PENGARUH PENAMBAHAN SORBITOL TERHADAP STABILITAS

ENZIM SELULASE DARI Rhizopus oligosporus

(Skripsi)

Oleh

Fifi Adriyanthi

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2017

ABSTRACT

THE EFFECT OF ADDITION SORBITOL TOWARD STABILITY OF

CELLULASE FROM Rhizopus oligosporus

By

Fifi Adriyanthi

This research was conducted to determine the stability of the enzyme before and

after the addition of sorbitol compound cellulase enzyme from Rhizopus

oligosporus using the polyol compound sorbitol. Scope of this reseach were

including production, isolation, purification, addition of additives using sorbitol

with a concentration of 0.5; 1.0; 1.5 M and characterization of purified cellulase

enzymes before and after sorbitol addition. The result showed that the purified

enzyme has a specific activity 35,2038 U/mg or increase for 10 times than crude

extract enzyme which has specific activity 3,48078 U/mg respectively. The

purified enzyme have some characteristics are optimum reaction reach at pH 5,5;

temperature 65oC; KM = 18,69 mg/mL; Vmax = 0,856 μmol/mL.min. A thermal

stability test for 60 min at a temperature of 65oC of cellulase enzyme has ki =

0,043 min-1

; t1/2 = 16,11 min and ΔGi = 98,77 kJ/mol. The enzyme after addition

of sorbitol has the same pH and temperature as the purified enzyme. Enzyme

kinetics data after addition of sorbitol 0.5 M were obtained KM = 17,37 mg/mL;

Vmax = 0,596 μmol/mL.min; ki = 0,039 min-1

; t1/2 = 17,76 min and ΔGi = 99,32

kJ.mol-1

. Enzyme kinetics data after addition of sorbitol 1 M were obtained KM =

14,72 mg/mL; Vmax = 0,342 μmol/mL.min; ki = 0,031 min-1

; t1/2 = 22,35 min and

ΔGi = 99,65 kJ/mol. Enzyme kinetics data after addition of sorbitol 1,5 M were

obtained KM = 11,32 mg/mL; Vmax = 0,223 μmol/mL.min; ki = 0,029 min-1

; t1/2 =

25,66 min and ΔGi = 100,23 kJ/mol. Based on the decrease of ki values, increase

of t1/2 and ΔGi, are known that enzyme after addition sorbitol can increase the

stability of cellulase from Rhizopus oligosporus.

Key words : Rhizopus oligosporus, cellulase, additives, sorbitol

ABSTRAK

PENGARUH PENAMBAHAN SORBITOL TERHADAP STABILITAS

ENZIM SELULASE DARI Rhizopus oligosporus

Oleh

Fifi Adriyanthi

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh penambahan sorbitol

terhadap kestabilan enzim selulase dari Rhizopus oligosporus menggunakan

senyawa poliol yaitu sorbitol. Adapun tahapan yang dilakukan dalam penelitian

ini meliputi : produksi, isolasi, pemurnian, penambahan zat aditif menggunakan

sorbitol dengan konsentrasi 0,5; 1; 1,5 M dan karakterisasi enzim selulase

sebelum dan setelah penambahan sorbitol. Hasil penelitian menunjukkan bahwa

aktivitas spesifik enzim selulase tanpa sorbitol 35,2038 U/mg, meningkat 10 kali

dibandingkan dengan ekstrak kasar enzim yang mempunyai aktivitas spesifik

3,48078 U/mg. Enzim selulase tanpa sorbitol mempunyai pH optimum 5,5; suhu

optimum 65oC; KM = 18,69 mg/mL substrat; Vmaks = 0,856 μmol/mL.menit. Uji

stabilitas termal selama 60 menit pada suhu 65oC enzim selulase mempunyai nilai

ki = 0,045 menit-1

; waktu paruh (t1/2) = 15,40 menit dan ΔGi = 98,65 kJ/mol.

Enzim setelah penambahan sorbitol mempunyai pH dan suhu optimum yang sama

dengan enzim tanpa sorbitol. Data kinetika enzim setelah penambahan sorbitol 0,5

M diperoleh KM = 17,37 mg/mL, substrat dan Vmaks = 0,596 μmol/mL.menit, t1/2 =

19,80 menit, ki = 0,035 menit dan ΔGi = 99,32 kJ/mol. Data kinetika enzim

setelah penambahan sorbitol 1 M diperoleh KM = 14,72 mg/mL, substrat dan

Vmaks = 0,342 μmol/mL.menit, t1/2 = 22,35 menit, ki = 0,031 menit dan ΔGi =

99,65 kJ/mol. Data kinetika enzim setelah penambahan sorbitol 1,5 M diperoleh

KM = 11,33 mg/mL, substrat dan Vmaks = 0,223 μmol/mL.menit, t1/2 = 27,72 menit,

ki = 0,025 menit dan ΔGi = 100,23 kJ/mol. Berdasarkan penurunan nilai ki,

peningkatan waktu paruh (t1/2) dan nilai ΔGi, diketahui bahwa enzim setelah

ditambahkan senyawa aditif menggunakan sorbitol dapat meningkatkan stabilitas

enzim selulase dari Rhizopus oligosporus.

Kata kunci : Rhizopus oligosporus, selulase, zat aditif, sorbitol

PENGARUH PENAMBAHAN SORBITOL TERHADAP STABILITAS

ENZIM SELULASE DARI Rhizopus oligosporus

Oleh

Fifi Adriyanthi

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar

SARJANA SAINS

Pada

Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDARLAMPUNG

2017

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Simpang Perikanan pada tanggal 9 Januari

1996, sebagai anak pertama dari tiga bersaudara putri dari Bapak

Endang Carmin dan Ibu Rusmiati.

Jenjang Pendidikan diawali dari Sekolah Dasar (SD) di SDN 3 Way Tuba, Way

Kanan dan diselesaikan pada tahun 2006. Sekolah Menengah Tingkat Pertama di

SMPN 3 Way Tuba, Way Kanan diselesaikan pada tahun 2009 dan Sekolah

Menengah Atas di SMAN 3 Martapura diselesaikan pada tahun 2012. Tahun

2012, Penulis terdaftar sebagai Mahasiswa Jurusan Kimia FMIPA Unila melalui

jalur SNMPTN-Undangan (Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri).

Pada tahun 2016 Penulis telah melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) selama

60 hari di Desa Bumi Dipasena Sejahtera, Kec. Rawajitu, Kab. Tulang Bawang

dan Praktik Kerja Lapangan (PKL) di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia

FMIPA Unila. Selama menjadi mahasiswa penulis pernah menjadi asisten

praktikum Sains Dasar Biologi, Sains Dasar Matematika, Biokimia periode 2016-

2017 untuk mahasiswa S1 Jurusan Teknik Hasil Pertanian FP Unila, Biokimia

periode 2017-2018 untuk mahasiswa S1 Jurusan Kimia FMIPA Unila, dan

Biokimia periode 2017-2018 untuk mahasiswa S1 Jurusan Teknik Hasil Pertanian

FP Unila. Dalam bidang organisasi, Penulis pernah terdaftar sebagai Kader Muda

Himpunan Mahasiswa Kimia (KAMI) FMIPA Unila periode 2012-2013, sebagai

anggota biro penerbitan Himpunan Mahasiswa Kimia (HIMAKI) FMIPA Unila

periode 2013-2014 dan 2014-2015. Penulis juga pernah terdaftar sebagai Anggota

Dinas Adkesma BEM FMIPA Unila periode 2013-2014, sebagai Kepala Deputi

Pengembangan Sains PSLH BEM FMIPA Unila periode 2014-2015.

MOTO

Secepat apapun kebohongan itu berlari

Kebenaran akan melambungnya (B.J. Habibie)

Jika kamu gagal membuat persiapan

Maka bersiaplah untuk Gagal (Benjamin Franklin)

Apa artinya ijazah yang bertumpuk,

Jika kepedulian dan kepekaan tidak ikut dipupuk?

Apa gunanya sekolah tinggi-tinggi,

Jika hanya perkaya diri dan sanak-famili ?

(Najwa Shihab)

Rasa sakit dan penderitaan selalu tidak terelakkan untuk yang berakal luas dan

berhati dalam,

Orng-orang yang benar-benar besar pastilah , menurutku,

Punya kesedihan besar di bumi

(Fyodor Dostoyevsky,Crime and Punishment )

Ilmu itu lebih baik dari pada harta,

Ilmu menjaga engkau dan engkau menjaga harta,

Ilmu itu menghukum (hakim) dan harta terhukum,

Harta itu kurang apabila dibelanjakn tapi ilmuakan bertambah bila dibelanjakan .

( Saidina Ali bin Abi Talib )

“Dengan menyebut nama Allah Yang Maha Pengasih lagi Maha Penyayang

(Q.S. Al-Fatihah : 1)

Kupersembahkan karya ini kepada :

ALLAH S.W.T

Rosulullah SAW beserta keluarganya

Junjunganku, suri tauladanku, yang kunanti-nantikan

syafa’atnya di hari kebangkitan kelak.

Kedua Orang tua ku,

Ayah dan Ibu yang telah menyayangi, merawat, mendidik,

mengajarkan banyak kebaikan hingga saat ini. Kalianlah

semangat hidupku.Terima kasih untuk semua hal yang telah

Ayah dan Ibu lakukan semata untuk membahagiakanku yang

mungkin takkan bisa ku balas dan kugantikan dengan apapun.

Oleh karena itu, ijinkan anakmu mempersembahkan sebuah

karya kecil ini sebagai ungkapan rasa terima kasih dan

hormatku kepada Ayah dan Ibu.

Kedua Saudaraku :

Yuni Dwi Irfiana dan Alwan Hariiz

Bapak Prof.Dr. Ir. Yandri AS. M.S.

Guru-guru yang slalu membagi ilmunya untukku

Seluruh sahabat yang selalu menyemangatiku

dan Almamater Tercinta

SANWACANA

Assalamu’alaikum Wr. Wb.

Alhamdulillah puji dan syukur Penulis ucapkan atas kehadirat Allah SWT, karena

atas segala rahmat dan karunia-Nya skripsi ini dapat diselesaikan. Skripsi dengan

judul “PENGARUH PENAMBAHAN SORBITOL TERHADAP

STABILITAS ENZIM SELULASE DARI Rhizopus oligosporus” adalah salah

satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Jurusan Kimia, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

Dalam pelaksanaan dan penulisan skripsi ini tidak lepas dari kesulitan dan

rintangan, namun itu semua dapat penulis lalui berkat rahmat dan ridha Allah

SWT serta bantuan dan dorongan semangat dari orang-orang yang hadir di

kehidupan penulis. Dalam kesempatan ini, penulis menyampaikan terimakasih

setulus-tulusnya kepada :

1. Bapak Prof. Dr. Ir. Yandri A.S.,M.S., selaku pembimbing utama penelitian,

pembimbing akademik dan Kepala Laboratorium Biokimia FMIPA Unila

yang telah banyak memberikan ilmu pengetahuan, gagasan, bimbingan,

bantuan, motivasi, arahan, saran dan kritik kepada penulis dalam proses

perencanaan dan pelaksanaan studi serta saat penelitian

2. Bapak Mulyono, Ph.D., selaku pembahas I atas kesediaan memberikan

arahan, koreksi, saran dan kritik.

3. Ibu Dr. Nurhasanah, M.Si., selaku pembahas II atas kesediaan memberikan

arahan, koreksi, saran dan kritik.

4. Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T., selaku ketua Jurusan Kimia

FMIPA Unila.

5. Bapak Prof. Warsito, S.Si., D.E.A., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

6. Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Kimia FMIPA Unila yang telah mendidik dan

memberikan ilmu pengetahuan yang sangat bermanfaat kepada penulis

selama kuliah.

7. Seluruh staf pengajar dan karyawan Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

8. Kedua orangtuaku, Ayah Endang Carmin dan Ibu Rusmiati atas semua

pengorbanan, cinta, kasih sayang, kesabaran, keikhlasan, dan do’a yang tulus.

9. Adik-adikku tersayang Yuni Dwi Irfiana dan Alwan Hariiz, terimakasih atas

keceriaan dan semangat dukungannya sehingga penulis bisa menyelesaikan

skripsi ini.

10. Keluarga besarku baik dari ayah maupun ibu terimakasih banyak atas doa,

semangat, dukungan, dan seluruh bantuannya selama ini.

11. Guru-guruku yang telah memberikan ilmu, semangat, dan motivasinya.

Semoga Allah membalas semua kebaikan kalian semua.

12. Teman seperjuanganku satu bimbingan pada penelitian ini, Rizki Putriyana,

Syathira Assegaf, dan Diani Iska Miranti atas kerjasama, bantuan, motivasi,

kritik, dan saran dalam menyelesaikan penelitian dan skripsi ini. Para

penghuni laboratorium Biokimia Mbak Putri, Mbak Ana, Mbak April, Mbak

Uswa,(Terimakasih Mbak atas arahan dan bimbingannya pada penelitian ini),

Erlita Aisyah, Maria Ulfa, Ruwaidah Muliana, Ayu Imani, Meta Fosfi

Berliana, adik-adik 2013 bimbingan Pak Yandri dan Pak Mulyono,

terimakasih atas bantuan, keceriaan dan semangatnya selama dilaboratorium

Biokimia.

13. Keluarga Kimia 2012: Adi Setiawan, Aditian Sulung Saputra, Agus

Ardiansyah, Ajeng Wulandari, Ana Maria Kristiani, Apri Welda, Arif

Nurhidayat, Arya Rifansyah, Atma Istanami, Ayu Imani, Ayu Setianingrum,

Deborah Jovita, Derry Vardella, Dewi Aniatul Fatimah, Diani Iska Miranti,

Dwi Anggraini, Edi suryadi, Eka Hurwaningsih, Elsa Zulha, Erlita Aisyah,

Febita Glyssenda, Feby Rinaldo Pratama Kusuma, Fenti Visiamah, Ferdinand

Haryanto Simangunsong, Handri Sanjaya, Hiqi Alim, Indah Wahyu

Purnamasari, Indry Yani Saney, Intan Mailani, Ismi Khomsiah, Jean Pitaloka,

Jenny Jessica Sidabalok, Khoirul Anwar, Maria Ulfa, Meta Fosfi Berliyana,

Muhammad Rizal Robbani, Murni Fitria, Nila Amalin Nabilah, Putri

Ramadhona, Radius Uly Artha, Riandra Pratama Usman, Rifki Husnul

Khuluk, Rizal Rio Saputra, Rizki Putriyana, Ruliana Juni Anita, Ruwaidah

Muliana, Siti Aisah, Siti Nurhalimah, Sofian Sumilat Rizki, Sukamto, Susy

Isnaini Hasanah, Suwarda Dua Imatu Dela, Syathira Assegaf, Tazkiya Nurul,

Tiand Reno, Tiara Dewi Astuti, Tiurma Debora Simatupang, Tri Marital,

Ulfatun Nurun, Wiwin Esty Sarwita, Yepi Triapriani, Yunsi’U Nasy’Ah, dan

Zubaidi. Terimakasih persahabatan, pertemanan, dan kekeluargaannya selama

ini, semoga selamanya masih terjaga dengan baik.

14. Sahabat baikku yang selalu memberi nasihat,keceriaan, dan seluruh

bantuannya selama ini Ana Maria Kristiani, Ismi Khomsiah, Eka

Hurwaningsih, Siti Nurhalimah, Ayu Imani, Rizal Rio Saputra, Agung Setyo

Widodo. Teman baikku para pejuang toga Elsa Zhulha, Febita Glyssenda,

Khoirul Anwar, Ruliana Juni Anita, Putri Ramadhona, Radius Uly Artha,

Deborah Jovita, Derry Vardela, Adityan Sulung, dan Zubaidi (Semangat

Skripsinya teman !!!).

15. Seseorang yang sangat berarti untuk penulis, Bangkit Richad Sanjaya

terimakasih atas bantuan dan semangatnya selama ini, semoga niat baik kita

diridhoi oleh Allah SWT, Amiinn.

16. Keluarga kosan tercinta Keluarga besar bapak Wardani, Mbak Marsyamsih,

Mbak Dian, Mbak Sinta, Mbak Retty, Mbak Ferra, Mbak Wiwin, Susi, Cici ,

Vitri, Liyana, Rintya, Dewi, Ferantika, Eka, Mbak Husna, Diah, dan Alim

(Terimakasih atas kecerian dan kebersamaannya)

17. Kakak tingkat Jurusan Kimia 2008, 2009, 2010, 2011 dan adik tingkat 2013,

2014, 2015, dan 2016 yang memotivasi dan memberikan saran.

18. Keluarga Besar Bumi Dipasena Sejahtera dan teman-teman KKN BD.

Sejahtera (Fiki, Budi, Sivi, Nia, Vella, dan Gyka) atas kebersamaan dan

kerjasamanya selama disana.

19. Teman-teman SMA, SMP, SD, dan teman sejak kecil hingga sekarang,

terimakasih atas segalanya.

20. Almamater tercinta Universitas Lampung.

21. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang secara tulus

dan ikhlas memberikan bantuan moril dan materil kepada penulis.

Penulis berharap semoga skripsi yang sederhana ini dapat berguna dan bermanfaat

bagi kita semua. Aamiin.

Bandar Lampung, Juli 2017

Penulis

Fifi Adriyanthi

i

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ..................................................................................... i

DAFTAR GAMBAR ........................................................................ iv

DAFTAR TABEL ............................................................................ vi

I. PENDAHULUAN ........................................................................ 1

A. Latar Belakang ....................................................................... 1

B. Tujuan Penelitian .................................................................... 3

C. Manfaat Penelitian .................................................................. 3

II. TINJAUAN PUSTAKA .............................................................. 4

A. Enzim .................................................................................... 4

1. Klasifikasi enzim ............................................................. 5

2. Sifat katalitik enzim ........................................................ 6

3. Teori pembentukan enzim substrat ................................. 7

B. Enzim Selulase ....................................................................... 12

C. Selulosa .................................................................................. 13

D. Rhizopus oligosporus ............................................................. 14

E. Isolasi dan Pemurnian Enzim ................................................. 16

1. Sentriugasi ....................................................................... 16

2. Fraksinasi dengan ammonium sulfat ............................... 17

3. Dialisis ............................................................................. 18

4. Penguji anaktivitas enzim dengan metode Mandels ....... 19

5. Penentuan kadar protein dengan mentode Lowry ........... 19

F. Kinetika Reaksi Enzim ........................................................... 20

G. Stabilitas Enzim ...................................................................... 22

1. Stabilitas termal enzim ................................................... 22

2. Stabilitas pH enzim ......................................................... 24

H. Senyawa Aditif ....................................................................... 24

I. Polilol (Alkohol Polihidrat) .................................................... 25

iii

III. METODELOGI PENELITIAN ............................................... 26

A. Tempat dan Waktu Penelitian .............................................. 26

B. Alat dan Bahan ..................................................................... 26

C. Prosedur Penelitian .............................................................. 27

1. Penentuan kondisi optimum Rhizopus oligosporus

untuk memproduksi enzim selulase ................................ 27

a. Pembuatan media inokulum dan fermentasi ............... 27

b. Inokulasi Rhizopus oligosporus .................................. 27

2. Produksi dan isolasi enzim selulase ................................ 28

a. Produksi enzim selulase ............................................. 28

b. Isolasi enzim selulase ................................................. 28

3. Pemekatan enzim selulase ............................................... 29

4. Pemurnian enzim selulase ............................................... 29

a. Pengendapan dengan ammonium sulfat [(NH4)2SO4] 29

b. Dialisis ....................................................................... 31

5. Uji aktivitas enzim selulase ............................................. 31

a. Pembuatan pereaksi untuk pengujian aktivitas

Enzim selulase metode Mandels(Mandels et al., 1976) 31

b. Pengujian aktivitas enzim selulase metode Mandels . 32

6. Penentuan kadar protein enzim selulase.......................... 32

a. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran kadar protein

enzim selulase metode Lowry ................................... 32

b. Penentuan kadar protein enzim selulase metode Lowry 32

7. Penambahan sorbitol ....................................................... 33

8. Karakterisasi enzim sebelum dan setelah penambahan...

sorbitol ............................................................................. 33

a. Penentuan pH dan suhu optimum ............................... 34

b. Penentuan data kinetika enzim (nilai KM dan

Vmaks) .......................................................................... 34

c. Uji stabilitas termal dan stabilitas pH enzim .............. 35

d. Penentuan waktu paruh (t1/2), konstanta laju

inaktivasi (ki), dan perubahan energi akibat

denaturasi (ΔGi) .......................................................... 35

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................. 36

A. Produksi dan isolasi enzim Selulase .................................... 36

B. Pemurnian enzim selulase .................................................... 37

1. Fraksinasi dengan ammonium sulfat ..............................

2. Dialisis ............................................................................ 39

C. Karakterisasi enzim hasil pemurnian dan setelah

penambahan sorbitol ............................................................ 40

1. Penentuan pH optimum enzim hasil pemurnian dan setelah

penambahan sorbitol……………………………………. 41

2. Penentuan suhu optimum enzim hasil pemurnian dan setelah

penambahan sorbitol .......................... …………………. 42

3. Penentuan KM dan Vmaks enzim hasil pemurnian dan setelah

iiii

penambahan sorbitol ....... ……………………………… 43

4. Stabilitas termal enzim hasil pemurnian sebelum dan setelah

penambahan sorbitol ……………………………… 45

5. Konstanta laju inaktivasi termal (ki), waktu paruh (t1/2) dan

perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi) enzim hasil pemurnian

dan setelah penambahan sorbitol……………………….. 46

a. Waktu paruh (t1/2) dan konstanta laju inaktivasi termal (ki) 47

b. Perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi) ............................. 48

SIMPULAN DAN SARAN ....................................................................... 49

A. Simpulan ........................................................................................ 49

B. Saran .............................................................................................. 50

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 51

LAMPIRAN ............................................................................................... 57

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Teori kunci gembok dan teori induksi ....................................................... 8

2. Hubungan aktivitas enzim dengan suhu ..................................................... 9

3. Hubungan kecepatan reaksi dengan pH ..................................................... 9

4. Hubungan antara laju reaksi dengan konsentrasi enzim .......................... 10

5. Hubungan konsentrasi substrat dengan laju reaksi enzim.......................... 11

6. Mekanisme hidrolisis selulosa oleh enzim selulase ................................... 12

7. Struktur selulosa ......................................................................................... 14

8. Rhizopus oligosporus ................................................................................. 16

9. Diagram Lineweaver-Burk ......................................................................... 22

10. Skema proses pengendapan protein enzim dengan pengendapan

ammonium sulfat ........................................................................................ 30

12. Diagram alir penelitian ............................................................................... 35

13. Hubungan antara tingkat kejenuhan amonium sulfat (0-100)% dengan

aktivitas unit enzim selulase dari Rhizopus oligosporus. ........................... 38

13. Hubungan antara tingkat kejenuhan amonium sulfat (0-90)% dengan

aktivitas unit enzim selulase dari Rhizopus oligosporus. ........................... 39

14. Grafik pH optimum enzim hasil pemurnian dan setelah penambahan

v

sorbitol dengan konsentrasi 0,5; 1; dan 1,5 M. .......................................... 41

15. Grafik Suhu optimum enzim hasil pemurnian dan setelah penambahan

sorbitol dengan konsentrasi 0,5; 1; dan 1,5 M. .......................................... 42

16 .Grafik Lineweaver-Burk enzim hasil pemurnian dan setelah penambahan

sorbitol dengan konsentrasi 0,5; 1; dan 1,5 M. .......................................... 44

17. Grafik stabilitas termal enzim hasil pemurnian dan setelah penambahan

sorbitol dengan konsentrasi 0,5; 1; dan 1,5 M. .......................................... 45

18. Grafik Hubungan Ln(Ei/E0) enzim hasil pemurnian setelah

penambahan sorbitol untuk penentuan nilai ki, waktu paruh dan ΔGi ........ 47

19. Grafik kurva standar glukosa .................................................................... 66

20. Grafik kurva standar serum albumin sapi (BSA) ...................................... 67

vi

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Pemurnian enzim selulase dari Rhizopus oligosporus 40

2. Nilai Km dan Vmaks enzim tanpa sorbitol dan setelah penambahan

sorbitol 44

3. Nilai konstanta laju inaktivasi(ki), waktu paruh (t1/2), dan perubahan

energi akibat denaturasi (ΔGi) enzim tanpa sorbitol sebelum

dan setelah penambahan sorbitol 46

4. Hubungan antara berbagai tingkat kejenuhan ammonium sulfat (0-100%)

dengan aktivitas spesifik enzim selulase 58

5. Hubungan antara berbagai tingkat kejenuhan ammonium sulfat (0-90%)

dengan aktivitas spesifik enzim selulase 58

6. Hubungan antara pH dengan aktivitas unit enzim tanpa sorbitol

dan setelah penambahan sorbitol 58

7. Hubungan antara pH dengan aktivitas sisa enzim tanpa sorbitol

dan setelah penambahan sorbitol 59

8. Hubungan antara suhu dengan aktivitas unit enzim tanpa sorbitol

dan setelah penambahan sorbitol 59

9. Hubungan antara suhu dengan aktivitas sisa enzim tanpa sorbitol

dan setelah penambahan sorbitol 60

10. Data untuk penentuan KM dan Vmax enzim selulase tanpa sorbitol

berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk 60

vii

11. Data untuk penentuan KM dan Vmax enzim selulase setelah penambahan sorbitol

menggunakan sorbitol berdasarkan persamaan

Lineweaver-Burk 61

12. Hubungan antara aktivitas Unit enzim tanpa sorbitol dan setelah penambahan

sorbitol…………………………………………………………… 61

13. Hubungan antara aktivitas sisa enzim tanpa sorbitol dan setelah penambahan

sorbitol…………………………………………………………… 62

14. Penentuan ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim tanpa sorbitol 62

15. Penentuan ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim setelah

penambahan sorbitoldengan konsentrasi sorbitol 0,5 M pada suhu 60oC 63

16. Penentuan ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim hasil modifikasi

dengan derajat modifikasi sorbitol 1 M

pada suhu 60oC 63

17. Penentuan ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim hasil modifikasi

dengan derajat modifikasi sorbitol 1,5 M

pada suhu 60oC 64

18. . Absorbansi glukosa pada berbagai konsentrasi untuk penentuan kurva

standar glukosa 65

19. . Absorbansi serum albumin sapi (BSA) pada berbagai konsentrasi

untuk penentuan kurva standar serum albumin sapi (BSA) 66

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Saat ini industri enzim telah berkembang pesat dan menempati posisi penting

dalam bidang industri dimana teknologi enzim sebagai salah satu alternatif utama

untuk menggantikan berbagai proses kimiawi dalam bidang industri (Wilda dkk.,

2013). Berkembangnya teknologi pemanfaatan enzim khususnya sebagai

biokatalisator dalam industri pangan dan nonpangan, secara nyata dapat

memberikan manfaat dan keuntungan bagi manusia (Reed, 1975; Wyk dan

Mohulatsi., 2003). Enzim merupakan biokatalisator yang mampu mempercepat

reaksi biokimia yang terjadi di dalam sel maupun di luar sel (Poedjiadi, 2006).

Fungsi enzim dalam mempercepat reaksi memberikan keuntungan bagi industri

karena menghemat waktu dan biaya (Page, 1997).

Salah satu enzim yang memiliki peranan penting adalah enzim selulase. Enzim

selulase dapat menghidrolisis selulosa menjadi glukosa yang dapat dimanfaatkan

sebagai bahan baku pembuatan zat kimia lain seperti etanol, aseton, dan asam-

asam organik sehingga memiliki nilai ekonomis yang lebih tinggi maupun sebagai

sumber karbon dalam pertumbuhan bakteri untuk produksi antibiotik dan

bermacam-macam enzim (Gunam dkk., 2004).

2

Secara umum enzim memiliki beberapa kelemahan selain harganya yang mahal

seperti sifatnya yang hanya dapat sekali pakai, hanya bekerja pada kondisi

fisiologis dan tidak tahan pada kondisi ekstrim, sehingga menyebabkan

terbatasnya pemakaian enzim dalam industri. Hal ini dapat diatasi dengan

meningkatkan stabilitas enzim. Ada beberapa syarat tertentu untuk enzim yang

digunakan dalam dunia industri, diantaranya harus stabil pada suhu

tinggi(termostabil) dan tahan pada kondisi pH yang ekstrim (Suhartono,1989).

Syarat tersebut dapat terpenuhi dengan cara mengisolasi enzim langsung dari

organisme yang hidup dalam kedaan ekstrim (Weagen, 1984) atau dengan teknik

amobilisasi, modifikasi kimia, rekayasa molekuler dan penambahan zat aditif.

Penggunaan zat aditif lebih sering dipilih karena relatif lebih mudah dan biayanya

murah (Suhartono,1992).

Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan modifikasi kimia enzim selulase

menggunakan beberapa senyawa kimia, diantaranya asam glioksilat ( Rina,

2014), sitrakonat anhidrida (Fatma, 2014), dan sianurat klorida polietilenglikol

(CC-PEG) (Fitriyanti, 2014). Dari hasil penelitian tersebut diperoleh hasil bahwa

modifikasi kimia dapat meningkatkan stabilitas enzim selulase. Sedangkan

penambahan senyawa aditif terhadap enzim α-amilase yang telah dilakukan

menggunakan senyawa kimia poliol seperti sorbitol menunjukkan adanya

peningkatan stabilitas termal enzim dibandingkan enzim hasil pemurnian (Aprilia,

2016).

Pada penelitian ini, akan dilakukan penambahan senyawa sorbitol untuk melihat

pengaruhnya terhadap stabilitas enzim selulase yang diisolasi dari Rhizopus

oligosporus. Pemilihan sorbitol didasarkan pada beberapa kelebihan antara lain,

3

dapat mempertahankan konformasi enzim, mengurangi kemungkinan oksidasi

gugus tiol pada enzim, menjaga stabilitas interaksi non kovalen, termasuk

interaksi hidrofobik dalam molekul enzim, meningkatkan stabilitas dan daya awet

enzim, dan yang terpenting adalah menjaga keutuhan struktur enzim terhadap

degradasi oleh suhu. Oleh karena itu, pada penelitian ini dipelajari pengaruh

penambahan sorbitol terhadap stabilitas enzim selulase dari Rhizopus oligosporus.

B. Tujuan Penelitian

Adapun tujuan dari penelitian ini adalah :

1. Mengisolasi ekstrak kasar enzim selulase dari Rhizopus oligosporus pada

kondisi optimum sehingga diperoleh enzim yang memiliki aktivitas unit

terbaik.

2. Mempelajari pengaruh penambahan sorbitol terhadap stabilitas enzim selulase

dari Rhizopus oligosporus.

C. Manfaat Penelitian

Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini adalah :

1. Memberikan informasi mengenai pengaruh penambahan sorbitol terhadap

stabilitas enzim selulase dari Rhizopus oligosporus.

2. Enzim selulase dengan stabilitas yang tinggi dapat digunakan dalam proses-

proses industri.

4

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Enzim

Enzim adalah senyawa protein yang bertindak sebagai biokatalisator, artinya

senyawa tersebut mampu mempercepat reaksi kimia, tetapi zat itu sendiri tidak

ikut bereaksi (Chalal, 1983). Selain itu juga enzim merupakan katalis biologi,

yang mampu meningkatkan laju reaksi dengan cara selektif dan efisien

berdasarkan pada hukum termodinamika dan kinetika (Shahib, 2005). Molekul

enzim biasanya berbentuk bulat (globular), sebagian terdiri atas satu rantai

polipeptida dan sebagian lain terdiri dari lebih dari satu polipeptida

(Wirahadikusumah, 1997). Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat

perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk dengan adanya kerja

enzim (Grisham dkk., 1999). Bila enzim tidak ada maka reaksi-reaksi akan

berjalan terlalu lambat untuk dapat menopang kehidupan atau reaksi-reaksi

tersebut akan memerlukan kondisi-kondisi non-fisiologis (Dryer, 1993).

Enzim bersifat efisien dan spesifik dalam kerja katalitiknya, sehingga enzim

dikatakan mempunyai sifat sangat khas karena hanya bekerja pada substrat

tertentu dan bentuk reaksi tertentu. Kespesifikannya disebabkan oleh bentuknya

yang unik dan adanya gugus-gugus polar (atau nonpolar) yang terdapat dalam

struktur enzim (Fessenden dan Fessenden, 1982).

5

1. Klasifikasi enzim

Menurut Martoharsono (1993) enzim dapat diklasifikasi menjadi 6 kelas

berdasarkan fungsinya dan tiap kelas mempunyai beberapa subkelas

berdasarkan IUPAC.

a. Berdasarkan tipe reaksi yang diketahui, enzim dibagi menjadi enam

kelompok:

1. Oksidureduktase

Enzim oksidureduktase adalah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi

oksidasi atau reduksi suatu bahan. Dalam golongan enzim ini terdapat

2 macam enzim yang paling utama yaitu oksidase dan dehidrogenase.

Oksidase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi antara substrat

dengan molekul oksigen. Dehidrogenase adalah enzim yang aktif

dalam pengambilan atom hidrogen dari substrat.

2. Transferase

Enzim transferase adalah enzim yang ikut serta dalam reaksi

pemindahan (transfer) suatu gugus.

3. Hidrolase

Enzim hidrolase merupakan kelompok enzim yang sangat penting

dalam pengolahan pangan, yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi

hidrolisis suatu substrat atau pemecahan substrat dengan pertolongan

molekul air. Enzim-enzim yang termasuk dalam golongan ini

diantaranya adalam amilase, invertase, selulase dan sebagainya.

6

4. Liase

Enzim liase adalah enzim yang aktif dalam pemecahan ikatan C-C dan

C-O dengan tidak menggunakan molekul air.

5. Isomerase

Enzim isomerase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi perubahan

konfigurasi molekul dengan cara pengaturan kembali atom-atom

substrat, sehingga dihasilkan molekul baru yang merupakan isomer

dari substrat atau dengan perubahan isomer posisi misalnya mengubah

aldosa menjadi ketosa.

6. Ligase

Enzim ligase adalah enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan-

ikatan tertentu, misalnya pembentukan ikatan C-C, C-O dan C-S

dalam biosintesis koenzim A serta pembentukan ikatan C-N dalam

sintesis glutamin (Winarno, 1989).

b. Berdasarkan cara terbentuknya dibedakan menjadi dua, yaitu :

1. Enzim konstitutif, yaitu enzim yang jumlahnya dipengaruhi kadar

substratnya, misalnya enzim amilase.

2. Enzim adaptif, yaitu enzim yang pembentukannya dirangsang oleh

adanya substat, contohnya enzim β-galaktosidase yang dihasilkan oleh

bakteri Eshericia coli yang ditumbuhkan di dalam medium yang

mengandung laktosa (Lehninger, 1982).

2. Sifat katalitik enzim

Sifat-sifat katalitik dari enzim ialah sebagai berikut (Page,1989) :

7

a. Enzim mampu meningkatkan laju reaksi pada kondisi biasa ( fisiologik )

dari tekanan, suhu dan pH.

b. Enzim berfungsi sebagai selektifitas tinggi terhadap substrat (substansi

yang mengalami perubahan kimia setelah bercampur dengan enzim) dan

jenis reaksi yang dikatalisis.

c. Enzim memberikan peningkatan laju reaksi yang tinggi dibanding dengan

katalis biasa.

3. Teori Pembentukan Enzim-Substrat

Menurut Shahib (2005) ada dua teori pembentukan kompleks enzim-subtrat

yaitu teori lock and key dan teori induced-fit yang dapat diilustrasikan pada

Gambar 1.

a. Teori lock and key (gembok dan kunci)

Dimana subtrat yang spesifik akan terikat pada daerah spesifik di

molekul enzim yang disebut sisi aktif. Substrat mempunyai daerah

polar dan non-polar pada sisi aktif yang baik bentuk maupun muatannya

merupakan pasangan substrat. Hal ini terjadi karena adanya rantai

peptida yang mengandung rantai residu yang menuntun substrat untuk

berinteraksi dengan residu katalitik. Ketika katalisis berlangsung,

produk masih terikat pada molekul enzim. Kemudian produk akan

bebas dari sisi aktif dengan terbebasnya enzim.

b. Teori induced-fit (ketetapan induksi)

Teori ini menerangkan bahwa enzim bersifat fleksibel. Dimana

sebelumnya bentuk sisi aktif tidak sesuai dengan bentuk substrat.

8

Tetapi setelah substrat menempel pada sisi aktif, maka enzim akan

terinduksi dan menyesuaikan dengan bentuk substrat.

Gambar 1. Teori kunci gembok dan teori induksi (Yandriano,2006)

Berikut ini faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim :

a. Suhu

Enzim mempercepat terjadinya reaksi kimia pada suatu sel hidup. Dalam

batas-batas suhu tertentu, kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim akan naik

bila suhunya naik. Reaksi yang paling cepat terjadi pada suhu optimum

(Rodwell, 2011). Suhu optimum merupakan suhu pada saat enzim memiliki

aktivitas maksimum. Suhu yang terlalu tinggi (jauh dari suhu optimum suatu

enzim) akan menyebabkan enzim terdenaturasi. Bila enzim terdenaturasi,

maka bagian aktifnya akan terganggu yang menyebabkan konsentrasi efektif

enzim menjadi berkurang. Hal ini menyebabkan laju reaksi enzimatik

menurun (Poedjiadi, 1994). Pada suhu 0 oC enzim menjadi tidak aktif dan

dapat kembali aktif pada suhu normal (Lay dan Sugyo, 1992). Hubungan

antara aktivitas enzim dengan suhu ditunjukkan dalam Gambar 2.

Active Site Active Site

Enzim Substrat

Sisi Aktif Enzim

Enzim

Substrat Sisi Aktif Enzim

Teori Kunci Gembok sisi aktif

cenderung kaku

s

s

Sisi aktif cenderung kaku

Teori Kecocokan Induksi sisi

aktif lebih fleksibel

Sisi aktif lebih fleksibel

9

Gambar 2. Hubungan aktivitas enzim dengan suhu (Rodwell, 2011)

b. pH

(Derajat keasaman) enzim pada umumnya bersifat amfolitik, yang berarti

enzim mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun gugus

basanya, terutama pada gugus residu terminal karboksil dan gugus terminal

amino. Perubahan kereaktifan enzim diperkirakan merupakan akibat dari

perubahan pH lingkungan (Winarno, 2002). Perubahan pH dapat

mempengaruhi asam amino kunci pada sisi aktif, sehingga menghalangi sisi

aktif enzim membentuk kompleks dengan substratnya (Page, 1997).

Gambar 3. Hubungan kecepatan reaksi dengan pH (Winarno,2002)

pH optimum

pH

Aktivitas

Enzim

10

c. Konsentrasi enzim

Konsentrasi enzim secara langsung mempengaruhi kecepatan laju reaksi

enzimatik dimana laju reaksi meningkat dengan bertambahnya konsentrasi

enzim (Poedjiadi, 2006). Hubungan antara laju reaksi enzim dengan

konsentrasi enzim ditunjukkan dalam Gambar 4.

Gambar 4. Hubungan antara laju reaksi dengan konsentrasi enzim (Page, 1997)

d. Konsentrasi substrat

Kecepatan reaksi enzimatis pada umumnya tergantung pada konsentrasi

substrat. Kecepatan reaksi akan meningkat apabila konsentrasi substrat

meningkat. Peningkatan kecepatan reaksi ini akan semakin kecil hingga

tercapai suatu titik batas yang pada akhirnya penambahan konsentrasi substrat

hanya akan sedikit meningkatkan kecepatan reaksi (Lehninger, 2005).

Hubungan antara konsentrasi substrat dengan laju reaksi enzim ditunjukkan

pada Gambar 5.

11

Gambar 5. Hubungan konsentrasi substrat dengan laju reaksi enzim

(Shahib,2005)

e. Aktivator dan inhibitor

Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya. Aktivator

adalah senyawa atau ion yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi enzimatis.

Komponen kimia yang membentuk enzim disebut juga kofaktor. Kofaktor

tersebut dapat berupa ion-ion anorganik seperti Zn, Fe, Ca, Mn, Cu, Mg atau

dapat pula sebagai molekul organik kompleks yang disebut koenzim

(Martoharsono, 2006).

Menurut Wirahadikusumah (1989), inhibitor merupakan suatu zat kimia

tertentu yang dapat menghambat aktivitas enzim. Pada umumnya cara kerja

inhibitor adalah dengan menyerang sisi aktif enzim sehingga enzim tidak dapat

berikatan dengan substrat dan fungsi katalitik enzim tersebut akan terganggu

(Winarno, 2002).

f. Kofaktor Logam

Kofaktor adalah suatu faktor yang membantu keaktifan enzim. Ikatan antara

kofaktor dan enzim dapat sangat kuat dan ada pula yang tidak terikat dengan

kuat (Poedjiadi, 1994).

12

g. Pelarut Organik

Pengunaan pelarut dalam reaksi enzimatik memberikan keuntungan antara lain

ialah kelarutan substrat-organik dan enzim lebih tinggi dibandingkan dengan

air serta meningkatkan kestabilan enzim dengan pelarut (Kwon dan Rhee,

1986).

B. Enzim Selulase

Selulase adalah enzim terinduksi yang disintesis oleh mikroorganisme selama

ditumbuhkan dalam medium selulosa (Lee dan Koo, 2001). Untuk

menghidrolisis selulosa yang tidak larut atau selulosa kristal diperlukan kerja

sinergistik dari ketiga komponen enzim tersebut. Mekanisme hidrolisis

selulosa oleh enzim selulase dapat dilihat dalam Gambar 6.

Gambar 6. Mekanisme hidrolisis selulosa oleh enzim selulase (Lee dan Koo,

2001).

ᵦ-(1,4)-glukosidase

13

Adapun ketiga komponen enzim tersebut yaitu :

1. Ekso-β-(1,4)-glukanase dikenal sebagai faktor C1. Faktor ini diperlukan

untuk menghidrolisis selulosa ke bentuk kristal selulosa amorf.

2. Endo-β-(1,4)-glukanase dikenal sebagai faktor Cx. Faktor ini diperlukan

untuk menghidrolisis ikatan β-(1,4)-glukosida pada selulosa amorf menjadi

selobiosa.

3. β-(1,4)-glukosidase menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa (Reese, 1976).

C. Selulosa

Selulosa merupakan biomolekul yang paling banyak ditemukan di alam dan unsur

utama penyusun kerangka tumbuhan. Diperkirakan sekitar 1011

ton selulosa

dibiosintesis tiap tahun. Daun kering mengandung 10-20% selulosa, kayu 50%

dan kapas 90% (Koolman, 2001). Selulosa bersifat kristalin dan tidak mudah

larut. Selulosa dapat dihidrolisis menjadi gula-gula sederhana dengan

menggunakan katalis asam, enzim maupun mikroba selulolitik. Beberapa

penelitian melaporkan bahwa proses hidrolisis secara enzimatis lebih

menguntungkan daripada menggunakan asam. Selain tidak menimbulkan masalah

korosi dan berlangsung pada kondisi mild (pH 4,8 dan suhu 50oC), proses

hidrolisasi secara enzimatis juga menghasilkan yield lebih tinggi daripada

hidrolisis yang dikatalisis asam (Duff dan Murray, 1996). Rumus empiris

selulosa adalah (C6H10O5)n, dengan banyaknya satuan glukosa yang disebut

derajat polimerisasi (DP), dimana jumlahnya mencapai 1.200-10.000 dan panjang

molekul sekurang-kurangnya 5.000 nm. Berat molekul selulosa rata-rata sekitar

400.000 (Sjostrom, 1995). Adapun struktur selulosa dapat dilihat pada Gambar 7.

14

Gambar 7. Struktur selulosa (Fessenden, 1992)

D. Rhizopus oligosporus

Fungi adalah heterotrof yang mendapatkan nutriennya melalui penyerapan. Dalam

cara nutrisi ini, molekul – molekul organik kecil diserap dari medium

sekitarnya.Kapang adalah fungi yang tumbuh cepat dan bereproduksi secara

aseksual. Salah satu contoh dari kapang ini Rhizopus. Miselia Rhizopus juga dapat

bereproduksi secara aseksual dengan cara membentuk sporangia yang

menghasilkan spora haploid yang secara genetik identik (Campbell,2002).

R. oligosporus mempunyai koloni abu-abu kecoklatan dengan tinggi 1 mm atau

lebih. Sporangiofor tunggal atau dalam kelompok dengan dinding halus atau agak

sedikit kasar, dengan panjang lebih dari 1000 m dan diameter 10-18 m.

Sporangia globosa yang pada saat masak berwarna hitam kecoklatan, dengan

diameter 100-180 m. Kolumela globosa sampai sub globosa dengan apofisa -

apofisa berbentuk corong. Ukuran sporangiospora tidak teratur dapat globosa atau

elip dengan panjang 7-10 m. Klamidospora banyak, tunggal atau rantaian

Ikatan 1,4’-ᵦ H

15

pendek, tidak berwarna, dengan berisi granula, terbentuk pada hifa, sporangiofor

dan sporangia. Bentuk klamidospora globosa, elip atau silindris dengan ukuran 7-

30 m atau 12-45 m x 7-35 m. Suhu optimum, minimum, maksimum berturut-

turut adalah 30-35o C, 12 C. (Samson, dkk., 2004).

R.oligosporus memiliki panjang sporangiosfor pada media Malt Extract Agar

(MEA) 150-400 m lebih pendek dari R.oryzae yaitu lebih dari 1500 m.

R.oligosporus biasanya memiliki rhizoid yang pendek, sporangium dengan

diameter 80 –120 m dan pada saat 7 hari akan pecah yang menyebabkan spora

keluar kolumela dengan diameter 25-75 m. Sedangkan R.oryzae memiliki

diameter sporangium lebih dari 150 m, kolumela dengan diameter lebih dari 100

m (Pitt dan Hocking, 1985)

Beberapa sifat penting dari Rhizopus oligosporus antara lain meliputi aktivitas

enzimatiknya, kemampuan menghasilkan antibiotika, biosintesa vitamin-vitamin

B, kebutuhannya akan senyawa sumber karbon dan nitrogen, perkecambahan

spora, dan penetrisi miselia jamur tempe ke dalam jaringan biji kedelai. Rhyzopus

oligosporus berperan dalam peningkatan Nilai gizi protein kedelai, yaitu

mensintesis enzim pemecah protein (protease) (Kasmidjo, 1990). Adapun gambar

dari Rhizopus oligosporus dapat dilihat pada gambar 8.

16

Gambar 8. Rhizopus oligosporus (Kasmidjo, 1990).

E. Isolasi dan Pemurnian Enzim Selulase

Enzim selulase merupakan enzim ekstraseluler yang dihasilkan oleh mikroba

selulolitik (Duff dan Murray, 1996). Enzim ekstraseluler merupakan enzim

yang diproduksi di dalam sel namun bekerja di luar sel, sehingga mudah

diisolasi dan dipisahkan dari pengotor lain serta tidak banyak bercampur

dengan bahan-bahan sel lain ( Pelczar dan Chan, 1986 ).

1. Sentrifugasi

Sentrifugasi merupakan metode yang dapat digunakan untuk memisahkan

enzim ekstraseluler dari sisa-sisa sel. Sentrifugasi akan menghasilkan enzim

terlarut dalam bentuk filtrat yang jernih dan sisa - sisa sel lain serta pengotor

dalam bentuk endapan yang terikat kuat pada dasar tabung. Sel-sel mikroba

biasanya mengalami sedimentasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit

(Scopes, 1982; Walsh dan Headon, 1994).

Prinsip sentrifugasi berdasarkan pada kenyataan bahwa setiap partikel yang

berputar pada laju sudut yang konstan akan memperoleh gaya keluar (F).

17

Besar gaya ini bergantung pada laju sudut ω (radian/detik) dan radius

pertukarannya (sentimeter).

F = ω2 r

Gaya F dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, karena itu dinyatakan sebagai

gaya sentrifugal relatif (RCF dengan satuan g (gravitasi).

RCF = 980

2r

Dalam praktiknya, alat sentrifugasi dioperasikan dengan laju rpm. Oleh sebab

itu, harga rpm dikonversikan kedalam bentuk radian menggunakan

persamaan:

ω = 30

rpm

RCF = (πrpm)2 r x

230

980

RCF = (1.119x10-5

)(rpm)2r (Cooper, 1997 dalam Sariningsih, 2000).

2. Fraksinasi menggunakan ammonium sulfat [(NH4)2SO4]

Fraksinasi merupakan proses pengendapan protein atau enzim dengan

penambahan senyawa elektrolit seperti garam ammonium sulfat, natrium

klorida atau natrium sulfat. Menurut Suhartono (1989), penambahan

senyawa elektrolit ke dalam larutan yang mengandung protein dapat

menyebabkan terjadinya proses pengendapan protein. Proses pengendapan

protein tersebut dipengaruhi oleh kekuatan ion dalam larutan. Dengan

meningkatnya kekuatan ion, kelarutan enzim akan semakin besar atau disebut

dengan peristiwa salting in, setelah mencapai suatu titik tertentu, dimana

18

kandungan garam semakin tinggi akan menyebabkan kelarutan protein

semakin menurun dan terjadi proses pengendapan protein. Peristiwa

pengendapan protein ini disebut salting out (Wirahadikusumah, 1989). Pada

kekuatan ion rendah, protein akan terionisasi sehingga interaksi antar protein

akan menurun dan kelarutan akan meningkat. Peningkatan kekuatan ion ini

meningkatkan kadar air yang terikat pada ion, dan jika interaksi antar ion

kuat, kelarutannya menurun akibatnya interaksi antar protein lebih kuat dan

kelarutannya menurun (Agustien dan Munir, 1997).

Senyawa elektrolit yang sering digunakan untuk mengendapkan protein ialah

ammonium sulfat. Kelebihan ammonium sulfat dengan dibandingkan dengan

senyawa-senyawa elektrolit lain ialah memiliki kelarutan yang tinggi, tidak

mempengaruhi aktivitas enzim, mempunyai daya pengendap yang efektif,

efek penstabil terhadap kebanyakan enzim, dapat digunakan pada berbagai

pH dan harganya murah (Scopes, 1982).

3. Dialisis

Dialisis merupakan metode yang digunakan untuk memurnikan larutan

protein atau enzim yang mengandung garam setelah proses fraksinasi

berdasarkan pada sifat semipermeabel membran. Proses dialisis dilakukan

dengan memasukkan larutan enzim ke dalam kantung dialisis yang terbuat

dari membran semipermeabel (selofan). Selanjutnya, kantung yang berisi

larutan protein atau enzim dimasukkan ke dalam larutan bufer sambil diputar-

putar. Selama proses tersebut, molekul kecil yang ada di dalam larutan

protein atau enzim seperti garam anorganik akan keluar melewati pori-pori

membran, sedangkan molekul protein atau enzim yang berukuran besar tetap

19

tertahan dalam kantung dialisis. Keluarnya molekul menyebabkan distribusi

ion-ion yang ada di dalam dan di luar kantung dialisis tidak seimbang. Untuk

memperkecil pengaruh ini digunakan larutan bufer dengan konsentrasi

rendah di luar kantung dialisis (Lehninger, 1982). Setelah tercapai

keseimbangan, larutan di luar kantung dialisis diganti dengan larutan yang

baru agar konsentrasi ion-ion di dalam kantung dialisis dapat dikurangi.

Proses ini dapat dilakukan secara terus menerus sampai ion-ion di dalam

kantung dialisis dapat diabaikan (Mc Phie, 1971 dalam Boyer 1993). Difusi

zat terlarut bergantung pada suhu dan viskositas larutan. Meskipun suhu

tinggi dapat meningkatkan laju difusi, namun sebagian besar protein dan

enzim stabil pada suhu 4-8°C sehingga dialisis harus dilakukan di dalam

ruang dingin (Pohl, 1990).

4. Pengujian Aktivitas Selulase dengan Metode Mandels

Pengujian aktivitas selulase dilakukan dengan metode Mandels (Mandels

dkk.,1976), yaitu berdasarkan pembentukan glukosa dari substrat

Carboxymethyl Cellulase (CMC) oleh enzim selulase yang dideteksi dengan

penambahan pereaksi DNS (dinitrosalisilic acid) ke dalam larutan uji serta

proses pemanasan, sehingga akan dihasilkan larutan berwarna kuning hingga

merah pekat. Semakin pekat warna larutan sampel dibandingkan larutan

kontrol, maka semakin tinggi aktivitasnya .

5. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry

Salah satu metode yang digunakan untuk menentukan kadar protein adalah

metode Lowry. Metode ini bekerja pada lingkungan alkali dan ion tembaga

(II) bereaksi membentuk kompleks dengan protein. Selanjutnya reagen folin-

20

ciocelteau yang ditambahkan akan mengikat protein. Ikatan ini secara

perlahan akan mereduksi reagen folin menjadi heteromolibdenum dan

merubah warna larutan dari kuning menjadi biru keunguan. Pada metode ini,

pengujian kadar protein didasarkan pada pembentukan komplek Cu2+

dengan

ikatan peptida yang akan tereduksi menjadi Cu+ pada kondisi basa. Cu

+ dan

rantai samping tirosin, triptofan, dan sistein akan bereaksi dengan reagen

folin-ciocelteau. Reagen ini bereaksi menghasilkan produk yang tidak stabil

yang tereduksi secara lambat menjadi molybdenum atau tungesteen blue.

Protein akan menghasilkan intensitas warna yang berbeda tergantung pada

kandungan triptofan dan tirosinnya.

Metode ini relatif sederhana dan dapat diandalkan serta biayanya relatif

murah. Namun, kekurangan dari metode ini adalah sensitif terhadap

perubahan pH dan konsentrasi protein yang rendah. Untuk mengatasi hal

tersebut dapat dilakukan dengan menggunakan volume sampel dalam jumlah

kecil sehingga tidak mempengaruhi reaksi (Lowry dkk, 1951).

F. Kinetika Reaksi Enzim

Parameter dalam kinetika reaksi enzim adalah konstanta Michaelis-Menten (KM)

dan laju reaksi maksimum (Vmaks). Berdasarkan postulat Michaelis dan Menten

pada suatu reaksi enzimatis terdiri dari beberapa fase yaitu pembentukan

kompleks enzim substrat (ES), dimana E adalah enzim dan S adalah substrat,

modifikasi dari substrat membentuk produk (P) yang masih terikat dengan enzim

(EP), dan pelepasan produk dari molekul enzim (Shahib, 2005).

21

Setiap enzim memiliki sifat dan karakteristik yang spesifik seperti yang

ditunjukkan pada sifat spesifisitas interaksi enzim terhadap substrat yang

dinyatakan dengan nilai tetapan Michaelis-Menten (KM). Nilai KM didefinisikan

sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai kecepatan

setengah kecepatan maksimum. Setiap enzim memiliki nilai KM dan Vmaks yang

khas dengan substrat spesifik pada suhu dan pH tertentu (Kamelia dkk, 2005).

Nilai KM yang kecil menunjukkan bahwa kompleks enzim-substrat sangat mantap

dengan afinitas tinggi terhadap substrat, sedangkan jika nilai KM suatu enzim

besar maka enzim tersebut memiliki afinitas rendah terhadap substrat (Page,

1997). Nilai KM suatu enzim dapat dihitung dengan persamaan Lineweaver-Burk

yang diperoleh dari persamaan Michaelis-Menten yang kemudian dihasilkan suatu

diagram Lineweaver-Burk yang ditunjukkan Gambar 8 (Page, 1997).

Persamaan Lineweaver-Burk …(2)

[S]

[S] K1 M

0 maksVV

maksmaks

M

VSV

K

V

111

0

[S] K

S V

M

maks0

V

Persamaan Michaelis-Menten…(1)

22

Gambar 9. Diagram Lineweaver-Burk ( Suhartono, 1989)

G. Stabilitas Enzim

Menurut Kazan dkk., (1997), stabilitas enzim dapat diartikan sebagai kestabilan

aktivitas enzim selama penyimpanan dan penggunaan enzim tersebut, serta

kestabilan terhadap senyawa yang bersifat merusak seperti pelarut tertentu (asam

atau basa), oleh pengaruh suhu dan kondisi – kondisi nonfisiologis lainnya.

Terdapat dua cara yang dapat dilakukan untuk mendapatkan enzim yang

mempunyai stabilitas tinggi, yaitu menggunakan enzim yang memiliki stabilitas

ekstrim alami dan mengusahakan peningkatan stabilitas enzim yang secara alami

tidak atau kurang stabil, salah satunya adalah dengan cara memodifikasi enzim

menggunakan zat kimia tertentu.

1. Stabilitas termal enzim

Pada suhu yang terlalu rendah stabilitas enzim tinggi, namun aktivitasnya

rendah, sedangkan pada suhu yang terlalu tinggi aktivitas enzim tinggi, tetapi

maksV

1

0

1

V

MK

1 S

1

maks

M

V

KSlope

23

kestabilannya rendah. Kenaikan suhu akan mempengaruhi kecepatan laju

reaksi enzim, namun hanya sampai batas tertentu dan selanjutnya akan terjadi

proses denaturasi protein. Daerah suhu saat stabilitas dan aktivitas enzim

cukup besar disebut suhu optimum untuk enzim tersebut (Wirahadikusumah,

1997). Dalam industri, umumnya reaksi-reaksi dilakukan pada suhu tinggi hal

ini bertujuan untuk mengurangi tingkat kontaminasi dan masalah-masalah

viskositas serta meningkatkan laju reaksi. Namun, suhu yang tinggi ini

merupakan masalah utama dalam stabilitas enzim, karena enzim umumnya

tidak stabil pada suhu tinggi. Proses inaktivasi enzim pada suhu tinggi

berlangsung dalam dua tahap, yaitu:

a. Adanya pembukaan partial (partial unfolding) struktur sekunder, tersier,

atau kuartener molekul enzim.

b. Perubahan struktur primer enzim karena adanya kerusakan asam amino -

asam amino tertentu oleh panas (Ahern dan Klibanov, 1987).

Air memegang peranan penting pada kedua tahap di atas. Oleh karena itu,

dengan menggunakan air seperti pada kondisi mikroakuos, reaksi inaktivasi

oleh panas dapat diperlambat dan stabilitas termal enzim akan meningkat.

Stabilitas termal enzim akan jauh lebih tinggi dalam kondisi kering

dibandingkan dalam kondisi basah. Adanya air sebagai pelumas membuat

konformasi suatu molekul enzim menjadi sangat fleksibel, sehingga bila air

dihilangkan molekul enzim akan menjadi lebih kaku (Virdianingsih, 2002).

24

2. Stabilitas pH enzim

Stabilitas enzim dipengaruhi oleh banyak faktor seperti suhu, pH, pelarut,

kofaktor dan kehadiran surfaktan (Eijsink dkk, 2005), dari faktor-faktor

tersebut pH memegang peranan penting. Diperkirakan perubahan keaktifan

pH lingkungan disebabkan terjadinya perubahan ionisasi enzim, substrat atau

kompleks enzim-substrat. Enzim menunjukkan aktivitas maksimum pada

kisaran pH optimum enzim dengan stabilitas yang tinggi (Winarno, 1989).

Pada reaksi enzimatik, sebagian besar enzim akan kehilangan aktivitas

katalitiknya secara cepat dan irreversible pada pH yang jauh dari rentang pH

optimum untuk reaksi enzimatik. Inaktivasi ini terjadi karena unfolding

molekul protein sebagai hasil dari perubahan kesetimbangan elektrostatik dan

ikatan hidrogen (Kazan dkk, 1997).

H. Senyawa Aditif

Senyawa aditif merupakan senyawa yang jika ditambahkan pada larutan enzim

akan meningkatkan stabilitas struktur protein enzim tanpa mempengaruhi

interaksi kovalen pada enzim. Pengaruh senyawa aditif terbatas pada interaksi

non kovalen dengan enzim atau pada sistem pelarut enzim (Wulandari, 2008).

Schwimmer (1981) menggolongkan zat aditif menjadi beberapa kelompok yaitu:

substrat, senyawa hidrofilik, larutan garam dan gula, ion logam, anion, polianion,

polikation, protein dan polimernya, inhibitor protease, senyawa pengkelat, anti

buih, serta senyawa pereduksi dan antioksidan. Golongan alkohol polihidrat

termasuk ke dalam senyawa hidrofilik. Senyawa hidrofilik akan menimbulkan

hidrasi sehingga konfirmasi protein terjaga dari kemungkinan “membuka”, artinya

25

konfirmasi aslinya cenderung tetap stabil. Senyawa ini sifatnya menarik air

(hidrofilik) sehingga dapat menurunkan aktivitas air. Selain itu penambahan

senyawa ini akan meningkatkan interaksi hidrofilik di antara protein enzim

sehingga diduga meningkatkan kestabilannya. Senyawa ini dapat bertindak

sebagai penangkap atau pengikat radikal bebas sehingga mengurangi

kemungkinan oksidasi terhadap enzim (Schwimmer, 1981).

I. Poliol (Alkohol Polihidrat)

Dalam industri polimer, senyawa poliol digunakan sebagai monomer pembentuk

polimer, pemlastis, pemantap, pelunak, dan sebagai bahan aditif lainnya untuk

pengolahan berbagai bahan polimer diantaranya PVC, polietilen, polipropilen,

poliamida, poliester, dan poliuretan (Goddete dkk., 1993).

Semakin besar berat molekul poliol maka makin tinggi pengaruhnya terhadap

stabilitas enzim. Pada penelitian akan dipelajari pengaruh penambahan sorbitol

terhadap stabilitas enzim selulase dari Rhizopus oligosporus. Sorbitol yang

biasanya dikenal sebagai glusitol adalah gula yang metabolismenya lambat dalam

tubuh. Sorbitol dihasilkan oleh reduksi glukosa dengan penggantian gugus

aldehid dengan gugus hidroksil. Sorbitol umumnya digunakan sebagai bahan

baku industri barang konsumsi pengganti gula dalam makanan diet dan permen

karet bebas gula, dan sering digunakan dalam kosmetik modern sebagai

penghilang noda. Sorbitol memiliki titik leleh 95°C, titik didih 296°C, massa

molekul sebesar 182,17 g.mol-1

, densitas sebesar 0,68 g.cm-3

, dengan nama

IUPAC heksana-1,2,3,4,5,6-heksanol (Hart dkk., 2003).

26

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2016 – Februari 2017 di

Laboratorium Biokimia, Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain alat-alat gelas, jarum ose,

pembakar spritus, mikropipet ependorff, batang pengaduk, neraca analitik,

pengaduk magnet, spatula, sentrifuga, autoclave model S-90N, lemari pendingin,

shaker incubator (orbit environ shaker), kolom kromatografi, waterbath, laminar

air flow CURMA model 9005-FL, thermometer, pH meter, magnetic stirer dan

spektrofotometer UV-VIS Hitachi U2010.

Bahan-bahan yang akan digunakan pada penelitian ini adalah Potato Dextrose

Agar (PDA), CMC (Carboxymethyl Cellulose), Yeast Ekstrak, (NH4)2SO4,

KH2PO4, CaCl2, MgSO4, urea, KCl, pepton, sorbitol, ammonium sulfat, akuades,

Na2CO3, NaOH, CuSO4.5H2O, reagen follin ciocalteau, Na/K-tartrat, NaH2PO4,

Na2HPO4, pereaksi DNS, kantong selofan dan kertas saring.

27

Mikroorganisme penghasil enzim selulase yang digunakan dalam penelitian ini

adalah jamur Rhizopus oligosporus yang diperoleh dari Laboratorium

Mikrobiologi dan Teknologi Bioproses Jurusan Teknik Kimia Institut Teknologi

Bandung.

C. Prosedur Penelitian

1. Penentuan kondisi optimum Rhizopus oligosporus untuk

memproduksi enzim selulase

a. Pembuatan media inokulum dan fermentasi (Sundari, 2012)

Media inokulum dan fermentasi dibuat dengan cara menimbang

bahan-bahan yang terdiri dari (NH4)2SO4 0,14 gr, KH2PO4 0,2gr; urea

0,03gr; CaCl2.2H2O 0,03gr; MgSO4.7H2O 0,03gr; FeSO4.7H2O

0,005gr; ZnSO4.7H2O 0,0014gr; pepton 0,75gr; CMC (Carboxymethyl

Cellulose) 0,75gr; dan yeast ekstrak 0,75gr, yang dilarutkan dalam

akuades sebanyak 100 mL dalam labu erlemmeyer 250 mL dan

disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121oC, tekanan 1 atm

selama 15 menit.

b. Inokulasi Rhizopus oligosporus

Sebanyak 1-3 ose biakan Rhizopus oligosporus dari media agar

miring diinokulasi dalam media inokulum secara aseptis, lalu dikocok

dalam shaker inkubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 35oC

selama 24 jam.

28

2. Produksi dan Isolasi enzim selulase

a. Produksi Enzim selulase

Produksi enzim selulase dilakukan pada kondisi optimum yang

diperoleh pada tahapan selanjutnya.

b. Isolasi enzim selulase

Setelah media fermentasi yang berisi Rhizopus oligospurus dikocok

menggunakan shaker inkubator pada suhu 35°C selama waktu

fermentasi optimum, selanjutnya dipisahkan enzim selulase dari

komponen sel lainnya menggunakan sentrifuga dengan kecepatan

putaran 5000 rpm, pada suhu 4oC selama 25 menit. Filtrat yang

diperoleh disebut ekstrak kasar enzim yang akan diuji aktivitasnya

dengan Metode Mandels dan diukur kadar proteinnya dengan Metode

Lowry.

Prinsip sentrifugasi berdasarkan kecepatan sedimentasi dengan cara

pemusingan. Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan enzim

ekstraseluler dari sisa-sisa sel. Sentrifugasi dilakukan pada suhu

rendah (di bawah suhu kamar) untuk menjaga kehilangan aktivitas

enzim (Suhartono, 1989).

3. Pemurnian enzim selulase

Pada penelitian akan dilakukan pemurnian enzim dengan fraksinasi

menggunakan ammonium sulfat dan dialisis. Proses pengerjaannya

sebagai berikut :

29

a. Pengendapan dengan ammonium sulfat [(NH4)2SO4]

Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan garam

ammonium sulfat pada berbagai derajat kejenuhan yaitu (0-20)%; (20-

40)%; (40-60)%; (60-80)%; dan (80-100)% untuk mengetahui pada fraksi

mana enzim selulase terendapkan. Skema proses pengendapan protein

enzim dengan penambahan garam ammonium sulfat ditunjukkan pada

Gambar 11.

Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh ditambahkan garam

ammonium sulfat secara perlahan sambil diaduk dengan magnetic stirer

pada suhu 4oC. Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi

kejenuhan ammonium sulfat dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi

dingin pada kecepatan 5000 rpm selama 30 menit. Kemudian diuji

aktivitasnya dengan metode Mandels, serta diukur kadar proteinnya

dengan metode Lowry. Selanjutnya, filtrat yang didapat dari fraksi (0-

20)% digunakan untuk diendapkan dengan fraksi kejenuhan selanjutnya

dengan prosedur yang sama.

30

Gambar 11. Skema proses pengendapan protein enzim dengan ammonium sulfat

b. Dialisis

Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi ammonium sulfat

dengan aktivitas spesifik yang tinggi dimasukkan ke dalam kantong

selofan dan didialisis dengan bufer fosfat 0,01 M pH 5 selama ±24 jam

pada suhu dingin. Selama dialisis, dilakukan pergantian larutan bufer

selama 4-6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat

dikurangi. Proses ini dilakukan secara kontinu sampai ion-ion di dalam

kantong dialisis dapat diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak

ada lagi ion-ion garam dalam kantong, maka diuji dengan menambahkan

larutan Ba(OH)2 atau BaCl2. Bila masih ada ion sulfat dalam kantong,

maka akan terbentuk endapan putih BaSO4. Semakin banyak endapan

+ (NH4)2SO4 (0-20%)

+ (NH4)2SO4 (20-40%)

Ekstrak Kasar Enzim

Endapan(F1) Filtrat

Endapan(F2) Filtrat

Endapan(F3) Filtrat

+ (NH4)2SO4 (40-60%)

Endapan(F4) Filtrat

+ (NH4)2SO4 (60-80%)

+ (NH4)2SO4 (80-100%)

Endapan(F5) Filtrat

31

yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantong.

Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode Mandels serta diukur

kadar proteinnya dengan metode Lowry.

4. Uji aktivitas enzim selulase

a. Pembuatan pereaksi untuk pengujian aktivitas enzim selulase

metode Mandels (Mandels et al., 1976)

Ke dalam labu ukur 100 mL, dimasukkan 1% NaOH, 1 mL Na(K)

tartarat 40%, 1% DNS (dinitrosalisilic acid), 0,2% fenol dan 0,05%

Na2SO3 kemudian dilarutkan dengan 100 mL akuades hingga tanda

batas.

b. Pengujian aktivitas enzim selulase metode Mandels

Metode ini berdasarkan glukosa yang terbentuk (Mandels et al.,

1976). Sebanyak 0,25 mL enzim, 0,25 mL larutan CMC 0,5% dalam

buffer fospat pH 5,0 dicampur lalu diinkubasi selama 60 menit pada

suhu 50oC. Kemudian ditambahkan 1 mL pereaksi DNS

(dinitrosalisilic acid) dididihkan selama 10 menit pada penangas air

dan didinginkan. Setelah dingin, campuran ditambahkan akuades

sebanyak 1,5 mLdan diukur absorbansinya menggunakan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 510 nm. Kadar

glukosa yang terbentuk ditentukan dengan menggunakan kurva

standar glukosa

32

5. Penentuan kadar protein enzim selulase

a. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran kadar protein enzim

selulase metode Lowry

Pereaksi A : 2 gram Na2CO3 dilarutkan dalam 100 mL NaOH

0,1N.

Pereaksi B : 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% ditambahkan ke

dalam 5 mL larutan Na/K-tartrat 1%.

Pereaksi C : 2 mL pereaksi B + 100 mL pereaksi A.

Pereaksi D : reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades

1:1.

Larutan standar : Larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan

kadar 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 ppm.

b. Penentuan kadar protein enzim selulase metode Lowry

Kadar protein enzim ditentukan dengan metode Lowry (1951).

Sebanyak 0,1 mL enzim yang akan diukur kadar proteinnya

ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan dengan 5 mL pereaksi

C dan campuran diaduk rata kemudian dibiarkan selama 10 menit

pada suhu kamar. Setelah itu ditambahkan dengan cepat 0,5 mL

pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit

pada suhu kamar. Untuk kontrol, 0,1 mL enzim diganti dengan 0,1

mL akuades, selanjutnya perlakuannya sama seperti sampel.

Serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada λ

750 nm. Untuk menentukan konsentrasi protein enzim yang

digunakan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin).

33

6. Penambahan sorbitol

Larutan poliol yang digunakan yaitu sorbitol. Larutan poliol ditambahkan

pada enzim hasil pemurnian dengan konsentrasi 0,5 M; 1 M; dan 1,5 M

dengan perbandingan 1:1.

7. Karakteristik enzim (sebelum dan setelah penambahan sorbitol)

Karakterisasi enzim sebelum dan setelah penambahan sorbitol meliputi:

penentuan pH dan suhu optimum, penentuan data kinetika (KM dan Vmaks),

serta penentuan kestabilan terhadap suhu dan pH.

a. Penentuan pH dan suhu optimum

1) Penentuan pH optimum

Untuk mengetahui pH optimum enzim sebelum dan setelah

penambahan sorbitol digunakan variasi pH sebagai berikut : 5,0;

5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan 8,0. Suhunya dijaga tetap pada 50°C,

kemudian dilanjutkan dengan pengukuran aktivitas enzim dengan

metode Mandels.

2) Penentuan suhu optimum

Untuk mengetahui suhu optimum kerja enzim sebelum dan

setelah penambahan sorbitol dilakukan dengan variasi suhu yaitu

40; 45; 50; 55; 60; 65; dan 70°C, pH tetap dijaga pada pH

optimum. Selanjutnya diuji aktivitas enzim dengan metode

Mandels.

34

b. Penentuan data kinetika enzim (nilai KM dan Vmaks)

Konstanta Michaelis-Menten (KM) dan laju reaksi maksimum (Vmaks)

enzim sebelum dan setelah penambahan sorbitol ditentukan dari kurva

Lineweaver-Burk. Kurva Lineweaver-Burk dibuat dengan menguji

aktivitas enzim selulase dengan variasi konsentrasi substrat 0,2; 0,4;

0,6; 0,8; 1 dan 1,25% dalam buffer phosfat pada pH 6 dan suhu 50°C

selama 60 menit. Selanjutnya diukur aktivitas enzim dengan metode

Mandels.

c. Uji stabilitas termal dan pH enzim (Yang et al., 1996)

Penentuan stabilitas termal enzim dilakukan dengan mengukur

aktivitas sisa enzim setelah diinkubasi selama 100 menit pada suhu

50°C dan pH 6. Caranya adalah dengan mengukur aktivitas enzim

setelah proses pemanasan setiap interval waktu 10 menit. Aktivitas

awal enzim (tanpa proses pemanasan) diberi nilai 100%.

Aktivitas sisa = perlakuan) (tanpa awal enzim Aktivitas

perlakuansetelah enzim Aktivitas x 100%

(Virdianingsih, 2002).

Secara keseluruhan penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang

ditunjukkan dalam Gambar 12.

35

Gambar 12. Diagram alir penelitian

Karakterisasi enzim

Penentuan pH

dan suhu

optimum

Penentuan KM

dan Vmaks

Uji Stabilitas

Termal dan

pH Enzim

Produksi enzim

Ekstrak kasar enzim

Pemurnian enzim :

1. Fraksinasi

2. Dialisis

Uji aktivitas enzim selulase

metode Mandels dan

penentuan kadar protein

metode Lowry.

Penambahan Sorbitol

Enzim setelah penambahan

Sorbitol

Uji aktivitas enzim

selulase metode

Mandels

Enzim Tanpa Sorbitol Enzim Tanpa Sorbitol Enzim Setelah Penambahan

Sorbitol

49

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan

bahwa:

1. Aktivitas spesifik enzim hasil pemurnian sebesar 35,2038 U/mg,

meningkat kemurniannya 10 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim

dengan aktivitas spesifik sebesar 3,48078 U/mg.

2. Enzim selulase hasil pemurnian mempunyai pH optimum 5,5 dan suhu

optimum 65oC, harga KM 18,69 mgmL

-1 substrat, dan harga Vmaks = 0,856

μmol mL-1

menit-1

.

3. Uji stabilitas enzim hasil pemurnian pada pH dan suhu optimum selama

60 menit memiliki aktivitas sisa (%) sebesar 5,61%, ki = 0,043 menit-1

,

t1/2 = 16,11 menit, dan ∆Gi = 98,77 kJ mol-1

.

4. Enzim hasil setelah penambahan sorbitol dengan konsentrasi 0,5; 1; dan

1,5 M mempunyai pH optimum yang sama dengan enzim hasil

pemurnian yaitu pH 5,5 dan suhu optimum yang sama yaitu 65oC.

5. Enzim setelah penambahan sorbitol dengan konsentrasi 0,5 M memiliki

nilai KM 17,37 mgmL-1

substrat, dan harga Vmaks = 0,596 μmol mL-1

menit-1

.

50

6. Enzim setelah penambahan sorbitol dengan konsentrasi 1 M memiliki

nilai KM 14,72 mgmL-1

substrat, dan harga Vmaks = 0,342 μmol mL-1

menit-1

.

7. Enzim setelah penambahan sorbitol dengan konsentrasi 1,5 M memiliki

nilai KM 11,33 mgmL-1

substrat, dan harga Vmaks = 0,223 μmol mL-1

menit-1

.

8. Enzim setelah penambahan sorbitol dengan konsentrasi 0,5; 1; dan 1,5M

memiliki nilai ki berturut-turut sebagai berikut : 0,039; 0,031; dan 0,027

menit-1

; waktu paruh berturut-turut sebagai berikut : 17,76 menit; 22,35

menit, dan 25,66 menit; ΔGi berturut-turut sebagai berikut : 99,32

kJ/mol; 99,65 kJ/mol; dan 100,23 kJ/mol.

9. Penambahan sorbitol pada enzim selulase hasil pemurnian dapat

meningkatkan kestabilan enzim terhadap pH dan suhu, penurunan nilai

ki, peningkatan waktu paruh dan ∆Gi. Hal ini menunjukkan bahwa enzim

hasil modifikasi lebih stabil dibandingkan dengan enzim hasil pemurnian.

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka disarankan untuk

menggunakan konsentrasi sorbitol yang lebih tinggi lagi dari penelitian

sebelumnya untuk melihat kestabilan enzim terhadap sorbitol pada

konsentrasi yang lebih tinggi.

DAFTAR PUSTAKA

Agustien. A. and Munir. E. 1997. Purifikasi penisilin asilase dari Bacillus.

Prosiding Seminar Wawasan Keilmuan Untuk Meningkatkan Kualitas

Pembangunan Bangsa Indonesia. Malaysia. PPI Universitas Sains

Malaysia. 270-177.

Ahern, T.J.and A.M. Klibanov. 1987. Why do enzyme irreversibly inactive at

high temperature. Biotec 1. Microbial Genetic Engineering and Enzyme

Technology. Gustav Fischer. Stuttgart. New York.

Campbell, Neil A. 2002. Biologi. Erlangga. Jakarta.

Chalal, D.S 1983. Growth Characteristic Of Microorganism In Solid State

Fermentation For Uppgrading Of Protein Values Of Lignocelluloses And

Cellulose Production. American Chemical Society: 205 – 310.

Cooper, Donald R., dan Emory, William C. 1997. Metode Penelitian Bisnis.

Erlangga, Jakarta.

Duff, S.J.B and Murray, W.D. 1996. Bioconvertion of forest products industry

waste cellulosics to fuel ethanol: a review. Bioresource Technology.

Dryer, R.L. 1993. Biokimia. Jilid 1. UGM Press. Yogyakarta. 180-181.

Eijnsink, G.H., G. Sirgit, V. Torben, and Bertus van de Burg. 2005. Directed

Evolution of Enzym Stability. Biomolecular Engineering. Elsevier Science

Inc. New York. 23: 21-30.

Fitriyanti. 2014 . Peningkatan Kestabilitas Enzim selulase dari Bacillus subtilis

ITBCCB148 Dengan Modifikasi Kimia Menggunakan Sianurat Klorida

Polietilenglikol (CC-PEG). (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar

Lampung.

52

Francis, G.E., C. Delgado and D. Fisher. 1992. PEG-modified Proteins In

Stability of Protein Pharmaceuticals Part B. Ahern, T.J. and M. C.

Manning editor. Plenum Press. New York. 246-247.

Fessenden, R.J. dan Fessenden J.S. 1982. Kimia Organik. Jilid 2. Alih bahasa oleh

Aloysios H.P. Erlangga. Jakarta.

Goddete, D.W., C. Terri, F.L. Beth, L. Maria, R.M. Jonathan, P. Christian, B.R.

Robert, S.Y. Shiow, and C.R. Wilson. 1993. Strategy and implementation

of a system for protein engineering. Journal of Bioechnology. 28: 41-54.

Grisham, Charles M.; and Reginald H. Garrett. 1999. Biochemistry. Saunders

College Pub. Philadelphia.

Gunam, I.B.W, Hardiman, T. Utami, 2004. Chemical Pretreatments on Bagasse to

Enhance Hydrolysis of Its Cellulose Enzymatically. The 3th Hokkaido

Indonesian Student Association Scientific meeting (HISAS 3). Sapporo.

Hart, H. 1983. Kimia Organik. Erlangga. Jakarta.

Kasmidjo. 1990. Tempe, Mikrobiologi dan Biokimia Pengolahan serta

Pemanfaatannya. Semarang: Soegijapranata Press.

Kamelia, R., Muliawati S. and Dessy N. 2005. Isolasi dan Karakterisasi Protease

Intraseluler Termostabil dari Bakteri Bacillus stearothermophilus RP1.

Seminar Nasional MIPA. Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor.

Bogor.

Kazan, D., H. Ertan and A. Erarslan. 1997. Stabilization of Escherichia coli

Penicillin G acylase agains thermal Inactivation by cross-linking with

dextran dialdehyde polymers. Applied. Microbiology and Biotechnology.

48: 191-197.

Koolman, J. 2001. Atlas Berwarna dan Teks Biokimia. Penerbit Hipokrates.

Jakarta.

Kwon, D.Y. and Rhee, J.S. 1986. A Simple and Rapid Colometric Method for

53

Determination of Free Fatty Acid for Lipase Assay. J.A.O.C.S. 63. 69-92.

Lay, B. W. and Sugyo,H. 1992. Mikrobiologi. Rajawali Pers. Jakarta. 107-112.

Lee, S.M., and Koo, Y.M. 2001. Pilot scale production of cellulose using

Trichoderma reesei Rut C-30 in fed-batch mode. Journal of Microbiology

and. Biotechnology. 11: 229-233

Lehninger, A. L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid 1. Alih bahasa oleh Maggy

Thenawidjaya. Erlangga. Jakarta. 369 halaman.

Lehninger, A. L. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid 1. Alih bahasa oleh Maggy

Thenawidjaya. Erlangga. Jakarta.

Lowry, O. H., N. J., Rosebrough, A. L., Farr, R. J. Randall. 1951. Protein

measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biology and

Chemistry. 193-265.

Mandels, M., A. Raymond, R. Charles. 1976. Measurement of saccharifying

cellulose. Biotechnology and Bioengineering. John Wiley & Sons Inc.

Martoharsono, S. 1993. Biokimia. Jilid I. UGM-Press. Yogyakarta. 81-83.

Martoharsono, S. 2006. Biokimia. Jilid I. UGM-Press. Yogyakarta. 91 halaman.

McPhie, J., Doyle, M., & Allen, R., 1971, Volcaniclastic Textures, A Guide To

Interpretastion of textures in volcanic rocks, Centre of Ore Depostit and

Exploration Studies Universuty of Tasmania, Tasmania,

Murray, R.K. dkk. 2003. Biokimia Klinik Edisi 4. Jakarta :EGC.

Page, D.S. 1997. Prinsip-Prinsip Biokimia. Erlangga. Jakarta. 465 halaman.

Page, D.S. 1989. Prinsip-Prinsip Biokimia. Erlangga. Jakarta. 386 halaman.

54

Pelczar, M.J. and E. C. S. Chan. 1986. Dasar- Dasar Mikrobiologi. UI Press.

Jakarta. 409 halaman.

Perry, H. Robert, and D.W. Green. 1999. Chemical Engineering Handbook 7th

Edition. McGraw-Hill Book Company. New York.

Pitt, J.I dan Hocking, A.D, 1985. Fungi and Food Spoilage. Academic Press,

Sydney.

Poedjiadi, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. UI Press. Jakarta.

Poedjiadi, A. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. UI Press. Jakarta. 155-160.

Pohl, T. 1990. Concentration of Protein Removal of Salute dalam M.P. Deutscher,

Methods of Enzymology. Guide to Protein Purification. 182. Academic

Press. New York.

Reed, G.. 1975. Enzymes in Food Processing. Academic Press. New York. 212.

Reese, E.T. 1976. History of cellulase program at U.S. Army Natick Development

Center. Biotechnology and Bioengineering. Vol: 6. John Wiley & Sons

Inc.

Rodwell, V.W. 2011. Harper’s Review of Biochemistry. EGC Kedokteran.

Jakarta.

Samson, R. A. dan Hoekstra, E. S. 2004. Introduction to Food and Airborne

Fungi 7 edition. CBS. Utrecht, Netherland.

Sariningsih, R. 2000. Produksi Enzim Protease oleh Bacillus subtilis BAC-4.

(Skripsi). UNPAD. Bandung.

Shahib, N. 2005. Biologi Molekular Medik I. Unpad Press. Bandung. 164-167.

Schwimmer, S. 1981. Source Book of Food Enzymology. AVI Publishing Co., Inc.

Connecticut.

Scopes, R.K. 1982. Protein Purification. Springer Verlag. New York.

55

Sjostrom, E. 1995. Kimia Kayu: Dasar – dasar dan Penggunaan. Jilid 2.

Yogyakarta: Universitas Gajah Mada Press.

Stahl, S. 1999. Thermophilic Microorganism: The Biological Background for

Thermophily and Thermoresistence of Enzyme in Thermostabilyty of

Enzyme. Gupta M. N editor. Springer Verlag. New Delhi. 59-60.

Suhartono. M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Penelitian Antar Universitas.

IPB. Bogor.

Suhartono, M.T., A. Suwanto, dan H. Widjaja. 1992. Diklat Struktur dan

Biokimiawi Protein. Penelitian Antar Universitas. IPB. Bogor.

Sundari, Eka Sulis. 2011. Peningkatan Kestabilitas Enzim α-amilase dari Bacillus

subtilis ITBCCB148 Dengan Modifikasi Kimia Menggunakan Sitrakonat

Anhidrida. (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Virdianingsih, R. 2002. Mempelajari Stabilitas Termal Enzim Protease dari

Bacillus pumilus y1 dalam Pelarut Heksana, Toluena, dan Benzena.

(Skripsi). Institute Pertanian Bogor. Bogor.

Walsh, G., and D.R. Headon. 1994. Protein Biotechnology. John Willey and Sons.

New York.

Watson, J. D. 1987. Molecular Biology of the Gene. CSHL Press. USA.

Weagen ES. 1984. Strategies for increasing the stability of enzymes, in enzyme

engineering. The New York Academy of Sciences, New York. 7 : 1 – 19.

Wilda, L.S., S. Sumaryati. and Jamsari. 2013. Optimization of Protease Activity

from Lactic Acid Bakteria (Lab) pediococcus pentosaceus Isolated from

Saursop Fermentasi (Annona muriatal). Jurnal Kimia Unand (ISSN No.

2303-3401). 2(1).

Wirahadikusumah, M. 1989. Biokimia: Protein, Enzim dan Asam Nukleat. ITB.

Press. Bandung. 102 halaman.

56

Wirahadikusumah, M. 1997. Biokimia: Protein, Enzim dan Asam Nukleat. ITB.

Press. Bandung. 91 halaman.

Winarno, F.G. 1989. Enzim Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utama.

Jakarta.

Winarno, F.G. 2002. Enzim Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utama.

Jakarta.

Wolfe, S.L. 1993. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Publishing

Company. California.

Wulandari, P. 2008. Studi Pengaruh Penambahan Poliol Terhadap Stabilitas

Termal Enzim α-amilase dari Rhizopus oryzae. (Skripsi). Universitas

Lampung. Bandar Lampung.

Wyk, J.P.H.V., M. Mohulatsi. 2003. Biodegradation of wastepaper by cellulase

from Trichoderma viride. Bioresource Technology. 86: 21–23.

Yandriano, V. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Enzim Amilase dari Bakteri

Alkaloteron Asal Limbah Cair Tapioka di Daerah Karang Rejo Jati Agung

Lampung Selatan. (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Yang, Z., D. Michael, A. Robert, X.Y. Fang and J.R. Alan. 1996. Polyethylene

glycol-induced stabilization of subtilisin. Enzyme Microb. Technol. 18:

82-89.