Dr. Yan‐Ling Zhang:  Thank you, Sean, for the  introduction. Hello, everyone! Here, I'll present 

our case study in developing isoform specific HDAC inhibitors specifically focusing on kinetic characterization of HDAC  inhibition with microfluidic mobility shift assay. 

 Slide 29    HDAC catalyzes  the  removal of  the acetyl group  from  lysine  residues  in 

histone tails and also some non‐histone proteins. It plays a critical role in chromatin structure. Upon deacetylation, positive charge of the histones interact  with  the  negative  charge  of  DNA  forming  highly  compacted chromatin  structure,  shutting  down  the  gene  transcription,  so  histone acetylation plays an important role in the regulation of gene expression. 

 Slide 30    Zinc‐dependent HDACs are  classified  in  three  classes depending on  the 

sequence  homology  to  its  yeast  counterpart  and  localization.  Class  I HDAC contains HDAC1, 2, 3, and 8. They are most located in the nucleus. 

12

The  crystal  structure  of  HDAC2,  3,  and  8  are  available.  Their  catalytic domains are highly conserved. 

 Slide 31    Because of  the  importance of HDACs  in cell cycling, differentiation, and 

apoptosis, many  efforts  have  been  put  across  industries  and  academic labs in the development of small‐molecule HDAC inhibitors. 

 [0:24:58]    Here,  I  listed  four  classes  of  known HDAC  inhibitors,  hydroxamic  acid, 

which is represented by SAHA as the approved drug marketed under the name Zolinza for the treatment of cutaneous T‐cell lymphoma. It inhibits Class I and some Class II HDACs with nanomolar to micromolar potency. 

   Cyclic  peptide  is  another  class  of HDAC  inhibitors.  Their  representative 

compound  is  FK‐228,  which  is  also  a  recently  FDA‐approved  drug  for cutaneous T‐cell  lymphoma  indication.  It's a nanomolar, a Class  I HDAC inhibitor. 

   Some short‐chain fatty acids such as Butyrate also show inhibiting activity 

in  the HDACS as a millimolar  range of potency. Finally, benzamides  like MS‐275 and CI‐994 will target HDAC1, 2, 3 inhibitors. Some of them are in clinical trials for treatment of various cancers.  

   By looking at the target column in this table, you'll find that none of these 

known  inhibitors  are  isoform‐selective.  In  the  past  few  years, we  have been  interested  in developing  isoform‐selective  inhibitors to understand individual HDAC function. 

 Slide 32    We're  particularly  interested  in  HDAC2  because  of  its  function  in  the 

other diseases.    Dr. Li‐Huei Tsai's lab at MIT has shown that neuro‐specific overexpression 

of HDAC2 to the mice reduced dendritic spine density, synapse numbers, synapse  plasticity,  and  memory  formation.  So  conversely,  HDAC2 deficiency  resulted  in  increased  synapse  numbers  and  memory facilitation, so similar to chronic HDAC inhibitor treatment. 

   We started the lead optimization for HDAC inhibitors with the benzamide 

class  because  of  their  unique  inhibition  kinetics,  so  we  hoped  by 

13

optimizing  both  potency  and  inhibition  kinetics  that we  gain  excellent selectivity. 

   Inhibition kinetics measurement  requires a continuous enzymatic assay. 

Traditional or commonly used HDAC assay  is a trypsin‐coupled endpoint assay. The acetyl‐lysine containing peptide  substrate  is conjugated with coumarin.  So  upon  deacetylation  by  HDAC,  the  coumarin  will  be hydrolyzed by trypsin, releasing coumarin and generating a fluorescence readout. 

   In  the  presence  of  trypsin,  we  found  that  some  HDAC  enzymes  like 

HDAC2 were  not  stable  and would  also  be  cleaved  by  trypsin,  so  this trypsin‐coupled  assay  is not optimal  for  continuously monitoring HDAC activity. 

 Slide 33    One method  came  up  to  our mind  that will  continue HDAC  enzymatic 

kinetic  assay.  It's  the  Caliper  microfluidics  LabChip  technology.  This technology  is a capillary electrophoresis‐based separation technology.  It has been widely used  in  inhibitor  screening and MOA  studies  in kinase and protease fields. 

   The assay setup is quite straightforward, so we just incubated HDAC with 

acetylated  peptide  substrate.  The  substrate  is  fluorescent‐labeled. Because of  the charge difference between  the acetylated substrate and deacetylated product, they will be separated by capillary electrophoresis in microfluidic  chips  and  the  substrate  conversion  can  be  continuously monitored and quantified by  fluorescence peak  from both product and the substrate. 

 Slide 34    What we call first generation HDAC Caliper substrates from PerkinElmer 

are  listed  here. We  could  derive  it  either  from  Histone  3,  4,  or  p53 peptide. They are good  substrates  for HDAC3 and HDAC6. You  can  see the  conversion  here  for  HDAC3.  However,  very  little  activity  was observed  using  this  substrate  for  HDAC1,2  and  at  200  nanomolar  you barely see any conversion. 

   So working with our mechanism team and also application scientists from 

PerkinElmer,  we  were  able  to  synthesize  the  normal  HDAC  Caliper substrates, which show very good activity against all HDACs. 

 

14

[0:30:06]  Slide 35    So here in the left panel is the comparison of in‐house substrate with first 

generation of PerkinElmer Caliper substrate in HDAC1 activity.    The  right  panel  is  the  comparison  of  these  substrates  for  HDAC2,  3 

activity.  You  can  see  that  our  in‐house  Caliper  substrate  is  at  least fortyfold more active than first generation, commercial available Caliper substrate, so HDAC1, 2. Both substrates are quite efficient for HDAC3. 

 Slide 36    So with these new substrates in hand, we have developed our SAR assay 

using Caliper  technology  to support  the  lead optimization  for our HDAC program. This is the screen view of those response data from SAR assay, so including those curves ‐‐ and I see 15 ‐‐ so it's quite a robust assay. 

 Slide 37    We also developed that Caliper assay using in‐house substrate for HDAC1 

to 9  for  selective profiling. All  the  substrate conversion  reaches 20%  to 40% in the presence of subnanomolar or low nanomolar HDAC enzymes. 

 Slide 38    Here, the selective profile for known HDAC inhibitors using Caliper assay, 

you can see LBH and SAHA are hydroxamate‐based HDAC inhibitors with broad  inhibition  spectrum,  and  the  CI‐994  and  the  Merck60  are benzamide‐based  inhibitors with better  cell activity against HDAC1,2 or HDAC1,2,3. 

 Slide 39    We  also  profiled  in‐house  HDAC  inhibitors.  Here  are  field  profiling 

examples on our  in‐house HDAC1,2  selective  inhibitors, HDAC3  specific inhibitors, as well as HDAC6,8 selective inhibitors. Most of benzamide as well as HDAC selective inhibitors are time‐dependent inhibitors. 

 Slide 40    Next, we would  like to understand the  inhibition kinetics. There are two 

common mechanisms  shown  here  with  slow  binding  kinetics  analysis. 

15

Mechanism one indicates a slow binding step, being really a limiting step of  inhibiting kinetics.  In this case, K‐observed, which  is derived from the progression  curve  is  proportional  to  inhibitory  concentration  and  then the slope is exactly on the low substrate concentration. 

   In  mechanism  two,  the  slow  inhibiting  kinetics  is  mainly  from  slow 

conformational  change  of  enzyme  inhibitor  complex  after  inhibitor banding. So  in  this case, K‐observed  reaches  to hyperbolic saturation  in the presence of a high inhibitor concentration. 

 Slide 41    In both cases, a Koff can be derived from a dilution experiment. Here,  it 

shows you a design of dilution experiment. We  incubated  the enzymes with a high concentration of inhibitor for one to two hours depending on their binding kinetics, then diluted  it a hundredfold. The enzyme activity was  monitored  in  continuous  Caliper  assay  to  follow  the  inhibitor's dissociation and calculated the off rate. 

 Slide 42    Here  are  a  few  examples  on  how  to  measure  inhibiting  kinetics  of 

parameters. We  use  HDAC2  and  some  known  inhibitors  as  examples. First, we measured the inhibition kinetics for SAHA. SAHA is a fast on/fast off reversible HDAC2 inhibitor. 

   Here  is  the  progression  curve  for  HDAC2  catalyzed  enzyme  reaction 

generated from Caliper assay. X‐X is time and Y‐X is substrate conversion. The off  line with  the  largest slope  is a  time course of HDAC2 activity  in the absence of the SAHA. The other  lines are the time course of HDAC2 activity  in  the  presence  of  SAHA  at  a  different  concentration.  At  one micromolar  of  SAHA  concentration,  HDAC2  completely  lost  activity, suggesting that SAHA is a tighter nanomolar range inhibitor. 

 [0:35:06]    Upon  dilution,  the  HDAC2  activity  was  completely  recovered  just  like 

DMSO control suggesting this  inhibition  is reversible. The off rate  is also very fast. It reached up the limit of our detection. 

 Slide 43    We don't characterize the inhibition kinetics for benzamide inhibitor such 

as CI‐994. CI‐994 clearly shows time‐dependent inhibition, so we can see 

16

through  the  progression  curve  together  K‐observed  ‐‐  K‐observed  is proportional to CI‐994 concentration indicating a slow binding of inhibitor to  HDAC2.  The  Kon  is  at  0.016  per minute  or  per micromolar.  Upon dilution,  the  activity  gradually  comes  back  with  the  koff  0.0036  per minute, corresponding a half‐life of 190 minutes. 

 Slide 44    So  similarly, Merck60  is  also  a  slow  tight‐binding  inhibitor  with  even 

slower  off  rate.  Its  half‐life was  estimated  to  be  three  days,  but  I  just want  to mention  that although Merck60 has very  slow off  rate,  it does not form a covalent bond based on mass spec experiment. 

 Slide 45    So using these technologies, we have characterized the inhibition kinetics 

for all of these compounds. Here  is the summary table on the  inhibiting kinetics and the binding affinity data we obtained to support our SAR. As you can see, CI‐994  is a nanomolar  inhibitor  for HDAC1, 2, 3 with slow‐binding  kinetics.  Their  half  lives  are  74,  190,  and  160  minutes respectively. 

   Our in‐house compounds, Compound 4 and Compound 5, also have slow‐

binding  kinetics  towards HDAC1,  2,  3. However,  these  two  compounds have  much  slower  on‐rate  in  HDAC3,  which  makes  the  HDAC1,  2 selective. 

 Slide 46    Comparing with CI‐994, Compound 6 has much faster off rate  in HDAC1 

inhibition and HDAC1 and 2 binding. It maintains long half‐life for HDAC3, about 29 minutes. We can make HDAC3 selective inhibitor. 

 Slide 47    So  in  summary,  high  efficiency  HDAC  Caliper  substrates  have  been 

synthesized  and  characterized  for HDAC1‐9,  including  HDAC11.  Here,  I didn't  show  the data  for HDAC11, but  the  substrates are also good  for HDAC11.  All  these  substrates  and  assay  kits  are  now  available  in PerkinElmer. So by optimizing both potency and  inhibiting kinetics data using Caliper assay, we're able to get isoform‐selective inhibitors. 

   Both  our  HDAC1,  2  and  HDAC3  selective  inhibitors  have  great  PK/PD 

properties and a few animal efficacy, which we will publish the data soon. 

17

 Slide 48    This work  is  a  team effort  and  a  collaboration between  several  groups 

from  Broad,  also MGH  and MIT.  I  also want  to  thank  the  application scientists from PerkinElmer. Thank you. 

 Sean Sanders:  Thank you so much, Dr. Zhang. Many thanks to both of our speakers for 

the wonderful presentations and we're going to move right along to the questions submitted by our online viewers. 

 Slide 49    A quick reminder to those watching us live that you can still submit your 

questions. Just type them into the text box and click the "submit" button. And again, if you don't see that box, click the red Q&A icon and it should appear. 

   The first question I'm going to put to you, Mr. Janzen, from a therapeutic 

standpoint, would modulating  the  binding  of  RedA  proteins  to  histone tails  be  more  efficient  or  specific  than  utilizing  histone methyltransferases or HDAC inhibitors? 

 [0:40:03]  Dr. William Janzen:  That's a very good question. The difficulty there is that it's always difficult 

as  you move  into  a  new  protein  class  to  understand  how  specificity  is going to translate  into therapeutic efficacy. Clearly, as we're developing highly specific probes, these are some of the questions that we want to answer.  And  if  the  therapeutic  events  you're  trying  to  interrupt  does involve  specific  binding  to  a  histone  tail  by  an  epigenetic  complex,  it's going  to  be  more  specific  for  that  because  if  we  inhibit  the methyltransferases,  those  are  going  to have  substrates which  are non‐histone based. 

   I will say that for many of the probes that we're working on or actually for 

most  of  the  probes  we're  working  on,  we  have  not  seen  overt physiological effects as they've been administered. They do tend to be a bit more subtle.  I  think again our approach  is  to develop highly specific probes that we can make available to researchers so that we can answer exactly that question. 

 Sean Sanders:  Dr. Zhang, a question that came in for you, is the microfluidic technology 

that you're using applicable to targets other than HDACs? 

18

 Dr. Yan‐Ling Zhang:  Yes. Theoretically, an enzyme catalyzes that reaction. The substrate and 

the  product  have  different  charges.  You  can  separate  it  using  this technology. This technology had been widely used  in kinase field as well as protease field. Recently, it has been used in methyltransferase as well. 

 Sean Sanders:  Great! Coming back to you, Mr. Janzen, maybe a broader question, how 

could one specifically target drugs to a chosen gene in order to change its epigenetic status? Do you have any thoughts on that? 

 Dr. William Janzen:  Chosen gene to change  its epigenetic status, that's  ‐‐  I think the answer 

I'm  going  to  give  here  is  not  going  to  satisfy  whoever  submitted  it because I'm going to begin by saying I don't know. You could hypothesize some  methods  whereby  you  could  target  a  specific  gene  if  you understood clearly enough the expression patterns around that gene. 

   Where  this  can  be  done,  some  other  work  that  we're  doing  with  a 

collaborator  ‐‐  Ian  Davis  here  at  UNC  ‐‐  is  to  look  at  accessibility  of chromatin. I think one way you could look at targeting a specific gene is if that gene is known to be silenced or expressed by specific changes in the chromatin  and  we  can  find  small  molecules  that  then  change  that accessibility to the gene. 

 Sean Sanders:  Dr. Zhang, any thoughts on that?  Dr. Yan‐Ling Zhang:  Yeah.  I  would  think  it  depends  on  the  target.  If  the  epigenetic 

modification is easy to target, then it'll be easier to find a small molecule to manipulate it that way. If the gene itself has a function which you can manipulate  by  a  small molecule,  I  would  think  the  gene  directly,  the targeted gene, will be a good approach as well. 

 Sean Sanders:  Excellent.  Dr.  Zhang,  let  me  stay  with  you  and  come  back  to  the 

techniques that you were using. This viewer asks if it would be possible to identify non‐competitive inhibitors or modulators, for example, allosteric modulators of HDACs using the microfluidic technology. 

 Dr. Yan‐Ling Zhang:  Yes, I think so because the technology itself can monitor that mechanism 

or study the mechanism; and  if  it's a competitive  inhibitor,  it will clearly show it competes with the substrate. If it's allosteric, you will see it won't compete with  the  substrate, and  I  think  this  technology can distinguish them. 

 Sean Sanders:  Mr. Janzen, back to you. Have you done any work on chemical probes for 

bromodomains? 

19

 Dr. William Janzen:  That work  is  being  done  by  another  group  at  the  Structural Genomics 

Consortium, so the work is essentially divided between the collaborators. Other  than  accessing  some  of  their  probes  to  use  in  our  panels,  we haven't done any direct discovery of bromodomains. 

 Sean Sanders:  Do you have any places you  can point  the viewer  to where  they might 

find some information from your colleagues?  Dr. William Janzen:  I would go to the Structural Genomics Consortium website and that's the 

best starting point that will link in to all of the collaborators.  [0:45:04]  Sean Sanders:  Perfect! Dr. Zhang, if available, could you mention where the information 

about the development of quantitative SAR was published?  Dr. Yan‐Ling Zhang:  Yeah.  I don't have  the  literature off  the  top of my head, but  there are 

some  papers  there  including  not  just  potency,  but  as  well  as  all  the kinetics as a comment to SAR to support the lead optimization. 

 Sean Sanders:  Excellent!  I  think  this one was  also  for  you. The Caliper  assay  that  you 

mentioned,  can  they  be  used  to  study  the  kinetics  of  chemical compounds  targeted  to other histone modifying enzymes and have you tried this? 

 Dr. Yan‐Ling Zhang:  We  haven't  tried  that  yet,  but  again  like  I  said,  there  are  some 

publications  that use  this  technology  to do  the methyltransferase. Also, some people use this one to test the p53 DNA binding as well. 

 Sean Sanders:  Excellent! Mr. Janzen, back to you, do you have any  idea of the current 

status of measuring histone modifications using  small numbers of cells, maybe with the ultimate goal of single cell sensitivity? 

 Dr. William Janzen:  Well,  histone  changes,  it's  very  difficult  to  pin  that  down  to  a  specific 

answer.  The  current  status  of  that  as  far  as  I  know  is  that  people  are working on moving this down into smaller cells. We are currently working on  a platform, which  is  a derivation of  the  FAIRE platform, which uses formaldehyde‐assisted  cross‐linking  to  look  at  the  status  of  regulatory elements,  trying  to miniaturize  that  down  to  smaller  number  of  cells, which may then also be available for ChIP assays. 

   As far as I know, people have been able to get down to small numbers of 

cells, but not single cells. If there is a PCR readout for the change, we are 

20

hoping we can actually move these down into a single cell environment in the near future. 

 Sean Sanders:  Excellent! Actually, let me stay with you. I'm going to come to Dr. Zhang 

for this as well, but this viewer says, "It seems that the predisposition of certain enzymes  is  to act upon  their  respective histone  residues within the proximity of a specific region of DNA such as a promoter or enhancer region.  Is  it  known what  confers  this  kind  of  targeted  action when  it seems that histones appear essentially unrecognizable from each other?" Do you have any thoughts on that one? 

 Dr. William Janzen:  It seems that the histone regulators also are involved in targeting. One of 

the  things  that's  being  seen  in  epigenetics  is  that  the  enzymes  that modify histone tails or in some cases, even DNA methylation, don't work in isolation. They tend to come in as a complex. 

   So a reader domain may be involved in binding to a histone tail, but may 

bring with it a large complex, which then modifies adjacent tails, adjacent marks  on  the  tail,  or may  in  fact  open  and  close  chromatin  and  allow transcription of regions. 

   We don't  really  know whether  the presence of a  secondary protein on 

the  chromatin  is  involved  in  targeting  that as well, but  it's highly  likely that the presence of a transcription element could then recruit in binding elements that make epigenetic changes. 

 Sean Sanders:  Dr. Zhang?  Dr. Yan‐Ling Zhang:  Yeah,  I agree. As  for HDAC, we already know a  lot of HDACs actually  in 

vivo form complex forms. The complex form's substrate specificity could be different from a single HDAC enzyme  in vitro, so those might  involve the  interaction and  recognition with a different  reading of a histone  in the cell. 

 Sean Sanders:  Excellent! Dr. Zhang,  let me  stay with  you  for another question on  the 

application of this technology that you're using. Can it be used to monitor changes to substrates other than peptide substrates such as nucleosomes or individual histones, if you have any experience in that area? 

 Dr. Yan‐Ling Zhang:  I would think that it is possible. The only limitation for this technology is 

that your substrate cannot be too big.  [0:50:05]  

21

  It's pretty much  limited  to within 20 amino acids. You can do DNA and peptide  as well,  which  is  derived  from  either  protein  or  transcription factors, all kinds of in vivo proteins. 

 Sean Sanders:  Excellent! Mr.  Janzen,  back  to  you,  can  you  describe  the  paradigm  for 

your tertiary cell‐based screens, specifically the platform and end points?  Dr. William Janzen:  Each  one  is  different  because  in  each  case,  we're  usually  measuring 

access  to  a  different  chemical  target.  For  example,  for  the  reader domains, what we have  tended  to do  is  to  look  first at  things  like FRAP experiments for GFP‐labeled reader proteins, but then also the chemists have been very creative and have created click chemistry modifications of the  compounds  so  that we  can  actually  photoaffinity  tag  or  tag  these with  fluorescent moieties after  they're  in  the  cell  so  that we  can allow them to bind and then track. 

   There's publication  recently on what's been  called Chem ChIP of being 

able to use these tagged chemical compounds within the cell to then pull down and analyze the complexes that are active within the cell, so each one  is different. There's not a standard panel of phenotypic assays  that we look at. 

   Obviously, we do the basic assays, looking at cytotoxicity across a number 

of cells. And  if  the  function of a protein  is known,  then we will  look at that  specific  readout,  but  in most  cases  in  the  readers,  the  function  is largely poorly understood and we just want to show that we're having an intracellular effect. 

 Sean Sanders:  Excellent! Dr.  Zhang,  towards  the  end  of  your  talk,  some  of  the HDAC 

inhibitors you discussed had very  slow binding kinetics. What might be the clinical impact of this if it were to be applied in a clinical setting? 

 Dr. Yan‐Ling Zhang:  Yeah. Slow kinetic binding can mean  longer  residence  times, which can 

give you better efficacy and also can affect the dose as well.  Sean Sanders:  Excellent!  I have another question  for you, Dr. Zhang. How  is  it thought 

that  simple  short‐chain  fatty  acids  inhibit  HDACs?  Do  you  have  any thoughts on the mechanisms? 

 Dr. Yan‐Ling Zhang:  Those  inhibitors  vary.  The  potencies  is  not  as  great  as  others,  are 

minimolar.  So  in  terms  of  in  vivo  efficacy,  people  actually  don't  know exactly  whether  that's  because  of  inhibition  of  HDACs  or  some  other related targets. 

 

22

Sean Sanders:  Great!  A  pretty  broad  question  here,  this  is  probably  from  somebody who's  starting  off  in  the  field.  They're  saying  for  someone wanting  to enter the field of epigenetics research, where is a good place to start and what areas should they be looking at studying? Maybe Mr. Janzen, I'll ask you that one first. 

 Dr. William Janzen:  Without knowing a  little bit about their background, that's very difficult 

to  predict  again.  I would  say  the  place  to  start  is  by  learning  as much about  epigenetics  as  possible,  seeing  where  your  current  research background fits well into that. We obviously chose methylation because it was an area that was poorly understood and we felt that we could have a real impact there by generating these probes. 

   It also depends very much on whether the individual entering the field is 

interested  in  academic pursuit, drug discovery, or more of  getting  into the chemical biology side. The HDACs are very heavily researched. I think quite a bit is known about that. Probably the area that is most interesting now  is  trying  to  understand  how  the  CpG  islands  actually  affect transcription, so there's quite a bit. It's such a huge area that it's hard to isolate this down and say where one should enter it. 

 [0:55:04]    There are so many opportunities to have an impact right now that I think 

almost  any  area  you  choose,  you  will  be  able  to  find  something interesting  to do  there and  something  that will have a  large  impact on the field. 

 Sean Sanders:  Dr. Zhang, your thoughts?  Dr. Yan‐Ling Zhang:  Yeah, I agree. It depends on their interest and their background. You can 

either  focus on  individual  targets or enzymes  in epigenetics, or you can look  from  the  epigenetic  effects  on  either  developmental  or  disease‐focused. Either way will be interesting. 

 Sean Sanders:  All right, so we're coming to the end of the webinar, but I have  just one 

more question  I wanted  to put  to you. Well, maybe we'll start with Dr. Zhang  this  time. Where do you  see  the  technology moving  in  the next, say, two to five years and what would you  like to see that would enable your research and enable you to dig deeper into this subject area? 

 Dr. Yan‐Ling Zhang:  Specifically  for HDAC,  I would think a big challenge here  is currently we 

do  the  in  vitro  to  purify  the  system.  It will  be  great  if we  can  get  the 

23

complex  form  of what  exists  in  cell  in  vivo.  I  think mass  spectroscopy would be pretty helpful there. 

 Sean Sanders:  Great! Dr. Janzen, any last thoughts?  Dr. William Janzen:  Yeah. I think the field is actually moving in the directions we would like to 

see it go. One of the biggest challenges we've had has been being able to work with  isolated nucleosomes. There are a couple of small companies now  that  are  starting  up  and  are  beginning  to  produce  recombinant nucleosomes  that work  in  the  ‐‐  it  look  like  they would work at  least  in the AlphaScreen  format.  I think that's going to be a huge help to us all. The antibodies are getting better. 

   One  of  the  other  challenges  we've  had  has  been  the  specificity  of 

methylation,  so  I  think we're  gaining  the  tools  that we need.  The  final thing we need, I think,  is what was asked by a question earlier if we can get down to single cell level of changes. 

 Sean Sanders:  Excellent! Well, we are unfortunately out of time for this webinar, so on 

behalf of myself and our viewing audience, I want to thank our speakers very much for being with us today, Mr. Bill Janzen from the University of North  Carolina  at  Chapel  Hill  and  Dr.  Yan‐Ling  Zhang  from  the  Broad Institute of MIT and Harvard. 

   Please go to the URL now at the bottom of your slide view to learn more 

about  resources  related  to  today's  discussion  and  look  out  for  more webinars from Science available at webinar.sciencemag.org. 

 Slide 50    This  particular webinar will  be made  available  to  you  again  as  an  on‐

demand  presentation  within  about  48  hours  from  now.  We've  very interested to know what you thought of the webinar. Send us an email at the address now up in your slide viewer, webinar@aaas.org. 

   Again, thank you so much to our panel and to PerkinElmer for their kind 

sponsorship of today's educational seminar. Goodbye.  [0:58:25]  End of Audio