Next Generation SequencingNext Generation Sequencing(massively parallel sequencing)(massively parallel sequencing)

Secuenciación =determinar el orden preciso de bases

de NT de ADN (ARN)

Sin necesidad de clonación con PCR

2001Proyecto Genoma

Humano

Secuenciar moléculas de ADN no-modificadas para detectar

mutaciones o realizar de novo assemble de genomas.

TARGETSEQUENCING

WHOLE GENOME

SEQUENCINGvs.WHOLE EXOME

SEQUENCINGvs.

¡¿Qué es NGS?!

• 2da generación.• Simultáneamente se secuencian muchas

(cientos de millones) secuencias cortas.– 25-30pb.

• Es necesario agregar un adaptador a la secuencia.– Primer Universal.

Mutación puntual

Indelcortos

Deleción homocigota

Deleción heterocigota Inserción

Breakpoint de translocación

Alteraciones del Número de Copias

Detección de otra secuencia

Genoma de referencia*

Meyerson M, et al. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nature Reviews Genetics 11,685–696.

Mayor Precisión

• Probabilidad de ERROR: Score de Phred, Q.– Score Phred de Q20: probabilidad de anunciar

(call) una base errónea es 1 en 100, precisión 99%.

90% de la data recaba con plataformas de NGS tiene un score de Phred de 30 o más.

(Q30: 1 en 1000, 99.9%)

El error aleatorio se compensa con la cantidad de lecturas.

Definiciones y Conceptos Útiles

• Coverage• Profundidad• Library• Reads• Call

Procedimientos: conceptos

TARGET SEQUENCING WHOLE GENOME

SEQUENCINGPASO 1: PREPARACION DE LA LIBRERIA1.PCR para amplificar la porción del genoma que nos interesa (PCR MULTIPLEX).2.Generación de los amplicones.

PASO 2: SECUENCIACION 3. Agregar el PRIMER UNIVERSAL.4. Secuenciación.5. BIOINFORMATICA: interpretación de resultados comparando con genoma de referencia.

Shotgun sequencing.

1.Fragmentación aleatoria del ADN.2.Construcción de la librería.3.Secuenciación.4.BIOINFORMATICA: de novo assembly.

Diferencias con SANGER

Secuenciación de GENOMAS: sin necesidad de clonar.Utiliza PRIMERs universales.

Requiere menos (1ng) cantidad de ADN!! Mayor sensibilidad: lee la misma secuencia +

veces.SNP 1-2% de sensibilidad vs. 20% Sanger.

Menor Costo, Más rápido.

Plataformas Comercialmente Disponibles

454 FLX ROCHE 2006Secuenciación por síntesis/pirosecuenciación .

Reads + largas.

HiSeq Illumina 2007 Secuenciación por síntesisLa + usada.

SOLID Life techonologies 2007Secuenciación por ligación y detección de oliNT.

+ Precisa.

PacBio RS Pacific Biosystemis 2010Single molecule real-time seq.

Reads de + 1Kb!

ION TORRENT PGM Life Technologies

2010Medición de H+ liberados durante la síntesis de ADN

EL QUE TENEMOS!

Oxford Nanopore Gridion Oxford Nanopore Tec Ltd

2014Single molecules pasan por una membrana.

Research

Ion Torrent

Ion TorrentIon TorrentSequencing

C T G A

Oden de incorporación: CTGA

Oden de incorporación: CTGA

Sequencing

Sequencing

GENES SUPRESORES TUMORALES

ONCOGENES

Driver mutations: + crecimiento tx.

Passenger mutation: sin efecto en la proliferación tx (hitchhiker mutation)

The Number of “clinically relevant” alterations in a single patient is LOW buried amongst 1,000s of passenger genomic alterations.

MR Stratton et al. Nature 458, 719-724 (2009) doi:10.1038/nature07943

The lineage of mitotic cell divisions from the fertilized egg to asingle cell within a cancer showing the timing of the somatic mutationsacquired by the cancer cell and the processes that contribute to them.

Alteraciones moleculares del CANCER

1. Alteraciones en el número de copias– amplificación ERBB2, pérdida homocigota PTEN

1. Sustituciones– BRAF p.V600E, IDH1 p.R132H, TP53 p.R213

1. Inserciones y deleciones – EGFR e19 inserción, ERBB2 e20 inserción

• Rearreglos– FGFR3-TACC3, EML4-ALK1, SSX1-SYT

¿Qué Alteración Buscamos ?

• Actionable o interesantes– research ?– decisión terapeu’tica?

• Conocidas vs. Desconocidas

Selección de la “library”

IONTORRENT

•Hay muchos paneles de genes.•Se pueden customizar.

Aplicaciones en Medicina

• Detección de enfermedades hereditarias muy infrecuentes. – Whole genome sequencing or whole exome

sequencing de los padres y el hijo afectado (elimina necesidad de pedrigree grande).

• Microbiología– Paneles de detección de múltiples

microorganismos rápidos.

Aplicaciones en Cáncer

• Predicción de la respuesta a tratamientos convencionales.– Limited to date but genomic signatures for platinin and taxane.

• Predicción de respuesta a Targeted Therapies. – Main role.

• Predicción de respuesta Immunotherapies.– Total Mutational Burden (TMB), MSI, InterferonSignature, PD-

L1 Amplification (rare).• Predicción de Toxicidad (Germline Status).

– Cytochrome p450 (2D6, others), UGT1A1 (others).• Determinación del Sitio de Origen en Metástasis de origen

incierto.– Not a primary purpose, Many examples (TMPRSS-ERG, Sarcoma

fusions, others).

Consideraciones Fundamentales

• El tx es un conjunto de células heterogéneas:– células neoplásicas que tienen alteraciones somáticas

y germinales, – células normales (fibroblastos, ce. endoteliales).

• Con NGS se muestrean los alelos muchísimas veces… Se flanquea el “ruido”, y aparecen variantes infrecuentes 1-2%.

Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE)– baja calidad y cantidad… Librería subóptima!

Existen Guías Internacionales

• Opportunities and challenges with clinical diagnostic genenome sequencing: a report of the Association for molecular pathology (AMP).

• Assuring the quality of NGS in clinical laboratory practice. Centers for disease control and prevention (CDC).

• American College of Medical Genetics (ACMG) clinical laboratory standards for NGS.

• Genome analysis resource guide (CAP).

Biopsia Líquida y NGS

• Definiciones:– CTC: circulating tumor cells – cfDNA: cell-free DNA – ctDNA: circulating tumor DNA

“Significant “threat” to the future role of general anatomic pathology in the

management of cancer patients.” USCAP 2016.

Indicaciones ACTUALES de Bx Líquida

• Unavailable tissue in any location• Recurrent disease requiring a new biopsy that

could be harmful to the patient• Detection of specific therapy resistance

associated genomic alterations• EGFR T790M test now FDA approved for AZ’s

osimertinib (TagrissoTM)• Monitoring disease based on specific genomic

alterations

Bioinformática =Interpretación de los resultados

PASOS:

1.Convertir la señal cruda en una secuencia de NT.

2.Alignment del sequence read al genoma de referencia.

3.Calling de la variante genómica.

4.Interpretación de las variantes.

5.Almacenamiento de la información.**

Bioinformática →Convertir el resultado en información útil

Qué informar ?

Errores Ocurren

Conocer las limitaciones de

esta tecnología.

Para evitar errores

• Careful validation.• Know your settings. • Guided manual review.• Continuous quality monitoring.• Active communication.• “Fingerprinting”.• Paired germline sample.

Alteraciones «actionable» (target molecular) vs. «no accionables»

• Actionable: el resultado de NGS implica una decisión terapéutica específica. – On label and on target – On target but off indication – On indication but off target

• Drug on the market vs available only in a clinical trial

Alteraciones Somáticas vs. Germinales

• NGS assays performed on tumor tissue alone are not designed to function as surrogates for approved germline DNA sequencing tests.

• Germline status can be predicted from computational algorithms focused on the somatic DNA sequence.

• However, these findings can only be used to guide future germline testing for confirmation and ideally should not be used to guide genetic counseling of the patients and their families.

Medicina de Precisión vs. Medicina Basada en la Evidencia

NGS y Neoplasia de Origen Incierto

Costos / Ganancias de la Industria

Caso Clínico

• Turno de Tere!!

Reflexiones Finales

• Estamos en la era de la POS-GENOMICA.

• El conocimiento de la genésis de los tx está creciendo exponencialmente, y con ella el advenimiento de nuevas tecnologías.

• NGS representa la tecnología + avanzada para el dx de alteraciones morfológicas.

Bibliografía

• Meyerson M, et al. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nature Reviews Genetics 11,685–696.

• Bartlett J, Abeer S, Schmitt F. Molecular Pathology with Online Resource: A Practical Guide for the Surgical Pathologist and Cytopathologis. Cambridge, 2015.

• Rosenberg A, et al. High-Throughput Microdissection for NextGeneration Sequencing. PLoS One. 2016; 11(3): e0151775.

• Gord D, et al. Do Circulating Tumor Cells, Exosomes, and Circulating Tumor Nucleic Acids Have Clinical Utility? A Report of the Association for Molecular Pathology. The Journal of Molecular Diagnostics 2015, 17 (3).

• Schrijver I, et al. Opportunities and Challenges Associated with Clinical Diagnostic Genome Sequencing A Report of the Association for Molecular Pathology. JMD 2012, 14 (6).