Optimalisasi Produksi Steviosida dari Kalus Daun Stevia rebaudiana Bertoni

dengan Variasi Kombinasi Zat Pengatur Tumbuh

Optimization of Stevioside Production from Callus Derived from Stevia rebaudiana

Bertoni Leaves with Variation of Plant Growth Regulators Combination

Aditya Fendy Heryanto1, C. J. Soegihardjo2, L.M. Ekawati Purwijantiningsih3

Fakultas Teknobiologi Universitas Atma Jaya Yogyakarta

Jln. Babarsari No. 44, Yogyakarta 55281

fendyloe@yahoo.com

Abstrak

Steviosida merupakan salah satu metabolit sekunder dari tanaman Stevia rebaudiana

yang digunakan sebagai pemanis alami non kalori. Steviosida memiliki rasa manis 300 kali

dari sukrosa dan telah diuji tanpa efek samping. Kemampuan biji stevia untuk berkecambah

sangat rendah dan perbanyakan secara vegetatif juga terbatas. Oleh karena itu, kultur in vitro

digunakan untuk produksi metabolit sekunder. Penelitian ini bertujuan untuk mengoptimasi

produksi steviosida dari kalus daun stevia yang diinduksi dengan 2,4-D 1 mg/l dan dipelihara

dengan berbagai variasi kombinasi ZPT (2,4-D 0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l + Kin 1 mg/l; NAA

0,1 mg/l + BAP 2 mg/l; NAA 2 mg/l; IBA 2 mg/l + BAP 2 mg/l dan 2,4-D 1 mg/l) pada medium

½ MS dan NP. Data kuantitatif yang diperoleh meliputi kecepatan waktu induksi kalus,

persentase induksi kalus, indeks pertumbuhan kalus dan kandungan steviosida, sedangkan data

kualitatif yang diperoleh meliputi morfologi kalus (warna dan tekstur kalus). Kandungan

steviosida pada kalus diukur menggunakan kromatografi lapis tipis-densitometri dengan eluen

aseton : etil asetat : air (5:4:1) sebagai fase geraknya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa

tidak ada perbedaan kecepatan waktu induksi kalus pada medium ½MS dan NP. Jumlah kalus

yang terinduksi mencapai 70,2% dengan tekstur kompak dan berwarna putih kekuningan.

Harga Rf steviosida diperoleh antara 0,31 – 0,34 dengan λ maksimum 289 nm. Indeks

pertumbuhan kalus tertinggi dan kadar steviosida tertinggi diperoleh dari kombinasi IBA 2

mg/l + BAP 2 mg/l. Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa tidak adanya korelasi antara

indeks pertumbuhan dengan kadar steviosida. Kadar steviosida pada daun stevia masih lebih

tinggi dari kalus daun stevia.

Kata kunci : Stevia rebaudiana, steviosida, kalus, KLT-densitometri

Abstract

Stevioside is one of secondary metabolites from Stevia rebaudiana which has used

widely as a non-caloric natural sweetener. Stevioside has 300 times sweeter than sucrose and

have been tested without side effect. Stevia seeds show a very low germination and vegetative

propagation is also limited. Therefore, in vitro cultre can be used for secondary metabolites

production. The aim of this research is to optimized stevioside production form callus derived

from stevia leaves induced by 2,4-D 1 mg/l and maintained with variation of plant growth

regulators combination (2,4-D 0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l + Kin 1 mg/l; NAA 0,1 mg/l + BAP 2

mg/l; NAA 2 mg/l; IBA 2 mg/l + BAP 2 mg/l dan 2,4-D 1 mg/l) on ½MS and NP medium.

Quantitative data obtained such as callus initiation, percentage of induction, growth index and

stevioside content, while qualitative data obtained such as callus morphology (colour and

texture of callus). Stevioside content was evaluated through thin layer cromatography-

densitometry with aceton : ethyl acetate : water (5:4:1) as mobile phase. Result showed that

there was no difference of callus induction between ½MS and NP medium. Percentage of callus

induction is about 70,2% with compact texture and creamy colour. Rf value of stevioside is

between 0,31 – 0,34 with λ maximum 289 nm. Highest of callus growth index and stevioside

content in callus shows from IBA 2 mg/l + BAP 2 mg/l combination. The result also show that

there is no correlation between callus growth index and stevioside content. Stevioside content

in stevia leaves still higher than callus derived from stevia leaves.

Key words : Stevia rebaudiana, stevioside, callus, TLC-Densitometry

PENDAHULUAN

Stevia (Stevia rebaudiana) merupakan salah satu jenis tanaman obat di Indonesia yang

memiliki keunikan berupa rasa manis pada daunnya. Komponen utama yang memberikan rasa

manis dan terkandung paling banyak pada daun stevia adalah steviosida (Daneshyar dkk.,

2010), yang diperkirakan 300 kali lebih manis dari sukrosa (Geuns, 2008). Bahan pemanis ini

telah digunakan di banyak negara sebagai pemanis alami non-kalori, sehingga dapat

direkomendasikan untuk penderita diabetes mellitus tipe 2 dan penderita obesitas

(Jagatheeswari dan Ranganathan, 2012). Penggunaannya juga telah diuji dan tidak memberikan

efek samping (Megaji dkk., 2005 dalam Sairkar dkk., 2009).

Potensi yang dimiliki oleh stevia menjadi perhatian banyak orang sehingga banyak pula

keinginan untuk mengembangkan tanaman ini. Kemampuan biji stevia untuk berkecambah

sangatlah rendah dan propagasi secara vegetatif juga terbatas dilakukan karena rendahnya

jumlah individu yang dapat diperoleh dari satu tanaman induk (Saikar dkk., 2009 ; Janarthanam

dkk., 2010). Oleh karena itu, kultur in vitro dapat menjadi alternatif dan sebagai sumber yang

efisien untuk produksi metabolit sekunder (Janarthanam dkk., 2010).

Pada penelitian ini, medium kultur yang digunakan adalah medium ½ MS dan NP,

sedangkan eksplan yang digunakan adalah bagian daun dari tanaman stevia yang masih muda.

Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui kombinasi ZPT yang optimum untuk

menginduksi kalus dan untuk memproduksi steviosida dari eksplan daun pada medium MS.

Pada penelitian ini dilakukan dua tahap penelitian. Tahap pertama merupakan tahap induksi

kalus daun stevia pada medium ½ MS dan medium NP yang diberi hormon 2,4-D 1 mg/l. Tahap

kedua merupakan tahap pemeliharaan kalus untuk produksi steviosida pada medium ½ MS dan

NP dengan variasi kombinasi ZPT.

METODE PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang dilaksanakan pada bulan

Desember 2013 sampai Mei 2014 di Laboratorium Teknobio-Industri, Fakultas Teknobiologi,

Universitas Atma Jaya Yogyakarta. Tahap pengujian kualitatif dan kuantitatif steviosida

dilakukan di Laboratorium Kimia Analisis Instrumen dan Laboratorium Farmakognosi-

Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma.

Alat-alat yang digunakan adalah erlenmeyer, botol kultur, botol jam, petridish,

autoklaf, gelas ukur, gelas beker, pinset, skalpel, blade, bunsen, timbangan analitik,

mikropipet, tip, pH meter, hot plate magnetic stirer, laminar air flow, aluminium foil, kertas

payung, karet gelang, kertas saring, plastic wrap, lumpang porselin, mortar, vortex, tabung

reaksi, pipet ukur, propipet, pipet tetes, oven Venticell, termometer, rak kultur, plat KLT silika

gel 60 F254, sprayer pompa, chamber, Camag Linomat V Applicator, Camag TLC Scanner 3.

Bahan-bahan yang digunakan yaitu daun stevia dari tanaman Stevia rebaudiana yang

diperoleh dari CV. Sky Central Surakarta, aquades, alkohol 70%, fungisida Masalgin,

bakterisida Agrept, sabun cair, medium Murashige and Skoog (MS), medium New

Phalaenopsis (NP), agar bacteriological, Plant Preservative Mixture (PPM), 2,4-D, IBA,

NAA, BAP, Kinetin, larutan NaClO 20%, tween 20, metanol absolut, aseton, etil asetat, reagen

Liebermann-Burchard dan steviosida 90% sebagai standar yang diberi oleh Prof. Jan M. C.

Geuns (Katholieke Universiteit Leuven, Haverlee-Belgia).

Parameter yang diamati meliputi kecepatan waktu induksi kalus, persentase induksi

kalus, indeks pertumbuhan kalus, morfologi kalus (warna dan tekstur kalus) dan kandungan

steviosida baik secara kualitatif dan kuantitatif. Kadar steviosida pada kalus diukur pada

minggu ke-6 setelah inokulasi menggunakan kromatografi lapis tipis-densitometri. Data

kuantitatif berupa kecepatan waktu induksi kalus yang diperoleh dianalisis dengan uji t pada

tingkat kepercayaan 95% untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan yang bermakna. Data

kuantitatif berupa indeks pertumbuhan dan kadar steviosida yang diperoleh dianalisis dengan

ANOVA pada tingkat kepercayaan 95% dan dilanjutkan dengan uji Duncan’s Multiple Range

Test (DMRT) untuk mengetahui letak beda nyata antar perlakuan. Data kualitatif diperoleh

berupa morfologi kalus yang meliputi warna dan tekstur kalus.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Inisiasi Kalus

Kalus merupakan suatu massa sel tidak berbentuk dan tidak terorganisasi yang

terbentuk pada permukaan potongan jaringan yang terluka sebagai respon perlindungan

untuk menutup jaringan yang terluka. Sebelum kalus terbentuk, terjadi tahap pelengkungan

eksplan daun pada hari ke ±5, diikuti dengan munculnya kalus pada bagian permukaan

eksplan daun pada hari ke ±10. Kalus yang tumbuh diinkubasi (Gambar 1) dan disubkultur

ke medium perlakukan setelah tiga minggu

Gambar 1. Pertumbuhan Kalus Eksplan Daun Stevia Umur Tiga Minggu pada Medium

Induksi (Dokumentasi pribadi, 2014)

Keterangan : a = medium ½ MS 2,4-D 1 mg/l; b = medium NP 2,4-D 1 mg/l

b a

B. Kecepatan Waktu Induksi Kalus

Induksi kalus pada eksplan daun stevia yang ditanam pada medium induksi dengan

penambahan 2,4-D 1 mg/l terjadi pada hari ke 10 – 11 (Tabel 1) setelah penanaman eksplan.

Hasil analisis uji t yang dilakukan menunjukkan kecepatan waktu induksi kalus yang

tumbuh dari medium NP tidak berbeda nyata dengan medium ½MS. Hasil tersebut

menunjukkan bahwa komposisi medium ½MS dan NP tidak mempengaruhi kecepatan

waktu induksi kalus pada eksplan daun stevia. Secara umum, medium NP mirip dengan

medium ½MS, perbedaan utama pada medium ½MS dan NP adalah komposisi penyusun

makronutrien, kadar makro-mikro nutiren medium, serta kadar sukrosa.

Tabel 1. Kecepatan Waktu Induksi Kalus Eksplan Daun Stevia dengan ZPT 2,4-D 1 mg/l

dengan Variasi Jenis Medium (hari)

ZPT

Induksi Ulangan

Jenis Medium

NP ½ MS

2,4-D 1

mg/l

1 11 10

2 10 10

3 10 10

4 10 10

5 10 10

6 11 11

7 10 11

8 11 11

Rerata 10,375A 10,375A

Keterangan : angka pada baris yang diikuti huruf yang sama menunjukkan tidak ada

perbedaan yang bermakna dari uji t pada tingkat kepercayaan 95%

C. Persentase Pertumbuhan Kalus

Kemampuan ZPT 2,4-D 1 mg/l yang digunakan untuk menginduki kalus dari eksplan

daun stevia dapat diketahui tingkat keberhasilannya dengan pengamatan presentase

pertumbuhan kalus. Jumlah eksplan yang terinduksi diamati selama tiga minggu dan

diperoleh persentase induksi kalus diperoleh sebesar 70,2 %. Eksplan diinduksi

menggunakan hormon 2,4-D 1 mg/l karena menurut Machakova dkk. (2008), auksin yang

paling umum digunakan untuk menginduksi kalus adalah 2,4-D. Penelitian Babu dkk.

(2011) juga menunjukkan bahwa kalus dari eksplan daun stevia yang tumbuh dari medium

MS dengan 2,4-D 1 mg/l mampu menunjukkan kemampuan induksi kalus yang lebih baik

dengan respon induksi 75 ± 5 % (Janarthanam dkk., 2010).

D. Indeks Pertumbuhan

Indeks pertumbuhan kalus merupakan parameter pertumbuhan kalus yang

berdasarkan pada berat basah kalus. Kalus umur tiga minggu yang tumbuh di medium

induksi disubkultur ke medium perlakuan dengan berbagai kombinasi hormon yaitu 2,4-D

0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l + Kin 1 mg/l, NAA 0,1 mg/l + BAP 2 mg/l, NAA 2 mg/l, IBA 2

mg/l + BAP 2 mg/l dan kontrol 2,4-D 1 mg/l. Hasil pengamatan indeks pertumbuhan kalus

dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Indeks Pertumbuhan (%) Kalus Eksplan Daun Stevia Minggu ke-6 pada

Medium ½ MS dan NP dengan Variasi Kombinasi ZPT

Jenis

Medium

Kombinasi ZPT Optimum

Kontrol

1 mg/l

2,4-D

(E)

Rerata

0,5 mg/l

2,4-D +

0,5 mg/l

NAA +

1 mg/l

Kin

(A)

0,1 mg/l

NAA +

2 mg/l

BAP

(B)

2 mg/l

NAA

(C)

2 mg/l

IBA +

2 mg/l

BAP

(D)

NP 215,766bc 198,24bc 88,1961a 262,984c 110,546ab 175,147A

½ MS 109,968ab 188,294abc 213,288bc 286,292c 181,627abc 195,894A

Rerata 162,867A 193,267A 150,742A 274,638B 146,087A

Keterangan : angka pada baris dan kolom yang sama diikuti dengan huruf berbeda

menunjukkan adanya beda nyata pada tingkat kepercayaan 95%

Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa adanya perbedaan nyata pada variasi

kombinasi ZPT terhadap rerata indeks pertumbuhan kalus, tetapi tidak ada perbedaan nyata

pada variasi jenis medium terhadap indeks pertumbuhan. Rerata indeks pertumbuhan kalus

pada medium perlakuan (A – D) lebih besar daripada indeks pertumbuhan kalus pada

medium kontrol (E). Data rerata indeks pertumbuhan menunjukkan bahwa medium

perlakuan dengan penambahan IBA 2 mg/l + BAP 2 mg/l memberikan rerata indeks

pertumbuhan terbesar yaitu 274,638 %.

Interaksi antara medium MS dan NP dengan kombinasi ZPT IBA 2 mg/l + BAP 2

mg/l juga menunjukkan adanya beda nyata dengan menghasilkan indeks pertumbuhan yang

lebih besar dibandingkan indeks pertumbuhan dengan kombinasi ZPT lainnya. Menurut

Payghamzadeh dan Kazemitabar (2010), BAP dan IBA memiliki efek yang sinergis dalam

pembentukan kalus dan berat basah kalus. Hal serupa juga diungkapan oleh Mohajer dkk.

(2012) dalam penelitiannya yang menggunakan kombinasi NAA, BAP dan IBA pada

medium MS dan diperoleh kombinasi 2 mg/l BAP dan 1 mg/l IBA memberikan berat basah

kalus tertinggi dari eksplan daun Sainfoin (Onobrychis sativa).

E. Morfologi Kalus

Hasil pengamatan tekstur kalus pada semua perlakuan yaitu, kalus memiliki tekstur

kompak dengan warna yang mendominasi adalah warna putih kekuningan (Gambar 2).

Menurut Lizawati (2012), warna putih atau kekuningan menunjukkan ciri kalus yang

embrionik. Selain genotipe eksplan dan ZPT endogen, perkembangan dan tekstur kalus juga

dipengaruhi oleh jenis dan konsentrasi ZPT, komposisi nutrien medium dan kondisi

lingkungan kultur.

Gambar 2. Perbandingan Morfologi Kalus Eksplan Daun Stevia yang Ditumbuhkan pada

Medium ½MS dan NP dengan Variasi Kombinasi ZPT pada Minggu ke-6

(Dokumentasi Pribadi, 2014)

Keterangan : A = 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l + Kin 1 mg/l; B = NAA 0,1 mg/l + BAP 2

mg/l; C = NAA 1 mg/l; D = IBA 2 mg/l + BAP 2 mg/l; E = 2,4-D 1 mg/l

½MS A ½MS B ½MS C ½MS D ½MS E

NP A NP B NP C NP D NP E

F. Kandungan Steviosida

Parameter ini bertujuan untuk menentukan kandungan steviosida baik secara

kualitatif maupun kuantitatif dari kalus daun stevia. Kalus daun stevia umur 6 minggu

dikeringkan menggunakan oven dan digiling sebelum diekstrak. Kalus kering kemudian

diekstraksi menggunakan pelarut metanol dengan metode cold finger yang menggunakan

prinsip refluks. Ekstrak kemudian digunakan untuk uji kualitatif menggunakan metode KLT

dan dilanjutkan untuk uji kuantitatif menggunakan metode densitometri (TLC Scanner).

Hasil pengujian kualitatif steviosida diperoleh dengan adanya bercak steviosida pada

ekstrak kalus yang sejajar dengan bercak steviosida standar. Deteksi bercak steviosida

dilakukan dengan penyemprotan menggunakan pereaksi semprot Liebermann-Burchard.

Hasil uji kualitatif berupa bercak steviosida dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Pengujian Kualitatif Ekstrak Kalus Daun Stevia (Dokumentasi Pribadi, 2014)

Keterangan : a = standar steviosida; b = kalus ½MS A; c = kalus ½MS B; d = kalus ½MS C; e

= kalus ½MS D; f = kalus ½MS E; g = kalus NP A; h = kalus NP B; i = kalus NP

C; j = kalus NP D; k = kalus NP E; l = daun stevia; fase diam = plat silika gel

F254; fase gerak = aseton-etil asetat-air (5:4:1); deteksi = reagen semprot

Liebermann-Burchard (LB)

Warna bercak steviosida yang nampak adalah coklat keabu-abuan dengan harga Rf

standar 0,31, harga Rf ekstrak kalus daun stevia berkisar antara 0,31 – 0,34 dan harga Rf ekstrak

daun stevia 0,31. Harga Rf yang diperoleh juga sesuai dengan penelitian Chester dkk. (2012)

a b c d e f g h i j k

j

l

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

0

Rf

yaitu 0,31 ± 0,02. Bercak steviosida kemudian diukur kadarnya dengan mencari λ maksimum

dari 200 nm – 500 nm dan diperoleh ± 289nm.

Pengujian kuantitatif kandungan pada kalus daun stevia dihitung menggunakan

persamaan regresi Y = 19,85x + 152,25 dengan nilai R2 = 0,997. Persamaan regresi diperoleh

dari luas area kromatogram standar steviosida dengan seri 5, 25, 50, 75 dan 100 µg. Luas area

bercak steviosida dari kalus daun stevia diukur dan dihitung menggunakan persamaan regresi

yang diperoleh. Hasil kadar steviosida dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Kadar Steviosida (µg) Kalus Eksplan Daun Stevia Minggu ke-6 pada Medium ½ MS

dan NP dengan Variasi Kombinasi ZPT

Jenis

Medium

Kombinasi ZPT Optimum

Kontrol

1 mg/l

2,4-D

(E)

Rerata

0,5 mg/l

2,4-D +

0,5 mg/l

NAA +

1 mg/l

Kin

(A)

0,1 mg/l

NAA +

2 mg/l

BAP

(B)

2 mg/l

NAA

(C)

2 mg/l

IBA +

2 mg/l

BAP

(D)

NP 3,733a 7,763a 6,062a 24,418a 0,421a 8,479A

½ MS 12,243a 12,876a 7,657a 14,656a 7,599a 11,006A

Rerata 7,988A 10,320A 6,859A 19,537B 4,010A

Keterangan : angka pada baris dan kolom yang sama diikuti dengan huruf berbeda

menunjukkan adanya beda nyata pada tingkat kepercayaan 95%

Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa adanya perbedaan nyata pada variasi

kombinasi ZPT terhadap rerata kadar steviosida, tetapi tidak ada perbedaan nyata pada variasi

jenis medium dan interaksi jenis medium–kombinasi ZPT terhadap kadar steviosida. Rerata

kadar steviosida kalus pada medium perlakuan (A – D) lebih besar daripada kadar steviosida

kalus pada medium kontrol (E). Data rerata kadar steviosida menunjukkan bahwa medium

perlakuan dengan penambahan IBA 2 mg/l + BAP 2 mg/l memberikan rerata kadar steviosida

terbesar yaitu 19,537 µg.

Kombinasi IBA dan BAP merupakan kombinasi auksin dan sitokinin yang mampu

memberikan kadar steviosida tertinggi. Menurut Staden dkk., (2008), biosintesis dari sitokinin

melibatkan jalur MEP dan MVA, dimana jalur MEP juga merupakan jalur biosintesis

steviosida (Brandle dan Telmer, 2007). Osbourn dan Lanzotti (2009) juga mengungkapkan

bahwa tahap awal proses biosintesis steviosida terjadi di plastida, yaitu kloroplas. Sitokinin

pada penelitian ini menjadi unsur yang penting karena sitokinin juga berperan pematangan

kloroplas (Staden dkk., 2008).

Perlakuan kontrol dengan penambahan 2,4-D 1 mg/l juga menunjukkan rerata yang

terendah untuk parameter kadar steviosida. Machakova dkk. (2008) juga mengungkapkan

bahwa 2,4-D pada medium dapat mengurangi pembentukan klorofil pada kultur kalus. Oleh

karena itu, penggunaan kombinasi auksin dan sitokinin lebih dianjurkan untuk induksi kalus

maupun pemeliharaan kalus karena sitokinin mampu mendorong pembentukan klorofil,

sedangkan auksin dapat menghambatnya.

Rerata dari kedua parameter yang diperoleh dilanjutkan dengan uji korelasi untuk

melihat ada tidaknya hubungan antara indeks pertumbuhan dan kadar steviosida. Hasil analisis

menunjukkan tidak adanya korelasi yang signifikan antara indeks pertumbuhan dan kadar

steviosida, sehingga dapat dikatakan bahwa kadar steviosida tidak dipengaruhi oleh indeks

pertumbuhan kalus. Hasil ini tidak sesuai dengan pola rerata indeks pertumbuhan dan kadar

steviosida yang diperoleh dari variasi ZPT sebelumnya. Hal tersebut dimungkinkan karena

faktor yang mempengaruhi kandungan steviosida tidak hanya biomassa kalus dan

pertumbuhannya. Faktor lain seperti fotoperiod dapat mempengaruhi pembentukan klorofil,

sedangkan pada penelitian ini tidak dilakukan fotoperiod.

Kadar steviosida pada daun juga diukur sebagai pembanding dan diperoleh sebesar

146,221 µg. Kadar steviosida yang terukur pada kalus jauh lebih kecil daripada di daun. Hasil

tersebut juga menunjukkan bahwa belum optimalnya produksi steviosida pada kalus jika

dibandingkan pada daun stevia.

Upaya yang dapat dilakukan untuk meningkatkan produksi steviosida dari kalus daun

stevia yaitu dengan mengoptimasi kombinasi ZPT menggunakan auksin dan sitokinin. Selain

itu, penambahan prekursor seperti GA3 juga dapat dilakukan karena steviosida memiliki jalur

biosintesis yang sama dengan GA3. Modi dkk. (2011) juga melaporkan hasil penelitiannya

bahwa penyemprotan GA3 pada tanaman stevia ex vitro mampu meningkatkan kandungan

steviosida secara signifikan.

SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa : (1) Tidak ada perbedaan

kecepatan waktu induksi kalus pada medium ½MS dan NP yang diinduksi oleh 2,4-D 1 mg/l.

(2) Indeks pertumbuhan kalus terbesar diperoleh dari kombinasi hormon IBA 2 mg/l + BAP 2

mg/l, baik pada medium ½MS maupun NP. (3) Kadar steviosida terbesar diperoleh dari

kombinasi hormon IBA 2 mg/l + BAP 2 mg/l, baik pada medium ½MS maupun NP.

B. Saran

(1) Waktu kontak atau konsentrasi larutan fungisida pada metode sterilisasi eksplan

perlu ditingkatkan untuk mengurangi kontaminasi yang didominasi oleh jamur. (2) Perlu

dilakukan optimalisasi kombinasi ZPT yang digunakan untuk induksi kalus maupun

pemeliharaan kalus. Penggunaan auksin tunggal seperti 2,4-D saja sebaiknya tidak dilakukan,

melainkan dikombinasi dengan sitokinin. (3) Perlu diteliti ada tidaknya pengaruh dari

penambahan prekursor seperti GA3 untuk meningkatkan produksi steviosida pada kalus. (4)

Perlu adanya pengaturan fotoperiod selama inkubasi kultur kalus.

UCAPAN TERIMA KASIH

Terimakasih kepada Prof. C.J. Soegihardjo, Apt. dan L.M. Ekawati Purwijantiningsih,

S.Si., M.Si. untuk bimbingannya, juga kepada Prof. Jan. M. C. Geuns untuk steviosida standar

yang diberikan.

DAFTAR PUSTAKA

Babu, P., Chikkasubbanna, V., Prasad, T. G. and Radhakrishna, D. 2011. In vitro studies on

the bearing ability of Stevia for stevioside biosynthesis. Biosci. Biotech. Res. Comm.,

4(1) : 19 – 22.

Brandle, J. E. and Telmer, P. G. 2007. Steviol Glycoside Biosynthesis. Phytochemistry, 68 :

1855 – 1863.

Chester K., Tamboli, E. T., Singh, M. and Ahmad, S. 2012. Simultaneous Quantification of

Stevioside and Rebaudioside A in Different Stevia Samples Collected from Indian

Subcontinent. J. Pharm. Bioall. Sci., 4(4) : 276 – 281.

Daneshyar, M., Genus, J. M. C., Buyse, J. G. , Kermanshahi, H., Willemsen, H., Ansari, Z.,

Decuypere, E. and Everaert, N. 2010. Evaluation od Steviol Injection on Chicken

Embryos : Effects on Post-hatch Development, Proportional Organ Weight, Plasma

Thyroid Hormones and Metabolites. J. Poult. Sci, 47 : 71 – 76.

Geuns, J. M. C. 2008. Stevioside : A Safe Sweetener and Possible New Drug for the Treatment

of Metabolic Syndrome. In : Weerasinghe, D. K. and Dubois, G. (eds.). ACS Symposium

Series 979 : 596 – 614.

Jagatheeswari, D. and Ranganathan, P. 2012. Studies on Micropropagation of Stevia

rebaudiana Bert. Int. J. Pharm. Biol. Arch., 3(2) : 325 –320.

Janarthanam, B., Gopalakrishnan, M. And Sekar, T. 2010. Secondary Metabolite Production

in Callus Cultures of Stevia rebaudiana Bertoni. Bangladesh J. Sci. Ind. Res., 45(3) :

243 – 248.

Lizawati. 2012. Induksi Kalus Embriogenik dari Eksplan Tunas Apikal Tanaman Jarak Pagar

(Jatropha curcas L.) dengan Penggunaan 2,4-D dan TDZ. Jurnal Program Studi

Agroekoteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Jambi, 1(2) : 75 – 87.

Machakova, I., Zazimalova, E. and George, E.F. 2008. Plant Growth Regulators I :

Introduction; Auxin, Their Analogues and Inhibitors. In : George, E. F., Hall, M. A.

and de Klerk, G-J. (eds.). Plant Propagation by Tissue Culture. Third Edition Volume

1, p. 175. Springer, Dordrecht, The Netherland.

Modi, A. R., Shukla, Y. M., Litoriya, N. S., Patel, N. J. and Narayan, S. 2011. Effect of

Gibberellic Acid Foliar Spray on Growth Parameters and Stevioside Content of Ex

Vitro Grown Plants of Stevia rebaudiana Bertoni. Medicinal Plants, 3(2) : 157 – 160.

Mohajer, S., Taha, R. M., Khorasani, A. and Yaacob, J. S. 2012. Induction of Different Types

of Callus and Embryogenesis in Various Explant of Sainfoin (Onobrychis sativa). Aust.

J. Crop Sci., 6(8) : 1305 – 1313.

Osbourn, A. E. and Lanzotti, V. 2009. Plant-derived Natural Products : Synthesis, Function,

and Application. Springer, New York.

Payghamzadeh, K. and Kazemitabar, S.K. 2010. The Effect of BAP, IBA and Genotypes on In

Vitro germination of Immature Walnut Embryos. Int. J. Plant Prod., 4(4) : 309 – 322.

Sairkar, P. Chandravanshi, M. K., Shukla, N. P. and Mehrotra, N. N. 2009. Mass Production

of An Economically Important Medicinal Plant Stevia rebaudiana using in vitro

propagation techniques. J. Med. Plant Res., 3(4) : 266 – 270.

Staden, J. V., Zazimalova, E. and George, E. F. 2008. Plant Growth Regulators II : Cytokinins,

their Analogues and Antagonists. In : George, E. F., Hall, M. A. and de Klerk, G-J.

(eds.). Plant Propagation by Tissue Culture. Third Edition Volume 1, p. 65. Springer,

Dordrecht, The Netherland.