This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Über die Zusammensetzung der pigmenthaltigen Strukturen des Purpurbakteriums Rhodopseudomonas spheroides

R . S C H M I T Z

Botanisches Institut der Universität zu Köln ( Z . Natur forschg . 22 b , 6 4 5 — 6 4 8 [1967 ] ; e i n g e g a n g e n am 21 . O k t o b e r 1966)

Thylakoids isolated from the purple bacterium Rhodopseudomonas spheroides were examined with regard to the amino acid composition of their structural proteid and the fatty acid composition of their ether soluble lipids. The fatty acid composition was nearly identical with that of the ether soluble lipids from whole cells. The main component was cis-vaccenic acid. Mono-unsaturated and saturated fatty acids with 18 and 16 C-atoms were dominating. After extraction of the lipids and washing of the thylakoids with NaCI and NaOH solutions, there remained at least two protein fractions and these could be separated by phenol-water at 65 °C. The amino acid composi-tion of the structural proteid was similar to that of the structural proteids from thylakoids of Oscil-latoria, Chlorella and green higher plants.

Seit es gelang, aus den photosynthetisch aktiven Purpurbakterien pigmenthaltige Strukturen zu iso-lieren 1 _ 3 , sind vor allem die Athiorhodaceen elek-tronenmikroskopisch 4 _ 1 6 , chemisch und physika-lisch 1 7 - 2 2 sowie auch serologisch23 auf den Bau ihrer Zellstrukturen hin untersucht worden. Dabei erwiesen sich die sogenannten Chromatophoren der Purpurbakterien in morphologischer Hinsicht als verwandt mit den Thylakoiden der Chloroplasten ' und Blaualgen24. Im folgenden wird gezeigt, daß auch in der chemischen Zusammensetzung der Thyla-koide aus Rhodopseudomonas spheroides und der-jenigen anderer bisher analysierter Thylakoide eine gewisse Ähnlichkeit besteht. Dabei sollen hauptsäch-lich die Aminosäuren-Zusammensetzung des Struk-turproteids und die Fettsäuren-Zusammensetzung der ätherlöslichen Lipide betrachtet werden. Zum Ver-gleich wurden auch Analysen an unaufgeschlossenen

1 A. B . P A R D E E , H. K. SCHACHMAN, and R . Y. STANIER, Nature [London] 169,282 [1952].

2 H. K. SCHACHMAN, A. B. P A R D E E , and R. Y. STANIER, Arch. Biochem. 38,245 [1952].

3 J . B. T H O M A S , Proc. Kon. Ned. Akad. Wet. C 55, 207 [1952],

4 P . F . E L B E R S , K. M I N N A E R T , and J . B . T H O M A S , Acta bot. neerl. 6,345 [1957].

5 A. E. V A T T E R and R. S . W O L F E , J. Bacteriol. 75, 480 [1958], 6 G . C O H E N - B A Z I R E and R . K U N I S A W A , J . Cell Physiol. 1 6 , 4 0 1

[ 1 9 6 3 ] . 7 G . D R E W S U. P. GIESBRECHT, Zbl. Bakteriol. Parasitenk. 1 9 0 ,

5 0 8 [ 1 9 6 3 ] . 8 H. Low and B. A F Z E L I U S , Exp. Cell Res. 35, 431 [1964]. 9 G . D R E W S U. P. GIESBRECHT, Arch. Mikrobiol. 52, 242 [1965].

1 0 S . P. G I B B S , W . R. S ISTROM, and P. B. W O R D E N , J. Cell Biol. 2 6 , 3 9 5 [ 1 9 6 5 ] .

11 K. D. G I B S O N , J. Bacteriol. 90, 1059 [1965].

Bakterienzellen und weiteren Zellfraktionen aus-geführt.

Material und Methoden

Anzucht der Bakterien

Rhodopseudomonas spheroides van Niel wurde anaerob in 5-/-Glasgefäßen bei 30 ° C und ca. 3000 Lux Dauerbeleuchtung (Glühlampen) angezogen. Die Nähr-lösung wurde nach einer Vorschrift von WIESSNER 25 an-gesetzt. Die mit Reinststickstolf belüfteten Kulturen wurden nach jeweils 21/2 Tagen geerntet.

Isolierung der Thylakoide

In flüssigem Stickstoff eingefrorene Bakterien wur-den in einer Hughes-Presse unter 10,5 Tonnen bei tie-fer Temperatur durch einen schmalen Spalt gepreßt. Das Homogenat wurde bei 4 ° C in m/15-Phosphatpuf-fer PH 7,0 — 7,2 verrührt und die stark viskose Flüssig-keit einer fraktionierten Zentrifugation unterworfen:

12 D. D. HICKMAN and A. W . F R E N K E L , J. Cell Biol. 25, 261 [1965].

13 D. D. HICKMAN and A. W . F R E N K E L , J. Cell Biol. 25, 279 [1965],

1 4 S . C. H O L T and A. G. M A R R , J. Bacteriol. 89, 1402 [1965]. 1 5 S . C. H O L T and A. G. M A R R , J. Bacteriol. 89, 1413 [1965]. 1 6 S . C. H O L T and A. G. M A R R , J. Bacteriol. 89, 1421 [1965]. 1 7 M . J. BULL and J. LASCELLES, Biochem. J. 87, 15 [1963]. 18 C. B R I L , Dissertation, Utrecht 1964. 19 P. B. W O R D E N and W . R. SISTROM, J. Cell Biol. 23, 135

[1964]. 20 K. D. GIBSON, Biochemistry 4, 2027 [1965]. 21 K. D. GIBSON, Biochemistry 4, 2042 [1965] , 22 K. D. GIBSON, Biochemistry 4, 2052 [1965]. 23 J. B. NEWTON, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 42,

34 [I960], 2 4 W . M E N K E , Ber. dtsch. bot. Ges. 1964 Bd. LXXVII, 340

[1965]. 2 5 W . W I E S S N E R , Flora [Jena] 149, 2 [I960].

Homogenat 10 Min 25 000 g

g/100 g Trockensubstanz Thylakoide Zellen

Sediment verworfen

Überstand 60 Min. 25 000 g

Sediment verworfen

Uberstand 90 Min. 80 000 g

Sediment Überstand mehrmals mit Wasser nach Fällung mit Trichlor-nachgewaschen essigsäure

1 mit Methanol und Äther Thylakoide gewaschen

und getrocknet; nach salzsaurer Hydrolyse Bestimmung der Amino-säuren

Die salzfreien Thylakoide wurden gefriergetrocknet. Aus 100 g zentrifugenfeuchten Bakterien, die etwa 20 g gefriergetrockneten Zellen entsprachen, wurden 600 bis 700 mg wasserfreie Thylakoide erhalten.

Chemische Verfahren

Die analytischen Bestimmungen erfolgten weitgehend nach den bereits früher angegebenen Vorschriften 26, 27.

Der Gehalt an Bakteriochlorophyll wurde in Metha-nolextrakten colorimetrisch bei 772 m/u gemessen 28.

Tryptophan wurde nach S P I E S and C H A M B E R S 29 er-mittelt.

Ergebnisse

Die wasserfreien Thylakoide enthielten 53% Pro-tein, 36,5% ätherlösliche Lipide, 1,6% in Methanol und Äther unlösliche Kohlenhydrate sowie einen Rest unbekannter Stoffe, die z. T. in Methanol lös-lich, in Äther jedoch unlöslich waren (Tab. 1).

Der Gehalt der Thylakoide an Bakteriochlorophyll betrug 7,3%, derjenige unaufgeschlossener Zellen nur 3,0 Prozent. Wenn man annimmt, daß Chloro-phyll ausschließlich in den Thylakoiden vorkommt, entfielen 41% des Trockengewichts der Zelle auf Thylakoide. Von den ätherlöslichen Zell-Lipiden waren dann 84% in den Thylakoiden lokalisiert. 47% der ätherlöslichen Thylakoid-Lipide wurden nach Verseifung als Fettsäuren mit 14 und mehr

Gesamtstickstoff 9,3 ± 0,2 11,2 ± 0,2 Gesamtkohlenhydrate 3,5 ± 0,1 7,8 ± 0,2 Gesamtphosphor 1,44 ± 0,01 1,91 ± 0,01 Gesamtasche 5,3 ± 0,4 6,7 ± 0,3 In Methanol-Äther lösliche Stoffe 39,6 ± 0,8 20,1 ± 0,5

hiervon ätherlöslich 36,5 ± 0,3 17,9 ± 0,4 Bakteriochlorophyll 7,3 ± 0 , 2 2,96 ± 0,02 Fettsäuren (ab 14C-Atome) 17 ± 1 8,7 ± 0,3

In Methanol-Äther unlös-liche Stoffe 60.4 ± 0,8 79,9 ± 0,5

Stickstoff 8,80 ± 0,07 —

Protein (N • 6,0) 53 —

Kohlenhydrate 1,6 ± 0 , 1 —

Phosphor 0,38 ± 0,01 Asche 2,4 ± 0,2

In N a C l - N a O H lösliche Stoffe 24 —

In N a C l - N a O H unlös-liche Stoffe 36 —

mit Methanol aus der phenolischen Phase aus-fällbar 15 —

lösl. in wäßriger Phase 2 —

unlösl. Strukturproteid 15 —

Tab. 1. Zusammensetzung isolierter Thylakoide und unauf-geschlossener Zellen von Rhodopseudomonas spheroides.

( — nicht untersucht.)

Kohlenstoffatomen gefunden; das waren 80% aller höheren Fettsäuren der Zelle.

Die Fettsäuren-Zusammensetzung der ätherlös-lichen Thylakoid-Lipide entsprach fast genau der-jenigen der ätherlöslichen Zell-Lipide (Tab. 2 ) . Die Hauptkomponente wurde als cw-zl11-Octadecensäure (czs-Vaccensäure) identifiziert. Diese Befunde stim-men mit Ergebnissen anderer Autoren 3 0 - 3 3 überein. Bei einer zu fast 7% vorkommenden Fettsäure han-delt es sich möglicherweise um eine verzweigtkettige gesättigte Säure mit 19 Kohlenstoffatomen, soweit sich das aus Retentionszeiten abschätzen läßt. Der Quotient gesättigte Fettsäuren / ungesättigte Fett-säuren betrug für die Thylakoide wie für die Zelle jeweils 0,3.

Die Aminosäuren-Zusammensetzung der lipid-freien Thylakoide war zwar derjenigen der Gesamt-zelle ähnlich, wies jedoch einige Unterschiede auf

26 R. SCHMITZ, Arch. Mikrobiol. 56, 225 [1967]. 27 R. SCHMITZ, Arch. Mikrobiol. 56, 238 [1967]. 28 J. H. C . S M I T H and A. B E N I T E Z , in: „Moderne Methoden der

Pflanzenanalyse" Bd. IV, 142, Verlag Springer, Berlin-Göttingen-Heidelberg 1955.

29 J. R. S P I E S and D. C . C H A M B E R S , Analytic. Chem. 2 1 , 1249 [1949],

30 G. SCHEUERBRANDT and K. BLOCH, J . biol. Chemistry 2 3 7 , 2064 [1962].

3 1 R . V . H A R R I S , B. J . W O O D , and A . T . J A M E S , Biochem. J . 9 4 , 22 P [1965].

32 B. J . B. W O O D , B. W . NICHOLS, and A. T . J A M E S , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 106,261 [1965].

33 A. R . HANDS and W. B A R T L E Y , Biochem. J . 8 4 , 238 [1962].

Kohlenstoffzahl Gew.-Thylakoide Zelle

14 :0 Spur Spur 14:1 Spur Spur 16 :0 4,58 ± 0,05 5,0 ± 0 , 4 16:1 2,1 ± 0 , 1 2,41 ± 0,06 17 :0 verzw. ( ?) Spur Spur 17 :0 Spur Spur 18 :0 9,7 ± 0 , 5 9,7 ± 0 , 4 18:1 76,8 ± 0 , 8 76,6 ± 0 , 7 19 :0 verzw. ( ?) 6,8 ± 0 , 4 6,37 ± 0,06

Tab. 2. Fettsäuren-Zusammensetzung ätherlöslicher Lipide aus Rhodopseudomonas spheroides.

(Abb. 1). 40% der lipidfreien Thylakoide ließen sich mit Natriumchlorid-Lösungen und verdünnter Natronlauge (bis pn 11,0) auswaschen. Aus den ver-einigten Extrakten wurden die Proteine mit Trichlor-essigsäure ausgefällt, mit Methanol und Äther ge-trocknet und auf ihre Aminosäuren-Zusammenset-zung hin untersucht (Abb. 2). Besonders auffallend ist der hohe Gehalt an Alanin. Der mit Salz- und Laugenlösungen nicht auswaschbare Rüdestand wurde in der Wärme einer Phenol-Wasser-Behand-lung unterworfen. Dadurch wurde die Substanz wie-derum fraktioniert: 42% konnten mit einem Über-schuß an Methanol aus der phenolischen Phase aus-gefällt werden, weitere 42% verblieben als in Wasser und Phenol unlöslicher Rüdestand und nur der re-lativ geringe Rest wurde in der wäßrigen Phase an-getroffen. Durch die Phenolbehandlung stieg der Stickstoffgehalt von 14,3% auf 15,5% im phenol-löslichen Anteil bzw. auf 15,7% im unlöslichen Rück-stand. Der Kohlenhydratgehalt fiel von 1,3% nur unwesentlich auf 0,9% im unlöslichen Rüdestand.

Mol °/o 16-

14-

12-

10-

Ii

Amino- Amino- Amino- M o l - % säure säurereste säure der

Aminosäure in 100mg in 100 mg stick- Amino-Präparat Präparat stoff säuren

[ / /Mol] [mg] [%] Glycin 76,7 4,4 6,8 9,06 ± 0,06 Alanin 115,7 8,2 10,3 13,67 ± 0,08 Valin 61,6 6,1 5,5 7,27 ± 0,05 Leucin 79,6 9,0 7,1 9,4 ± 0,2 Isoleucin 39,3 4,5 3,5 4,64 ± 0,03 Serin 38,2 3,3 3,4 4,5 ± 0,1 Threonin 42,9 4,3 3,8 5,06 ± 0,05 Cystin 2,6 0,53 0,46 0,30 ± Methionin 18,7 2,5 1,7 2,21 ± 0,05 Prolin 52,9 5,1 4,7 6,3 ± 0,1 Phenylalanin 41,0 6,0 3,7 4,85 ± 0,09 Tyrosin 23,9 3,9 2,1 2,82 ± 0,09 Tryptophan 15,5 2,9 2,8 1,8 ± 0 , 1 Asparagin-säure ± Asparagin 65,0 7,5 5,8 7,67 ± 0,05 Glutamin-säure ± Glutamin 77,9 10,1 6,9 9,2 ± 0 , 2 Arginin 46,1 7,2 16,5 5,45 ± 0,02 Lysin 31,8 4,1 5,7 3,75 ± 0,04 Histidin 17,5 2,4 4,7 2,07 ± 0,04 Amide 39,9 3,6 4,7 ± 0 , 3

846,9 92,0 99,1 100 (ohne (ohne (mit (ohne

Amide) Amide) Amid-N) Amide)

Gly Ala Val Leu Dleu Ser Thr Met Pro Phe Tyr Asp Glu Arg Lys His

Abb. 1. Aminosäuren-Zusammensetzung salzsaurer Hydrolysate von Rhodopseudomonas spheroides. • Zelle, |///| Zentrifuga-tions-Uberstand zum Thylakoidsediment, • lipidfreie Thyla-

koide. In Mol-% der aufgeführten Aminosäuren.

Tab. 3. Aminosäuren-Zusammensetzung des unlöslichen Struk-turproteids aus Thylakoiden von Rhodopseudomonas spheroi-des. Das Präparat enthielt 15,7 ±0,07% Stickstoff, 0,9 + 0,1%

Kohlenhydrate und 1,9 ±0,2% Asche.

Die Aminosäuren-Zusammensetzung der verschiede-nen bei der Isolierung des Strukturproteids aus den Thylakoiden angefallenen Proteinfraktionen ist in Abb. 2 wiedergegeben. Wie aus dieser Abbildung zu entnehmen ist, waren das Präparat vor der Phe-nol-Wasser-Behandlung, die in Phenol lösliche Frak-tion und der unlösliche Rüdestand, der definitions-gemäß als das eigentliche Strukturproteid aufzufas-sen ist, in ihrer Aminosäuren-Zusammensetzung ähnlich. Dennoch sind deutliche Unterschiede wahr-zunehmen, welche sich absichern lassen. Daraus folgt, daß am Aufbau der Thylakoidmembran zumindest zwei Proteinfraktionen beteiligt waren, die sich mit Natriumchlorid-Lösungen und verdünnter Natron-lauge nicht auswaschen ließen und zusammen etwa 60% der lipidfreien Thylakoidsubstanz ausmachten. Die Phenol-Wasser-Behandlung bewirkte eine Auf-trennung des Proteingemisches. Berücksichtigt man, daß ein großer Proteinanteil sich mit Salz- und Laugenlösungen auswaschen ließ und eine anders-artige Aminosäuren-Zusammensetzung aufwies, so waren insgesamt drei oder mehr Proteinhauptkom-

Mol 7„ 20-

18-

16-

14-

12-

10-

8 -

6 -

U-

2 -

Gly Aia Val Leu Dleu Ser Thr Met Pro Phe Tyr Asp Glu Arg Lys His

Abb. 2. Aminosäuren-Zusammensetzung salzsaurer Hydrolysate aus Thylakoiden von Rhodopseudomonas spheroides. In Mol-% der aufgeführten Aminosäuren. Für jede Aminosäure von links nach rechts: 1. lipidfreie Thylakoide (schwarz), 2. Tri-chloressigsäure-Fällung des NaCl-NaOH-Extraktes (schwarz), 3. Proteid vor Phenol-Wasser-Behandlung (schraffiert), 4. phe-nollösliches Protein (schraffiert), 5. unlösliches Strukturpro-

teid nach Phenol-Wasser-Behandlung (schraffiert).

ponenten am Aufbau der Thylakoidmembran be-teiligt.

Zur Prüfung auf Verunreinigungen wurden die isolierten Thylakoide einer elektronenmikroskopi-schen Kontrolle unterzogen 34. Dabei konnten nahe-zu keine partikulären Fremdbestandteile nachgewie-sen werden. Um Zellwandbruchstücke ausschließen zu können, wurde weiterhin nach der wandspezifi-schen a,£-Diaminopimelinsäure gesucht 26. Während in 100 mg Zellen 2,8 //Mol dieser Säure vorkamen, wurden in den isolierten Thylakoiden allenfalls Spu-ren davon entdeckt. Aminosäurenanalysen deuten daraufhin, daß auch lösliche Zellproteine nur in be-schränktem Umfang in Betracht kommen, da die Aminosäuren-Zusammensetzung des zum Thylakoid-sediment gehörenden Zentrifugationsüberstand sich deutlich von derjenigen isolierter Thylakoide unter-schied (Abb. 1). Ribosomale Verunreinigungen dürften nur in geringen Mengen beteiligt sein, da die lipidfreien Thylakoide nur 0,4% Phosphor und nur 1,6% Kohlenhydrate enthielten (Tab. 1).

34 Für die elektronenmikroskopische Untersuchung der iso-lierten Thylakoide bin ich Herrn Prof. Dr. W. M E N K E ZU Dank verpflichtet.

33 A. R A D U N Z . Flora [Jena] 157,131 [1966], 36 E. L E V I N , W. J. L E N N A R Z , and K . BLOCH, Biochim. biophysica

Acta [Amsterdam] 84,471 [1964].

Diskussion

Bei einem Vergleich der vorgelegten Befunde mit Analysendaten, die an pigmenthaltigen Strukturen aus anderen photosynthetisch aktiven Organismen gewonnen wurden 26-27 '35 , fällt zunächst die ab-weichende Zusammensetzung des Fettsäurengemi-sches auf. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren, wie man sie in den Chloroplasten und in den Thyla-koiden der blaugrünen Alge Oscillatoria gefunden hat, treten nicht auf. Insofern besteht eine Ähnlich-keit mit den Chromatophoren des grünen Schwefel-bakteriums Chlorobium thiosuljatophilum. Im Ver-gleich zu den Verhältnissen bei Chlorobium ist je-doch die Fettsäuren-Hauptkomponente um eine C2-Einheit verlängert. Für die Ausbildung des Lamel-larsystems scheint ein gewisser Spielraum in der Auswahl der Fettsäuren zu bestehen, so daß diese selbst innerhalb relativ eng begrenzter pflanzen-systematischer Gruppen, wie im Falle der blau-grünen Algen3 6 '3 ' variieren können.

Was die Aminosäuren-Zusammensetzung des Strukturproteids betrifft, so läßt sich trotz Abwei-chungen bei einzelnen Aminosäuren eine weit-gehende Übereinstimmung mit den Strukturprotei-den pigmenthaltiger Strukturen aus anderen photo-synthetisch aktiven Organismen feststellen (höhere grüne Pflanzen, Grünalge Chlorella38, blaugrüne Alge Oscillatoria 2 6) . Ob sich auch das grüne Schwe-felbakterium Chlorobium thiosuljatophilum27 hier ohne Schwierigkeiten einreihen läßt, ist noch nicht sicher. Einen interessanten Parallelfall stellt die ver-gleichende Studie am unlöslichen Mitochondrien-Protein dar 39.

Herrn Prof. Dr. W. M E N K E danke ich für die The-menstellung und sein Interesse am Fortgang der Arbeit. Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n -s c h a f t und dem L a n d e s a m t f ü r F o r s c h u n g des Landes Nordrhein-Westfalen sei für ihre Unter-stützung gedankt.

3 7 R . W . HOLTON, H . H . BLECKER, and M . O N O R E , Phytochemi-stry 3.595 [1964].

38 P. W E B E R , Z . Naturforschg. 17 b, 683 [1962]. 3 9 R . K . BURKHARD and D . H . KLAASSEN, Comparat. Biochem.

Physiol. 18. 231 [1966].