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BIOLOGICAL CONTROL

Potencial de Isolados deMetarhizium anisopliae e Beauveria bassianae do leo de Nim no Controle do Pulgo Lipaphis erysimi (Kalt.)

(Hemiptera: Aphididae)JOS M DEARAUJO JR, EDMILSON J MARQUES, JOS V DE OLIVEIRA

Dept.o de Agronomia Entomologia, Univ. Federal Rural de Pernambuco, Av. Dom Manoel de Medeiros s/n, DoisIrmos, 52171-900, Recife, PE; jma_junior@yahoo.com.br; emar@depa.ufrpe.br; vargasoliveira@uol.com.br

Edited by talo Delalibera Jr ESALQ/USP

Neotropical Entomology 38(4):520-525 (2009)

Potential ofMetarhizium anisopliae and Beauveria bassiana Isolates and Neem Oil to Control the AphidLipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae)

ABSTRACT -This work aimed to determine the efficiency of the entomopathogenic fungiMetarhiziumanisopliae andBeauveria bassiana to control the aphid Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera:Aphididae)in kale Brassica oleracea var acephalaD.C., as well as their compatibility with a neem oil formulation(Neemseto). Ten isolates of both fungi were tested and the most pathogenic ones were B. bassianaCG001 andM. anisopliaeCG30with 90% and 4.4 days, and 64% and 3.8 days of mortality andmedianlethal time, respectively. Bioassays with neem at concentrations of 0.5, 1.0 and 2.0% were done eitherby leaf discs dipping or spraying the aphids on the leaf discs. The neem spraying treatment at 2.0%provided 90% mortality. The use of B. bassiana isolate CG001 or M. anisopliae isolate CG30 withneem at 0.125, 0.25, and 0.5%, demonstrated that these isolates could have their spore viability orcolony growth affected when exposed to neem concentrations higher than 0.25%. In absolute values,the isolates B. bassiana CG001 andM. anisopliae CG30 are the most virulent to L. erysimi, and couldbe utilized in the management of this pest.

KEYWORDS: Entomopathogenic fungi, botanic insecticide, compatibility, crucifer

RESUMO - Avaliou-se a eficincia de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana para o controledo pulgo Lipaphis erysimi (Kalt.) em couve Brassica oleracea L. var. acephala D.C., bem como suacompatibilidade com leo de nim (Neemseto). Dez isolados desses fungos foram utilizados, ondeo isolado CG 001 de B. bassiana e o isolado CG 30 de M. anisopliae apresentaram-se como os maisvirulentos com 90% e 4,4 dias, e 64% e 3,8 dias, de mortalidade e tempo letal mdio, respectivamente.Bioensaios com o produto base de nim nas concentraes 0,5; 1,0 e 2,0% foram realizados porimerso foliar e pulverizao sobre os pulges. O tratamento com pulverizao de 2,0% de Neemsetoproporcionou mortalidade de 90%. O teste in vitro de Neemseto a 0,125; 0,25 e 0,5%, sobre osisolados CG 001 de B. bassiana e CG 30 de M. anisopliae mostrou que esses isolados podem ter seucrescimento colonial e viabilidade alterados quando expostos a concentraes de nim maiores que0,25%. Em valores absolutos, os isolados CG 001 de B. bassiana e CG 30 deM. anisopliae foram osmais virulentos para L. erysimi, podendo ser utilizados no manejo dessa praga.

PALAVRAS-CHAVE: Fungo entomopatognico, inseticida botnico, compatibilidade, crucfera

A produtividade das brassicceas pode ser reduzida pelapresena de vrios insetos, com destaque para os pulgesBrevicoryne brassicaeL,Myzus persicae (Sulzer) e Lipaphiserysimi (Kaltenbach) (Sousa-Silva& Ilharco 1995, Blackman&Eastop 2000).As ninfas e os adultos de L. erysimi sugam aseiva das folhas, brotos jovens e inflorescncia, resultando atmesmo namorte da planta.Adicionalmente, podem transmitirviroses, como o vrus do mosaico do pepino e do feijoeiro

(Castle et al 1992).Atualmente, o controle de pulges baseia-se no uso

de inseticidas qumicos sintticos e produtos alternativoscomo o alho, arruda, confrei (Symphytum officinali), fumoe outros (Abreu Jr 1998). Os pulges, entretanto, possuemalta capacidade reprodutiva e com a aplicao intensiva deinseticidas, pode ocorrer desenvolvimento de resistncia(Zheng et al 1997), levando busca de novas alternativas

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para o controle desses insetos, como o controle biolgico,a utilizao de inseticidas naturais, e at mesmo a interaoentre esses dois agentes de controle.

O controle microbiano com o uso de entomopatgenos,principalmente fungos, tem se destacado devido ocorrnciadosmicroorganismos em condies naturais, tanto enzoticacomo epizoticamente, e tem sido, no Brasil e em outrospases, um fator importante na reduo de populaes deinsetos. Os fungos entomopatognicos Beauveria bassianae Metarhizium anisopliae so mundialmente conhecidos eutilizados como agentes biocontroladores de pragas agrcolasde vrias espcies em diversas ordens (Alves et al 2008),inclusive Hemiptera, como os pulges (Butt et al 1994,Loureiro & Moino Jr 2006).

Os produtos base de azadiractina, encontradaprincipalmente nas sementes de nim, esto entre os principaismtodos alternativos para o controle de pulges (Schmutterer1990, Mordue & Nisbet 2000). Os efeitos da azadiractinasobre insetos incluem repelncia, deterrncia alimentar,interrupo do crescimento, interferncia na metamorfose,esterilidade e anormalidades anatmicas (Mordue & Nisbet2000, Martinez & Emden 2001, Venzon et al 2007, Santoset al 2004).

Testes de compatibilidade de produtos fitossanitrioscom fungos entomopatognicos in vitro mostram queesses produtos promovem grande variao de resposta e,dependendo do produto qumico, podem ser observadosefeitos deletrios, nulos ou mesmo sinrgicos sobre essesagentes de controle microbiano (Alves et al 1998).

O presente trabalho teve por objetivos avaliar a eficinciada aplicao de nim formulado e de isolados deMetarhiziumanisopliae e Beauveria bassiana no controle do pulgo L.erysimi, e avaliar, in vitro, o efeito de nim sobre os fungos.

Material e Mtodos

Criao de pulges, obteno emultiplicao dos isoladosdos fungos. Lipaphis erysimi foi coletada na horta daUFRPEe criada sobre plantas de couve-folha B. oleraceae var.acephala, mantidas em casa-de-vegetao em vasos plsticosde 1 L, contendo mistura de solo mais esterco (2:1).

Os isolados utilizados de M. anisopliae e B. bassianaso mantidos na micoteca do Laboratrio de Patologia deInsetos daUFRPE.Os isolados selecionados (Tabela 1) forammultiplicados em BDA (batata-dextrose-gar) e MC (meiocompleto), constitudo de extrato de levedura, glicose, saisminerais, gar e gua destilada (Alves 1998).

Seleo de isolados. O experimento foi conduzido emdelineamento inteiramente casualizado, com 21 tratamentose 10 repeties, sendo cada parcela constituda por 10 ninfasdo pulgo L. erysimi com 24-48h de idade, de primeiro ousegundo instar (Godoy & Cividanes 2002).

Os isolados foram multiplicados em placas de Petricom BDA + antibitico (estreptomicina) e mantidos emestufa incubadora B.O.D. a 26 1C, com fotofase de 12h.Em seguida, foram preparadas as suspenses fngicas,adicionando-se 10 ml de gua destilada esterilizada mais

espalhante adesivo Tween 80 a 0,01% (ADE + espalhante).Aps diluies sucessivas, obtiveram-se suspenses nasconcentraes de 107 condiosml-1, que foram utilizadas paraos testes de patogenicidade. A viabilidade dos condios foiaferida emmicroscpio ptico 20h aps o plaqueamento emBDA + antibitico (sulfato de estreptomicina a 0,05%).

Para os bioensaios com pulverizao, dez ninfas foramcolocadas sobre discos de folhas de couve com 5 cm dedimetro, mantidas em placas de Petri plsticas de 9 cmde dimetro com meio gar-gua (1%) (Loureiro & MoinoJnior 2006). Os discos de folhas contendo os insetosforam pulverizados com 1 ml das suspenses fngicas naconcentrao de 107 condios ml-1 e com gua destilada maisespalhante adesivo Tween 80 (testemunha), utilizando-se omicroatomizador PaascheAirbrush eltrico, modelo VL,acoplado a um compressor regulado para 15 libras/pol2 depresso. Em seguida, os discos foram deixados em placasde Petri plsticas perfuradas nas tampas e cobertas com telaanti-afdeo, a 26 2 C, 70 10% de UR e fotofase de 12h.A mortalidade foi avaliada diariamente, sendo os insetosmortos transferidos para placas de Petri com papel de filtroumedecido para confirmao do agente causal.

Os dados demortalidademdia foramanalisadosmedianteanlise de varincia (ANOVA), utilizando o ProcANOVAdoSAS (SAS Institute 1999-2001), e asmdias comparadas peloteste de Tukey a 5% de probabilidade quando significativo,sendo os dados transformados para (x + 0,5).

Apartir dos dados demortalidade confirmada, certificadaaps a extruso micelial do fungo no corpo do inseto morto,determinou-se a porcentagem de sobrevivncia mdia em10 dias. As mdias de sobrevivncia foram submetidas aostestes Log-Rank, atravs do mtodo Kaplan-Meyer, porcomparao de pares de isolados usando o Proc Lifetest doSAS (SAS Institute 1999-2001).

Ao de nim sobre L. erysimi. Na primeira etapapulverizaram-se emulses de leo de nim adquiridasatravs do produto comercial Neemseto (Cruangi Neemdo Brasil Ltda, Timbaba, PE), que contm 2,389 ppm deprincpio ativo (azadirachtinaAe B, nimbina e salanina), nasconcentraes de 0,5, 1,0 e 2,0% sobre discos de folha decouve com 5 cm de dimetro, infestadas com 10 ninfas dopulgo com 24-48h de idade, em placas de Petri contendomeio gar-gua (1%).

Para a segunda etapa, os discos de folhas foramimersos por 20 segundos em emulso de leo de nim nasconcentraes citadas anteriormente, sendo em seguidainfestados com 10 ninfas do pulgo por repetio.Na testemunha, os discos contendo os pulges forampulverizados com gua destilada. O delineamentoexperimental utilizado foi inteiramente casualizado comsete tratamentos e 10 repeties cada.

As avaliaes foram realizadas diariamente, por umperodo de 10 dias. Os insetos mortos foram coletados,sendo os dados de mortalidade mdia submetidos anlisede varincia (SAS Institute 1999-2001). As mdias foramcomparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade,quando significativas, sendo os dados transformados para (x + 0,5).

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Efeito in vitro do leo de nim sobre o crescimento,esporulao e viabilidade deM. anisopliae e B. bassiana.Foram avaliados os isolados CG 001 de B. bassiana eCG 30 de M. anisopliae, selecionados como os maiseficientes no controle do pulgo. Em funo dos resultadosexperimentais verificados em outros trabalhos (Marques etal 2004, Depieri et al 2005), o Neemseto foi utilizado nasconcentraes de 0,125, 0,25 e 0,5%. Com o meio BDAainda lquido temperatura prxima de 40C, adicionou-se o produto nas referidas concentraes e, em seguida, amistura foi vertida em placas de Petri (20 ml/placa). Devidos baixas concentraes utilizadas, obteve-se uma misturauniforme do produto com o meio. Aps a solidificao, osentomopatgenos foram inoculados tocando-se, com ajudade uma pina, um fragmento de slica gel impregnado com osfungos em trs pontos por placa, trs placas por tratamento,em cmara de fluxo laminar.

Em seguida, as placas foram mantidas em B.O.D. (26 1C e fotofase de 12h) por um perodo de 14 dias.Aps esseperodo, foi aferido o dimetromdio das colnias e contadoso nmero de condios produzidos por colnia (Alves 1998).

Essa etapa do experimento foi realizada em delineamentointeiramente casualizado, constando de sete tratamentos,onde cada tratamento foi composto por trs placas de Petricom trs colnias do fungo em cada, sendo avaliadas apenasseis colnias.

Para os testes de viabilidade, foi adicionado 1 ml dasuspenso de 107 condios ml-1s emulses do Neemseto nasconcentraes de 0,125, 0,25 e 0,5%.Decorridos 60minutos,alquotas de 0,1ml dessamistura foram espalhadas em placasde Petri contendo meio de cultura BDA+A. Na testemunhautilizou-se a suspenso do fungo diluda em ADE+E. Paracada tratamento foram realizadas quatro repeties (placas).Aps 20h avaliou-se a germinao dos condios, dividindo-seas placas em quatro quadrantes, quantificando-se os condiosgerminados e no-germinados (100 condios/quadrante), sobmicroscpio ptico.

Para a classificao da compatibilidade do produtocom os entomopatgenos foi utilizado o modelo IB (ndiceBiolgico), desenvolvido por Alves et al (2007), paracaracterizar a compatibilidade de fungos entomopatognicoscom produtos inseticidas in vitro, emmeio de cultura slido.

URPE = Universidade Federal Rural de Pernambuco; ESALQ = Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba-SP; CG = CENARGEN - Recursos Genticos e Biotecnologia, Braslia-DF; PL = PLANALSUCAR (Programa Nacional deMelhoramento da Cana-de-acar); URM = Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE); E =EMCAPA, Vitria-ES

Tabela 1 Origem e hospedeiro dos isolados deBeauveria bassiana eMetarhizium anisopliae utilizados nos experimentoscom Lipaphis erysimi.

Isolados Origem HospedeirosB. bassianaCG 001 Brasilia-DF Deois flavopicta (Stal)ESALQ-447 Cuiab-MS Solenopsis invicta (Buren)ESALQ-645 Piracicaba-SP Amostra de soloESALQ-604 Piracicaba-SP Amostra de soloURPE-4 Recife-PE Membracis sp.URPE-8 Recife-PE Membracis foliata L.URPE-9 Paudalho-PE M. foliataURPE-14 Escada-PE Amostra de soloURPE-18 Cabo de Santo Agostinho-PE Amostra de soloURPE-22 Chapada Diamantina-BA PercevejoM. anisopliaeCG 30 Esprito Santo D. flavopictaE9 Vitria-ES D. flavopictaESALQ-1189 Piracicaba-SP Amostra de soloESALQ-1204 Piracicaba-SP M. foliataESALQ-866 Goinia-GO Atta sp.PL 43 Flexeiras-AL Mahanarva posticata (Stl)PL 47 Campos-RJ M. posticataURM-4407 So Miguel da Mata-AL M. posticataURPE-6 Camaragibe-PE Periplaneta americana L.URPE-19 Vitria de Santo Anto-PE Amostra de solo

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Assim, foram calculados os valores percentuais mdiosde esporulao e crescimento vegetativo das colnias dosfungos com relao testemunha, sendo aplicada, para cadaconcentrao do produto, a seguinte frmula:

IB = [47 (CV) + 43 (ESP) + 10 (GERM)] / 100, onde:IB = ndice biolgicoCV= Porcentagem de crescimento vegetativo em relao

testemunhaESP = Porcentagem de esporulao das colnias em

relao testemunhaGER = Porcentagem de germinao dos condiosOs valores de IB para a classificao dos produtos

so: txico 0-41, moderadamente txico 42-66 e com-patvel > 66.

Resultados e Discusso

Testes de patogenicidade dos isolados. Os condios dosisolados de B. bassiana e de M. anisopliae apresentaramviabilidades superiores a 95%. A mortalidade confirmada eo tempo mdio de sobrevivncia dos pulges, obtidos dosisolados de ambos os fungos,mostramvirulncia varivel paraos isolados deB. bassiana (F10; 99 = 11,36; P< 0,0001) (Tabela2), bem como paraM. anisopliae (F10;99 = 24,07; P < 0,0001)(Tabela 3). Os valores porcentuais mdios de sobrevivncia,ao final dos 10 dias de avaliao, foram estatisticamentediferentes, variando de 4,4 a 7,3 dias (2Gl=9 = 178,06; P