northen blots
TRANSCRIPT
-
7/30/2019 northen Blots
1/25
NORTHEN BLOTS
Tri Novia Kumalasari
20112508059
-
7/30/2019 northen Blots
2/25
History/Background
Spawned naming of related techniques:
Southern blot
(DNA)
Northern blot
(RNA)
Western blot
(Protein)
Eastern blot
(Pasca translasi protein
-
7/30/2019 northen Blots
3/25
Blot adalah suatu teknikmemindahkan bagian protein
yang telah dipisahkan, RNA
atau DNA dari gel ke lembarantipis atau matriks membran
agar.
Sumber: http://id.shvoong.com/t
ags/northern-blot/#ixzz2EJ9TtAnA
http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/ -
7/30/2019 northen Blots
4/25
Northern blottingbertujuan mendeteksi
sequences RNA,
disebut Northern karena RNA dianggap
merupakan bayangan berlawanan dari
DNA.
Northern blottingjuga dapat dilakukanoleh prosedurpolymerase chain reaction(PCR) dengan memakai ensim reversetranscriptase
-
7/30/2019 northen Blots
5/25
Northern Blotting digunakan dalam riset
biologi molekular untuk:
- pendeteksian mRNA ukuran catatan
- studi RNA penurunan(pangkat,derajad)
- studi RNA dapat mendeteksi sebagai
alternatif menyambung - studi RNA umur-paruh
- studi untuk memindahkan kemungkinan
RNA dan cistron translasi.
- sering digunakan untukmengkonfirmasikan dan memeriksa
transgenik binatang
-
7/30/2019 northen Blots
6/25
Tahapan :
Tahap pertama prosedur tersebut adalah
migrasi molekul asam nukleat pada gel
agarosa.
. Ekstraksi RNA dipisahkan dengan
menggunakan elektrophoresis
Pita-pita untai tunggal RNA, kemudian
dipindahkan ke membran nilon atau
nitroselulosa seperti halnya pada
hibridisasi koloni.
-
7/30/2019 northen Blots
7/25
Begitu asam nukleat dipindahkan ke
membran, tahap-tahap selanjutnya pada
kedua prosedur skrining tersebut sama,
yaitu fiksasi asam nukleat pada membran,
hibridisasidengan pelacak, pencucian sisa
pelacak, dan deteksi fragmen yang
mengalami hibridisasi menggunakan
autoradiografi.
-
7/30/2019 northen Blots
8/25
Di antara tahap-tahap tersebut kondisi hibridisasi
merupakan faktor yang paling memerlukan perhatian.
Jika antara pelacak dan sekuenstarget terdapat homologi yang
sangat tinggi (mendekati atau sama dengan 100%), makadapat
diberlakukan kondisi hibridisasi yang ketat, yaitu
dengan suhu hibridisasi tinggi
dan konsentrasi garam rendah pada bufer hibridisasi.
Sebaliknya, jika sekuens pelacak tidak terlalu homolog dengan
sekuens target, maka ketetatan kondisi hibridisasi harus
diturunkan sampai pada tingkatan yang memungkinkan
terbentuknya hibrid-hibrid yangkurang sempurna.
Namun, jika keketatannya diturunkan terlalu banyak, fragmenpelacak
mungkin akan berikatan dengan sekuens-sekuens lain yang
tidak spesifik.
-
7/30/2019 northen Blots
9/25
Northen Blotting
-
7/30/2019 northen Blots
10/25
Penggambaran
Teknik NorthenBlotting
-
7/30/2019 northen Blots
11/25
Capsella rubella ? copies of gene X
extract
RNA
Example Looking for Gene X
-
7/30/2019 northen Blots
12/25
Step 1. Restriction Enzyme Digestion
-
7/30/2019 northen Blots
13/25
Step 2. Gel Electrophoresis
_+
-
7/30/2019 northen Blots
14/25
Step 4. Transfer RNA to Membrane
Two methods for transferring RNA to a
membrane
capillary
electrophoretic
-
7/30/2019 northen Blots
15/25
Step 5. Making a Probe
Arabidopsis thaliana 2 copies of gene X
-
7/30/2019 northen Blots
16/25
Step 6. Pre-hybridization
Prehybridization buffers
mengandung blocking reagents
t
-
7/30/2019 northen Blots
17/25
Step 7. Hybridization
-
7/30/2019 northen Blots
18/25
Step 8. Washes
-
7/30/2019 northen Blots
19/25
Step 9. Anti-DIG
-
7/30/2019 northen Blots
20/25
Step 10. Washes
-
7/30/2019 northen Blots
21/25
Step 11.
-
7/30/2019 northen Blots
22/25
Step 12. Detection
Detesi sesuai tujuan
melakuan Northen
blotting
Beberapa hal yang
-
7/30/2019 northen Blots
23/25
Beberapa hal yangmembedakan dengan Southernblotting adalah
: (1) RNA jauh lebih rentan terhadapdegradasi dibanding DNA, oleh karenaitu elektroforesis dilakukan dalam buferyang mengandung zat kimia yang
bersifat melindungi (biasanyaformaldehid),
(2) RNA sudah berupa untai tunggaldan membutuhkan kondisi denaturasi
yang lebih ringan
-
7/30/2019 northen Blots
24/25
(3) RNA biasanya berukuran tertentusehingga tidak memelukan digestienzim untuk memperoleh pola pita.Kedua prosedur sangat mirip karena
setelah elektroforesis RNA jugaditransfer ke membran melalui difusikapilaritas. Biasanya sinarUVdigunakan untuk mengikat
(crosslink) RNA pada membransehingga tidak bergerak (imobilisasi).
-
7/30/2019 northen Blots
25/25
Terima Kasih