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LE ROLE DE L’AUTOANTIGENE DANS LESMALADIES AUTO-IMMUNES : ETUDE DE LA
DESMOGLEINE 1 AU COURS DES PEMPHIGUSHugo Mouquet
To cite this version:Hugo Mouquet. LE ROLE DE L’AUTOANTIGENE DANS LES MALADIES AUTO-IMMUNES :ETUDE DE LA DESMOGLEINE 1 AU COURS DES PEMPHIGUS. Immunologie. Université deRouen, 2006. Français. �tel-00130209�
UNIVERSITE DE ROUEN FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
ECOLE DOCTORALE NORMANDE DE CHIMIE-BIOLOGIE
THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE ROUEN
Discipline : Sciences Biologiques
Spécialité : Immunologie
Présentée pour l’obtention du grade de Docteur de l’université de Rouen
par :
Mr MOUQUET Hugo
LE ROLE DE L’AUTOANTIGENE DANS LES
MALADIES AUTO-IMMUNES : ETUDE DE LA
DESMOGLEINE 1 AU COURS DES PEMPHIGUS
Soutenue publiquement le 21 novembre 2006 devant le jury composé de :
Monsieur le Professeur François TRON Président Monsieur le Professeur Christian BOITARD Rapporteur Monsieur le Professeur Jean François NICOLAS Rapporteur Monsieur le Professeur Pascal JOLY Examinateur Madame Danièle GILBERT Directrice de thèse
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
ECOLE DOCTORALE NORMANDE DE CHIMIE-BIOLOGIE
THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE ROUEN
Discipline : Sciences Biologiques
Spécialité : Immunologie
Présentée pour l’obtention du grade de Docteur de l’université de Rouen
par :
Mr MOUQUET Hugo
LE ROLE DE L’AUTOANTIGENE DANS LES
MALADIES AUTO-IMMUNES : ETUDE DE LA
DESMOGLEINE 1 AU COURS DES PEMPHIGUS
Soutenue publiquement le 21 novembre 2006 devant le jury composé de :
Monsieur le Professeur François TRON Président Monsieur le Professeur Christian BOITARD Rapporteur Monsieur le Professeur Jean François NICOLAS Rapporteur Monsieur le Professeur Pascal JOLY Examinateur Madame Danièle GILBERT Directrice de thèse
« Science avec patience, le supplice est sûr » A. Rimbaud, Poésies.
A Pauline,
A mes parents et mes sœurs,
A mes Amis,
A Monsieur le Professeur François TRON, qui me fait l’honneur de présider ce jury de thèse, je tiens à exprimer toute ma gratitude pour m’avoir accueilli dans son équipe. Je tiens à vous témoigner ma sympathie et mon profond respect pour m’avoir encouragé et soutenu, pour m’avoir transmis vos connaissances immunologiques et enseigner les subtilités de la recherche, pour votre ouverture d’esprit qui m’a permis d’appréhender avec liberté ce travail de thèse. Soyez certain, Monsieur, que vos conseils et vos enseignements me guideront tout au long de mon parcours sur le chemin tortueux de la recherche et au cours de ma carrière en Immunologie qui je le souhaite, sera la plus longue et bénéfique possible. A Madame Danièle GILBERT, directrice de thèse, qui a supervisé mon travail durant mon DEA et mes cinq années de thèse, j’adresse toute ma gratitude. Pour votre soutien et votre confiance à mon égard, pour l’autonomie dont j’ai disposé en travaillant à vos côtés ainsi que le sens de la rigueur et de la critique scientifique que j’ai développé sous votre direction, je vous remercie. A Monsieur le Professeur Christian BOITARD et Monsieur le Professeur Jean-François NICOLAS, qui ont accepté d’être les rapporteurs de ce travail. Eu égard à leur renommée scientifique, leur participation à ce jury constitue pour moi un honneur. Qu’ils en soient remerciés. A Monsieur le Professeur Pascal JOLY, j'adresse ma profonde reconnaissance pour son indispensable soutient financier durant mes deux dernières années de thèse qui m'a permis de finaliser celle-ci dans les meilleures conditions. Je tiens à vous exprimer, Monsieur, mes vifs remerciements pour avoir accepté d'être l'examinateur de mon travail, pour votre confiance et pour m'avoir associé à vos projets. A Monsieur le Professeur Philippe MUSETTE, j'adresse mes remerciements chaleureux pour son soutient, ses encouragements et ses conseils avisés. Au Docteur Philippe MARTEL, qui m’insuffla sa passion de la recherche sur les pemphigus et qui fut le guide de mes tout premiers pas dans ce domaine, je tiens à témoigner toute mon amitié. A mon ami, le Docteur Damien PICARD, compère de labo inestimable, merci pour tout. A tous les acteurs de la recherche à l’U519 qui ont participé à ma formation pratique et à l’élaboration de mon savoir-faire technique, Dr Vincent Saulot, Mr Laurent Drouot, Dr Sandrine Thébault, Mr Christophe Arnoult, Dr Roland Charlionnet. Veuillez trouver ici l’expression de ma gratitude. Je tiens à remercier les techniciennes du laboratoire d’Immunopathologie Clinique tout particulièrement Mme Edwige Tesson, ainsi que Mlle Isabelle Duval.
ABBREVIATIONS 2D : bidimensionnel(le)
- A - Ag : antigène(s) Ac(m) : anticorps (monocloanaux) ACh : acétylcholine ADN(c) : acide désoxyribonucléique (complémentaire) AIRE : Autoimmune regulator APECED : Autoimmune PolyEndocrinopathy Candidiasis Ectodermal Dystrophy AutoAc : autoanticorps AutoAg : autoantigène(s) ARN(m) : acide ribonucléique (messager)
- B - β2-GPI : β2-glycoprotéine I BCR : B Cell Receptor BET : Bromure d’éthidium BPAG1 : antigène majeur de la pemphigoïde bulleuse
- C - CPA : cellules présentatrices d’antigènes CDR : troisième région déterminant la complémentarité CET(m) : cellules épithéliales thymiques (de la médullaire) CHRNA : sous-unité α du récepteur musculaire à l'acétylcholine CMH : complexe majeur d’histocompatibilité CTLA4 : Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 Cp : crossing point
- D - DP : desmoplakine(s) Dsc : desmocolline(s) Dsg : desmogléine(s) DSG1-AT : transcrits alternatifs du gène DSG1 DTT : dithiotréitol
- E - EAE : encéphalomyélite allergique expérimentale EC : extracellulaire ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ENV : envoplakine
- F - Foxp3 : forkhead box P3
- G - GAPDH : gène de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase GITR : glucocorticoid-induced tumor-necrosis factor like receptor GPI : gradient de pH immobilisé
- H - HLA : Human Leukocyte Antigen Hsp : Heat shock protein HE : Human Epidermis
- I - IEF : isoélectrofocalisation IFD : immunofluorescence directe
IFI : immunofluorescence indirecte Ig (IV): immunoglobulines (intraveineuses) IP3 : inositol 1,4,5-triphosphate
- L – LED : lupus érythémateux disséminé
- M - MAPK : mitogen activating protein kinase MAI : maladies autoimmunes MALDI-ToF : Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight M-MLV RT : Moloney-Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase MBP : protéine basique de la myéline MOG : protéine oligodendriale de la myéline
- N - NK : Natural killer NOD : Non Obese Diabetic
- P - PBMC : cellules mononuclées du sang périphérique (Q-)PCR : (Quantitative-)polymerase chain reaction PF : pemphigus foliacé PG : plakoglobine PKP : plakophiline(s) pI : point isoélectrique PL : plectine PLP : protéine protéolipidique PPL : périplakine PPN : pemphigus paranéoplasique PR : polyarthrite rhumatoïde PS : pemphigus superficiels PV : pemphigus vulgaire
- R - RAG : recombination-activating genes (sn)RNP : (small nuclear) ribonucleoproteins rEC1/5-Dsg1 : région extracellulaire recombinante de la Dsg1
- S - SAPL : syndrome des anti-phospholipides SCID : Severe Combined Immunodeficiency SDS-PAGE : SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis SEP : sclérose en plaques SI : stimulation index
SIC : substance intercellulaire SNP : single nucleotide polymorphism
- T - TB : thyroglobuline bovine TCR : T Cell Receptor TGFβ : transforming growth factor-β TLR : Toll-like receptors TNF : Tumor necrosis factor Th : T helper TSH : Thyroid Stimulating Hormone
- V - VNTR : variable number of tandem repeats
LISTE DES FIGURES Figure 1. Mécanismes de tolérance des lymphocytes T
et B ....................................................................... 5
Figure 2. Rôle de la protéine AIRE dans l’induction de
la tolérance intrathymique .................................... 9
Figure 3. Exemples de mécanismes lésionnels autoanticorps dépendants.................................... 17
Figure 4. Epissage canonique et non canonique des transcrits immatures ........................................... 38
Figure 5. Mécanismes d’épissage alternatif des
autoantigènes....................................................... 39
Figure 6. Mécanisme proposé pour expliquer le
processus auto-immun médié par la PLP............. 41
Figure 7. Ultrastructure du desmosome ............. 48 Figure 8. Organisation moléculaire du desmosome 49
Figure 9. Structure des cadhérines desmosomales 50
Figure 10. Représentation moléculaire de l’interface
d’adhésion entre les domaines extracellulaires des cadhérines classiques .......................................... 51
Figure 11. Organisation génomique des cadhérines
desmosomales...................................................... 53
Figure 12. Structures génique et protéique de la
desmogléine 1 ...................................................... 55 Figure 13. Structure des plakines....................... 57 Figure 14. Organisation moléculaire de la jonction
dermoépidermique ............................................... 60
Figure 15. Lésions muqueuses et cutanées de pemphigus vulgaire.............................................. 65
Figure 16. Histologie des pemphigus .................. 66
Figure 17. Lésions cutanées de pemphigus foliacé ..............................................................................67
Figure 18. Tumeurs associées au pemphigus
paranéoplasique................................................... 68
Figure 19. Les réactivités des autoanticorps chez les
malades atteints de pemphigus ................................. 70
Figure 20. Corrélation entre les populations d’anticorps anti-desmogléines et les phénotypes
clinico-histologiques de pemphigus ..................... 78
Figure 21. Modèles de pathogénicité des anticorps
anti-desmogléines ................................................ 83 Figure 22. Immunopharmacologie du pemphigus 91
Figure 23. Position des résidus polymorphiques de la
chaîne β dans la poche d’ancrage des peptides de la
molécule HLA-DR................................................. 98
Figure 24. Distribution génotypique du SNP 809 et de la combinaison DR4/SNP809 C/C chez les malades
atteints de pemphigus foliacé et chez les sujets sains
............................................................................ 100
Figure 25. Cartographie épitopique T des domaines extracellulaires de la desmogléine 3..................... 103
Figure 26. La réponse T au cours du pemphigus
vulgaire ................................................................ 104
Figure 27. Les pemphigus endémiques............... 107
Figure 28. Séquences nucléique et protéique de
l’isoforme tronquée de la desmogléine 1 .............. 119
Figure 29. Principe de la PCR en temps réel sur
l’appareil LightCycler ........................................... 122
Figure 30. Représentation schématique des principales étapes de la production d’un baculovirus
recombinant utilisé pour la synthèse de la protéine rEC1/5-Dsg1 ....................................................... 126
Figure 31. Organigramme des étapes expérimentales de la production de la baculoprotéine recombinante
............................................................................ 127
Figure 32. Séquence nucléique codant pour la région extracellulaire de la desmogléine 1 humaine ....... 129
Figure 33. Structure de la « cassette » de clonage du vecteur pGEM4Z-SP-TAG..................................... 134
Figure 34. Organigramme des étapes expérimentales
de la purification des baculovirus recombinants par la technique des plages de lyse................................ 137
Figure 35. Structure du Transcend™ tRNA utilisé comme système de purification et de détection des
protéines synthétisées par transcription/traduction in vitro...................................................................... 143
Figure 36. Représentation schématique des principales étapes de la production d'Ac polyclonaux
anti-peptides de l’isoforme tronquée de la Dsg1 .. 144
Figure 37. Représentation schématique des principales étapes de l’identification de protéines
cibles d’anticorps par immunocriblage de carte
protéique 2D couplé à la spectrométrie de masse 150
Figure 38. Représentation schématique des principales étapes de l’identification de protéines
cibles d’anticorps par immunocriblage de banque d’expression d’ADNc ............................................ 156
Figure 39. Epissage alternatif à l’origine d’une isoforme tronquée de la Dsg1................................................... 160
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1. Autoantigènes exprimés dans le thymus et
maladies auto-immunes associées ............................. 7
Tableau 2. Manifestations pathologiques du
syndrome APECED ............................................... 8
Tableau 3. Les principales maladies auto-immunes............................................................................. 14
Tableau 4. Diversité des autoantigènes au cours des maladies auto-immunes....................................... 15
Tableau 5. Mécanismes lésionnels des autoanticorps
............................................................................. 16
Tableau 6. Modifications post-traductionnelles
associées aux maladies auto-immunes ................ 33
Tableau 7. Polymorphismes géniques d’autoantigènes et mécanismes associés ....................................... 33
Tableau 8. Exemples d’autoantigènes subissant un
épissage alternatif ................................................ 37
Tableau 9. Modifications des autoantigènes induites
par épissage alternatif.......................................... 40 Tableau 10. Comparaison des séquences aminoacides entre les desmogléines humaines......................... 54
Tableau 11. Partenaires desmosomiaux d'interactions avec les protéines Armadillo ................................. 62
Tableau 12. Associations entre pemphigus et d’autres
maladies auto-immunes....................................... 69 Tableau 13. Autoantigènes des pemphigus ......... 73
Tableau 14. Allèles HLA de susceptibilité au
pemphigus vulgaire.............................................. 94 Tableau 15. Allèles HLA de susceptibilité au pemphigus superficiel .......................................... 94
Tableau 16. Séquences des amorces utilisées pour la l’amplification des séquences ADNc spécifiques des
transcrits GAPDH, DSG1 et DSG1-AT.................. 120
Tableau 17. Composition du mélange réactionnel de
PCR pour l’amplification des séquences ADNc spécifiques des transcrits GAPDH, DSG1 et DSG1-AT
............................................................................ 120
Tableau 18. Phases de la réaction de PCR classique pour l’amplification des séquences ADNc spécifiques
des transcrits GAPDH, DSG1 et DSG1-AT ........... 120
Tableau 19. Composition du milieu réactionnel des
réactions de Q-PCR en temps réel sur LightCycler
pour l’amplification des ADNc GAPDH, DSG1 et DSG1-AT........................................................................ 123
Tableau 20. Phases de la réaction de Q-PCR en temps
réel sur LightCycler pour l’amplification des ADNc
GAPDH, DSG1 et DSG1-AT.................................. 124
Tableau 21. Composition du milieu réactionnel de PCR « nichée » pour l’amplification des séquences
ADNc codant pour le peptide signal et le propeptide de
la Dsg1 humaine.................................................. 128
Tableau 22. Phases de l’amplification par PCR « nichée » des séquences ADNc codant pour le peptide
signal et le propeptide de la Dsg1 humaine ......... 128
Tableau 23. Composition du mélange réactionnel de
la double digestion par les enzymes de restriction BamHI et Hind III................................................. 130
Tableau 24. Composition du mélange réactionnel de
la PCR utilisant les amorces M13 ........................ 131
Tableau 25. Phases de la réaction de PCR utilisant les
amorces M13 ....................................................... 131
Tableau 26. Composition du mélange réactionnel de séquençage sur le séquenceur 16 capillaires AB3100
(Applied Biosystems)............................................ 132
Tableau 27. Phases de la réaction de séquençage sur
le séquenceur 16 capillaires AB3100 (Applied Biosystems).......................................................... 132
Tableau 28. Conditions expérimentales de la ligation
entre le vecteur pGEM4Z-SP et les séquences codant les peptides FLAG et Histidine ............................. 133
Tableau 29. Composition du mélange réactionnel pour l’amplification par PCR de la séquence ADNc
codant pour la région extracellulaire de la Dsg1..... ............................................................................ 135
Tableau 30. Phases de la réaction de PCR pour
l’amplification de la séquence ADNc codant pour la
région extracellulaire de la Dsg1.......................... 135 Tableau 31. Mélange réactionnel de la digestion par l’enzyme Pfl23 II................................................... 135
Tableau 32. Composition du mélange réactionnel de
la double digestion du vecteur de transfert p119. 136
Tableau 33. Composition du gel de polyacrylamide de
porosité 14% utilisé pour la séparation électrophorètique des protéines par SDS-PAGE... 138
Tableau 34. Composition du milieu réactionnel de
PCR pour l’amplification de la séquence ADNc codant
pour la protéine EC1/2-INT6 ............................... 140
Tableau 35. Phases de l’amplification par PCR de la séquence ADNc codant pour la protéine EC1/2-INT6
............................................................................ 140 Tableau 36. Composition du mélange réactionnel de
la PCR utilisant les amorces SP6 et T7 ................ 141
Tableau 37. Phases de la réaction de PCR utilisant les amorces SP6 et T7 ............................................... 141
Tableau 38. Composition des solutions de
réhydratation des bandelettes GPI....................... 152
Tableau 39. Composition du mélange réactionnel de
la PCR de criblage des clones de la banque λgt11 156
Tableau 40. Phases de la réaction de PCR de criblage
des clones de la banque λgt11 ............................. 157
TABLE DES MATIERES
AVANT-PROPOS
INTRODUCTION .................................................................................................. 1
Chapitre 1 : Les Maladies Auto-immunes .............................................................. 3
I. LA TOLERANCE AU SOI .............................................................................................................................. 3
A- Evolution du concept de tolérance immunitaire................................................................................ 3
B- Les mécanismes de tolérance immunitaire........................................................................................ 4
1/ LA TOLERANCE DES LYMPHOCYTES T................................................................................................................................................................ 4
La tolérance centrale............................................................................................................................................................................... 4
Le concept d’expression thymique d’antigènes tissu-spécifiques............................................................................................................ 6
La tolérance périphérique ...................................................................................................................................................................... 10
2/ LA TOLERANCE DES LYMPHOCYTES B ............................................................................................................................................................... 11
La tolérance centrale.............................................................................................................................................................................. 11
La tolérance périphérique ...................................................................................................................................................................... 12
II. PRESENTATION DES MALADIES AUTO-IMMUNES .................................................................................. 13
A- Critères et classification.................................................................................................................... 13
B- Les mécanismes lésionnels des effecteurs auto-immuns .................................................................. 16
1/ LES AUTOANTICORPS : DES FACTEURS LESIONNELS MAJEURS ..................................................................................................................... 16
2/ LES EFFECTEURS LYMPHOCYTAIRES T ............................................................................................................................................................. 19
C- Les modèles expérimentaux de maladies auto-immunes .................................................................. 20
1/ LES MODELES SPONTANNES................................................................................................................................................................................ 21
La souris NOD........................................................................................................................................................................................ 21
Les souris lupiques ................................................................................................................................................................................ 22
La thyroïdite du poulet obèse................................................................................................................................................................. 23
2/ LES MODELES INDUITS.......................................................................................................................................................................................... 24
La thyroïdite allergique expérimentale ................................................................................................................................................... 24
L’encéphalomyélite allergique expérimentale ........................................................................................................................................ 25
Chapitre 2 : Le Rôle des Autoantigènes au cours des Maladies Auto-immunes ...... 27
I. L’AUTOANTIGENE INITIE ET CONDUIT LA REPONSE AUTO-IMMUNE ..................................................... 27
II. LA SEQUESTRATION DES AUTOANTIGENES ........................................................................................... 28
A- La séquestration anatomique ............................................................................................................ 28
B- La séquestration moléculaire............................................................................................................. 28
III. LES MODIFICATIONS DES ANTIGENES DU SOI ..................................................................................... 29
A- Modifications de l’autoantigène par les métaux lourds..................................................................... 30
B- Modifications de l’autoantigène et processus apoptotique ............................................................... 30
C- Modifications de l’autoantigène et cancer ........................................................................................ 31
D- Modifications de l’autoantigène au cours des processus de réparation tissulaire ............................ 32
E- Modifications co- et post-traductionnelles des autoantigènes.......................................................... 32
IV. LE POLYMORPHISME GENIQUE DES AUTOANTIGENES........................................................................ 33
A- Le modèle de la myasthénie .............................................................................................................. 34
B- Le modèle du diabète de type 1......................................................................................................... 34
C- Autres polymorphismes géniques des autoantigènes........................................................................ 36
V. EPISSAGE ALTERNATIF ET ISOFORMES D'AUTOANTIGENES................................................................. 36
A- L’épissage alternatif des transcrits codant des autoantigènes est fréquent ..................................... 38
B- Des isoformes d'autoantigènes à l'origine d'une rupture de la tolérance centrale ? ......................... 41
C- La réponse auto-immune dirigée contre les isoformes d'autoantigènes générées par épissage
alternatif ............................................................................................................................................ 44
1/ UNE REPONSE LYMPHOCYTAIRE T DIRIGEE CONTRE DES EPITOPES SPECIFIQUES D’ISOFORMES D’AUTOANTIGENES : L’EXEMPLE
DE LA MBP...................................................................................................................................................................................................................... 44
2/ LA REACTIVITE AUTOANTICORPS CONTRE LES ISOFORMES D'AUTOANTIGENES ......................................................................................... 45
Chapitre 3 : Le Desmosome ................................................................................. 48
I. L’ULTRASTRUCTURE DU DESMOSOME.................................................................................................... 48
II. LA STRUCTURE MOLECULAIRE DU DESMOSOME.................................................................................. 49
A- Les cadhérines desmosomales........................................................................................................... 50
1/ LA STRUCTURE MOLECULAIRE ............................................................................................................................................................................ 50
2/ LA FONCTION D’ADHESION................................................................................................................................................................................... 52
3/ L’EXPRESSION TISSULAIRE................................................................................................................................................................................... 53
4/ LES DIFFERENTS MEMBRES................................................................................................................................................................................. 54
Les desmogléines ................................................................................................................................................................................... 54
Les desmocollines .................................................................................................................................................................................. 56
B- Les plakines ....................................................................................................................................... 56
1/ LA STRUCTURE MOLECULAIRE ............................................................................................................................................................................ 57
2/ LA FONCTION D’ANCRAGE.................................................................................................................................................................................... 57
3/ LES DIFFERENTS MEMBRES................................................................................................................................................................................. 57
Les desmoplakines ................................................................................................................................................................................. 57
La plectine.............................................................................................................................................................................................. 59
L’antigène majeur de la pemphigoïde bulleuse, BPAG1......................................................................................................................... 59
L’envoplakine et la périplakine .............................................................................................................................................................. 60
L’épiplakine............................................................................................................................................................................................ 61
C- Les protéines Armadillo .................................................................................................................... 61
La plakoglobine ...................................................................................................................................................................................... 62
Les plakophilines ................................................................................................................................................................................... 62
Chapitre 4 : Les Pemphigus ................................................................................. 64
I. LES ASPECTS CLINIQUES ET HISTOLOGIQUES DES DIFFERENTES FORMES DE PEMPHIGUS............ 64
A- Le pemphigus vulgaire, l’archétype des pemphigus profonds........................................................... 64
B- Le pemphigus foliacé, l’archétype des pemphigus superficiels......................................................... 66
C- Le pemphigus paranéoplasique.......................................................................................................... 67
D- Les associations au pemphigus.......................................................................................................... 68
1/ LES NEOPLASIES.................................................................................................................................................................................................... 68
2/ LES MALADIES AUTO-IMMUNES ........................................................................................................................................................................... 69
II. LES SPECIFICITES DES AUTOANTICORPS AU COURS DES PEMPHIGUS............................................... 70
A- Les anticorps déposés et circulants................................................................................................... 70
B- Localisation et identification des antigènes cibles............................................................................ 71
1/ LE PEMPHIGUS VULGAIRE .................................................................................................................................................................................... 71
2/ LE PEMPHIGUS FOLIACE ....................................................................................................................................................................................... 72
3/ LE PEMPHIGUS PARANEOPLASIQUE.................................................................................................................................................................... 72
C- Les anticorps anti-desmogléines ....................................................................................................... 74
D- Les anticorps anti-plakines................................................................................................................ 75
E- Le chevauchement de la réponse autoanticorps au cours des pemphigus : Conséquence d’un
phénomène d’extension épitopique ?................................................................................................ 76
F- Les anticorps anti-récepteurs à l’acétylcholine................................................................................. 79
III. LA PHYSIOPATHOLOGIE DU PEMPHIGUS............................................................................................... 80
A- La pathogénicité des autoanticorps................................................................................................... 80
1/ PREUVES INDIRECTES........................................................................................................................................................................................... 80
Relation entre l’activité de la maladie et le taux d’anticorps circulants ................................................................................................. 80
Pemphigus néonatal............................................................................................................................................................................... 81
2/ MODELES EXPERIMENTAUX................................................................................................................................................................................. 82
Modèles d’acantholyse in vitro................................................................................................................................................................ 82
Modèles d’acantholyse in vivo ................................................................................................................................................................ 82
Modèle murin de pemphigus vulgaire.................................................................................................................................................... 84
B- Les mécanismes physiopathologiques............................................................................................... 85
1/ INHIBITION DE LA FONCTION D’ADHESION DES DESMOGLEINES................................................................................................................... 86
2/ TRANSDUCTION DE SIGNAUX CELLULAIRES...................................................................................................................................................... 87
Activation de protéases .......................................................................................................................................................................... 87
Phosphorylation des protéines desmosomales et désorganisation du desmosome ................................................................................ 88
Les récepteurs à l’acétylcholine et l’immunopharmacologie du pemphigus........................................................................................... 90
3/ APOPTOSE KERATINOCYTAIRE ............................................................................................................................................................................ 92
IV. GENETIQUE DES PEMPHIGUS................................................................................................................ 93
A- L’association au locus HLA................................................................................................................ 93
B- Le polymorphisme génique des desmogléines................................................................................... 99
C- Autres gènes candidats..................................................................................................................... 101
V. LA REPONSE LYMPHOCYTAIRE T AU COURS DES PEMPHIGUS............................................................ 102
VI. LES FACTEURS ENVIRONNEMENTAUX ET EXOGENES DU PEMPHIGUS............................................. 106
A- L’épidémiologie des pemphigus endémiques.................................................................................... 106
1/ LE FOGO SELVAGEM ............................................................................................................................................................................................ 106
2/ LE PEMPGIGUS TUNISIEN ..................................................................................................................................................................................... 109
3/ LE PEMPHIGUS COLOMBIEN................................................................................................................................................................................ 109
B- Les facteurs exogènes ....................................................................................................................... 110
1/ LES PEMPHIGUS MEDICAMENTEUX.................................................................................................................................................................... 110
2/ LES RADIATIONS, LES FACTEURS DE CONTACT, LES VIRUS ET LES ALIMENTS ........................................................................................... 110
VII. LES TRAITEMENTS DES PEMPHIGUS................................................................................................... 111
OBJECTIFS DE THESE ..................................................................................... 114
MATERIELS & METHODES............................................................................... 116
A- Les patients....................................................................................................................................... 117
1/ DIAGNOSTIC........................................................................................................................................................................................................... 117
2/ LE GENOTYPAGE HLA DE CLASSE II.................................................................................................................................................................. 117
B- La quantification des transcrits normaux et alternatifs de la desmogléine 1 dans l’épiderme
humain.............................................................................................................................................. 117
1/ SOURCE TISSULAIRE ............................................................................................................................................................................................ 117
2/ EXTRACTION DES ARN ET TRANSCRIPTION INVERSE ...................................................................................................................................... 118
3/ AMPLIFICATION DES SEQUENCES ADNc SPECIFIQUES DES TRANSCRIPTS NORMAUX ET ALTERNATIFS DE LA DESMOGLEINE 1........ 118
4/ QUANTIFICATION DES TRANSCRITS NORMAUX ET ALTERNATIFS DE LA DESMOGLEINE 1 PAR PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL 121
Principe de la PCR en temps réel sur l’appareil LightCycler .............................................................................................................. 121
Amplification des séquences ADNc d’intérêt par Q-PCR en temps réel................................................................................................. 123
Normalisation et quantification des transcrits normaux et alternatifs de la desmogléine 1 ................................................................. 124
C- Production des desmogléines 1 recombinantes ............................................................................... 126
1/ PRODUCTION DE LA PROTEINE REC1/5-DSG1.................................................................................................................................................. 126 Préparation du vecteur « cassette » de clonage...................................................................................................................................... 128
Clonage de la région extracellulaire de la desmogléine 1 ...................................................................................................................... 134
Préparation du vecteur de transfert ...................................................................................................................................................... 136
Cotransfection des cellules d’insectes et production du virus recombinant ......................................................................................... 136
Production et purification de la protéine rEC1/5-Dsg1 ........................................................................................................................ 139
2/ SYNTHESE DE LA FORME TRONQUEE DE LA DESMOGLEINE 1 ...................................................................................................................... 139
Amplification de l’ADNc codant pour la protéine EC1/2-INT6.............................................................................................................. 139
Clonage de l’insert codant pour la protéine EC1/2-INT6...................................................................................................................... 140
Synthèse in vitro de la protéine EC1/2-INT6 ........................................................................................................................................ 142
D- La production et la caractérisation d’anticorps monoclonaux anti-desmogléine 1 et d’anticorps
polyclonaux dirigés contre son isoforme tronquée .......................................................................... 143
1/ COUPLAGE DES PEPTIDES A LA THYROGLOBULINE BOVINE .......................................................................................................................... 145
2/ IMMUNISATION DES ANIMAUX............................................................................................................................................................................. 145
3/ DETECTION DE LA PRODUCTION D’ANTICORPS SPECIFIQUES CHEZ LES ANIMAUX IMMUNISE ................................................................. 146
ELISA peptides...................................................................................................................................................................................... 146
ELISA rEC1/5-Dsg1.............................................................................................................................................................................. 146
Immunofluorescence indirecte .............................................................................................................................................................. 147
Immunoempreinte sur extrait protéique d’épiderme humain ............................................................................................................... 147
4/ PRODUCTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX............................................................................................................................................... 148
Génération des hybridomes .................................................................................................................................................................. 148
Clonage des hybridomes ....................................................................................................................................................................... 149
E- L’identification des protéines épidermiques cibles par immunocriblage......................................... 149
1/ IMMUNOCRIBLAGE DE CARTE PROTEIQUE 2D D’EPIDERME HUMAIN ........................................................................................................... 149
Préparation d’un extrait protéique d’épiderme humain ........................................................................................................................ 149
Réhydratation des bandelettes GPI ....................................................................................................................................................... 151
Première dimension : Isoélectrofocalisation des protéines .................................................................................................................... 151
Equilibrage des bandelettes GPI ........................................................................................................................................................... 152
Deuxième dimension : Séparation des protéines par SDS-PAGE.......................................................................................................... 152
Coloration des protéines de la carte 2D ................................................................................................................................................ 153
Identification des protéines................................................................................................................................................................... 153 2/ IMMUNOCRIBLAGE DE BANQUE D’EXPRESSION D’ADNc DE KERATINOCYTES HUMAINS........................................................................... 155
F- L’étude fonctionnelle de peptides spécifiques de l’isoforme tronquée de la desmogléine 1............ 157
1/ CAPACITE DE LIAISON DES PEPTIDES AUX MOLECULES HLA DE CLASSE II................................................................................................. 157
2/ PROLIFERATION LYMPHOCYTAIRE ..................................................................................................................................................................... 158
RESULTATS....................................................................................................... 159
A- Un épitope T spécifique d’une isoforme tronquée de la desmogléine 1, générée par épissage
alternatif, se fixe à la molécule HLA DRβ1*0102 de susceptibilité au pemphigus superficiel......... 160
ARTICLE 1...................................................................................................................................................................................................................... 163
B- L’immunisation de souris normales avec la desmogléine 1 induit une diversification de réponse
anticorps vis à vis d’autres composants du desmosome.................................................................. 164
ARTICLE 2...................................................................................................................................................................................................................... 166
C- Le transcrit de la desmogléine 1 est exprimé dans le thymus humain............................................ 167
ARTICLE 3...................................................................................................................................................................................................................... 168
DISCUSSION ..................................................................................................... 170
CONCLUSION.................................................................................................... 187
REFERENCES ................................................................................................... 188
ANNEXES.......................................................................................................... 206
Avant-propos
AVANT-PROPOS
Les pemphigus sont des maladies rares, dites orphelines dont l’incidence dans la
population mondiale est faible. A titre d’exemple, l’incidence du pemphigus vulgaire (le
plus fréquent) en Amérique du Nord et en Europe est de 1 à 3 nouveaux cas par million
d’habitants et par an. Les pemphigus sont des maladies graves associées à une mortalité
d’environ 30% pour le pemphigus vulgaire, à une importante altération des conditions de
vie, à la fois en terme de souffrances physique et mentale, et posent donc de réels
problèmes de santé publique.
Les pemphigus et plus généralement les maladies auto-immunes cutanées
bulleuses, représentent un véritable paradigme de maladies auto-immunes spécifiques
d’organe médiées par des autoanticorps pathogènes. Elles constituent donc un modèle
d’étude des mécanismes d’auto-immunité d’autant plus que les antigènes cibles sont
désormais connus et accessibles. En effet, depuis plus d’une vingtaine d’années, les
efforts de recherche ont permis la localisation puis l’identification des autoantigènes
cibles de la réponse auto-immune. L’étude des propriétés des autoanticorps, notamment
leur rôle dans le processus physiopathologique, ainsi que la caractérisation de la réponse
immune au niveau cellulaire ont largement contribué au développement de nouveaux
outils diagnostiques, à une meilleure compréhension des processus d’auto-immunisation
et à de nouvelles approches thérapeutiques.
En nous appuyant sur le concept bien établi du rôle initiateur de l’autoantigène au
cours des maladies auto-immunes, nous avons entrepris d’étudier l’intervention d’un des
autoantigènes des pemphigus, la desmogléine 1. Cette protéine est particulièrement
intéressante puisque qu’elle est la cible de la réponse auto-immune au cours des
différentes formes de pemphigus et par conséquent, semble jouer un rôle clé dans la
maladie.
1
INTRODUCTION
Introduction
- 2 -
INTRODUCTION
Le système immunitaire désigne un ensemble de facteurs cellulaires et humoraux
ayant pour but de protéger l’organisme des agressions provenant d’agents exogènes
(bactéries, virus, parasites) ou endogènes (cellules tumorales) reconnus comme
n’appartenant pas au « soi ». Les principales cellules du système immunitaire jouant un
rôle primordial dans le maintien de l’homéostasie sont les lymphocytes T et B capables de
reconnaître l’antigène (Ag) via leur récepteur pour l’Ag : TCR (T Cell Receptor) pour les
cellules T et BCR (B Cell Receptor) pour les cellules B. La reconnaissance de l’Ag par le
TCR nécessite, en outre, que celui-ci soit présenté par une molécule HLA (Human
Leukocyte Antigen) du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Les récepteurs pour
l'Ag sont spécifiques d’un Ag donné et l’ensemble des spécificités exprimées par les
lymphocytes en constitue le répertoire. Ce répertoire résulte d’un processus génétique
d’origine somatique. Il est théoriquement illimité et généré de façon stochastique avant
tout contact préalable avec l’Ag par des mécanismes de recombinaison génétique. La
génération de cette diversité est nécessaire à la défense de l’organisme. Elle constitue un
avantage sélectif. Néanmoins, le système immunitaire est susceptible de générer des
clones T et B capables de reconnaître des Ag du soi encore appelés clones autoréactifs. Ce
sont les phénomènes dits de tolérance immunitaire qui permettent de prévenir la
survenue de processus auto-immuns grâce à l’élimination ou au contrôle de ces clones
autoréactifs. Dans certaines conditions non physiologiques, une dérégulation du réseau
d’interactions cellulaires et moléculaires contrôlant la présence ou l’expansion de cellules
autoréactives peut conduire à une rupture de tolérance au soi caractérisée par l’activation
et la multiplication de ces cellules et au développement d’une maladie auto-immune
(MAI). Les pemphigus représentent un groupe de MAI spécifiques d’organe qui touchent la
peau et les muqueuses. Ils sont caractérisés par la production d’autoanticorps
pathogènes dirigés contre des protéines du desmosome, plus particulièrement, les
desmogléines qui permettent l’adhésion entre eux des kératinocytes de l’épiderme.
Ce propos introductif débutera par une description des divers aspects des MAI
comportant notamment, un bref rappel des mécanismes de tolérance aux Ag du soi, des
mécanismes effecteurs de la réponse auto-immune et des modèles expérimentaux d’étude
de ces pathologies. Ces thèmes seront présentés en insistant sur leur relation avec
l’autoantigène (autoAg). Dans un second temps, nous exposerons plus précisément les
différents arguments en faveur du rôle de l’autoAg dans les processus d’auto-immunité.
Enfin, après une synthèse sur la structure d’adhésion du desmosome, nous décrirons les
caractéristiques immunologiques des pemphigus.
Introduction
- 3 -
Chapitre 1 : Les Maladies Auto-immunes
I. LA TOLERANCE AU SOI
A- Evolution du concept de tolérance immunitaire
Au début du siècle dernier, Paul Ehrlich a observé le phénomène
d’alloimmunisation dûe à la présence d’isolysines (isoanticorps) par injection à des
chèvres de globules rouges homologues, tandis que toutes les tentatives d’auto-
immunisation afin de produire des autolysines (autoanticorps) ont échoué. Ces
observations montrant l’absence de réaction du système immunitaire vis à vis des propres
constituants de l’organisme ont conduit Ehrlich à la notion d’ horror autotoxicus pour
désigner l’incapacité de celui-ci à se mettre en danger par la production d’autoanticorps
(autoAc) toxiques. Ce postulat a été confirmé par la découverte des règles de compatibilité
transfusionnelle par Karl Landsteiner qui lui ont permit de définir le système ABO en
démontrant l’existence d’isoagglutinines naturelles dirigées contre l’Ag non exprimé et
l’absence d’autoAc contre l’Ag exprimé. Les expériences conduites par Owen en 1945
suivies par celles de Medawar ont eu une influence considérable dans l’élaboration de la
théorie de la délétion clonale par le groupe de McFarlane Burnet. L’interprétation de
Burnet et Medawar, a été que l’organisme doit acquérir la capacité de discriminer le soi
du non soi pendant la vie embryonnaire et que les clones autoréactifs sont éliminés
pendant la vie fœtale. Cette interprétation a permis de forger le concept de tolérance
immunitaire.
La théorie originelle de la distinction entre soi et non soi s’est ultérieurement
modifiée pour s’accommoder des nouvelles découvertes, incompatibles avec ce modèle
soi/non soi, telles que : la génération à partir de lymphocytes B activés de potentielles
cellules autoréactives via le phénomène d’hypermutation ; la nécessité pour le lymphocyte
T de recevoir en plus du signal procuré par l’interaction TCR/peptide/CMH, un second
signal apporté par des cellules présentatrices d’Ag (CPA) exprimant les molécules dites de
costimulation ; ou encore la théorie du Danger défendue par Polly Matzinger qui stipule
que la CPA pour fournir ce second signal doit elle-même recevoir un signal endogène
« d’alarme » ou « de danger » provenant d’une cellule lésée ou soumise à un stress
[Matzinger, 2002]. Il paraît clair aujourd’hui, que la tolérance immunitaire correspond
d’avantage à un état physiologique acquis où le système immunitaire ne réagit pas de
façon agressive contre les composants de l’organisme dans lequel il s’est développé, plutôt
qu’à un état de non réponse contre les constituants du soi. La tolérance désigne donc
l’ensemble des mécanismes inhibant ou contrôlant une réponse dirigée contre un Ag du
soi ou autoAg.
Introduction
- 4 -
B- Les mécanismes de tolérance immunitaire [Goodnow, 2005]
Les récepteurs pour l’Ag des lymphocytes T et B sont générés au hasard par le
processus de recombinaison des différents segments géniques V, D et J codant pour les
domaines variables de ces molécules. Entre 20 et 50% des TCR et des BCR ont une
affinité potentiellement dangereuse pour les Ag du soi. Par ailleurs, des clones B
autoréactifs peuvent aussi être générés par hypermutation somatique lors de leur
différenciation dans les centres germinatifs des organes lymphoïdes périphériques.
L’élimination des clones autoréactifs implique donc des mécanismes de tolérance
immunitaire intéressant aussi bien le compartiment T que le compartiment B. Dans de
nombreux modèles de souris transgéniques exprimant sur la majorité de leurs
lymphocytes un seul récepteur (TCR ou BCR), spécifique d’un Ag donné, le suivi du
développement de ces lymphocytes a permis de mettre en évidence plusieurs mécanismes
de tolérance souvent communs aux lymphocytes T et B. Classiquement, les mécanismes
de tolérance lymphocytaire se scindent selon leur localisation anatomique en deux
grandes catégories : l’une centrale, survenant dans les organes lymphoïdes centraux
(thymus pour les cellules T et moelle osseuse pour les cellules B) et l’autre périphérique,
prenant place dans les organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions lymphatiques,
système lymphoïde associé aux muqueuses). La tolérance peut être acquise selon quatre
mécanismes (Figure 1) : (i) l’élimination des cellules autoréactives par délétion clonale qui
intervient dans les organes lymphoïdes centraux précocement au cours de leur
différenciation ; (ii) la neutralisation fonctionnelle des cellules autoréactives appelée
anergie clonale, qui se traduit par l’inaptitude des cellules à répondre à une stimulation
par l’Ag ; (iii) la ré-édition du récepteur qui permet la génération de nouveaux récepteurs
ayant perdu leur autoréactivité ; (iv) la régulation extrinsèque des cellules T appellée
indifférence ou ignorance lymphocytaire (v) l’immunorégulation des cellules autoréactives
par des cellules régulatrices à activité suppressive ou par d’autres facteurs tels que des
facteurs de croissance ou des médiateurs pro-inflammatoires.
1/ LA TOLERANCE DES LYMPHOCYTES T
La tolérance centrale
Le répertoire lymphocytaire T exprimé en périphérie résulte des mécanismes de
sélection positive et sélection négative qui ont lieu dans le thymus. La sélection positive
est un processus destiné à favoriser la survie et l’expansion des thymocytes qui
reconnaissent les peptides du soi complexés aux molécules du CMH exprimées par les
cellules épithéliales de la corticale thymique. La sélection négative a pour but d’éliminer
les cellules fortement réactives vis à vis des peptides du soi présentés par les molécules
Introduction
- 5 -
du CMH qui sont exprimées par les cellules épithéliales de la médullaire thymique et les
cellules dendritiques.
Figure 1. Mécanismes de tolérance des lymphocytes T et B.
THYMUS MOELLE OESSEUSE
Organes lymphoïdes primaires
Organes lymphoïdes secondaires
RATE GANGLION LYMPHATIQUE
Lymphocytes T immatures
Lymphocytes B immatures
Lymphocytes matures
TO
LER
AN
CE
CE
NT
RA
LE
TO
LER
AN
CE
PE
RIP
HE
RIQ
UE
Lymphocytes activés ou effecteurs
DELETION CLONALE PAR APOPTOSE
RE-EDITION DES RECEPTEURS
DELETION CLONALE PAR APOPTOSE
IGNORANCE
ANERGIE
ACTIVITES REGULATRICES
ANERGIE
Introduction
- 6 -
Les cellules soumises à la sélection négative ou échappant à la sélection positive
meurent rapidement par apoptose. Bien que les événements moléculaires impliqués dans
ce phénomène soient encore mal connus, la signalisation de la mort cellulaire via les
molécules pro-apoptotiques BCL-2-interacting mediator of cell death (BIM) et Fas semble
cruciale. La délétion clonale des lymphocytes T autoréactifs est une étape essentielle dans
les processus de tolérance immune qui se traduit par l’élimination de 90% des
thymocytes entrant en différenciation.
Les thymocytes en voie de différenciation ont aussi la possibilité d’effectuer, nous
l’avons vu plus haut, une ré-édition de leur TCR ayant une forte affinité pour un Ag du
soi. Dans ce cas, l’expression du TCR est diminuée et grâce aux recombinases RAG
(recombination-activating gene) qui permettent le réarrangement des locus codant pour les
chaînes α et β, la première chaîne α synthétisée est remplacée par une seconde chaîne.
Ce second mécanisme de tolérance centrale permet donc in fine, la perte de la spécificité
anti-soi [McGargill, 2000].
Un dernier mécanisme de tolérance prenant place dans le thymus est l’anergie
selon lequel l’interaction du TCR avec le complexe peptide/CMH conduit à l’inactivation
intrinsèque du lymphocyte T. L’anergie lymphocytaire sera davantage détaillée dans la
partie consacrée aux mécanismes de tolérance périphérique.
Le thymus intervient dans les processus de tolérance T non seulement par la
délétion et l’anergie des cellules T autoréactives, mais aussi par la sélection positive des
cellules T dites régulatrices CD4+CD25high. Il est désormais clairement établi que ces
cellules constituent une lignée distincte de cellules T matures qui prend son origine au
niveau du thymus et nécessite une interaction forte avec les cellules épithéliales
thymiques exprimant un complexe peptide du soi/molécules CMH de classe II. Le thymus
contribue ainsi aux mécanismes de tolérance périphérique via la génération de
lymphocytes T régulateurs dont les caractéristiques seront abordées plus bas.
Le concept d’expression thymique d’antigènes tissu-spécifiques
La diversité des Ag du soi qui sont accessibles au répertoire T qui s’établit dans le
thymus va déterminer l’étendue et la spécificité de la tolérance centrale. Différentes
catégories de CPA, essentiellement les cellules épithéliales thymiques (CET) de la
médullaire et de la corticale, les cellules dendritiques thymiques et les macrophages,
chacune présentant un ensemble unique de peptides du soi, contribuent à la diversité
des Ag exprimés dans le thymus. L’absence d’autoréactivité vis à vis de protéines
exprimées spécifiquement dans un tissu était auparavant considérée comme la
conséquence exclusive de mécanismes de tolérance périphérique. En effet, n’étant pas
Introduction
- 7 -
représentés au niveau thymique, ces Ag tissu-spécifiques ne pouvaient intervenir dans la
délétion des clones T autoréactifs. Depuis une décennie, les travaux démontrant
l’expression thymique d’autoAg tissu-spécifiques chez l’homme, la souris ou le rat, se sont
progressivement accumulés (Tableau 1) [Sospedra, 1998; Heath, 1998]. Récemment, les
travaux de l’équipe de Klein [Derbinsky, 2001] ont révélé la diversité des protéines des
tissus qui sont représentées dans le thymus humain. On estime qu’environ 5 à 10% des
protéines du soi sont présentes au niveau du thymus. Ce concept est dénommé
promiscous gene expression. Cette expression de gènes tissu-spécifiques est une propriété
physiologique des CET, en particulier des CET de la médullaire (CETm) et persiste aussi
longtemps que des cellules T émigrent du thymus, même après l’involution thymique
[Derbinsky, 2001]. Ce phénomène est conservé chez l’homme et la souris. De manière
intéressante, certains des gènes tissulaires exprimés par les CETm sont regroupés sur
des segments chromosomiques [Gotter, 2004].
Tableau 1. Autoantigènes exprimés dans le thymus et maladies auto-immunes associées [Kyewsky B, 2004]
*L’expression thymique de ces autoAg n’a été détectée que chez la souris. Cyp11a1, cytochrome P450 11a1; IRBP, protéine de fixation à l’interphotorécepteur rétinoïde; TPO, thyropéroxydase; PLP, protéine protéolipidique; MBP, protéine basique de la myéline; MOG, glycoprotéine olygodendrocyte de la myéline; NAChR, récepteur nicotinique à l’acétylcholine; GAD, glutamate décarboxylase ; MART, antigène du mélanome reconnu par les cellules T.
Maladies auto-immunes Autoantigènes candidats
Maladie d’Addison Gastrite auto-immune Uvéite auto-immune Thyroïdite de Hashimoto Infertilité masculine Sclérose en plaque Myasthénie Polyarthrite rhumatoïde Diabète de type I Vitiligo APECED Pemphigus vulgaire
Cyp11a1* H+/K+-ATPase (chaîne α et β*) et facteur intrinsèque* IRBP, Antigène rétinien S, α1-cristalline* Thyroglobuline, TPO Antigène 6 associé au sperme, glutathion transférase PLP, (golli)-MBP, MOG et S100b* NAChR (chaîne α1) Collagène de type II Insuline, GAD65, GAD67 et IA-2 Tyrosinase, gp100 et MART1 Nombreux autoAg Desmogléine 3
Introduction
- 8 -
La base moléculaire de ce phénomène a été découverte par l’équipe de Mathis et
Benoist [Anderson, 2002] grâce à la caractérisation de souris invalidées pour le gène
AIRE. Le gène AIRE (Auto-immune regulator), initialement identifié chez l’homme [The
Finnish-German APECED Consortium, 1997 ; Nagamine, 1997], code pour un facteur de
transcription fortement exprimé dans le thymus, notamment par les CETm. Chez
l’homme, les mutations de ce gène (une cinquantaine a été identifiée) conduisent à une
maladie héréditaire monogénique définie comme le syndrome poly-endocrinien auto-
immun de type 1, le syndrome APS-1 (Auto-immune Polyendocrinopathy Syndrome type 1)
ou APECED (Auto-immune PolyEndocrinopathy Candidiasis Ectodermal Dystrophy).
L’APECED est caractérisé par un ensemble de manifestations pathologiques notamment
auto-immunes touchant particulièrement les organes endocriniens (Tableau 2) et par la
production d’autoAc dirigés contre les composants des organes affectés [Peterson, 2005].
Tableau 2. Manifestations pathologiques du syndrome APECED [Peterson P, 2005]
Composants de l’APECED Prévalence
(%)
Maladie d’Addison
Hypoparathyroïdisme
Candidose chronique
Dystrophie ectodermale
Thyroïdite auto-immune
Diabète de type 1
Hypogonadisme
Alopécie
Vitiligo
Kératopathie
Hépatite auto-immune
Anémie pernicieuse
Gastrite auto-immune
60-100
77-100
73-100
10-77
8-18
4-23
31-60
27-72
4-26
12-35
10-19
12-15
6
Les souris AIRE-/- présentent des manifestations auto-immunes proches de celles
observées au cours du syndrome APECED, avec une infiltration lymphocytaire des
organes cibles associée à la présence d’autoAc. L’analyse comparative du transcriptome
des cellules thymiques des souris AIRE-/- et des souris normales a montré que la protéine
AIRE induit l’expression dans les CETm, de 200 à 1200 transcrits dont la majorité ont
une expression restreinte à un seul tissu. Beaucoup de ces gènes codent pour des autoAg
qui sont la cible des réponses au cours de MAI, tels que la pro-insuline ou le cytochrome
P450 1A2 [Anderson, 2002]. AIRE exerce sa fonction de tolérisation en permettant la
sélection négative des cellules T autoréactives plutôt que la sélection de lymphocytes T
Introduction
- 9 -
régulateurs que l’on sait aujourd’hui générés dans le thymus. En outre, AIRE semble
capable d’augmenter les propriétés de CPA des CETm [Anderson, 2005a]. Par sa fonction
d’induction de l’expression d’Ag tissu-spécifiques dans le thymus, AIRE a donc un rôle
crucial dans l’acquisition de la tolérance des lymphocytes T (Figure 2). Il est cependant
nécessaire d’apporter quelques nuances. En effet, de nombreux gènes tissu-restreints
sont exprimés dans les CETm matures en l’absence de AIRE qui ne constitue
vraisemblablement pas l'inducteur exclusif de cette promiscous gene expression
[Derbinsky, 2005]. Par ailleurs, l'expression ectopique d'Ag tissulaires dans le thymus au
niveau transcriptionnel n'est pas la condition sine qua none d'une délétion efficace des
cellules T autoréactives vis à vis des peptides de cet Ag comme cela a pu être montré pour
la H+/K+ ATPase, autoAg cible au cours de la gastrite auto-immune [Allen, 2005].
Figure 2. Rôle de la protéine AIRE dans l’induction de la tolérance intrathymique. Dans les conditions normales, AIRE est fonctionnelle et induit l’expression des Ag du soi par les cellules épithéliales thymiques (CET) permettant la délétion des cellules T autoréactives au cours du processus de sélection négative. Lorsque la protéine AIRE est défective chez l’homme au cours du syndrome APECED et chez les souris AIRE-/-, les CET ne présentent plus les peptides du soi aux cellules T autoréactives. Ces cellules survivent, prolifèrent et initient une réponse auto-immune en périphérie, lors de la rencontre avec les autoAg cibles.
APECED
Perte de fonction
Cellule AIRE-
Cellule AIRE+ AIRE fonctionnelle
Destruction des cellules autoréactives
Cellules autoréactives
Thymocyte exprimant un TCR anti-Ag du soi
Mutation R257X
Peptide du soi
CET
CET
Introduction
- 10 -
S’il est admis que les cellules T fortement autoréactives sont éliminées lors des
événements de sélection intrathymique, de nombreuses études ont révélé le caractère
partiel du phénomène de délétion clonale. En effet, tous les Ag tissu-spécifiques ne sont
pas exprimés dans le thymus (Ag séquestrés). De plus, des modifications d'ordre
quantitatif et qualitatif qui seront explicitées ultérieurement peuvent affecter l'expression
thymique d'autoAg. Enfin, certaines modifications physiologiques (dégradation
métabolique, spermatogenèse, lactation…) se traduisent par la synthèse de novo de
molécules du soi qui nécessite une tolérisation des cellules T potentiellement
autoréactives vis à vis de ces Ag. Des mécanismes tolérogènes doivent donc compléter à la
périphérie, la purge des cellules T autoréactives amorcée au niveau central par les
phénomènes de sélection intrathymique.
La tolérance périphérique
Les 4 mécanismes de tolérance périphérique qui peuvent s’exercer sur les
lymphocytes T et B sont présentés dans la figure 1. L'anergie consiste en une altération
fonctionnelle des cellules T autoréactives qui se traduit par une incapacité à être activées
et à proliférer en réponse à une stimulation antigénique. Ce mécanisme de régulation
intrinsèque des lymphocytes T peut résulter de modifications biochimiques diverses.
Celles-ci consistent en la diminution de l'expression des TCR qui peut être de 50% et,
l'augmentation du seuil d'activation de la cellule par recrutement, par exemple, de
molécules impliquées dans le contrôle négatif de la voie de signalisation du TCR comme
CD5 ou CTLA4 (Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4). Ces molécules ont donc un rôle crucial
dans le maintien de l'anergie périphérique de lymphocytes T autoréactifs.
Un autre modèle de tolérance périphérique est l'indifférence lymphocytaire. Il s'agit
d'une régulation extrinsèque du lymphocyte T par limitation des stimulus
immunogèniques. Parmi les stimulus immunogèniques susceptibles d'induire cette levée
d'indifférence, l'interaction de la molécule CD28 exprimée par les cellules T avec les
protéines B7-1 (CD80) et B7-2 (CD86) à la surface des APC a vraisemblablement un rôle
majeur. De façon générale les APC, notamment les cellules dendritiques et leur activation
par l'intermédiaire des récepteurs Toll-like (TLR), participent étroitement à l'activation des
cellules T autoréactives et donc au contrôle de la tolérance T périphérique [Turley, 2002].
Un dernier mécanisme est l'immunorégulation, c'est-à-dire la suppression de
clones T autoréactifs par d'autres populations lymphocytaires T. L’autoréactivité
physiologique et, de façon plus générale, l’ensemble des réponses immunitaires sont
placées sous le contrôle de plusieurs populations de cellules T régulatrices, appelées
autrefois cellules T suppressives. Cette immunorégulation joue un rôle essentiel dans la
tolérance périphérique comme l’illustre l’apparition d’un syndrome poly-auto-immun
Introduction
- 11 -
après thymectomie chez la souris [Sakaguchi, 2004]. Le rôle de l’immunorégulation dans
la tolérance périphérique est, cependant, complexe et encore mal défini, faisant intervenir
à la fois des cellules régulatrices naturelles (cellules T CD4+CD25high mais aussi cellules
NKT et γ/δ+) dont la présence n’est pas secondaire à des stimulations exogènes ou
endogènes et des cellules régulatrices adaptatives (telles que les cellules Th2,
CD4+CD62L+ et Tr1) dont la différentiation est secondaire à la stimulation par un autoAg.
Néanmoins, au vu des différentes avancées réalisées sur la compréhension des
lymphocytes T régulateurs et de leur utilisation potentielle dans le traitement des MAI, il
est intéressant d’en décliner quelques caractéristiques. Les expériences in vitro ont
montré que les cellules T CD4+CD25high sont capables d’inhiber la prolifération et les
fonctions effectrices de lymphocytes T CD4+CD25-. Bien que ces cellules régulatrices aient
une spécificité pour l’autoAg, il n’est pas formellement établi que leur action suppressive
soit spécifique de l’autoAg reconnu ou plus diffuse, en s’étendant à des réponses
immunitaires spécifiques d’autres autoAg. En revanche, leur action suppressive semble
nécessiter un contact direct avec les cellules cibles et n’apparaît pas dépendante de la
sécrétion de cytokines. Toutefois, le rôle de l’IL10 et surtout du TGFβ (transforming growth
factor-β) a été évoqué, de même que l’intervention de molécule membranaire notamment
celle de la molécule CTLA4 et du GITR (glucocorticoid-induced tumor-necrosis factor like
receptor). Enfin, le facteur de transcription Foxp3 (forkhead box P3) constituerait un
marqueur spécifique des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25high chez l'homme et la
souris. Des mutations du gène Foxp3, situé sur le chromosome X, sont responsables chez
l'homme de troubles dysimmunitaires complexes, tel que l'IPEX (immune dysregulation,
polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome). Les sujets atteints sont des enfants
de sexe masculin qui présentent une sensibilité particulière aux maladies auto-immunes
et allergiques. Chez la souris, les mutations du gène Foxp3 sont à l'origine du phénotype
dit scurfy. Les souris scurfy développent des pathologies analogues à celles de l'IPEX chez
l'homme et présentent également une lymphoprolifération associée à une activation
anormalement élevée des cellules T CD4+. L'étude de ce modèle a permis de mettre en
évidence le rôle essentiel de Foxp3 dans l'orientation et le développement thymique des
cellules T régulatrices CD4+CD25high [Sakaguchi, 2004].
2/ LA TOLERANCE DES LYMPHOCYTES B
La tolérance centrale
Au niveau central, la sélection négative des lymphocytes B a lieu dans la moelle
osseuse, au stade immature. Les analyses de souris transgéniques exprimant un
répertoire de BCR restreint révèlent une série d'événements cellulaires qui sont
déclenchés immédiatement après que des cellules B immatures arborent des récepteurs
anti-Ag du soi dans la moelle osseuse. Lorsque l'affinité du BCR pour l'Ag et la
Introduction
- 12 -
signalisation intracellulaire excèdent un certain seuil, les lymphocytes B internalisent
rapidement leurs BCR et stoppent temporairement leur programme de maturation. Trois
événements vont résulter de cet état: les récepteurs de « homing » tel que le ligand de
CD62, nécessaires à l'entrée des cellules B dans les ganglions lymphatiques, ne sont pas
exprimés; (ii) les récepteurs pour le B-cell activating factor (BAFF), une cytokine requise
pour la survie des lymphocytes B, ne sont pas induits; (iii) les recombinases RAG-1 et
RAG-2 sont exprimées. Les cellules B immatures exprimant un BCR anti-soi de forte
affinité ont alors la possibilité de ré-éditer leur récepteur. Le réarrangement du locus
codant pour la chaîne légère par les recombinases permet le remplacement de la première
chaîne légère par une deuxième chaîne et, in fine, la perte de la spécificité anti-soi
[Erikson, 1991 ; Nemazee, 2003]. Si leurs récepteurs autoréactifs n'ont pas été ré-édités,
les cellules B meurent après 1 à 2 jours. Ce processus de délétion clonale implique
l'induction du facteur pro-apoptotique BIM ainsi que la répression des récepteurs de la
molécule BAFF.
Une anergie des clones lymphocytaires B dirigée contre l'Ag du soi peut également
être induite au niveau de la moelle osseuse. Les lymphocytes B anergisés présentent alors
une diminution, soit de l'expression du BCR, soit des signaux d'activation de la voie de
signalisation positive du BCR. Le modèle murin double transgénique pour le lysozyme de
poule et un anticorps (Ac) spécifique de haute affinité dirigé contre cette molécule a
largement contribué à l’exploration du phénomène d'anergie clonale. Dans ce modèle,
bien que des clones autoréactifs spécifiques du lysozyme soient présents, aucune réponse
humorale spécifique n'est initiée par ces cellules B [Goodnow, 1988].
La tolérance périphérique
Au niveau périphérique, le lymphocyte B peut aussi manifester une indifférence vis
à vis des autoAg. La prolifération et la différenciation des cellules B en plasmocytes
nécessitent en effet que celles-ci reçoivent deux signaux, l'un de l'Ag se liant au BCR et
l'autre des cellules T auxiliaires. Les lymphocytes T peuvent délivrer leur message par le
ligand de CD40 exprimé à leur surface et la sécrétion de cytokines telles que l'IL2, l'IL4,
l'IL5 et l'IL21. L'absence du deuxième signal, c'est-à-dire de cellules T spécifiques d'un des
épitopes de l'Ag conduit à l'arrêt du programme de différenciation voire à la mort cellulaire
du lymphocyte B [Goodnow, 2005]. Récemment, le rôle des TLR exprimés à la surface des
cellules B a été démontré dans l'activation du lymphocyte B [Beutler, 2004] : ceux-ci
pourraient se substituer partiellement aux signaux délivrés par les cellules T pour
permettre la production d'Ac.
Introduction
- 13 -
II. PRESENTATION DES MALADIES AUTO-IMMUNES
Les MAI représentent l’expression pathologique du phénomène d’auto-immunité. Il
est légitime de penser que des défaillances au niveau des différents mécanismes
d’induction de tolérance centrale et/ou périphérique conduisent à l’émergence de
lymphocytes T et B autoréactifs et donc, à la possibilité de développer des manifestations
auto-immunes. Cette rupture de la tolérance est par exemple parfaitement illustrée par le
syndrome APECED chez l’homme et chez la souris invalidée pour le gène AIRE. Dans ce
cas, un défaut constitutionnel unique dans l’expression thymique des autoAg et donc,
dans le processus de sélection négative des clones T autoréactifs aboutit à l’induction
d’un syndrome « multi-auto-immun ». Toutefois, la plupart des MAI sont des maladies
multifactorielles qui résultent non pas d’un seul facteur génétique mais de l’action
conjointe de facteurs génétiques et environnementaux. Leur survenue n’est donc pas
souvent la conséquence d’un mécanisme univoque.
A- Critères et classification
Les MAI sont fréquentes puisqu’elles affectent 5 à 7 % de la population [Sinha,
1990]. On en connaît plus de 40 et quasiment tous les organes peuvent être touchés.
Quatre critères majeurs permettent d’affirmer l’origine auto-immune d’une maladie [Rose,
1993] : (i) la mise en évidence d’une réaction auto-immune (humorale ou cellulaire)
dirigée contre l’organe à l’origine des manifestations cliniques ; (ii) la démonstration du
pouvoir pathogène des effecteurs auto-immuns in vitro par des tests fonctionnels ou in
vivo par des expériences de transfert ; (iii) l’induction d’une maladie expérimentale par
immunisation avec l’autoAg cible ; (iv) la prévention ou la suppression de la maladie par
l’administration d’un traitement immunosuppresseur. Peu de MAI réunissent l’ensemble
de ces critères et dans de nombreux cas, seuls deux ou trois de ces critères sont réunis.
Il est d’usage de classer les MAI en deux catégories (Tableau 3) : (i) les MAI
spécifiques d’organe, comme le diabète de type I, la myasthénie, les thyroïdites et les
pemphigus, caractérisées par une réponse auto-immune dirigée contre des Ag exprimés
spécifiquement par l’organe cible; (ii) les MAI non spécifiques d’organe ou systémique,
caractérisées des manifestations pathologiques plus étendues, telles que le lupus
érythémateux disséminé (LED) ou la polyarthrite rhumatoïde (PR), et dont la rupture de
tolérance intéresse des autoAg ubiquitaires, exprimés par un grand nombre de tissus
(Tableau 4). Ces maladies n’en demeurent pas moins Ag spécifique et peuvent
paradoxalement s’exprimer préférentiellement au niveau d’un ou de plusieurs organes
[Matsumoto, 1999].
Introduction
- 14 -
Tableau 3. Les principales maladies auto-immunes
Maladies auto-immunes
Non spécifiques d’organe Lupus érythémateux disséminé Polyarthrite rhumatoïde Syndrome de Gougerot-Sjögren Anémies hémolytiques, leucopénies et thrombopénies auto-immunes Sclérodermie Dermatomyosite, polymyosite
Spécifiques d’organe Thyroïdites Maladie de Basedow Hypoparathyroïdie Maladie d’Addison Diabète de type 1 Certains hypogonadismes Anémie de Biermer Maladie de Crohn Myasthénie Rhumatisme articulaire aigu Syndrome de Lambert-Eaton Sclérose en plaques Syndrome de Guillain-Barré Syndrome de Goodspature Pemphigus Maladies bulleuses auto-immunes sous-épidermiques Vitiligo Pelade Psoriasis Hépatites aiguës Hépatites chroniques actives Cirrhose biliaire primitive Ophtalmies sympathiques Uvéites Certaines stérilités
Organe cible GLANDES ENDOCRINES
TRACTUS GASTRO-INTESTINAL MUSCLE SYSTEME NERVEAUX REIN
PEAU FOIE OEIL SPERMATOZOIDES
Introduction
- 15 -
Tableau 4. Diversité des autoantigènes au cours des maladies auto-immunes
GABA, acide gamma-amino butyrique ; LED, lupus érythémateux disséminé ; RNP, ribonucléoprotéines ; TSH, Thyroid Stimulating Hormone.
Les mécanismes effecteurs de l’auto-immunité peuvent faire intervenir l’immunité
cellulaire et/ou l’immunité humorale. Les autoAc, les cellules T cytotoxiques et d’autres
effecteurs cellulaires ou moléculaires recrutés par les cellules auto-immunes, constituent
les mécanismes lésionnels au cours des MAI.
Nature biochimique Localisation tissulaire
Fonction Maladies auto-immunes
Protéines Protéines structurales Histones Myosine Desmogléines Collagène IV Protéines fonctionnelles Récepteur de la TSH Récepteur de l’Ach Facteur intrinsèque Immunoglobulines Hormones Insuline Thyroglobuline Enzymes Pyruvate-déshydrogénase H+/K+-ATPase Glutamate décarboxylase Calpastatine Transglutaminase
Ubiquitaire Muscle strié Peau/Muqueuses Rein Thyroïde Muscles Estomac Sang Pancréas Thyroïde Ubiquitaire Estomac Pancréas Ubiquitaire Ubiquitaire
Chromatine Myofibrilles Desmosomes Membrane basale Croissance des cellules thyroïdiennes Transmission du signal Transport vitamine B12 Immunologique Métabolisme du glucose Fonction thyroïdienne Mitochondries Formation de HCl Synthèse du GABA Inhibition des calpaïnes Digestion du gluten
Connectivites Cardiomyopathies Pemphigus Syndrome de Goodpasture Maladie de Basedow Myasthénie Anémie de Biermer Polyarthrite rhumatoïde Diabète de type 1 Thyroïdite Cirrhose biliaire primitive Gastrites auto-immunes Diabète de type 1 Polyarthrite rhumatoïde Maladie coeliaque
Acides nucléiques ADN Complexes ribonucléiques (U1RNP)
Ubiquitaire Ubiquitaire
Support génétique Splicéosomes
LED LED
Lipides Phospholipides
Ubiquitaire
Constituant membranaire
Syndrome des anti-phospholipides
Polysaccharides Antigène I
Erythrocytes et ubiquitaire
Structure des Ags des groupes sanguins
Anémies hémolytiques
Introduction
- 16 -
B- Les mécanismes lésionnels des effecteurs auto-immuns
1/ LES AUTOANTICORPS : DES FACTEURS LESIONNELS MAJEURS
La preuve la plus éloquente du caractère pathogène des autoAc est la capacité de
transférer la maladie par le sérum des malades atteints d’une MAI. Cette démonstration
peut être faîte, soit chez l’animal par le transfert passif du sérum à des animaux
normaux, soit chez l’homme, par transfert transplacentaire des autoAc de classe G de la
mère atteinte au fœtus. Ainsi, la myasthénie [Gardnerova, 1997], l’hyperthyroïdie
[Hollingsworth, 1976], le pemphigus [Anhalt, 1982] peuvent-ils être induits chez la souris
par le transfert d’IgG isolées à partir du sérum de malades. Le transfert d’autoAc de la
mère à son fœtus est par exemple responsable de myasthénie néonatale [Gardnerova,
1997], d’hyperthyperthyroïdie ou de pemphigus vulgaire [Chowdhury, 1998].
Les mécanismes par lesquels les autoAc induisent des lésions cellulaires ou
tissulaires sont divers. Quatre grands mécanismes peuvent être mis en jeu (Tableau 5,
figure 3).
Tableau 5. Mécanismes lésionnels des autoanticorps
Mécanismes Maladies auto-immunes
CYTOLYSE DIRECTE
Complément dépendante Cellulaire dépendante des Ac (ADCC) BLOCAGE FONCTIONNEL
D’une molécule circulante D’une molécule membranaire par :
○ Blocage stérique
○ Modulation antigènique STIMULATION FONCTIONNELLE
D’un récepteur D’une activité enzymatique INFLAMMATOIRE
Complexes immuns
LED Myocardite
Myasthénie, thyroïdite, anémie de Biermer
Myasthénie
Myasthénie, hyperthyroïdie, encéphalite de Rasmussen
Pemphigus, LED
LED, glomérulonéphrites
LED, lupus érythémateux disséminé.
Introduction
- 17 -
Figure 3. Exemples de mécanismes lésionnels autoanticorps dépendants.
La cytolyse de la cellule cible peut être secondaire à l’activation du complément. Au
cours des anémies hémolytiques par exemple, les Ac anti-I fixés à la surface des
érythrocytes activent le complément via la voie classique. Cette activation aboutit à la
formation du complexe d’attaque membranaire C5b9 qui forme des pores dans la
membrane du globule rouge et induit la lyse cellulaire. Au cours de la pemphigoïde
bulleuse, une maladie bulleuse auto-immune de la jonction dermoépidermique, des
dépôts du fragment C3 du complément et d’IgG sont présents au siège du décollement
dermoépidermique responsable de la formation de bulles cutanées chez les malades
[Mouquet, 2005]. De plus, dans le modèle expérimental murin de la pemphigoïde induite
par transfert passif d’Ac dirigés contre l’autoAg cible de la maladie humaine, l’activation
du complément est indispensable [Liu, 1995]. La cytolyse médiée par les autoAc peut
aussi faire intervenir les cellules monocytaires/macrophagiques. Ces cellules peuvent
C
C
C
C C
C
C
C
CYTOLYSE COMPLEMENT-DEPENDANTE
C C C
FORMATION DE COMPLEXES IMMUNS
STIMULATION FONCTIONNELLE
CYTOTOXITE CELLULAIRE ANTICORPS-DEPENDENTE (ADCC)
BLOCAGE FONCTIONNEL
Ligands
Récepteurs membranaires
Cellule cible
Cellule NK
Ag
AutoAg FcγR
Introduction
- 18 -
fixer par leur récepteur du fragment Fc des IgG (FcγR), les cellules cibles recouvertes des
autoAc spécifiques d’un Ag qu’elles expriment, les phagocyter et enfin les détruire. La
phagocytose des plaquettes par les macrophages au cours des thrombopénies auto-
immunes illustre ce mécanisme. La cytotoxicité cellulaire dépendante des Ac (ADCC)
constitue un troisième mécanisme lésionnel de cytolyse directe. Cette cytotoxicité est
exercée par des cellules mononuclées en particulier les cellules NK (natural killer). Les
lymphocytes NK s’activent via l’interaction entre leurs FcγR et les autoAc recouvrant les
cellules et libèrent des granules lysosomiaux contenant des enzymes, les granzymes
(sérines-estérases) et la perforine, qui vont détruire la cellule cible. Ce mécanisme
interviendrait dans la destruction des cardiocytes au cours des myocardites [Anand,
1983].
Certains autoAc ont la capacité de se lier à des récepteurs membranaires et d’en
modifier l’expression ou les fonctions biologiques. La myasthénie en fournit l’illustration
la plus éloquente. Des expériences de culture de lignées de cellules musculaires
exprimant de récepteur à l’acétylcholine (ACh) réalisées en présence de sérum de malades
atteints de myasthénie ont montré que le pontage des récepteurs par les autoAc
s’accompagne de leur internalisation et d’une augmentation de leur dégradation. Cette
modulation de l’expression membranaire du récepteur à l’ACh altère la transmission
neuromusculaire qui caractérise la maladie. Un second mode d’action de ces autoAc anti-
récepteur à l’Ach pourrait être le blocage par encombrement stérique de la liaison de
l’ACh à son récepteur [Eymard, 1997]. La thyroïdite de Hashimoto illustre également le
blocage par des autoAc de la liaison d’un ligand à son récepteur. En effet, certains
malades atteints de thyroïdite de Hashimoto présentent des autoAc qui bloquent le
récepteur de la TSH (Thyroid Stimulating Hormone) et cette fixation provoque une
inhibition des fonctions thyroïdiennes [Mukhtar, 1975]. A l’instar, dans la maladie de
Basedow, les autoAc anti-récepteurs de la TSH sont capables d’activer ce récepteur et
ainsi d’induire une hyperthyroïdie avec sécrétion accrue d’hormones thyroïdiennes
[Geenen, 2001]. Ce mécanisme d’activation d’un récepteur par des autoAc est aussi
invoqué dans l’encéphalite de Rasmussen, qui est caractérisée par une production d’Ac
dirigés contre le récepteur d’un neurotransmetteur, le glutamate, à l’origine d’une
épilepsie sévère et d’une démence progressive chez l’enfant [Rogers, 1996].
D’autres populations d’autoAc, dont la cible correspond à une protéine de surface
cellulaire, semblent capables d’induire après leur fixation, la formation de seconds
messagers et la transduction de signaux aboutissant à l’activation cellulaire. Ce mode
d’action des autoAc est incriminé dans la physiopathologie des pemphigus et sera
développé dans la partie qui lui est consacrée.
Introduction
- 19 -
Un autre mécanisme lésionnel des autoAc est lié à la formation de complexes
immuns. Ces complexes peuvent se former soit dans la circulation puis se déposer au
niveau des tissus, soit in situ, l’Ag se déposant en premier avant d’être reconnu par les
autoAc circulants. Ces mécanismes de formation de dépôt des complexes immuns
conduisent à l’activation du complément, à la libération d’anaphylatoxines, au
recrutement et à l’activation des polynucléaires neutrophiles qui participent aux lésions
inflammatoires. Les glomérulonéphrites observées au cours du LED en constituent sans
doute un bon modèle [Clough, 1992]. Les autoAc se fixent à leurs cibles, notamment
l’ADN et les constituants du nucléosome, insérés dans la membrane basale des
glomérules et/ou les complexes immuns s’y déposent. Ceci entraîne l’activation du
complément et la libération d’anaphylatoxines qui accroissent l’accès de la membrane
basale par contraction des cellules endothéliales. L’altération de la membrane basale
glomérulaire est dûe à trois mécanismes : (i) directement par dépôts des complexes
immuns, les Ac et le complément modifiant les propriétés électrostatiques de la
membrane basale, ayant pour conséquence la fuite de protéines du sérum dans les
urines (protéinurie) ; (ii) indirectement par le recrutement de polynucléaires neutrophiles
qui sécrètent des enzymes digérant la membrane basale, et, (iii) par accumulation dans le
temps de complexes immuns sur la membrane basale, faisant perdre au glomérule son
pouvoir filtrant.
Dans certains cas on invoque la pénétration intracellulaire des autoAc. En effet,
des autoAc sont capables de pénétrer à l’intérieur d’une cellule vivante, d’atteindre leur
Ag par exemple nucléaire et, ainsi de modifier les fonctions cellulaires [Alarcon-Segovia,
1996a ; Alarcon-Segovia, 1996b]. C’est le cas des Ac anti-ribonucléoprotéines (RNP) et
anti-ADN produits au cours du LED ou encore des Ac anti-Hu produits au cours des
encéphalites paranéoplasiques observées chez les patients présentant un cancer du
poumon à petites cellules. La mise en évidence de la capacité qu’ont certains Ac de
pénétrer à l’intérieur des cellules ouvre donc de nouvelles perspectives dans la
compréhension des mécanismes par lesquels certains autoAc dirigés contre des Ag
intracellulaires participent au dysfonctionnement de certaines catégories cellulaires et
donc de certains organes.
2/ LES EFFECTEURS LYMPHOCYTAIRES T
Le diabète de type 1 et la sclérose en plaques représentent deux prototypes de MAI
médiées par les lymphocytes T. La première démonstration du caractère auto-immun du
diabète de type 1 a été fournie par la détection d’autoAc dirigés contre les cellules β des
îlots de Langerhans dans les sérums d’individus prédiabétiques ou diabétiques. Les
modèles de diabète de type 1 spontané chez la souris NOD (Non Obese Diabetic) ou chez
Introduction
- 20 -
les rats BB (bio-breeding) ont toutefois démontré que la destruction des cellules β,
caractéristique de la maladie humaine, est dépendante et assurée par les lymphocytes T,
les cellules T CD4+ et CD8+ étant toutes deux nécessaires [Tisch, 1996]. La spécificité du
diabète de type 1 chez l’homme est l’infiltration cellulaire des îlots pancréatiques (ou
insulite). Les études immunohistochimiques ont montré que ces cellules sont
majoritairement des lymphocytes T et, plus particulièrement, des lymphocytes T CD8+
auxquels s’associent des macrophages et des lymphocytes B. Le rôle prépondérant des
effecteurs T dans le développement de la maladie est démontré par le fait que les
lymphocytes T purifiés à partir de la rate de souris diabétiques donatrices peuvent
transférer le diabète, de manière adoptive, à des souris receveuses syngéniques et non
atteintes, les souris NOD-SCID, dépourvues de lymphocytes B et T, par exemple.
L’induction du diabète chez l’animal receveur n’est possible que si les deux populations T
CD4+ et CD8+ issues des souris diabétiques sont transférées et, ne nécessite ni la
présence de lymphocytes B du donneur ni ceux du receveur [Haskins, 1996].
Un mécanisme lésionnel médié par lymphocytes T est également impliqué dans le
développement de la sclérose en plaques (SEP), et des modèles animaux
d’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE). L’EAE peut être induite dans de
nombreuses espèces animales par immunisation avec de la myéline du système nerveux
central ou certains de ses composants comme la protéine basique de la myéline (MBP), la
protéine protéolipidique (PLP), et la protéine oligodendriale de la myéline (MOG) [Liblau,
1992]. Cette affection peut également être induite passivement par le transfert de
lymphocytes T CD4+ autoréactifs à des animaux syngéniques. Il est toutefois essentiel de
rappeler que ces maladies s’accompagnent de la production d’autoAc (par exemple d’Ac
anti-insuline au cours du diabète ou d’Ac anti-MOG au cours de la SEP) qui constituent
de bons marqueurs de la réponse auto-immune spécifique.
C- Les modèles expérimentaux de maladies auto-immunes
Les modèles animaux de MAI, qu’ils soient spontanés ou induits, sont à l’origine de
progrès formidables sur la compréhension des mécanismes de rupture de la tolérance,
des mécanismes effecteurs de la réponse auto-immune, et des bases génétiques qui
concourent à la survenue de la maladie chez l’homme. A ce titre, l’exploitation du modèle
NOD ou encore des souris lupiques a fourni une profusion d’aperçus sur la complexité de
survenue des manifestations auto-immunes. Ces modèles permettent notamment
d’attribuer aux autoAg un rôle essentiel dans l’initiation de la réponse immunitaire.
Introduction
- 21 -
1/ LES MODELES SPONTANES
La souris NOD [Anderson, 2005b]
La souris NOD, obtenue au Japon par Makino et al à la fin des années 1960,
constitue vraisemblablement le plus informatif et important modèle expérimental de
diabète de type 1. L’incidence de la maladie chez la souris NOD est de 60-80% pour les
femelles et de 20-30% pour les mâles. Comme certains malades atteints de diabète de
type 1, la souris NOD conjugue de manière globale, une propension génétique pour une
auto-immunité multi-organe. En effet, la souris NOD peut également développer d’autres
manifestations auto-immunes telles qu’une thyroïdite auto-immune, une polyneuropathie
périphérique auto-immune, une sialite auto-immune ou une anémie hémolytique. Le
diabète survient entre la 12e et 14e semaine chez les femelles et un peu plus tard chez les
mâles. Les études histologiques ont montré que des infiltrats de cellules mononuclées
sont présents autour des îlots de Langerhans (péri-insulite) des souris mâles et femelles à
partir d’environ 3-4 semaines d’âge et, qu’ils envahissent progressivement les îlots
(insulite) préalablement à la survenue du diabète. La majorité des cellules qui composent
ces infiltrats sont des lymphocytes T CD4+ bien que des lymphocytes T CD8+, des
cellules NK, des lymphocytes B, des cellules dendritiques et macrophages peuvent aussi
être identifiés dans les lésions. Plusieurs arguments prouvent que la maladie chez la
souris NOD est essentiellement médiée par les lymphocytes T CD4+ et CD8+ : la capacité
de transférer passivement le diabète à des souris receveuses saines par des cellules T
CD4+ et CD8+ purifiés à partir de souris NOD ou de clones T (restreints par les molécules
du CMH de classe I et de classe II) dérivés des îlots des souris NOD ou encore le fait que
les thérapies modulant les cellules T inhibent l’incidence de la maladie. La souris NOD
développe également des autoAc contre des Ag des cellules β des îlots pancréatiques de
Langerhans. Tandis que le diabète est transférable par transfert passif de splénocytes
issus d’animaux malades, il ne peut cependant pas être transféré par les autoAc de souris
diabétiques, bien que les cellules B soient clairement impliquées dans le développement
de la maladie. L’inflammation suivie de la destruction des cellules β productrices
d’insuline par les cellules T autoréactives est la conséquence du diabète d’origine auto-
immune. L’administration d’alloxane qui détruit sélectivement les cellules β des îlots de
Langerhans préalablement à la survenue de la maladie, prévient l’apparition des autoAc
et des effecteurs cytotoxiques dirigés contre les Ag pancréatiques et souligne que la
présence de l’autoAg est indispensable pour induire la réponse auto-immune [Larger,
1995].
Introduction
- 22 -
Les souris lupiques
Plusieurs modèles murins développent un lupus spontané caractérisé par des
manifestations voisines de la maladie humaine. Quatre lignées de souris lupiques sont
particulièrement étudiées : les souris NZB (New Zealand Black), les hybrides (NZB x
NZW)F1 ou BW, les souris MRL-lpr/lpr et les souris BXSB. Chaque modèle a ses propres
caractéristiques génotypiques, phénotypiques et pathologiques soulignant ainsi la
diversité et la nature polygénique de la maladie lupique. Il n’en demeure pas moins qu’il
existe des caractéristiques communes à ces quatre lignées : l’hypergammaglobulinémie,
l’activation polyclonale des lymphocytes B liée à une hyperactivité intrinsèque et/ou une
réponse accrue de ces cellules à des facteurs de stimulation, la production d’Ac dirigés
contre des constituants nucléaires (par exemple l’ADN, les histones), la commutation de
classe précoce d’IgM en IgG, la formation de complexes immuns, les glomérulonéphrites,
l’implication des lymphocytes T CD4+. L’étude des croisements entre souches auto-
immunes et souches normales a montré que chaque anomalie immunologique était sous
contrôle génétique (polygénique) via des gènes de fonction et/ou des gènes de régulation
[Kotzin,1997 ; Morel, 2000 ; Morel, 2001]. Des gènes accélérateurs ou inhibiteurs de la
maladie lupique ont aussi été identifiés. Par exemple, l’introduction du gène lpr (codant
pour une forme anormale de la molécule Fas) dans une lignée lupique induit une
accélération de la maladie. Par ailleurs, le gène lié au chromosome Y des souris BXSB,
soit le gène Yaa est à l’origine de la gravité de la maladie chez les mâles de cette lignée.
Cette mutation n’a été identifiée que très récemment et consiste en la duplication du gène
codant pour le récepteur TLR7 [Pisitkun, 2006]. Ainsi, l’expression plus élevée de TLR7
sur les cellules B conduirait-elle à une augmentation de leur sensibilité vis à vis des Ag
nucléaires contenant de l’ARN. L’analyse des nombreux modèles murins de LED cités ci-
dessus a largement contribué à une meilleure compréhension des mécanismes
physiopathologiques qui concourent au développement de la maladie notamment, à
l’identification d’anomalies lymphocytaires T et B.
Ces modèles spontanés de LED ont par ailleurs apporté d'autres arguments sur
l'intervention de l'autoAg dans l'initiation de la réponse auto-immune grâce à l'analyse du
compartiment lymphocytaire B et de l'analyse structurale des autoAc dirigés contre l'ADN
dont la production constitue une anomalie majeure du LED. Ces modèles ont notamment
permis l'obtention d'Ac monoclonaux (Acm) anti-ADN dont la caractérisation a montré
que l'expansion des cellules B autoréactives spécifiques de cet autoAg est clonale et
sélectionnée par l'Ag [Radic, 1994]. En effet, l'analyse des caractéristiques structurales
des chaînes lourdes (H) et légères (L) des Acm anti-ADN dérivés de souris MRL-lpr/lpr et
BW a montré que leur spécificité est la conséquence de mécanismes de diversification
identiques à ceux observés au cours de la réponse dirigée par un Ag exogène. Certains
Introduction
- 23 -
gènes VH non polymorphes sont utilisés préférentiellement pour élaborer une réponse
anti-ADN et de façon récurrente par des hybridomes sécrétant des Acm anti-ADN. En
outre, ces clones portent également des mutations somatiques qui génèrent des
aminoacides créant ou amplifiant la spécificité pour l'ADN. De la sorte, l'accumulation de
résidus chargés positivement, arginine ou lysine, dans les domaines variables des chaînes
H et L confèrent aux Ac anti-ADN des propriétés de protéines de liaison à l'ADN. La
troisième région déterminant la complémentarité (CDR3) des chaînes H des Acm anti-
ADN comporte fréquemment des résidus arginine et lysine, capables de se lier aux
structures anioniques de l'ADN [Shlomchik, 1987 ; Shlomchik, 1990]. En définitive,
même si le rôle d'une activation polyclonale lymphocytaire semble intervenir au cours du
LED, tous les arguments expérimentaux convergent pour considérer que l'activation des
clones B autoréactifs est la conséquence d'un processus dirigé par l'autoAg.
La thyroïdite du poulet obèse
La thyroïdite du poulet obèse développée par une souche de poulet issue de celle
de White Leghorn, constitue un modèle de thyroïdite auto-immune. Cette pathologie est
caractérisée par une hyperthyroïdie qui est liée à la destruction de la glande thyroïdienne
secondaire à une réponse auto-immune dirigée contre des Ag thyroïdiens comme la
thyroglobuline et/ou la thyropéroxydase, molécules impliquées dans le métabolisme des
hormones thyroïdiennes. Les signes cliniques sont des dépôts de graisse sous-cutanés
principalement abdominaux, des anomalies des os et des phanères ainsi qu’une
hypersensibilité au froid. Les poulets obèses dont la pathologie ressemble à la thyroïdite
de Hashimoto présentent de nombreuses anomalies immunitaires. Les Ac dirigés contre
des Ag thyroïdiens, notamment la thyroglobuline, détectés dans le sérum de ces poulets
ont un titre qui culmine au cours de la 7e semaine de vie. Les contributions des cellules T
et B aux anomalies lymphocytaires observées ont été respectivement étudiées par des
expériences de thymectomie et de bursectomie [Vasicek, 2001]. Elles révèlent que la
thyroïdite peut être prévenue par la bursectomie in ovo et que celle-ci peut être aggravée
par la thymectomie néonatale. L’injection de cellules isolées des bourses de Fabricius de
poulets sains à des poulets de la souche obèse bursectomisés ne prévient pas la survenue
de la thyroïdite. De même, l’injection de cellules bursiques de poulets obèses à des
poulets normaux bursectomisés n’induit pas la maladie. En revanche, le transfert de
cellules T de poulets obèses à des poulets normaux irradiés provoque la thyroïdite tandis
que le transfert de cellules T normales à des poulets obèses irradiés la prévient.
L’ensemble de ces données suggère une défaillance des cellules T suppressives avec des
effets prédominants portant notamment sur la production des autoAc anti-Ag thyroïdiens
[Wick, 1989].
Introduction
- 24 -
1/ LES MODELES INDUITS
Plusieurs modèles de MAI induites ont été développés chez l’animal, dans
différentes espèces, en leur injectant des extraits d’organe ou des autoAg purifiés en
présence d’adjuvant. A titre d’exemple, nous décrirons deux modèles de MAI
expérimentales induites : la thyroïdite allergique expérimentale et l’EAE, qui miment les
MAI développées spontanément et qui permettent l’étude de leurs mécanismes
physiopathologiques.
La thyroïdite allergique expérimentale [Stafford, 2000]
L’injection d’extraits thyroïdiens homologues émulsifiés dans de l’adjuvant complet
de Freund à des cobayes, des souris ou des rats provoque l’apparition d’une thyroïdite
chez ces animaux. La maladie ressemble en de nombreux points à la thyroïdite de
Hashimoto et à la thyroïdite du poulet obèse décrite précédemment. Les lésions
thyroïdiennes s’accompagnent de la perte de l’architecture folliculaire normale et d’une
infiltration de cellules mononuclées. Les manifestations auto-immunes induites sont
proches de celles observées au cours de la maladie humaine avec notamment, une
production d’autoAc dirigés contre la thyroglobuline et une hypersensibilité retardée vis à
vis de cette protéine [Stafford, 2000]. La maladie est contrôlée génétiquement, à la fois au
niveau de la réponse immunitaire T anti-thyroglobuline (par un locus situé dans la région
I-A du CMH de classe II de la souris) et de façon intéressante au niveau de l’autoAg lui-
même ; la thyroglobuline de certaines souches entraînant plus facilement l’apparition de
la maladie. Cinq peptides pathogéniques de la thyroglobuline ont été identifiés. Le peptide
le plus court, le peptide 2496-2504 de la thyroglobuline de rat, est capable d’induire
directement une thyroïdite chez les souris d’haplotype H-2K et H-2S. En outre, les seuls
peptides connus pour provoquer une réponse B associée au développement de la maladie
expérimentale sont les peptides 2549-2560 de la thyroglobuline humaine et 2495-2511
de la thyroglobuline de rat. Le pouvoir pathogène des autoAc a été démontré par : la
prévention du transfert de la maladie d’un animal malade à un animal normal par
incubation des lymphocytes B avec de la thyroglobuline fortement radiomarquée ; la
possibilité de transférer la maladie par le sérum administré toutefois en quantité
suffisante. A la différence de la thyroïdite du poulet obèse, la thyroïdite provoquée est
prévenue par la thymectomie néonatale. Les cellules T interviennent donc aussi, sans
doute, essentiellement en tant que cellules T auxiliaires dans la production des autoAc.
Introduction
- 25 -
L’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE)
L’EAE est une MAI démyélinisante du système nerveux central qui peut être
induite dans de nombreuses espèces animales (rongeurs, lagomorphes, primates,
poulets…) en particulier chez la souris, par immunisation avec de la myéline du système
nerveux central ou certains de ses composants comme la MBP, la PLP et la MOG. Ses
manifestations cliniques et pathologiques ressemblent en de nombreux points à celles de
la SEP. Histologiquement, les lésions sont caractérisées par une infiltration périvasculaire
de cellules mononuclées, prédominant au niveau de la moelle épinière, constituée de
nombreux lymphocytes T et de macrophages, et par une démyélinisation d'intensité
variable. Il est actuellement clairement établi que les lymphocytes T CD4+, spécifiques de
composants de la myéline, sont à la base du processus pathogène. En effet, les lésions
histologiques de l'EAE ressemblent à une réaction d'hypersensibilité retardée et, dans la
plupart des études, il existe une bonne corrélation entre la survenue de l'EAE et
l'existence d'une réaction d'hypersensibilité retardée vis à vis des Ag de la myéline. De
plus, l'EAE peut être induite par transfert adoptif de lymphocytes T CD4+ autoréactifs à
des animaux syngéniques. Bien qu’une grande variété d’Ac spécifiques de plusieurs Ag de
la myéline en particulier, la MOG et la MBP, soit détectée dans le sérum d’animaux
atteints, l’implication des cellules B et des autoAc dans la physiopathologie de l’EAE reste
très controversée. Signalons par ailleurs, que le développement de l’EAE est
génétiquement contrôlé, lié au moins partiellement et de façon polygénique au CMH.
Dans d’autres modèles expérimentaux, les manifestations auto-immunes chez
l’animal peuvent être induites par l’injection de l’autoAg sous forme recombinante ou
purifié à partir du tissu qui l’exprime. Par exemple, l’injection intradermique de collagène
de type II extrait de cartilage humain en présence d’adjuvant complet de Freund à
différentes lignées de rat induit une arthrite inflammatoire dans 40% des cas. La maladie
se caractérise par une synovite proliférative ressemblant à la polyarthrite rhumatoïde
chez l’homme. Les réponses lymphocytaires T et B sont dirigées contre des déterminants
antigèniques localisés principalement sur le fragment CB11 issu de la digestion du
collagène II par le bromure de cyanogène. En effet, l’épitope 58-73 du fragment CB11
stimule aussi efficacement que la molécule complète la prolifération in vitro de
lymphocytes T issus de souris dont l’arthrite a été induite par le collagène II. De plus,
l’administration du peptide 58-73 à des rats prévient l’induction de la maladie par le
collagène, démontrant ainsi in vivo que la réponse immunitaire dirigée contre ce peptide
intervient dans la pathogénèse de l’arthrite [Ku, 1993]. En outre, le rôle pathogène des
autoAc anti-collagène II a été démontré par des expériences de transfert passif. En effet, le
Introduction
- 26 -
transfert de la maladie a été observé après (i) injection à des rats (ou à des souris) sain(e)s
d’IgG provenant de rats (ou de souris) immunisé(e)s avec du collagène de type II.
Certaines données expérimentales, notamment issues de l’étude de l’évolution de
la réponse auto-immune chez ces modèles animaux, permettent de penser que les MAI
sont initiées par une réponse dirigée contre un Ag unique, qu’il soit spécifique ou non
d’un tissu. Secondairement, la réponse auto-immune s’étend vers d’autres déterminants
du même Ag ou d’autres Ag du même tissu, selon le phénomène d’extension épitopique
intramoléculaire et intermoléculaire qui rend compte de la diversité des spécificités Ac
observée au cours d’une même MAI [Lehmann, 1993 ; Mamula, 1998].
Ce premier chapitre doit être particulièrement considéré du point de vue de
l'intervention de l'autoAg dans le développement des MAI. En effet, au niveau des
phénomènes de tolérance immunitaire, l'autoAg joue un rôle essentiel notamment, par
son expression thymique qui intervient dans les phénomènes de sélection négative des
cellules T autoréactives et de sélection positive des lymphocytes T régulateurs. Une
anomalie de cette expression ectopique des autoAg au niveau du thymus participe très
certainement à l'induction de MAI systémiques et spécifiques d'organe comme l'illustre
l'APECED. Par ailleurs, il est fondamental d'insister sur le fait que l'étude des modèles
expérimentaux de MAI, qu'ils soient spontanés ou induits, a entre autres permis
d’attribuer aux autoAg un rôle essentiel dans l’initiation de la réponse immunitaire. Dans
ce second chapitre consacré au rôle de l'autoAg dans les MAI, nous allons exposer de
manière plus précise par quels mécanismes l'autoAg prend part à l'initiation, la
propagation et la pérennisation de la réponse auto-immune.
Introduction
- 27 -
Chapitre 2 : Le Rôle des Autoantigènes au cours des
Maladies Auto-immunes
Les MAI sont caractérisées par des manifestations pathologiques qui sont la
conséquence directe de l'interaction des autoAg cibles avec les mécanismes effecteurs du
système immunitaire (autoAc et/ou lymphocytes T CD8 cytotoxiques). Le rôle clef de
l’autoAg lui même dans l'initiation, la propagation et la pérennisation de la réponse auto-
immune a été mis en exergue et cela, en raison de ses caractéristiques structurales, de sa
localisation, de ses modifications, de son apprêtement ou de sa modalité de présentation
aux cellules du système immunitaire. [Zinkernagel, 1997 ; Zingernagel, 2001 ; Mocci,
2000].
I. L’AUTOANTIGENE INITIE ET CONDUIT LA REPONSE AUTO-IMMUNE
Les arguments les plus directs du rôle de l’autoAg dans l’initiation de la réponse
auto-immune sont issus de modèles animaux au cours desquels l'ablation ou
l'élimination de l'organe cible prévient la mise en jeu de la réponse auto-immune. Ainsi,
dans le modèle de la thyroïdite du poulet obèse, la thyroïdectomie du poulet à la
naissance prévient-elle l'apparition des autoAc et des lymphocytes T autoréactifs dirigés
contre les Ag thyroïdiens tels que la thyroglobuline et la thyropéroxydase. De même chez
la souris NOD, la destruction sélective les cellules β de Langerhans par l'administration
d'alloxane prévient l'apparition des autoAc et des lymphocytes T cytotoxiques dirigés
contre les Ag pancréatiques. Chez l'homme, certaines observations suggèrent également
que la suppression de l'autoAg s'accompagne de la diminution d'une réponse auto-
immune établie. C'est ainsi qu'au cours du diabète de type 1, la destruction complète des
cellules β des îlots de Langerhans par le processus lésionnel, peut s'accompagner d'une
diminution, voire d'une disparition des autoAc dirigés les Ag pancréatiques cibles. On a
également rapporté la diminution des taux d'Ac anti-thyroglobuline et anti-
thyropéroxydase chez les malades souffrant d'une maladie de Basedow et subissant une
thyroïdectomie. A ces arguments directs s'associent des arguments indirects fondés sur
l'analyse des caractéristiques structurales des autoAc et des TCR exprimés par les
lymphocytes autoréactifs au cours des MAI spécifiques d'organe et non spécifiques
d'organe. Au cours des MAI spécifiques d’organe, ces arguments sont issus de l’analyse
des chaînes β du TCR exprimées par les clones T sélectionnés sur leur capacité à
reconnaître des autoAg de l’organe cible. C’est ainsi que des clones T Vβ13.1 dirigés
contre un peptide immunodominant de la MBP et partageant une CDR3 ont été observés
chez plusieurs malades atteints de SEP [Oksenberg, 1993]. Des CDR3 de séquences
Introduction
- 28 -
identiques ont été également identifiés dans les chaînes β du TCR des cellules T CD4+
isolées de malades atteints de maladie coeliaque [Prisco, 1997]. Cette démonstration
d’une identité structurale entre clones lymphocytaires T spécifiques d’un même autoAg et
isolés de différents patients atteints d’une même MAI est un argument majeur en faveur
de l’intervention d’un autoAg dans l’initiation de la réponse auto-immune.
Etant donné le rôle de l’autoAg dans la survenue du processus auto-immun, il est
logique de penser que des variations dans sa localisation, ses caractéristiques
structurales, son niveau et ses modalités d'expression jouent un rôle essentiel dans sa
capacité à activer les lymphocytes T et B autoréactifs.
II. LA SEQUESTRATION DES AUTOANTIGENES
A- La séquestration anatomique
Malgré la démonstration de la présence d’une multiplicité d’Ag tissu-spécifiques
dans le thymus humain, certains Ag sont exclusivement exprimés au niveau d’un tissu et
ne permettent donc pas la sélection négative des clones T autoréactifs qui in fine, vont
circuler en périphérie [Sebzda, 1999]. Cette séquestration anatomique d’Ag du soi peut
rendre compte de la rupture de la tolérance lorsque ces molécules sont anormalement
libérées, apprêtées par les molécules du CMH et présentées aux cellules T autoréactives
passées à la périphérie [Sebzda, 1999]. C’est le cas des Ag séquestrés (Ag portés par les
spermatozoïdes ou le cristallin) dont la libération anormale à l’occasion d’un traumatisme
ou d’une infection, peut induire la survenue d’une MAI spécifique d’organe (orchite auto-
immune secondaire à une vasectomie, ophtalmie sympathique consécutive à une
intervention sur l’œil). Par ailleurs, certains syndromes paranéoplasiques neurologiques
pourraient relever d’un tel mécanisme en raison de l’expression anormale par les cellules
tumorales de l’Ag qui était jusqu’ici ignoré par le système immunitaire avant son
expression ectopique [Darnell, 1996].
B- La séquestration moléculaire [Moudgil, 2005]
Il existe un autre type de séquestration présentée par certains autoAg, dite
séquestration moléculaire. En effet, au sein d’une protéine, certains peptides ont une
forte affinité pour les molécules du CMH et sont présentés de façon privilégiée aux TCR
par rapport à d’autres peptides de cette protéine. Il existe donc une hiérarchie peptidique
des Ag du soi qui sont dits dominants, sous-dominants ou cryptiques selon leur capacité
à s’associer aux molécules du CMH. Les principes de cette théorie sont que : (i) tout Ag
protéique et notamment les Ag du soi, présente une minorité d’épitopes
immunodominants impliqués dans la sélection négative et responsables de la tolérance T
efficace ; (ii) à l’inverse, la majorité des déterminants d’une protéine sont cryptiques, c’est
Introduction
- 29 -
à dire qu’ils ne sont pas efficacement apprêtés et présentés aux clones T potentiellement
autoréactifs vis à vis de ces déterminants. Ce mécanisme aboutit donc à un défaut de
tolérisation des lymphocytes T spécifiques d’épitopes sous-dominants ou cryptiques qui
gagnent alors la périphérie. Certaines circonstances contribuent à la présentation de
déterminants antigéniques cryptiques aux cellules T et par conséquent, à l’induction
d’une réponse auto-immune. Par exemple, lors d’infection virale ou bactérienne, un
peptide porté par l’agent pathogène peut être identique structuralement à un épitope
cryptique d’un Ag du soi (phénomène de mimétisme moléculaire) qui dans ce contexte,
peut devenir immunodominant. Une réaction inflammatoire peut aussi constituer une
situation propice à l’apprêtement et la présentation d’épitopes cryptiques par les CPA. Au
cours de l’inflammation, la formation de complexes immuns peut faciliter
l’immunogénicité de peptides cryptiques étant donné que l’Ag complexé comme substrat
de la machinerie cellulaire peut moduler l’apprêtement de l’Ag par rapport à sa forme libre
et notamment, augmenter de 10 à 100 fois sa présentation par les molécules du CMH de
classe II.
Cette « désequestration » de l’autoAg au niveau moléculaire, illustrée par ces
différents mécanismes, ne concerne pas seulement l’initiation de la réponse immunitaire
mais également sa pérennisation et son extension via le phénomène d’extension
épitopique [Vanderlugt, 2002]. En effet, on considère que la première vague de la réponse
immune dirigée contre des épitopes cryptiques est suivie par des vagues successives de
réponses contre des déterminants antigéniques de la même molécule (extension
épitopique intramoléculaire) ou de molécules physiquement liées (extension épitopique
intermoléculaire). Ce phénomène pourrait rendre compte de la diversification de la
réponse auto-immune contre différents Ag de l’organe cible que l’on observe fréquemment
au cours de MAI spécifiques et non spécifiques d’organe.
III. LES MODIFICATIONS DES ANTIGENES DU SOI
Une importante interrogation concernant la rupture de tolérance est de déterminer
si les autoAg sont normaux ou modifiés, les deux situations étant apparemment possibles
[Doyle, 2002]. La théorie du soi modifié constitue néanmoins, une hypothèse plus
séduisante pour rendre compte du déclenchement d’un processus d’auto-immunité chez
l’homme. Les modifications des Ag du soi par les métaux lourds, au cours des processus
d’apoptose, de cancer, de réparation tissulaire ainsi que celles générées par des
modifications co- et post-traductionnelles seront traitées dans cette partie.
Introduction
- 30 -
A- Modifications de l’autoantigène par les métaux lourds
La création de néo-autoAg peut être la conséquence de l’interaction entre les Ag du
soi et les métaux lourds. Les métaux tel que l’or, possède une forte capacité oxydative qui
peut être responsable de l’oxydation des chaînes latérales des aminoacides constituant les
Ag protéiques et, ainsi, conduire à leur dénaturation. Par ailleurs, des complexes
protéine-métal peuvent se former via la fixation des métaux aux chaînes latérales des
protéines. Ces deux mécanismes pourraient être à l’origine d’une activation de cellules T
n’ayant pas été tolérisés vis à vis de ces peptides du soi altérés [Griem, 1995].
B- Modifications de l’autoantigène et processus apoptotique
Un autre exemple du rôle des déterminants néo-antigéniques dans l’induction
d’une réponse effectrice est fourni par les modifications des autoAg reconnus par les
autoAc à l’occasion du phénomène d’apoptose rencontré au cours du LED. Certains Ag
reconnus au cours du LED subissent des modifications de concentration, de distribution
cellulaire et de structure au cours de l’apoptose et ce sont ces modifications qui
interviendraient dans l’initiation et la propagation de la réponse auto-immune au cours
de la maladie [Casciola-Rosen, 1994]. Le premier constat est que les autoAg cibles au
cours du LED subissent une redistribution géographique dans la cellule en apoptose,
plus spécifiquement une concentration et un regroupement dans les vésicules de surface
des cellules apoptotiques. En effet, les vésicules apoptotiques sont considérablement
enrichies en Ag ribosomaux, protéines Ro et La, snRNP, poly(ADP-ribose) polymérase qui
ont normalement une distribution nucléaire diffuse [Casciola-Rosen, 1994]. En outre, la
surface des vésicules apoptotiques exprime la phosphatidylsérine qui à la capacité de se
lier à des protéines qui sont la cible de la réponse au cours de MAI non spécifiques
d’organe, comme la β2-glycoprotéine et l’annexine V. Ces observations suggèrent que la
vésicule apoptotique et son contenu antigénique constituent la source des immunogènes
majeurs au cours du LED à l’origine de la réponse autoAc si particulière de la maladie. La
deuxième observation majeure est que certains des autoAg mentionnés précédemment
sont des substrats d’enzymes protéolytiques mises en jeu au cours du processus
apoptotique. Par exemple, la poly(ADP-ribose) polymérase subit un clivage protéolytique
par une famille de protéases à cystéine appelées caspases [Yamanaka, 1987]. Des travaux
ultérieurs ont montré le clivage par les caspases, d’autres Ag impliqués au cours du LED
[Yamanaka, 1987 ; Waterhouse, 1996 ; Martin, 1995 ; Casiano, 1996 ; Takeda, 1999].
D’autres modifications structurales pourraient affecter les autoAg au cours du processus
apoptotique. A cet égard, il a été montré qu’au cours du LED, les autoAc ciblent
fréquemment des protéines sélectivement phosposphorylées durant l’apoptose par des
sérine/thréonine-kinases et qui correspondent soit à des Ag déjà identifiés soit à de
Introduction
- 31 -
nouvelles protéines spécifiques de l’apoptose [Utz, 1997 ; Utz, 1998]. Ces protéines
modifiées, c'est-à-dire clivées par une caspase ou modifiées par une kinase pourraient
constituer des néo-épitopes vis à vis desquels les cellules T ne sont pas tolérisées qui in
fine contribueraient à l’activation des lymphocytes B spécifiques de ces Ag. Par ailleurs, il
est essentiel de rappeler que des cellules apoptotiques ne sont pas immunologiquement
passives, mais peuvent exercer, selon la CPA avec laquelle elles interagissent, un effet
positif ou négatif sur le système immunitaire. Par exemple, les cellules dendritiques, à
l'inverse des macrophages, présentent de façon efficace les Ag dérivés des cellules
apoptotiques et sont capables de stimuler des lymphocytes T [Bellone, 1997].
L'immunisation intraveineuse de souris non auto-immunes avec des thymocytes
apoptotiques syngéniques induit la production transitoire d'autoAc, notamment d'Ac anti-
cardiolipine et ADN simple brin ainsi que des dépôts glomérulaires d'immunoglobulines
rappelant les anomalies biologiques et histologiques du LED [Mevorach, 1998]. Il convient
aussi de noter que les vésicules de surfaces des kératinocytes en apoptose se lient au
C1q, le premier composant de la voie d'activation classique du complément et qui peut lui
conférer un rôle essentiel dans la clairance des cellules apoptotiques. Or, le déficit en C1q
est quasiment constamment associé à un LED chez l'homme comme chez les souris
invalidées pour le gène du C1q [Korb, 1997]. Tout se passe donc comme si la génération
et l'accumulation de vésicules apoptotiques et des Ag modifiés qu'elles contiennent
constituent un des mécanismes immunogènes principaux des cellules T et B au cours du
LED.
C- Modifications de l’autoantigène et cancer
D'autres modèles défendent le concept du soi modifié dans le déclenchement d'une
réponse auto-immune. Des anomalies des gènes codant pour la protéine p53 sont
observées chez environ 50% des malades ayant un cancer du poumon ou un cancer du
sein parmi lesquels 20 à 30% développent des Ac dirigés contre la protéine p53. L'étude
des lignées cellulaires de malades atteints de cancer du poumon a révélé la présence de
mutations du gène p53 qu'il s'agisse de mutations ponctuelles, de mutations générant un
codon stop ou de mutations décalant le cadre de lecture. Ces mutations ponctuelles
peuvent être à l'origine de la production de protéines p53 dont les fonctions sont altérées
et surtout, dont la stabilité intracellulaire est considérablement augmentée en regard de
la protéine p53 sauvage qui est rapidement dégradée [Tilkin, 1995]. La première
hypothèse est que les autoAc anti-p53 sont dirigés contre la protéine altérée. Cependant,
il a été démontré que ces autoAc reconnaissent à la fois la forme mutante et la forme
sauvage et notamment des épitopes situés en dehors des points chauds de mutation. Ceci
suggère que c'est plus la persistance de la protéine p53 ou la formation de complexes
Introduction
- 32 -
entre la protéine mutante et d'autres protéines qui est à l'origine de la réponse auto-
immune, que la formation de néo-épitopes. Il n'en demeure pas moins que l'hypothèse de
la formation de néo-épitopes liée à la mutation de certaines protéines qui sont la cible de
la réponse auto-immune au cours du cancer reste une hypothèse attractive dans les
phénomènes d'immunisation anti-tumorale [Winter, 1992 ; Davidoff, 1992].
D- Modifications de l’autoantigène au cours des processus de
réparation tissulaire
Les modifications de l’autoAg au cours des mécanismes de réparation peuvent
également intervenir au cours des MAI. Cet autre aspect de la contribution de l'expression
de l'autoAg dans l'autoréactivité est illustré par la démonstration de l'expression
d'isoformes embryonnaires de la MBP au cours des processus de remyélinisation observés
dans la SEP et dans son modèle expérimental murin, l'EAE. Cette génération d’isoformes
de la MBP par des mécanismes d’épissage alternatif et leurs implications dans le
processus auto-immun sera détaillée ultérieurement.
E- Modifications co- et post-traductionnelles des autoantigènes
Un autre exemple de formation de néo-Ag susceptible d'induire une rupture de la
tolérance est apporté par les modifications co- et post-traductionnelles d'autoAg [Doyle,
2002], comme par exemple, la citrullination des protéines au cours de la polyarthrite
rhumatoïde (PR) [Schellekens, 1998]. La citrulline est un constituant majeur des
déterminants antigéniques reconnus par les autoAc présents dans le sérum de malades
atteints de PR. C'est la déimination des résidus arginine par l'enzyme peptidyl-arginine
déiminase qui transforme les résidus arginine en citrulline. L'observation qu'une
modification post-traductionnelle des résidus arginine génère des déterminants
antigéniques B suggère un nouveau mécanisme de production des autoAc. Une
hypothèse est que la tolérance est établie vis à vis de la protéine non modifiée. Ainsi,
quand la protéine modifiée et maturée est présentée au système immunitaire, comme par
exemple après une lyse cellulaire massive, l'Ag modifié pourrait induire une réponse
immunitaire et, par extension épitopique, conduire à une réponse auto-immune
polyclonale contre la protéine entière. De nombreux exemples avérés de réponse auto-
immune T et B contre des Ag modifiés co- et post-traductionnellement illustrent ce
concept (Tableau 6). A l’inverse, il a clairement été démontré qu’au cours du LED et de
l’EAE, l’absence d’une de ces modifications pré-existante au niveau physiologique sur un
Ag du soi peut également induire une réponse auto-immune.
Introduction
- 33 -
Tableau 6. Modifications post-traductionnelles associées aux maladies auto-immunes
EAE, encéphalomyélite allergique expérimentale ; LED, lupus érythémateux disséminé ; LDL, Light-Density Lipoprotein ; MBP, protéine basique de la myéline ; PR, polyarthrite rhumatoïde ; SEP, sclérose en plaque ; snRNP, small nuclear ribonucleoproteins.
IV. LE POLYMORPHISME GENIQUE DES AUTOANTIGENES
Les MAI sont des maladies complexes dites multifactorielles qui résultent de
l’action conjointe de facteurs génétiques et environnementaux. Ces maladies polygéniques
font intervenir de nombreux locus de susceptibilité qui pris isolément, sont le plus
souvent ni nécessaires ni suffisants à leur développement. Le déterminisme génétique
aux MAI peut schématiquement se placer à 3 niveaux : la réactivité globale du système
immunitaire, l’autoAg et sa présentation, la réponse et la sensibilité de l’organe cible. Il
est désormais bien établit que la plupart des MAI est associée au locus HLA. Cette partie
ne traitera que du polymorphisme de l'Ag et de sa contribution, par le biais de différents
mécanismes d’action, à la survenue des MAI spécifiques et non spécifiques d’organe
(Tableau 7).
Tableau 7. Polymorphismes géniques d’autoantigènes et mécanismes associés
CHRNA, sous-unité α du récepteur musculaire à l'ACh ; Dsg1, Desmogléine 1 ; β2-GPI, β2 glycoprotéine I ; SAPL, syndrome des anti-phospholipides.
Modifications Autoantigènes Maladies auto-immunes
Glycosylation
Phosphorylation
Oxydation
Déamidation
Isoaspartylation
Transglutamination
Déimination (citrullination)
Nitration des tyrosines
Collagène de type II
Multiples
LDL
Gliadine
snRNP
Histone H2B, actine, myosine
Fibrine
MBP
Multiples (tissu inflammatoire)
PR
LED
Athérosclérose
Maladie cœliaque
LED
LED
PR
EAE/SEP
LED
Mécanismes Autoantigènes Maladies auto-immunes
TOLERANCE INTRATHYMIQUE
PRESENTATION DE L’ANTIGENE
PRODUCTION D’AUTOANTICORPS
Insuline
CHRNA
Dsg1
β2-GPI
Ro52 kD
Diabète de type 1
Myasthénie
Pemphigus
SAPL
Syndrome de Sjögren
Introduction
- 34 -
A- Modèle de la myasthénie
La myasthénie est une MAI caractérisée par la production d'autoAc dirigés contre
la sous-unité α du récepteur musculaire à l'acétylcholine (CHRNA). Grâce à l’étude de
marqueurs microsatellites situés dans le premier intron du gène CHRNA, Garchon et al
ont démontré l’association entre l’allèle HB*14 d’un des microsatellites et la maladie
[Garchon, 1994]. Le mécanisme d’action de ce polymorphisme n’est cependant pas connu
et n’est probablement pas direct, ce dernier siégeant sur une séquence intronique et
aucune fonction n’étant attribuée aux microsatellites chez les eucaryotes supérieurs. Il
s’agit donc probablement de marqueurs génétiques en déséquilibre de liaison avec
d’autres polymorphismes fonctionnels. Deux hypothèses ont été émises, l’une impliquant
un polymorphisme de régions régulatrices de l’expression du gène, l’autre impliquant un
polymorphisme des séquences codantes capables de moduler l’immunogénicité de la
protéine. Pour étayer cette hypothèse, et plus précisément la capacité de ce variant à
générer des peptides capables de s’associer avec les molécules HLA de susceptibilité,
l’effet du marqueur HB*14 sur la distribution des génotypes HLA a été étudié. Cette étude
a permis de montrer une augmentation significative du génotype DQA1*0101/0501 chez
les patients HB*14 [Djabiri, 1997]. Le rôle propre de l’allèle DQA1*0101 a de plus pu être
démontré dans la mesure où les allèles des gènes DRB1 et DQB1 en déséquilibre de
liaison avec DQA1*0101 ne sont pas associés à la maladie. En revanche, le rôle propre de
DQB1*0501 n’a pu être individualisé au sein de l’haplotype étendu DR3. Ces résultats
ont conduit à proposer un modèle polygénique de susceptibilité à la myasthénie auto-
immune faisant intervenir 3 gènes : le gène de l’autoAg via l’existence d’un variant qui
serait présenté par le produit du gène DQA1*0101 associé à une chaîne β, la réaction
auto-immune étant favorisée par un troisième gène de régulation immune situé sur
l’haplotype DR3.
B- Modèle du diabète de type 1
Le diabète de type 1 est une MAI spécifique d’organe qui est déclenchée par la
destruction des cellules β des îlots de Langerhans responsables de la sécrétion
d’insuline. C’est la MAI la plus étudiée et la mieux caractérisée sur le plan génétique.
L’implication du complexe HLA est connue de longue date (1973) [Singal, 1973 ;
Cudworth, 1974] et a été confirmée depuis et évaluée à 40-50% de la composante
génétique de la maladie [Thomson, 1988]. L’association la plus forte est retrouvée avec
les gènes de classe II (DRB1, DQA1 et DQB1) et plus particulièrement avec les allèles
DR4 et DR3 dont l’un au moins est retrouvé chez 90% des patients atteints de diabète
de type 1 contre seulement 45% de la population générale. D’autres facteurs
génétiques non HLA sont également en cause [Risch, 1987]. Parmi les régions
Introduction
- 35 -
identifiées, IDDM2 (située sur le bras court du chromosome 11) contient le gène de
l’insuline (INS) [Bell, 1984 ; Bain, 1992]. Dix variants fortement associés à la maladie
ont été identifiés dans un segment génétique de 4,1 kb incluant le gène INS. De vastes
études d’association analysant la fréquence des différentes combinaisons génotypiques
de ces 10 variants, ont permis d’identifier 4 polymorphismes comme étant
significativement plus associés à la maladie que les autres [Julier, 1994]. L’un de ces
variants correspond à un VNTR (variable number of tandem repeats), de la région
située en 5' du gène INS et contenant un polymorphisme résultant d’un nombre
variable de répétition en tandem d’éléments de 14 pb. La taille des différents allèles se
répartit selon une distribution trimodale permettant de distinguer 3 classes (classe I:
20 à 63 répétitions, classe II: 64 à 139 répétitions et classe III: 140 à 210 répétitions).
Les allèles associés au diabète de type 1 sont les allèles de classe I à l’état homozygote
qui sont retrouvés chez 78% des patients contre 45% des témoins. Les allèles de
classe I apparaissent donc comme des traits récessifs. Leur rôle peut être envisagé
autrement, puisque la présence d’au moins une copie des allèles de classe III (les
allèles de classe II étant très rares en Europe) est associée à une diminution du risque
de développer la maladie, cette classe d’allèle constituant un trait dominant de
protection contre la maladie. Cette vision est confortée par la mise en évidence d’un
effet protecteur variable en fonction de certains sous-groupes de classe III. Cet effet
protecteur pourrait être lié au niveau d’expression du gène de l’insuline dans le
thymus [Jolicoeur, 1994]. En effet, il a été montré que l’insuline est exprimée dans le
thymus chez l’homme comme chez la souris, et que le niveau d’expression du gène est
sous la régulation du VNTR, avec 2 à 3 fois plus d’ARN messager (ARNm) du gène INS
chez les sujets porteurs des allèles de classe III que chez les sujets porteurs des allèles
de classe I. L’effet protecteur pourrait alors s’expliquer par une meilleure délétion
intrathymique des clones T autoréactifs ou par une sélection positive de cellules
régulatrices CD4+ CD25high. A cet égard, l'étude d'un modèle murin dans lequel
l'expression thymique de l'insuline est progressivement réprimée montre une
corrélation inverse entre la concentration thymique d'insuline et la réactivité
lymphocytaire T contre cet autoAg en périphérie [Chentoufi, 2002]. Enfin, l'absence
d'expression de la pro-insuline 2 conduisant à une accélération de la maladie chez les
souris NOD/pro-insuline 2-/- conforte le rôle de l'expression thymique de l'insuline
dans la susceptibilité au diabète [Thebault-Baumont, 2003]. Quoiqu’il en soit, le VNTR
de l’insuline constitue le candidat fonctionnel le plus probable au niveau du locus
IDDM2 et pourrait agir en modifiant l’accessibilité des régions en 5' du gène, aux
molécules régulant son expression [Lucassen, 1995 ; Kennedy, 1995 ; Bennett, 1995].
Introduction
- 36 -
C- Autres polymorphismes géniques des autoantigènes
D'autres exemples du rôle du polymorphisme de l'autoAg ont été découverts au
cours de MAI non spécifiques d'organe. Le syndrome des anti-phospholipides (SAPL) est
caractérisé par la production d'Ac dirigés contre des structures phospholipidiques
anioniques (cardiolipine, phosphatidylsérine) qui nécessitent pour se fixer à leur ligand, la
présence d'un cofacteur protéique, notamment la β2-glycoprotéine I (β2-GPI). Or, 2 études
cas-témoins ont montré qu’il existe une corrélation entre le polymorphisme valine/leucine
en position 247 du gène de la β2-GPI et la production d’Ac anti- β2-GPI chez les patients
présentant un SAPL [Atsumi, 1999 ; Hirose, 1999]. Le polymorphisme Valine247 pourrait
intervenir de différentes façons, soit qu'il modifie des déterminants peptidiques de la
molécule qui peuvent alors être apprêtés par des CPA et présentés par les molécules de
classe II du CMH, soit qu’il modifie l’affinité de la β2-GPI pour les phospholipides et ainsi
la constitution des complexes β2-GPI/phospholipides reconnus par les Ac. De même, une
association entre le génotype C/T d’un single nucleotide polymorphism (SNP) situé dans
l’intron 3 du gène Ro52 et la présence d’Ac anti-Ro52 kD dans le syndrome de Sjögren a
été démontré [Nakken, 2001]. Enfin, nous avons identifié un polymorphisme de la
desmogléine 1 associé à la survenue du pemphigus que nous décrirons plus bas.
V. EPISSAGE ALTERNATIF ET ISOFORMES D’AUTOANTIGENES
Malgré de significatifs progrès, les mécanismes par lesquels les protéines du soi
rompent la tolérance immune et deviennent la cible des effecteurs auto-immuns sont
encore mal compris. Depuis une dizaine d’années, plusieurs travaux ont montré
l’implication du phénomène d’épissage alternatif des autoAg au cours des MAI
spécifiques et non spécifiques d’organe. Ce processus met en jeu des changements
dans le choix des sites d’épissage qui peuvent aboutir à des modifications diverses des
transcrits et donc, des protéines qu’ils codent. Le plus généralement, la conséquence
de l’épissage alternatif consiste en l’inclusion d’une portion de séquence codante dans
les ARNm matures aboutissant à la synthèse d’isoformes protéiques, dont la séquence
aminoacide et les propriétés biochimiques sont modifiées [Black, 2003]. Les analyses
bio-informatiques estiment qu’environ 42% des 60000 gènes que contient le génome
humain peuvent subir un épissage alternatif [Ng, 2004]. L’épissage alternatif est donc
un mécanisme crucial par lequel un nombre restreint de gènes peut générer la grande
complexité du protéome humain, estimé de 9.104 à 1.106 protéines [Stamm, 2002].
Etant donné que la majorité du processus d’épissage alternatif (70% à 88%) affecte des
régions codantes des ARNm [Modrek, 2002], les répercutions de ce phénomène au
niveau immunologique peuvent être multiples. A cet égard, une vingtaine d’autoAg ont
été décrits à ce jour comme subissant un épissage alternatif avec ou sans la
Introduction
- 37 -
démonstration de la production d’un variant protéique, suggérant que ce mécanisme
contribue à la régulation de leur expression (Tableau 8) [Mouquet, manuscrit en
préparation]. Différents travaux montrent l’implication directe des transcrits
alternatifs/isofomes d’autoAg dans les processus d’auto-immunité et font l’objet d’un
développement dans cette partie.
Tableau 8. Exemples d’autoantigènes subissant un épissage alternatif
NOR90, 90-kDa nucleolus organizer region autoantigen ; NASP, nuclear autoantigenic sperm protein ; PLP, proteolipid protein ; ICA512, islet cell antigen 512 ; MBP, myelin basic protein ; IAR PTP, islet cell antigen-related protein-tyrosine phosphatase ; NuMA, nuclear mitotic apparatus protein ; BPAG1e, epidermal bullous pemphigoid antigen 1; ICAp69, islet cell antigen p69 ; hnRNP, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein ; TPO, thyroperoxydase. ND, non dénommé. IGRP, islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein.
Autoantigènes Isoformes/Transcrits alternatifs Maladies associées
NOR-90
tNASP (testiculaire)
PLP
SmB/B´
Ro52
La/SS-B
ICA512 (IA-2)
MBP (21, 5 kDa)
Lamine A/C
Topoisomérase IIα-1
Antigène de Goospasture
Fogrine (IAR PTP)
Golgine 67
NuMA
Protéine du réseau trans-
Golgien p230
BPAG1e
αII spectrine (α-fodrine)
RA33 (hnRNP A1)
ICAp69
TPO
Thyroglobuline
IGRP
ND
sNASP (somatique)
DM20
SmB´ aORF
Ro52β (p52-2)
ND
ICA512∆13 / ICA512∆14
20, 2 kDa MBP / 18,5 kDa MBP / 17,3
kDa MBP
Lamine A∆10
Topoisomérase IIα-2 / IIα-3 / IIα-4
ND
ND
ND
NuMA-m (U4/p195) / NuMA-s (U6/p194)
Clones λ7 / λ8 / Y1
BPAG1n / BPAG1a / BPAG1b
αIIσ2- / αIIσ3- / αIIσ4-spectrine
hnRNPB1
ICAp69β / ICAp69γ
TPO2 / TPO3 / TPO2-3 / TPO4 / TPO2-4
/ TPO5 / TPO6
ND
G6PC2∆4 / G6PC2∆3-4 / G6PC2∆2-3 /
G6PC2∆2-4 / G6PC2∆2-3-4
MAI systémiques
Vasectomie
SEP
LED
LED
LED/Syndrome de Sjögren
Diabète de type 1
SEP
Granulomatose de Wegener
Morphée
Syndrome de Goodspature
Diabète de type 1
Syndrome de Sjögren/LED
Syndrome de Sjögren
Syndrome de Sjögren
Pemphigoïde bulleuse
Syndrome de Sjögren
PR
Diabète de type 1
Thyroïdite auto-immune
Thyroïdite auto-immune
Diabète chez la souris NOD
Introduction
- 38 -
A- L’épissage alternatif des transcrits codant des autoantigènes est
fréquent [Ng, 2004]
Une récente étude in silico a démontré que le taux de transcrits immatures
subissant un épissage alternatif est de 100% pour les messagers codant des autoAg
(n=45) et de seulement 41% pour ceux codant des protéines humaines sélectionnées
au hasard (n=50). L'épissage alternatif de ces transcrits d'autoAg utilisent pour 80%
d'entre eux, des sites d'épissage non-canoniques ne respectant pas la règle GT—AG
caractéristique des séquences d'épissage consensus qui sont employées dans 99% des
cas pour l'épissage des messagers correspondant à des gènes sélectionnés au hasard
(Figure 4). Par ailleurs, les auteurs montrent que les séquences spécifiques des
isoformes d'autoAg générées par épissage alternatif correspondent en majorité (77%) à
des sites de modifications post-traductionnelles des protéines qui seraient
susceptibles d'accroître l'immunogénicité des autoAg.
Actuellement, on connaît une vingtaine d’autoAg pour lesquels des messagers
alternatifs ont été mis en évidence (Tableau 8) [Mouquet, manuscrit en préparation].
Des mécanismes moléculaires distincts peuvent intervenir dans l’épissage alternatif de
ces transcrits d’autoAg (Figure 5) et conduire dans certains cas, à des modifications
structurales qui affectent les propriétés biochimiques, la localisation, la fonction ou
encore l’expression et l’accessibilité des autoAg (Tableau 9). Sur un plan
immunologique, l’épissage alternatif peut par exemple être à la base de l’expression de
nouveaux déterminants antigèniques vis à vis desquels les cellules T en différenciation
dans le thymus ne sont tolérisées, créant ainsi une rupture potentielle de la tolérance
immunitaire. En effet, l’introduction de séquences exoniques par ce mécanisme peut
aboutir à la production de séquences peptidiques d’une taille suffisante (8 à 15
aminoacides) pour être reconnues par des autoAc et/ou pour être apprêtées par les
molécules du CMH de classe I et de classe II et constituer ainsi de nouveaux épitopes
5´SE 3´SE
Exon 1 Exon 2 Intron 1
GT AG
AT AC
AT AG GT AT AT AT GT GG AT AA GT AA GT CA GC AG
5´ 3´
3´ 5´
Paires de nucléotides non canoni ques possibles
Figure 4. Epissage canonique et non canonique des transcrits immatures. L’épissage dit canonique utilise les sites d’épissage aux extrémités 5´ et 3´ de l’intron correspondant aux séquences flanquantes GT–AG. Cet épissage canonique représente plus de 99% de l’épissage de transcrits sélectionnés au hasard. Lorsque l’épissage n’utilise pas les séquences introniques consensus GT–AG, il est qualifié de non canonique et rend compte de moins d’1% de l’épissage. SE, site d’épissage.
Introduction
- 39 -
spécifiques de récepteur lymphocytaire T. De plus, ces modifications pourraient altérer
ou a contrario augmenter l’immunogénicité des autoAg et par conséquent, contribuer
au processus physiopathologique des MAI.
Figure 5. Mécanismes d’épissage alternatif des autoantigènes.
TRANSCRIPTS MATURES « NORMAUX » TRANSCRIPTS ALTERNATIFS
Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 1 Exon 3
Exon 1 Exon 3
Délétion d’exon ou de séquence exonique sans modifi cation du cadre de lecture
Exon 1 Exon 2 Exon 3
Exon 1 Exon 3
Exon 3 Exon 1 Exon 2
� NOR-90, tNASP, PLP, Ro52, ICA512, MBP, Lamine A-C, Antigène de Goospasture, TPO
Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 3 Exon 2
Insertion de séquence intronique ou exonique
Exon 1
� Topoisomérase II α-1, p230, fogrine, RA33, α-fodrine
Génération d’une nouvelle extrémité N -terminale ou C -terminale
Exon 1 Exon 2 Exon 3
Exon 1 Exon 2 Exon 3
Exon 1 Exon 2 Exon 3
� SmB’
Insertion ou délétion apportant un codon Stop ou un changement de cadre
Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 1 Exon 3
� ICAp69, NuMA
Insertion / délét ion multiples – Substitutions de séquences
� La/SS-B, BPAG1-e, NuMA, p230, IGRP
Introduction
- 40 -
Tableau 9. Modifications des autoantigènes induites par épissage alternatif
NASP, nuclear autoantigenic sperm protein ; ICA512, islet cell antigen 512 ; NuMA, nuclear mitotic apparatus protein ; BPAG1, bullous pemphigoid antigen 1; ICAp69, islet cell antigen p69 ; hnRNP, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein ; TPO, thyroperoxydase ; MBP, myelin basic protein ; PLP, proteolipid protein ; IGRP, islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein ; LED, lupus érythémateux disséminé ; SEP, sclérose en plaque ; EAE, encéphalomyélite allergique expérimentale.
Modifications Isoformes/Transcrits alternatifs
Autoantigènes Maladies auto-immunes
PHYSIOLOGIQUE Perte de la localisation subcellulaire Expression augmentée (1) ou diminuée (2)
Génération de nouveau domaine d’interaction Perte de l’activité enzymatique IMMUNOLOGIQUE Expression thymique de l’autoAg restreinte à un variant alternatif Création de néo-épitope cible de la réponse T Génération potentielle d’épitopes B Perte potentielle ou avérée d’épitopes T ou B
Ro52β ICA512∆13 NuMA-m, NuMA-s Topoisomérase IIα-4 (1)
sNASP (1)
TPO2 (2)
αIIσ3 et αIIσ4 spectrines BPAG1n / BPAG1a / BPAG1b TPO2
DM20 ICA512∆13 ND G6PC2∆2/3/4 X2MBP
ICA512∆13 Ro52-kD SmB/B´ ND ICA512∆13 DM20 Ro52-kD
Ro52 ICA512 NuMA Topoisomérase IIα-1 tNASP TPO αII spectrine BPAG1e TPO PLP ICA512 Thyroglobuline IGRP MBP ICA512 Ro52β SmB´ aORF Antigène de Goospasture ICA512
PLP Ro52β
LED Diabète de type 1 Syndrome de Sjögren Morphée Vasectomie Thyroïdite auto-immune Syndrome de Sjögren Pemphigoïde bulleuse Thyroïdite auto-immune EAE/SEP Diabète de type 1 Thyroïdite auto-immune Diabète chez la souris NOD SEP
Diabète de type 1 LED LED Syndrome de Goospasture Diabète de type 1 EAE/SEP LED
Introduction
- 41 -
B- Des isoformes d'autoantigènes à l'origine d'une rupture de la
tolérance centrale ?
Plusieurs travaux ont montré que l’expression thymique d’un autoAg, ciblé par
la réponse auto-immune au cours de MAI, est restreinte à un messager alternatif
susceptible de produire une isoforme protéique tronquée. Ainsi, l’épissage alternatif
des autoAg pourrait constituer un mécanisme moléculaire à la base d’une rupture de
la tolérance au soi qui favoriserait l’émergence de lymphocytes T autoréactifs, non
tolérisés vis à vis d’épitopes exclusivement présents sur la forme complète d’un autoAg
exprimée en périphérie, dans l’organe ciblé par la réponse auto-immune.
La PLP, principalement exprimée dans le système nerveux central, est un
composant de la gaine myéline qui est ciblé par la réponse auto-immune au cours de
la SEP. Les ARNm immatures de la PLP peuvent subir un épissage alternatif qui
aboutit à l’élimination de l’exon 3b (105 pb) codant pour un domaine en boucle de la
PLP [Nave, 1987]. L’isoforme protéique générée par ce mécanisme, appelée DM20, est
aussi exprimée dans le système nerveux central bien que plus faiblement comparée à
la forme complète de la protéine. Klein et al en 2000 ont montré que l’expression dans
le thymus de la PLP est largement restreinte à son isoforme DM20, la forme complète
n’y étant pas exprimée [Klein, 2000]. Ces résultats suggèrent donc que la tolérance
lymphocytaire T vis à vis de la PLP est limitée aux épitopes présents sur le variant
DM20, excluant ceux contenus dans la boucle de la PLP (35 aminoacides), absente du
thymus. Par conséquent, les cellules T spécifiques d’un épitope de cette boucle
pourraient échapper à la tolérisation intrathymique et gagner la périphérie. Les
auteurs ont confirmé cette hypothèse par l’étude de la réponse lymphocytaire T dans 2
lignées de souris immunisées avec la PLP : les souris SJL, porteuses de l’haplotype du
CMH H2S et caractérisées par susceptibilité accrue à l’induction de l'EAE, et les souris
BL/6 d’haplotype H2b. La comparaison entre les 2 lignées montre que seules les souris
SJL développent une réponse T dirigée contre un épitope (139-151) présent sur la
boucle de la PLP, les molécules H2S étant capables d’accommoder le peptide 139-151
[Klein, 2000]. L’exclusion de cette épitope immunodominant des mécanismes de
tolérance centrale chez les souris SJL permet d’expliquer pourquoi les cellules T
autoréactives dirigées contre la boucle de la PLP ne sont pas purgées du répertoire et
donc, jouent un rôle clé dans le développement de l’EAE chez ces animaux. Chez
l’homme, l’expression thymique de la PLP est aussi restreinte à son isoforme DM20 et
puisque des réponses T sont dirigées contre des épitopes situés dans le domaine en
boucle de la PLP [Markovic-Plese, 1995 ; Trotter, 1998], le phénomène décrit
expérimentalement chez la souris pourrait rendre compte de la rupture de la tolérance
contre la PLP humaine (Figure 6).
Introduction
- 42 -
Figure 6. Mécanisme proposé pour expliquer le processus auto-immun médié par la PLP. Les cellules T immatures spécifiques des épitopes portés par la PLP-DM20 (rose) sont éliminées dans le thymus tandis que les cellules T dirigées contre la région en boucle de la PLP (violet), absente de la PLP-DM20, ne sont pas délétées et migrent à la périphérie. Les peptides de la PLP, incluant la région en boucle, sont présentés par des APC aux lymphocytes T non tolérisés. Les cellules T activées passent ensuite la barrière hémato-encéphalique et infligent des dommages aux oligodendrocytes exprimant la PLP. Au cours de l’EAE induite par la PLP, c’est l’immunisation qui conduit à l’activation initiale des cellules T autoréactives mais dans le cas de la maladie humaine, les événements à l’origine de cette activation ne sont pas encore connus. SNC, système nerveux central.
APC
APC
PLP-DM20 PLP
THYMUS SYSTEME LYMPHATIQUE PERIPHERIQUE
SNC
Immunisation Infection virale
Mimétisme avec des pathogènes ?
Effecteurs Effecteurs
Naïfs
APC thymique
APC périphérique
Axone
Oligodendrocyte endommagé
DM20
PLP
PLP
T
T
T
T
T
T
T
T T T
Introduction
- 43 -
Un second exemple de l’expression différentielle d’un autoAg en périphérie et de
son isoforme dans le thymus a été décrit pour l’Ag des îlots pancréatiques, ICA512 (ou
IA-2). IA-2 est une protéine transmembranaire de type tyrosine phosphatase ciblée par
la réponse autoAc au cours du diabète de type 1. Chez l’homme, deux transcrits
alternatifs de cet autoAg ont été identifiés. Le premier variant, IA-2 ∆ exon 13, est
caractérisé par une délétion (219 pb) dans l’exon 13 qui code pour les domaines
transmembranaire et juxtamembranaire de la protéine et le second, IA-2 ∆ 14, par
une délétion (129 pb) dans l’exon 14 qui code une partie du domaine intracellulaire.
Les études montrent que les 3 types de messagers IA-2 sont présents dans les îlots
pancréatiques mais que seul le transcrit alternatif IA-2 ∆ exon 13 est exprimé dans le
thymus et la rate [Diez, 2001]. Différents travaux ont montré l’existence d’une réponse
auto-immune dirigée contre des épitopes contenus dans les domaines
transmembranaire et juxtamembranaire d’IA-2 [Naserke, 1998 ; Bonifacio, 1998 ;
Lampasona, 1996]. Puisque ces épitopes sont absents de la protéine IA-2 ∆ exon 13,
l’expression thymique restreinte à cette isoforme pourrait expliquer la rupture de la
tolérance vis à vis de l’autoAg IA-2 au cours du diabète de type 1.
Un autre exemple est fournit par un autoAg cible de la réponse auto-immune
chez la souris NOD, la protéine associée à la sous-unité catalityque de la glucose-6-
phosphatase spécifique des cellules β des îlots pancréatiques (IGRP). Cette protéine
est codée par le gène G6PC2 qui posséde également 5 trancrits alternatifs caractérisés
par des délétions exoniques. Les 6 transcrits G6PC2 sont exprimés dans le pancréas
en revanche, à l'exception du messager délété des exons 2, 3 et 4, les autres transcrits
G6PC2 ne sont pas ou peu exprimés dans le thymus et la rate [Dogra, 2006]. Bien que
l'IGRP ne constitue qu'un autoAg candidat du diabète de type 1, on peut envisager que
cette expression tissulaire différentielle entre le pancréas et le thymus puisse favoriser
la survenue de réponses auto-immunes anti-IGRP chez l'homme.
Enfin, une étude montre que des transcrits de la thyroglobuline de souris
comportant certains épitopes pathogéniques sont absents du thymus bien qu’ils soient
exprimés dans les glandes thyroïdes de l’animal [Li, 2005]. Etant donné que les
peptides correspondants sont capables d’induire une thyroïdite auto-immune
expérimentale, l’épissage alternatif de la thyroglobuline dans le thymus pourrait
aboutir à un défaut de tolérisation des lymphocytes T spécifiques de ces séquences.
Introduction
- 44 -
C- La réponse auto-immune dirigée contre les isoformes
d'autoantigènes générées par épissage alternatif
1/ UNE REPONSE LYMPHOCYTAIRE T DIRIGEE CONTRE DES EPITOPES SPECIFIQUES
D’ISOFORMES D’AUTOANTIGENES : L’EXEMPLE DE LA MBP
L'étude in silico citée précédemment montre que les séquences peptidiques
spécifiques des isoformes d'autoAg peuvent constituer des épitopes T potentiellement
ciblés par la réponse auto-immune. En effet, 92% de ces isoformes d'autoAg
contiennent dans leurs séquences spécifiques des épitopes T CD8+ restreints aux
molécules HLA-A2.1 et 88% des épitopes T CD4+ restreints aux molécules HLA-DR4.
Différents travaux expérimentaux corroborent les résultats obtenus par ces analyses
bio-informatiques. En effet, l’existence d’une réactivité lymphocytaire T dirigée contre
des épitopes spécifiques d'une isoforme d'autoAg a été démontrée dans la SEP. Quatre
isoformes de la MBP, autoAg cible de la réponse auto-immune au cours de la maladie,
ont été décrites chez l’homme. Ces isoformes possèdent des poids moléculaires
différents ; 21,5 kDa, 20,2 kDa, 18,5 kDa et 17,3 kDa, les 3 dernières étant générées
par épissage alternatif [Roth, 1987]. La MBP de 18,5 kDa est codée par des transcrits
alternatifs caractérisés par une délétion de l’exon 2 et, constitue l’isoforme
majoritairement exprimée dans le système nerveux central humain et la mieux étudiée
en terme de réponse lymphocytaire T chez les malades. A l’instar, les transcrits codant
pour les MBP de 20,2 kDa et 21,5 kDa contiennent l’exon 2 et ont une expression
augmentée lors des processus de remyélinisation [Jordan, 1990]. Voskuhl et al ont
démontré l’existence de lymphocytes T CD4+ dirigés spécifiquement contre le peptide
encodée par l’exon 2 (X2MBP), restreints par les molécules HLA de classe II et
capables de fonction effectrice cytotoxique [Voskuhl, 1993a]. Plus précisément,
l'analyse de la réponse lymphocytaire T à l'aide de clones spécifiques de X2MBP isolés
chez les malades de SEP, a montré que celle-ci est restreinte à l'allèle HLA DR2/DQw1
qui est associé à la maladie. De plus, les clones T ayant une spécificité commune
semblent utiliser préférentiellement certains segments VDJ codant pour le TCR
[Voskuhl, 1994]. Les auteurs montrent par ailleurs que la fréquence de clones T
spécifiques de X2MBP, isolés chez les membres d’une famille multiplexe atteints de
SEP, est corrélée à la gravité de la maladie [Voskuhl, 1993b]. Bien que les souris
SJL/J immunisées avec le peptide X2MBP ne développent qu'une EAE modérée, les
clones T anti-X2MBP isolés chez ces souris sont capables d'induire une EAE sévère
lorsqu'ils sont transférés à des receveurs syngéniques [Segal, 1994 ; Fritz, 1994].
Puisque des cellules T spécifiques de X2MBP sont aussi détectées chez les sujets
sains, leur présence n’est pas suffisante pour développer la maladie mais pourrait
cependant, contribuer à sa progression. En effet, l’expression potentiellement
Introduction
- 45 -
augmentée des isoformes contenant la séquence encéphalitogène X2MBP, due au
processus de remyélinisation qui accompagne l’accumulation des lésions chez les
patients caractérisés par une maladie avancée, pourrait entretenir la réponse auto-
immune.
2/ LA REACTIVITE AUTOANTICORPS CONTRE LES ISOFORMES D'AUTOANTIGENES
Les analyses bio-informatiques montrent que les régions spécifiques des
isoformes d'autoAg contiennent pour 70% d’entre-elles, un ou plusieurs épitopes
candidats capables de fixer des autoAc. Toutefois, aucune démonstration formelle
notamment, par une étude fine de la cartographie épitopique B, n'a été apportée
expérimentalement dans le but de corroborer l’existence d’une réactivité autoAc dirigée
contre un néo-épitope porté par une isoforme d’autoAg. Les différentes études
décrivent soit une perte d’antigénicité via la suppression de séquences comportant des
épitopes initialement ciblées par les autoAc soit, la persistance d’une réponse B contre
des épitopes communs à l’autoAg et son isoforme respective. A cet égard, il est
intéressant de mentionner que le criblage de banque d’expression d’ADNc avec les
sérums de malades atteints de MAI a abouti à la découverte de transcrits alternatifs
pour plusieurs autoAg tels que les protéines SS-A/Ro52-kDa [Chan, 1991] et SS-B/La
[Tröster, 1994] ou encore la protéine p230 du réseau trans-golgien [Tsukada, 2000].
La réactivité autoAc dirigée contre des isoformes générées par épissage
alternatif a été clairement mise en évidence pour les autoAg SS-A/Ro52-kD et
ICA512/1A-2, qui sont respectivement les cibles de la réponse auto-immune B au
cours du LED et du diabète de type 1. Le criblage d’une banque d’expression d’ADNc
de cellules MOLT-4 a permis l’isolement d’un clone immunoréactif (p52-2)
correspondant à un variant alternatif de l’Ag SS-A/Ro52-kD [Chan, 1991]. Ce transcrit
est caractérisé par une délétion de 231 pb correspondant à l’exon 4 du gène RO52 qui
une fois traduit, aboutit à la synthèse d’une isoforme protéique notamment exprimée
dans le coeur, Ro52β, délétée du domaine leucine zipper [Chan, 1995]. L’absence de ce
domaine leucine zipper nécessaire aux interactions avec d’autres protéines mais aussi
avec l’ADN induit très probablement une perte de fonctions et de localisation
subcellulaire de l’isoforme Ro52β. Bien que cette région leucine zipper contienne des
épitopes B ciblés au cours du LED, l’analyse de la réactivité autoAc montre que 87%
des sérums de mères dont les enfants sont atteints de lupus néonatal (n=30) sont
capables d’immunoprécipiter la protéine Ro52β recombinante alors que la forme
canonique Ro52α n’est reconnue que dans 50% des cas. Cette isoforme pourrait donc
exprimer des néo-épitopes provenant soit de la réunion de séquences dûe à la délétion
de l’exon 4, soit du changement ou de la perte de conformation protéique. On peut
Introduction
- 46 -
émettre l’hypothèse que l’altération du domaine impliquée dans la localisation
cellulaire de l’Ag SS-A/Ro52-kD pourrait aboutir à une désequestration moléculaire de
la protéine Ro52β alors susceptible de rompre la tolérance au soi.
Un exemple très proche de celui décrit ci-dessus est illustré par l’isoforme de
l’autoAg ICA512/1A-2. Park et al ont identifié un transcrit alternatif (clone
ICA512.bdc) caractérisé par la délétion de l’exon 13 du gène ICA512/1A-2 codant pour
les domaines transmembranaire et juxtamembranaire de la protéine [Park, 2000].
L’isoforme synthétisée à partir de ce transcrit, IA-2 ∆ exon 13, est probablement
soluble et sécrétée par les cellules β du pancréas. Bien que des épitopes portés par le
domaine juxtamembranaire réagissent avec les autoAc au cours du diabète de type 1,
son élimination de la protéine IA-2 ∆ exon 13 n’abolit pas la réactivité Ac vis à vis de
cette isoforme. De manière intéressante, une population d’autoAc semble cibler
spécifiquement la forme tronquée d’ICA512/1A-2 (3 à 6% des patients) probablement
au niveau de néo-épitopes générés par la jonction des exons 12 et 14. Par ailleurs,
comme nous l’avons vu précédemment, seule la forme IA-2 ∆ exon 13 est exprimée
dans le thymus, ce qui conduirait à « l’échappement » de clones T non tolérisés vers la
périphérie. Dans les organes lymphoïdes, cette isoforme soluble pourrait transiter par
la voie sécrétoire avant d’être apprêtée et présentée par les molécules du CMH portées
par les CPA qui auraient alors la capacité d’induire l’activation de cellules T
autoréactives à potentiel lésionnel.
Enfin, la seule preuve directe de la présence d’autoAc dirigés contre un néo-
épitope B vient de la production d’un néo-autoAg par épissage alternatif qui
initialement ne constitue pas une cible au cours de la PR. Tanaka et al ont en effet
montré l’existence d’une isoforme tronquée de la sous-unité β (gp130) du récepteur à
l’IL6 caractérisée par l’addition à son extrémité C-terminale d’un oligopeptide absent
sur la forme transmembranaire de la protéine gp130. Cette isoforme soluble et plus
précisément la séquence C-terminale de 15 acides aminés est reconnue par les autoAc
présents chez 75% des patients atteints de PR [Tanaka, 2000].
A côté de ces démonstrations qui confirment que des variants alternatifs
peuvent constituer des cibles de la réponse lymphocytaire B, il faut néanmoins
préciser que le mécanisme d’épissage alternatif peut conduire à l’élimination
d’épitopes spécifiques des formes canoniques d'autoAg ciblées au des MAI spécifiques
et non spécifiques d’organe et donc, à une diminution de l’antigénicité (Tableau 9).
Au vu des différentes études sur les transcrits alternatifs/isoformes d’autoAg,
plusieurs conclusions peuvent être formulées sur l’implication du mécanisme
d’épissage alternatif des autoAg dans l’initiation de la réponse auto-immune.
Introduction
- 47 -
Premièrement, au niveau central, l’expression thymique exclusive d’une isoforme
délétée d’une séquence portée par l’autoAg présent en périphérie peut conduire à un
défaut de la sélection intrathymique à l’origine de l’émergence de clones T autoréactifs
à la périphérie. De plus au niveau périphérique, différents phénomènes illustrant les
possibilités de modification des autoAg par épissage alternatif pourraient rendre
compte de la rupture de la tolérance au soi : (i) la création de néo-épitopes T ou B ; (ii)
la meilleure accessibilité d’isoformes ayant perdu les séquences nécessaires à leur
localisation cellulaire vis à vis du système immunitaire en d’autres termes, la
désequestration anatomique de l’autoAg ; (iii) la surexpression d’une isoforme par
rapport à l’autoAg sous sa forme canonique. A cet égard, Zinkernagel et al ont suggéré
que la surexpression des Ag du soi ou la création de nouvelles structures antigéniques
permet de franchir le seuil de la concentration en Ag nécessaire à l’initiation de la
réponse immune [Zinkernagel, 2001]. Ainsi, les changements induits par l’épissage
alternatif des autoAg via la production d’isoformes protéiques aux propriétés modifiées
semblent-ils vraiment participer à l’initiation de la réponse auto-immune au cours des
MAI spécifiques et non spécifiques d’organe.
Pour conclure sur le rôle de l'autoAg dans les processus auto-immuns, l'un des
aspects les plus importants concernant les mécanismes de l'auto-immunité est de
connaître la nature de l'Ag initiateur de la réponse auto-immune. Cela n'est pas sans
soulever certaines difficultés. Il n'est pas aisé de déterminer si les autoAc et les Ag
correspondants ont une relation avec le mécanisme pathogène d'une MAI. A cet égard,
il est important et intéressant de pouvoir disposer de modèles expérimentaux. Une
deuxième difficulté réside dans le fait que les MAI s'accompagnent, dans la majorité
des cas, d'une production de multiples autoAc dirigés contre divers Ag de l'organe
cible, ce qui rend difficile l'identification de l'autoAg initiateur. Il n'en demeure pas
moins que la démonstration du rôle de l'autoAg comme élément initiateur et
pérennisateur de la réponse auto-immune, à la fois dans les MAI spécifiques d'organe
et non spécifiques d'organe semble clairement établie et que l'étude des modifications
de l'Ag lui même dans sa structure, sa localisation, sa ditribution cellulaire constitue
des voies de recherche très intéressantes pour comprendre les processus d'auto-
immunité mis en oeuvre.
Introduction
- 48 -
Chapitre 3 : Le Desmosome
La cohésion interkératinocytaire est fondamentale pour l’organisation et le
maintien de l’architecture de la peau et donc pour les fonctions de l’épiderme. Les cellules
épithéliales et les kératinocytes sont interconnectés par trois types de structure
jonctionnelle : les jonctions d’ancrage, incluant les desmosomes et les jonctions
adhérentes; les jonctions serrées; et les nexus (ou gap-junctions). Les jonctions d’ancrage
permettent le pontage entre des molécules d’adhésion transmembranaires exprimées à la
surface cellulaire et le cytosquelette (microfilaments d’actine pour les jonctions
adhérentes et filaments intermédiaires de kératine pour les desmosomes).
Les mécanismes d’adhésion cellulaire assurent en générale deux fonctions
distinctes ; l’attachement d’une cellule à une autre ou à la matrice extracellulaire et, la
transduction de signaux qui régulent la survie et/ou le phénotype cellulaire. Ainsi, les
desmosomes qui représentent la structure adhésive majeure des kératinocytes,
garantissent-ils l’intégrité de l’épiderme par leur fonction d’adhésion intercellulaire,
fournissant une solidité structurale via l’ancrage du réseau de filaments intermédiaires
entre deux cellules voisines mais aussi par la régulation de nombreux phénomènes
biologiques tels que la croissance et la différenciation cellulaire.
I. L’ULTRASTRUCTURE DU DESMOSOME (Figure 7)
Dans l’épiderme, les desmosomes apparaissent comme des ponts entre
kératinocytes notamment au niveau des couches épineuses et granuleuses qui en sont
enrichies. En microscopie électronique à transmission, ils forment des structures
discoïdes de 0,1 à 0, 5 µm de diamètre, présentes uniquement sur la membrane des
kératinocytes, et qui sont constituées de deux plaques cytoplasmiques et symétriques,
appartenant aux deux cellules adjacentes et d’une région centrale extracellulaire appelée
desmoglie. La desmoglie (30 nm d’épaisseur), dans laquelle on distingue une ligne
extracellulaire dense, est prise en sandwich entre deux plaques desmosomales, qui sont
localisées à proximité de la membrane plasmique et dans lesquelles viennent s’insérer les
filaments intermédiaires du cytosquelette. La plaque desmosomale est une région dense
aux électrons, de 14 à 20 nm d’épaisseur, dans laquelle on distingue une plaque externe
(très dense) et une plaque interne (moins dense).
Introduction
- 49 -
II. LA STRUCTURE MOLECULAIRE DU DESMOSOME (Figure 8)
Le desmosome est un complexe multimoléculaire qui comprend des protéines de
trois différentes familles : les cadhérines desmosomales, les plakines et des protéines
armadillo. La partie N-terminale des molécules transmembranaires d’adhésion de la
superfamille des cadhérines, principalement les desmogléines et les desmocollines,
constitue la desmoglie. La partie C-terminale de ces deux protéines clés est implantée
dans la plaque dense externe qui contient les protéines armadillo, plakoglogine et
plakophiline, ainsi que la portion N-terminale des desmoplakines. La partie C-terminale
de ces dernières s’étend à travers la plaque dense interne où elle se fixe aux filaments
intermédiaires de kératine. Les desmoplakines comme la plectine fonctionnent comme
des adaptateurs moléculaires permettant la fixation des filaments de kératine aux
extrémités intracellulaire des cadhérines desmosomales et constituent des prototypes de
la famille des plakines. Deux autres membres, l’envoplakine et la périplakine,
originellement décrites comme des constituants de l’enveloppe cornée de l’épiderme, sont
aussi des plakines présentes dans le desmosome.
Plaque desmosomale
Plaque dense externe
Plaque dense interne
Desmoglie
Filaments intermédiaires de kératine
Membranes plasmiques des kératinocytes
Ligne extracellulaire dense
Figure 7. Ultrastructure du desmosome. Le desmosome assure l’adhésion cellulaire entre deux kératinocytes adjacents. En microscopie électronique, le desmosome prend l’aspect d’une structure discoïde constituée de deux plaques cytoplasmiques et symétriques, appartenant aux deux cellules adjacentes, appelées plaques desmosomales et d’une région centrale extracellulaire appelée desmoglie. Des filaments intermédiaires de kératine s’insèrent dans la plaque desmosomale qui est composée d’une plaque dense interne et d’une plaque dense externe. On distingue dans la partie centrale de la desmoglie, une ligne extracellulaire dense.
Introduction
- 50 -
Dsg
Dsc
ENV
PPL
DP
PG
PKP
Plaque desmosomale
PL
FIK
A- Les cadhérines desmosomales
Les cadhérines représentent une superfamille de protéines d'adhésion cellulaire
calcium-dépendantes initialement décrites comme sensibles à la dégradation trypsique
bien que résistantes à cette protéolyse en présence de calcium. Ces protéines
transmembranaires sont classées en 5 sous-familles dont 2 majeures, les cadhérines
classiques et les cadhérines desmosomales qui sont respectivement impliquées dans
l'adhésion cellulaire médiée par les jonctions adhérentes et les desmosomes. Le groupe
des cadhérines desmosomales comporte 2 membres, les desmocollines (Dsc) et les
desmogléines (Dsg). Ces glycoprotéines interagissent entre elles dans l’espace
interkératinocytaire et avec certaines protéines de la famille plakine et armadillo qui
composent la plaque desmosomale.
1/ LA STRUCTURE MOLECULAIRE (Figure 9)
Les différents membres appartenant à la superfamille des cadhérines possèdent
une organisation moléculaire commune avec une structure primaire très similaire.
Chaque molécule est composée dans l’orientation N- à C-terminale, des séquences signal
et propeptide à l’extrémité N-terminale du précurseur inactif, d’une région extracellulaire,
Membranes kératinocytaires
Figure 8. Organisation moléculaire du desmosome. Le desmosome est un complexe multimoléculaire qui est constitué, d’une part, de glycoprotéines transmembranaires appartenant à la famille des cadhérines desmosomales (les desmogléines (Dsg) et les desmocollines (Dsc)) qui forment la desmoglie et, d’autre part, de protéines cytosoliques ; les plakines (les desmoplakines (DP), la plectine (PL), l’envoplakine (ENV) et la périplakine (PPL)) et les protéines armadillo (la plakoglobine (PG) et les plakophilines (PKP) qui forment la plaque desmosomale. Les cadhérines desmosomales interagissent : (i) entre-elles par leur extrémité N-terminale, (ii) avec la PG et les DP par leur domaine cytosolique. Les filaments intermédiaires de kératines (FIK) sont fixés à la plaque desmosomale via des interactions avec les DP et la PL.
Desmoglie
Introduction
- 51 -
d’une portion transmembranaire et d’une région intracytoplasmique comprenant
notamment un domaine très conservé entre les cadhérines. La région extracellulaire des
cadhérines matures, qui renferment plusieurs motifs de fixation du calcium (DXD et
DXNDN), est constituée de cinq domaines équivalents d’environ 100 aminoacides chacun
dont les 4 premiers sont homologues et forment des unités répétitives de type cadhérines.
Les extrémités N-terminales de la région extracellulaire (EC) de deux molécules
interagissent entre-elles de manière homotypique et calcium-dépendante pour assurer la
fonction d’adhésion des cadhérines, détaillée ci-dessous [Amagai, 1995c].
Figure 9. Structure des cadhérines desmosomales. Les cadhérines sont des glycoprotéines transmembranaires synthétisées sous forme de précurseur inactif, possédant un peptide signal (S) et une proséquence (P) qui est clivée au cours de leur maturation. Les cadhérines sont composées de 4 domaines extracellulaires (EC), d’un domaine ancrage extracellulaire (AE) ou EC5, d’une région transmembranaire (TM), d’un domaine d’ancrage intracellulaire (AI) et d’un domaine très conservé dans la région cytosolique (SCI ; segment cadhérine intracellulaire). La région intracellulaire des Dsg contient en plus, un domaine de liaison riche en proline (DL), un domaine d’unités répétées (DUR) de 29 ± 1 résidus, caractéristiques de ces protéines ainsi qu’un domaine C-terminal (DT). Chaque isotype de Dsc possèdent un domaine C-terminal spécifique a ou b, dérivé d’un épissage alternatif.
Domaines extracellulaires Domaines intracellulaires
S P EC1 EC2 EC3 EC4 AE TM AI SCI DL DUR DT
C N
Dsg 3
C
Dsg 1
N
N
Dsg 2
C
N
Dsg 4
C
N a
C
Dsc
C
Cadhérine classique
N
b
Introduction
- 52 -
2/ LA FONCTION D’ADHESION
Comme les cadhérines classiques, les cadhérines desmosomales possèdent dans
leur domaine extracellulaire EC1, des sites de reconnaissance d’adhésion cellulaire (CAR).
Ces sites CAR correspondent à des tripeptides avec une alanine en position centrale. Ils
différent selon les isoformes de Dsc (YAT pour la Dsc1, FAT pour la Dsc2 et YAS pour la
Dsc3) et sont identiques pour l’ensemble des Dsg (RAL) [Garrod, 1996]. L’importance de
ces sites a été confirmée par une étude sur des fibroblastes transfectés par des
cadhérines desmosomales, qui a montré l’inhibition de l’adhésion par des peptides dérivés
des séquences CAR des Dsc1 et Dsg1 [Tselepis, 1998]. Les mécanismes moléculaires
précis impliqués dans l'adhésion des cadhérines ont été illustrés par de nombreux
modèles qui sont encore actuellement débattus [Troyanovsky, 2005]. Il est cependant
généralement admis que les cadhérines adhèrent entre-elles par des interactions entre
leurs domaines EC1. Plus précisément, les analyses cristallographiques sur les
cadhérines classiques ont montré que leur dimérisation nécessite l'insertion réciproque
du résidu tryptophane 2 (Trp2) du domaine EC1 dans une poche hydrophobe du domaine
EC1 complémentaire [Shapiro, 1995; Boggon, 2002] (Figure 10A). Les cadhérines
pourraient alors former des dimères entre 2 molécules antiparallèles qui s'assembleraient
de la sorte en un filament (Figure 10B). L'existence de dimères formés par des
interactions trans entre 2 cadhérines voisines est encore controversée. Néanmoins, une
étude par tomographie électronique sur des coupes de peau de souris a révélé
l'organisation du desmosome in situ. En effet, l'élaboration d'une carte en 3D a permis de
montrer que les molécules de cadhérines forment des groupes discrets par interaction de
leur extrémité N-terminale (Figure 10C). La flexibilité de cette interface d'adhésion serait
médiée par les échanges intermoléculaires de résidu Trp2 et conduirait à la génération
d'interactions cis et trans entre les cadhérines pouvant se propager le long de la jonction
(Figure 10D) [He, 2003]. A l'heure actuelle, peu de données sont disponibles sur
l'adhésion des cadhérines desmosomales. Une récente étude in vivo a néanmoins montré
par immunomicroscopie électronique directe, que le domaine EC1 de la Dsg3 murine est
localisé au niveau de la ligne extracellulaire dense du desmosome, c'est à dire dans la
partie médiane de la desmoglie [Shimizu, 2005].
Introduction
- 53 -
Figure 10. Représentation moléculaire de l’interface d’adhésion entre les domaines extracellulaires des cadhérines classiques. Les analyses cristallographiques montrent que les domaines extracellulaire EC1 des cadhérines classiques interagissent entre eux par l'insertion réciproque du résidu Trp2 (EC1) dans une poche hydrophobe du domaine EC1 complémentaire (A). Le dimère formé entre 2 molécules antiparallèles s'assemble alors en un filament (B). L’analyse in situ des desmosomes de la peau de souris par tomographie électronique a permis l'élaboration d'une carte en 3D montrant que les molécules de cadhérines forment des groupes moléculaires par interaction de leur extrémité N-terminale (C). La génération d'interactions cis et trans entre les cadhérines dûes à des échanges intermoléculaires de résidu Trp2 pourraient se propager le long de la jonction et aboutir ainsi, à la formation d’une interface d'adhésion flexible (D). 3/ L’EXPRESSION TISSULAIRE
Les Dsg2 et Dsc2 ont une expression ubiquitaire et sont détectées dans tous les
tissus contenant des desmosomes incluant les épithéliums simples tels que ceux du
colon et de l’intestin grêle, et les tissus non épithéliaux comme le myocarde ou encore les
follicules des ganglions lymphatiques. Au contraire, les Dsc3, Dsg3, Dsc1 et Dsg1 ont une
expression restreinte aux tissus épithéliaux stratifiés comme l’épiderme et les muqueuses
[Schäfer, 1994 ; Nuber, 1995]. Dans l'épiderme, la Dsg1 est exprimée selon un gradient
croissant des couches profondes vers les couches les plus superficielles de l’épiderme
A
B
Trp2
Trp2
EC1
EC1
C D
Introduction
- 54 -
alors que la Dsg2 et la Dsg3 présentent une expression restreinte aux kératinocytes des
couches basales. Dans les muqueuses, la Dsg3 est fortement exprimée à travers tout
l’épithélium tandis que l’expression de la Dsg1 est plus modérée et semble absente des
couches basales [Amagai, 1996; Shirakata, 1998]. Des travaux récents montrent que la
Dsg4 est principalement exprimée dans les couches granulaires de l'épiderme et à travers
tout l'épithélium muqueux excepté au niveau des couches basales [Mahoney, 2006]. Il
nécessaire de préciser que bien qu'elles soient caractérisées par des profils d'expression
distincts, les Dsg1, Dsg3 et Dsg4 sont aussi présentes dans le follicule pileux [Hanakawa,
2004 ; Mahoney, 2006].
4/ LES DIFFERENTS MEMBRES
Les desmogléines
Les Dsg sont des glycoprotéines transmembranaires de type 1, calcium-
dépendantes, qui appartiennent à la famille des cadhérines desmosomales. Chez
l’homme, il existe 4 isoformes de Dsg (Dsg1 à Dsg4) codées par des gènes distincts
localisés sur le chromosome 18q12.1, regroupés au sein d’un segment génique de 250 kb
et arrangés dans le sens 5´-cen-DSG1-DSG4-DSG3-DSG2-Tel.3´ (Figure 11) [Kljuic, 2003 ;
Whittock, 2003b]. Chez la souris, les homologues sont au nombre de six, le complexe
génique occupant alors environ 400 kb [Whittock, 2003a]. Les séquences et l’organisation
des gènes codants les différentes isoformes sont très conservées entre-elles (Tableau 10),
mais aussi entre l’homme et la souris.
Figure 11. Organisation génomique des cadhérines desmosomales.
Tableau 10. Comparaison des séquences aminoacides entre les desmogléines humaines
Id/Hom Dsg1 Dsg2 Dsg3 Dsg4
Dsg1 34/47 41/55 38/52
Dsg2 34/47 36/53 36/51
Dsg3 41/55 36/53 46/62
Dsg4 38/52 36/51 46/62
L’identité (Id) et l’homologie (Hom) entre les Dsg sont exprimées en %.
DSC1 (37 kb)
DSG1 (39 kb)
DSG4 (36 kb)
DSG3 (29 kb)
DSC2 (35 kb)
DSG2 (29 kb)
DSC3 (52 kb)
DSC1 (30 kb)
DSG6 (37 kb)
DSG1 (27 kb)
DSG5 (46 kb)
DSC2 (27 kb)
DSG4 (35 kb)
DSC3 (39 kb)
DSG3 (29 kb)
DSG2 (49 kb)
Télomère Centromère 25 kb
27 kb
157 kb
21 kb
34 kb
41 kb
30 kb
26 kb
138 kb
28 kb
32 kb
29 kb
48 kb
19 kb
HOMME
SOURIS
Introduction
- 55 -
Par ailleurs, les comparaisons géniques entre les deux espèces ont montré que la Dsg5
murine correspondrait véritablement à l’homologue de la Dsg1 humaine et que les gènes
codant les Dsg1 et Dsg6 chez la souris auraient été éliminés au cours de l’évolution
[Whittock, 2003a]. Chez l’homme, 15 exons composent les gènes DSG1 (Figure 12) et
DSG2 et 16 exons, les gènes DSG3 et DSG4.
Figure 12. Structures génique et protéique de la desmogléine 1. Le gène DSG1, localisé entre le gène DSG4 et le cluster génique des Dsc, est composé de 15 exons (E) et couvre une région génomique d’environ 40 kb. Les introns sont représentés par des lignes pointillées. La Dsg1 (160 kDa) comprend de son extrémité N- à C-terminale : un peptide signal suivi d’un propeptide ; une région extracellulaire composée de 5 domaines (EC1 à EC5) ; un domaine transmembranaire (TM) ; une région intracellulaire composée d’un domaine ancrage intracellulaire (AI), d’un segment des cadhérines intracellulaire, d’un domaine de liaison riche en proline (DL), un domaine de 5 unités répétées de 29 ± 1 résidus (DUR) et d’un domaine C-terminal (DT).
L’organisation protéique des Dsg est similaire à celle des autres cadhérines. Elles
sont composées d’une région extracellulaire organisée en 5 domaines (EC1 à EC5), d’un
segment transmembranaire et d’une région intracytoplasmique (Figure 9). Cependant,
elles différent des autres membres de la famille, puisque la région intracellulaire des Dsg
contient en plus, un domaine de liaison riche en proline (DL), un domaine d’unités
répétées (DUR) de 29 ± 1 résidus, caractéristiques de ces protéines ainsi qu’un domaine
C-terminal (DT).
Ces protéines adhèrent entre-elles dans l’espace interkératinocytaire ou desmoglie
par des interactions homotypiques (interactions entre protéines homologues) de leur
domaine extracellulaire EC1. Plusieurs travaux ont démontré l’existence d’interactions
hétérophiliques avec les Dsc (domaines EC1 et EC2) se traduisant par la formation de
dimère Dsg/Dsc [Chitaev, 1997]. Ces interactions qui font intervenir les domaines EC1-
EC2 des Dsc et les domaines EC1-EC2-EC3 des Dsg sont dépendantes du Ca2+ et
semblent indispensables à l'adhésion intercellulaire médiée par le desmosome [Chitaev,
1997]. Les interactions entre ces molécules sont certainement plus complexes et
diversifiées. Le modèle d'une interface d'adhésion flexible formée par des groupes
d'interaction moléculaire, décrite pour les cadhérines classiques est une hypothèse qui
pourrait rendre compte de la multiplicité des associations entre cadhérines
5’ 3’
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15
S P EC1 EC2 EC3 EC4 EC5 TM AI SCI DL DUR DT
Introduction
- 56 -
desmosomales [He, 2003]. La queue cytoplasmique des Dsg est liée directement aux
desmoplakines (protéine de la famille des plakines) qui se fixent elles-mêmes au
cytosquelette de kératine, ou indirectement par l’intermédiaire de protéines de la famille
armadillo (plakoglobine et plakophiline) (Figure 8) [Bornslaeger, 2001]. La plus récente
étude montre que la plakoglobine peut se complexer à 2 molécules de Dsg1 et à 1
molécule de Dsg2 ou de Dsg3 [Bannon, 2001].
Les desmocollines
Les Dsc, comme des Dsg, sont des glycoprotéines transmembranaires de type 1
qui appartiennent à la famille des cadhérines desmosomales. Trois isoformes de Dsc
(Dsc1 à Dsc3) ont été isolées, chacune étant codée par des gènes distincts qui sont
localisés sur le locus des cadhérines du chromosome 18q12.1, en 3´ des gènes DSG. Deux
formes de la protéine, une forme longue « a » (17 exons) et une forme courte « b » (16
exons), peuvent être générées à partir d’un même transcrits de Dsc par épissage alternatif
de l’extrémité C-terminale du domaine intracellulaire (élimination de l’exon 17) (Figure 9).
Seule la queue cytoplasmique des formes longues de Dsc (Dsc1a, Dsc2a et Dsc3a)
contient les séquences nécessaires aux interactions avec les desmoplakines et les
protéines armadillo. La Dsc3a aurait toutefois la capacité de s’associer à la plakophiline 3
[Bonne, 2003]. Leur fixation avec les desmoplakines directement ou via la plakoglobine
conduit, comme dans le cas des Dsg, au pontage d’une portion de leur domaine
intracellulaire au cytosquelette du kératinocyte.
B- Les plakines [Leung, 2002; Jefferson, 2004]
La famille des plakines comprend un ensemble de protéines intracellulaires dites
adaptatrices qui assure dans les épithéliums, la connexion entre les complexes
jonctionnels et le cytosquelette. Chez les mammifères, 12 protéines distinctes ont été
identifiées dont certaines représentent les isoformes protéiques des 7 membres
actuellement individualisés. Dans l’épiderme, 7 plakines épithéliales permettent la liaison
entre les jonctions intercellulaires ou cellules – matrice et les filaments intermédiaires de
kératine : les desmoplakines I et II, la plectine, la protéine BPAG1 (antigène majeur de la
pemphigoïde bulleuse), la périplakine, l’envoplakine, et l’épiplakine (Figure 10). Les
protéines BPAG1 et plectine pontent les filaments intermédiaires aux hémidesmosomes
tandis que les desmoplakines lient ces filaments aux cadhérines desmosomales. La
périplakine et l’envoplakine sont exprimées dans la couche cornée de l’épiderme dans
laquelle elles prennent part à son assemblage. Enfin, une nouvelle plakine a été
récemment identifiée, l'épiplakine, dont la fonction reste encore à définir. Qualifiées de
« cytolinker », ces véritables « Goliath » assurent, de par cette fonction d’ancrage, la liaison
Introduction
- 57 -
entre les jonctions cellulaires et le cytosquelette contribuant ainsi, à l’intégrité structurale
des kératinocytes.
Figure 13. Structure des plakines. Sept plakines, présentes dans l’épiderme, assurent la liaison entre les jonctions d’ancrage (desmosomes et hémidesmosomes) et les filaments intermédiaires de kératine ; les desmoplakines I (DPI) et II (DPII), l’envoplakine (ENV), la périplakine (PPL), l’épiplakine, l’antigène majeur de la pemphigoïde bulleuse (BPAG1) et la plectine (PL). Les plakines partagent une structure commune faite de deux domaines globulaires N- et C- terminaux séparés par un domaine central hélicoïdal (ou rod domain). Le domaine N-terminal nommé domaine plakine est constitué d’hélices α antiparallèles. Le domaine C-terminal est composé d’un nombre variable de répétions de type plakine (A, B ou C), qui sont conservées au sein de la famille et qui sont absentes de la structure des PPL. Le domaine central permet une homodimérisation par la formation d’une double hélice α. Dans leur domaine C-terminal, les desmoplakines possèdent un domaine supplémentaire, riche en glycine, sérine et arginine (domaine GSR) (▄) et qui est commun à celui de la PL. Cette dernière contient à son extrémité N-terminale, un domaine d’ancrage à l’actine (domaine ABD) (○). L, sous domaine de liaison (ou linker subdomain).
DPII
A B C C N
ENV C C N L
L
PPL
C N L
Domaine globulaire C-terminal
Domaine globulaire N-terminal
Domaine hélicoïdal
DPI
A B C C N L
BPAG1
B C C N
PL
B B B B B B B B B B B B B C N
Epiplakine
L
B B B B B C C N L
Introduction
- 58 -
1/ LA STRUCTURE MOLECULAIRE (Figure 13)
Les plakines possèdent une structure commune, organisée en 3 domaines : un
domaine N-terminal globulaire dénommé domaine plakine qui est composé de 6 hélices α
(NN, Z, Y, X, W et V) arrangées de manière antiparallèles pour former un faisceau α-
hélicoïdal; un domaine central hélicoïdal assurant l’homodimérisation des plakines; un
domaine C-terminal globulaire composé de nombreuses répétitions plakine (domaines
PRD) de type A, B et C. Un sous domaine de liaison (linker subdomain) est localisé entre
les répétitions B et C. L’extrémité C-terminale des desmoplakines et de la plectine
contient un domaine supplémentaire, riche en glycine, sérine et arginine (domaine GSR).
L’extrémité N-terminale de la plectine possède en plus, un domaine d’ancrage à l’actine
(domaine ABD) correspondant à deux domaines d’homologie avec la calponine (domaine
CH).
2/ LA FONCTION D’ANCRAGE
Les plakines sont fonctionnellement bivalentes car elles sont capables de se lier à
la fois aux protéines de jonction cellulaire et aux filaments intermédiaires du
cytosquelette. C’est le domaine plakine N-terminal qui est impliqué dans les associations
avec les protéines jonctionnelles. Les partenaires d’interactions de ce domaine plakine ont
été bien étudiés pour les plakines épithéliales et sont détaillés ci-dessous pour chacun
des membres. Les filaments intermédiaires se fixent aux unités PRD (Plakin-repeat
domain) du domaine globulaire C-terminal des plakines. Les études en cristallographie
ont montré que la conformation des domaines PRD de type B et C consiste en une épingle
β suivie par deux hélices α antiparallèles [Choi, 2002]. Cette structure possède les
caractéristiques d’un site d’amarrage des filaments intermédiaires. De plus, le sous
domaine linker, prédit pour former une hélice α, semble aussi impliqué dans la fixation de
ces filaments aux desmoplakines [Fontao, 2003] et à la périplakine [Karashima, 2002].
3/ LES DIFFERENTS MEMBRES
Les desmoplakines
Les desmoplakines (DP), identifiées en 1974 à partir de fractions purifiées de
plaques desmosomales [Skerrow, 1974] sont les plus abondants des composants
desmosomaux. Elles sont indispensables au desmosome, sont essentielles au maintien de
l’intégrité cellulaire et constituent le véritable prototype de la famille des plakines. Les
deux isoformes de DP, DPI (250 kDa) et DPII (210 kDa), sont synthétisées par épissage
alternatif. Une région de 599 aminoacides du domaine central hélicoïdal de la DPI est
absente de la DPII (Figure 13) [Virata, 1992]. Les DP sont localisées dans la portion la
plus interne de la plaque desmosomale où elles assurent l'ancrage des filaments
Introduction
- 59 -
intermédiaires de kératine (qu’elles fixent par leurs domaines PRD) à la membrane
plasmique. Elles s'associent généralement en dimère et interagissent avec les protéines
armadillo (plakoglobine et plakophilines 1 et 2) par leur domaine plakine de même
qu'avec la plectine. De plus, les DP se lient par leur domaine N-terminal à la région
cytoplasmique des cadhérines desmosomales directement ou par l’intermédiaire des
protéines armadillo, les couplant ainsi aux filaments intermédiaires du cytosquelette
kératinocytaire (Figure 8). Les DP sont exprimés dans tous les types d’épithélium et sont
aussi présentes dans certaines jonctions cellulaires autres que le desmosome.
La plectine
La plectine (protéine HD1 ou encore IFAP300) d’environ 500 kDa a originellement
été copurifiée avec des préparations de filaments intermédiaires extraits de culture
cellulaire [Pytela, 1980]. Cette phosphoprotéine intracellulaire d’expression ubiquitaire,
exception faîte des neurones, est exprimée dans les plaques desmosomales mais aussi
dans les plaques hémidesmosomales situées à la jonction dermoépidermique (Figure 14).
Comparée aux autres plakines du desmosome, la plectine possède un domaine d’ancrage
à l’actine (domaine ABD) à son extrémité N-terminale (Figure 13). Dans la plaque
desmosomale, elle coopère avec les DP dans leur fonction de couplage des filaments
intermédiaires aux desmosomes [Eger, 1997].
L’antigène majeur de la pemphigoïde bulleuse, BPAG1
La protéine BPAG1 (BP230) a été caractérisée en 1981 par Stanley et al, comme
une cible commune des autoAc présents chez les patients atteints de pemphigoïde
bulleuse [Stanley, 1981]. Cette protéine de 230 kDa qui appartient à la famille des
plakines, est exprimée dans l'épiderme et représente l'isoforme majeure du gène BPAG1
(BPAG1-e), qui par des mécanismes d'épissage alternatif, code pour 4 différentes
protéines [Leung, 2001]. Elle est synthétisée par les kératinocytes de la couche basale
épidermique et est localisée dans la plaque hémidesmosomale interne où elle contribue à
l’organisation du cytosquelette par la fonction de son extrémité C-terminale qui assure
l’ancrage des filaments intermédiaires de kératine à la plaque hémidesmosomale. Une
région N-terminale de BPAG1-e interagit avec les domaines intracytoplasmiques des
protéines transmembranaires de l'hémidesmosome, l’intégrine α6β4 et la protéine BPAG2
[Mouquet, 2004] (Figure 14).
Introduction
- 60 -
Mem
bran
e ba
sale
Kér
atin
ocyt
e ba
sal
FIK
PL
BPAG2 Laminine 5
Collagène VII
Epi
derm
e D
erm
e
Hémidesmosome
Lamina lucida
FC
Intégrine α6β4
BPAG1
Lamina densa
NaCl1 M
Sublamina densa
Figure 14. Organisation moléculaire de la jonction dermoépidermique. La jonction dermoépidermique constitue une zone d’adhésion entre l’épiderme et le derme. Cette adhésion est assurée par la triade ; hémidesmosomes, filaments d’ancrage et fibrilles d’ancrage. Les complexes hémidesmosomes/filaments d’ancrage permettent l’ancrage des kératinocytes basaux à la membrane basale composée de 2 lames ; la lamina lucida et la lamina densa. Les protéines intracellulaires BPAG1 et plectine (PL), sont localisées dans la plaque hémidesmosomale interne et interviennent dans la fixation du cytosquelette (filaments intermédiaires de kératine (FIK)) aux hémidesmosomes. La PL et BPAG1 interagissent avec l’intégrine α6β4 et avec la protéine BPAG2. Ces protéines transmembranaires ancrent les cellules basales au niveau de la plaque hémidesmosomale externe sur la membrane basale via leurs interactions avec la laminine 5, principale composante des filaments d’ancrage. Cette dernière interagit dans la lamina densa avec le collagène de type VII, constituant majeur des fibrilles d’ancrage, qui se projette dans une région dénommée sublamina densa, permettant ainsi la fixation de la membrane basale au derme sous-jacent. L’incubation de peau humaine avec une solution de NaCl 1 M provoque la séparation de l’épiderme du derme au niveau de la lamina lucida. FC : fibrilles de collagène. L’envoplakine et la périplakine
L’envoplakine (ENV) de 210 kDa et la périplakine (PPL) de 190 kDa ont initialement
été décrites comme des constituants de l’enveloppe cornée de l’épiderme [Ruhrberg, 1996
; Ruhrberg, 1997]. Ces plakines sont exprimées dans des tissus épithéliaux complexes
incluant des épithéliums squameux stratifiés non kératinisés mais pas dans les
épithéliums simples, les tissus mésenchymateux ou le cœur. Elles sont toutefois
Introduction
- 61 -
détectées dans l’épithélium pseudostratifié des glandes mammaires, l’épithélium
transitionnel de la vessie et dans l’épithélium des muqueuses gastriques. Leur expression
augmente avec la différenciation des épithéliums squameux stratifiés kératinisés tel que
l’épiderme. Ni l’une ni l’autre ne sont des constituants obligatoires des desmosomes
[Leung, 2002]. La région C-terminale de l’ENV ne contient qu’un seul domaine composé
de répétitions plakine de type C et celle de la PPL, n’en possède aucun (Figure 13). L’ENV
et la PPL peuvent former des homodimères et, peuvent interagirent entre-elles par leur
domaine central pour former des hétérodimères [Ruhrberg, 1997]. Elles sont amarrées à
la membrane plasmique par des transglutaminases durant la différenciation terminale
des épithéliums stratifiés. Ces protéines sont impliquées dans l'échafaudage de la couche
cornée bien que la PPL ne semble pas nécessaire à son assemblage [Maatta, 2001].
L’épiplakine
L’épiplakine a initialement été identifiée par le criblage d’une banque d'expression
d'ADNc de kératinocytes humains avec le sérum d'un patient présentant une maladie
bulleuse auto-immune et chez qui une réactivité autoAc dirigée contre une protéine
inconnue de 450-kDa était détectée [Fujiwara, 1996]. Cette protéine de la famille des
plakines est atypique puisqu’elle ne possède pas les domaines N-terminal globulaire et
central hélicoïdal (Figure 13) [Fujiwara, 2001]. Elle est uniquement constituée de 13
répétitions hautement conservées de type B, dont les 5 derniers sont particulièrement
homologues. Les analyses par Northern blot et par immunofluorescence indirecte
montrent que l’épiplakine est largement exprimée dans différents tissus humains. Dans
la peau, elle est présente au niveau de l'épiderme entier et pourrait participer à
l'empaquetage des filaments intermédiaires de kératine.
C- Les protéines Armadillo
Les protéines de la famille armadillo (littéralement « tatou ») possèdent une fonction
duale, de molécules d'adhésion et de signalement cellulaire. Elles sont caractérisées au
niveau structural, par un domaine central, composé d'une série de répétitions de 42–45
acides aminés appelées répétitions arm, qui est impliqué dans les interactions protéine-
protéine. Les protéines armadillo de la plaque desmosomale, la plakoglobine et les
plakophilines, interagissent avec de nombreux partenaires desmosomiaux (Tableau 11).
Introduction
- 62 -
Figure 11. Partenaires desmosomiaux d'interactions avec les protéines Armadillo
Dsg, desmogléine; Dsc, desmocolline; DP, desmoplakine; PG, plakoglobine; PKP, plakophiline.
La plakoglobine
La plakoglobine (PG) ou γ-caténine est une protéine de 83-kDa, non glycosylée et
fortement basique, qui est localisée à la fois dans les plaques desmosomales et
cytoplasmiques des jonctions adhérentes. Elle possède des fonctions d’adhésion et de
signalement cellulaire qui s’avèrent cruciales pour l’assemblage et la stabilité du
desmosome [Marcozzi, 1998]. Dans la plaque desmosomale, la PG se lie au niveau de ces
répétitions arm à la queue cytoplasmique des cadhérines desmosomales, plus fortement
aux Dsg qu’aux Dsc [Chitaev, 1996]. Elle se lie aussi au domaine N-terminal des DP
[Kowalczyk, 1997] en association avec la plakophiline 1 [Bornslaeger, 2001] ainsi qu'aux
filaments intermédiaires de kératine [Smith, 1998]. Sa fonction d'ancrage du
cytosquelette aux cadhérines est indispensable à l'adhésion desmosomale.
Les plakophilines [Hatzfeld, 2006]
Les plakophilines (PKP) sont au nombre de 3, la PKP1 (75-kDa), la PKP2 (100-kDa)
et la PKP3 (87-kDa). La PKP1 est majoritairement exprimée au niveau des couches
suprabasales des épithéliums stratifiés tandis que la PKP2 et PKP3 sont présentes dans
les épithéliums simples et stratifiés. Elles sont localisées dans la plaque desmosomale
dans laquelle elles interagissent avec d'autres protéines desmosomales (Tableau 11), mais
aussi dans le noyau des cellules épithéliales. Cette localisation intracellulaire mixte est en
Protéines Armadillo Protéines desmosomales
Plakoglobine
Plakophiline 1
Plakophiline 2
Plakophiline 3
Dsg1, Dsg2, Dsg3 Dsc1a, Dsc2a DP PKP1, PKP2, PKP3
Dsg1 Dsc1 DP
Dsg1, Dsg2 Dsc1a, Dsc2a DP PG
Dsg1, Dsg2, Dsg3 Dsc1a, Dsc2a, Dsc3a, Dsc3b DP PG
Introduction
- 63 -
accord avec leur intervention dans l’adhésion dépendante des desmosomes et dans les
voies de signalisation. Les PPK ont été considérées comme des protéines accessoires de la
plaque desmosomale contrairement à la DP et à la PG qui sont essentielles à la connexion
entre desmosome et cytosquelette. Cependant, leur importance dans la formation de la
plaque a récemment émergé. En effet, leurs nombreuses interactions (via leur domaine N-
terminal) dans cette structure suggèrent qu'elles agissent comme des protéines « de
coffrage » nécessaires à l'assemblage du desmosome. La PKP1, qui comme la PG est
requise pour la formation des plaques, aurait un rôle de recrutement et de stabilisation
des protéines desmosomales à la membrane plasmique [South, 2003]. La perte
d'expression de la PKP1 affecte notamment la taille, le nombre et la stabilité des
desmosomes. L'intervention des PKP2 et PKP3 dans la régulation de l'adhésion
desmosomale semble plus discrète. La PKP2 a néanmoins une fonction majeure dans le
transport de la DP à la membrane [Godsel, 2005]. Bien que les PKP ont aussi la capacité
d'interagir in vitro avec les filaments de kératine, elles ne paraissent pas intervenir dans
l'organisation du cytosquelette. Enfin, un nouveau membre de la famille des
plakophilines, la PKP4 (ou protéine p0071), est aussi localisé dans les desmosomes de
cellules épithéliales humaines. Elle peut interagir avec les cadhérines desmosomales ainsi
qu'avec plusieurs protéines de la plaque (DP, PKP2 et PG) et son rôle dans l'adhésion
kératinocytaire reste à déterminer.
Cette partie a été consacrée à la description des protéines qui participent à
l'organisation moléculaire et à la fonction d'adhésion de la jonction desmosomale. Il est
toutefois important de préciser que le desmosome intervient aussi dans la transduction
de signaux cellulaires qui dans un souci de clarté, ne sera pas développée dans cette
introduction. Le rôle de certaines protéines desmosomales dans le signalement
kératinocytaire en particulier, la PG, sera tout de même évoqué dans la partie suivante.
Introduction
- 64 -
Chapitre 4 : Les pemphigus
I. LES ASPECTS CLINIQUES ET HISTOLOGIQUES DES DIFFERENTES
FORMES DE PEMPHIGUS
Les pemphigus sont des MAI spécifiques d'organe touchant la peau et les
muqueuses. Ils se caractérisent par la production d'autoAc pathogènes dirigés contre des
constituants du principal système de jonction interkératinocytaire : le desmosome. La
fixation des Ac a pour conséquence la perte d'adhésion entre les kératinocytes appelée
« acantholyse » et in fine, la formation de bulles intra-épidermiques [Mouquet, 2005].
La classification initiale des pemphigus repose sur la distinction entre deux
grandes formes, en fonction de la profondeur du clivage intra-épidermique : les
pemphigus profonds (pemphigus vulgaire et pemphigus végétant) comportant un clivage
suprabasal et les pemphigus superficiels (pemphigus séborrhéique, pemphigus foliacé,
pemphigus érythémateux, pemphigus endémique), comportant un clivage dans la couche
granuleuse. Depuis les années 1970, de nouvelles formes de pemphigus ont été décrites,
qui échappent à cette dichotomie : pemphigus paranéoplasique, pemphigus herpétiforme
et pemphigus à IgA. Ainsi, si le diagnostic de pemphigus est souvent suspecté
cliniquement, son affirmation nécessite la réalisation d'une biopsie cutanée ou muqueuse
montrant un clivage intra-épidermique par acantholyse ainsi que des examens
complémentaires pour la recherche des autoAc permettant d'affiner le diagnostic.
Les pemphigus endémiques brésilien et tunisien se rapprochent du pemphigus
foliacé par leur présentation clinique et paraclinique. Ils sévissent avec une prévalence
très augmentée et présentent des caractéristiques épidémiologiques très particulières. Les
pemphigus brésilien et tunisien ainsi que le pemphigus endémique colombien seront
davantage détaillés dans la partie consacrée aux facteurs environnementaux de la
maladie.
Dans un souci de clarté, ne seront décrit dans cette partie que les 3 grandes
variétés de pemphigus : le pemphigus vulgaire, le pemphigus foliacé et le pemphigus
paranéoplasique.
A- Le pemphigus vulgaire, l’archétype des pemphigus profonds
Le pemphigus vulgaire (PV), décrit cliniquement par Willan en 1808 et Hebra en
1860, constitue la forme la plus fréquente de pemphigus avec plus de 70% des cas. Il
reste malgré cela une maladie rare dont l'incidence est de 1 à 5 cas par million
d'habitants et par an [Bastuji-Garin, 1995]. La maladie a été décrite dans toutes les
ethnies mais sa fréquence est nettement plus élevée chez les Juifs Ashkénazes (16 à 32
Introduction
- 65 -
cas par million d'habitants et par an) et au Japon. La maladie survient dans les deux
sexes le plus souvent entre 40 et 60 ans mais des cas ont été décrits chez des enfants et
chez des sujets plus âgés (de 18 mois à 89 ans).
Dans plus de deux tiers des cas, la maladie commence par une atteinte muqueuse
qui est le plus fréquemment buccale (Figure 15A). L'atteinte des autres muqueuses est
possible (atteinte œsophagienne [Joly, 1994], pharyngée, laryngée [Hale, 2001], génitale
ou rectale [Sami, 2001a ; Wright, 2000] (Figures 15B et 15C). Le plus souvent, l’atteinte
cutanée survient secondairement, plusieurs semaines ou plusieurs mois après les
érosions muqueuses. Elle se caractérise par la survenue de bulles flaccides à contenu
clair, siégeant classiquement en peau non érythémateuse (Figure 15D). Il existe un signe
de Nikolsky en peau péri-bulleuse et parfois en peau saine (Figure 15E). Ce signe consiste
en un détachement des couches superficielles de l'épiderme provoqué par le frottement
appuyé de la peau.
Figure 15. Lésions muqueuses et cutanées de pemphigus vulgaire. A, lésions endobuccales ; B, lésions balaniques ; C, lésions vaginales ; D, lésions cutanées avec un signe de Nikolsky positif (E).
A
B C
D
E
Atteintes muqueuses Atteintes cutanées
Introduction
- 66 -
L'examen en histologie standard d'une biopsie pratiquée au niveau d'une lésion
bulleuse met en évidence un clivage intra-épidermique situé le plus souvent au-dessus de
la couche basale de l'épiderme dont les kératinocytes sont également séparés les uns des
autres, prenant un aspect en « pierre tombale » (Figure 16). Ce clivage est parfois visualisé
au niveau des follicules pileux. Le liquide de bulle contient des cellules acantholytiques.
Un infiltrat dermique mixte, le plus souvent modéré et composé de polynucléaires
neutrophiles et/ou éosinophiles est souvent présent. L'aspect de spongiose à neutrophiles
souvent observé dans le pemphigus à IgA est parfois également observé dans le
pemphigus à IgG.
Figure 16. Histologie des pemphigus. L'examen en histologie d'une biopsie pratiquée au niveau d'une lésion bulleuse met en évidence un clivage intra-épidermique situé au-dessus de la couche basale chez les malades de PV (clivage profond) (A) et sous la couche cornée ou au niveau de la couche granuleuse chez les malades de pemphigus superficiel (clivage superficiel) (B).
B- Le pemphigus foliacé, l’archétype des pemphigus superficiels
Les pemphigus superficiels (PS) sont caractérisés par un clivage intra-épidermique
survenant dans la couche granuleuse et par la quasi inexistence de lésions muqueuses. Il
en existe différentes formes cliniques. L’archétype est constitué par le pemphigus foliacé
(PF) dont la forme localisée constitue le pemphigus séborrhéique. Le pemphigus
érythémateux y associe des signes de lupus érythémateux. Les pemphigus endémiques se
rapprochent du PF mais présente des caractéristiques épidémiologiques très particulières
constituant un modèle potentiellement informatif sur la ou les étiologies de la maladie.
Le PF, décrit par Cazenave en 1844, constitue la forme dite sporadique, par
opposition à la forme endémique, du PS. Il s’agit d’une maladie très rare en France dont
l’incidence est inférieure à 1 cas par million d’habitants et par an. Dans sa forme étendue,
la maladie réalise un tableau d'érythrodermie désquamative associée à des bulles très
superficielles et fugaces [Nousari, 2001] (Figure 17). Les lésions prédominent typiquement
sur les zones séborrhéiques (région médiofaciale, cuir chevelu, région présternale et partie
B A
Introduction
- 67 -
supérieure du dos). Le signe de Nikolsky est positif. Des lésions pustuleuses peuvent
dominer le tableau [Matsuo, 2001]. L’atteinte muqueuse est très inhabituelle et,
lorsqu’elle est présente, se traduit par des érosions buccales très superficielles moins
sévères que dans le PV.
Figure 17. Lésions de pemphigus superficiel.
Au stade initial de la maladie, l’histologie des lésions révèle un clivage intra-
épidermique par acantholyse, situé sous la couche cornée ou dans la granuleuse. Un
infiltrat dermique superficiel très discret composé de polynucléaires éosinophiles peut
être observé. A la phase érythrodermique apparaît une parakératose associée à un
œdème interkératinocytaire avec un infiltrat dermique et une exocytose de polynucléaires
éosinophiles.
C- Le pemphigus paranéoplasique
Cette nouvelle variété de pemphigus a été décrite en 1990 par Anhalt [Anhalt,
1990] Bien qu’il ait été décrit dans de nombreux pays, le pemphigus paranéoplasique
(PPN) est une maladie très rare. Le diagnostic est porté sur la coexistence de critères
cliniques, histologiques et immunologiques ainsi que sur l'association à une néoplasie le
plus souvent à type d'hémopathie lymphoïde (Figure 18) [Mutasim, 1993 ; Anhalt, 2004].
Cependant, aucun signe pris isolément n'est véritablement discriminant par rapport au
PV. L'éruption cutanée se caractérise par son polymorphisme [Martel et Joly, 2001a] et
associe grossièrement des signes de pemphigus, d'érythème polymorphe et de
pemphigoïde bulleuse [Anhalt, 1997] ainsi que des lésions lichénoïdes [Camisa, 1993 ;
Hsiao, 2001]. Bien que l’atteinte muqueuse soit prédominante, le PPN est la seule forme
de pemphigus qui touche des tissus non recouverts par un épithélium stratifié
Introduction
- 68 -
42%
29%10%
6%
6%
6%
Lymphome non-HodgkinienLLCMaladie de CastlemanThymomeSarcomeMacroglobulinémie de Waldenstrom
squameux. Approximativement 30 à 40% des cas vont développer une défaillance
pulmonaire évoluant vers des changements caractéristiques d'un tableau de bronchiolite
obstructive oblitérante, souvent létale [Nousari, 1999].
Figure 18. Tumeurs associées au pemphigus paranéoplasique.
Une acantholyse est présente comme dans les autres formes de pemphigus. Elle
est le plus souvent suprabasale, mais est parfois située plus superficiellement au niveau
du stratum spinosum. Des signes de souffrance kératinocytaire identiques à ceux
observés au cours des érythèmes polymorphes graves sont habituellement associés :
vacuolisation des kératinocytes basaux et nécroses kératinocytaires plus ou moins
étendues. On retrouve également un infiltrat dermique superficiel composé de
polynucléaires éosinophiles et de lymphocytes ayant parfois tendance à l'exocytose
pouvant s'associer à un certain degré de spongiose. Si ces signes histologiques sont
évocateurs, aucun n'est cependant spécifique du PPN [Joly, 2000]. L'étude en microscopie
électronique d'un fragment de peau péribulleuse, de réalisation non systématique, met en
évidence une acantholyse des kératinocytes basaux ainsi que des signes de souffrance,
voire de nécrose kératinocytaire.
D- Les associations au pemphigus
1/ LES NEOPLASIES
Il convient de distinguer deux cadres bien distincts. D'une part, le PPN qui
constitue une entité autonome présentant un profil clinique, histologique, immunologique
et un pronostic distinct des autres pemphigus et qui est toujours associé à une néoplasie
le plus souvent de lymphoïde (Figure 18). D'autre part, les autres types de pemphigus
pouvant s'associer à des cancers qui semblent correspondre à des coïncidences. En effet,
les tumeurs solides (le plus souvent du sein, du poumon et de la peau) sont le plus
souvent associées à des PV, plus rarement à des PS [Ota, 2000] et exceptionnellement à
des PPN [Joly, 2000]. Les thymomes sont observés à la fois chez les patients atteints de
Introduction
- 69 -
pemphigus foliacé, érythémateux et vulgaire. Dans certains cas le pemphigus apparaît
après thymectomie. Il est souvent associé à une myasthénie [Younus, 1990]. Cette
association cancer et pemphigus en particulier, le PPN pose la question des mécanismes
physiopathologiques reliant auto-immunité et tumeur [Anhalt, 2001a]. Une hypothèse
propose une réactivité croisée entre les Ag tumoraux et les Ag kératinocytaires.
Alternativement, une anomalie de régulation du cycle cellulaire (anomalie de l'apopotose
par exemple) pourrait à la fois être à l'origine d'une prolifération tumorale et d'un défaut
d'élimination de clones lymphocytaires autoréactifs. Enfin, on ne peut exclure qu'une
partie des cancers associés au pemphigus soit en partie liée aux traitements
immunosuppresseurs utilisés pour traiter le pemphigus.
2/ LES MALADIES AUTO-IMMUNES
Un certain nombre de MAI ont été décrites en association aux pemphigus qu'il
s'agisse des PS ou du PV (Tableau 12). Des associations à d'autres maladies bulleuses
auto-immunes ont été également rapportées, notamment avec la pemphigoïde bulleuse et
la pemphigoïde cicatricielle [Sami, 2001b]. Enfin des syndromes associant de multiples
maladies auto-immunes ont été décrits (pemphigus, LED, syndrome de Sjögren, anémie
hémolytique auto-immune, anticorps antithyroïdiens). Ces associations semblent donc
indiquer qu'une anomalie commune de la régulation du système immunitaire peut
conduire à différentes MAI. L'association à la myasthénie est particulière puisqu'elle
s’observe dans deux tiers des cas avec un thymome [Younus, 1990].
Tableau 12. Associations entre pemphigus et d’autres maladies auto-immunes
Maladies auto-immunes non spécifiques d’organe
Maladies auto-immunes spécifiques d’organe
Lupus érythémateux disséminé Polyarthrite rhumatoïde Sclérodermie Syndrome de Gougerot-Sjögren
Anémie hémolytique auto-immune Anti-facteur VIII Maladie d’Addison Myasthénie Sclérose en plaque Maladies thyroïdiennes auto-immunes
Introduction
- 70 -
II. LES SPECIFICITES DES AUTOANTICORPS AU COURS DES PEMPHIGUS
A- Les anticorps déposés et circulants
La mise en évidence de dépôts d’Ig à la surface des kératinocytes chez les patients
atteints de pemphigus revient à Beutner en 1965 [Beutner, 1965]. Elle repose sur
l'examen en immunofluorescence directe (IFD) d'un fragment biopsique périlésionnel. Le
marquage fluorescent obtenu a l’aspect d'une maille de filet ou d'une résille (encore
appelée substance intercellulaire : SIC) et reflète la fixation des Ac à la membrane des
kératinocytes (Figure 19A). Ces Ac sont essentiellement de classe IgG et de sous-classes
IgG1 et IgG4 (retrouvées respectivement chez 100% et 80% des patients) et plus rarement
de sous-classes IgG2 et IgG3 [Tremeau-Martinage, 1995]. Toutefois, des dépôts d’IgA
(caractéristiques des pemphigus à IgA) et d'IgM peuvent être associés aux dépôts d’IgG
présents à la surface kératinocytaire. Par ailleurs, des dépôts concomitants de fragment
C3 du complément sont observés dans 50% des cas de PV.
Figure 19. Les réactivités des autoanticorps chez les malades atteints de pemphigus. Les analyses en immunofluorescence directe (sur coupes de biopsie de peau périlésionnelle) ou indirecte (incubation du sérum avec des coupes de peau humaine saine) révèlent un marquage fluorescent de la substance intercellulaire de l’épiderme prenant l’aspect d’une résille (A). L’examen en immunomicroscopie électronique montre que les IgG déposées dans la peau des malades ou circulants dans leur sérum se fixent dans l’espace interkératinocytaire de l’épiderme ou desmoglie (B). L’analyse des sérums par immunoempreinte d'un extrait protéique d’épiderme humain permet de mettre en évidence des IgG dirigées contre ; la Dsg1 (160 kDa) chez malades de PF, la Dsg3 (130 kDa) chez les malades de PV et le plus fréquemment contre le doublet périplakine/envoplakine (190-210 kDa) et/ou le doublet desmoplakine II/I (210-250 kDa) (C) chez les malades de PPN. Des profils de réactivité identiques sont observés avec les expériences d’immunoprécipitation d’un extrait de kératinocytes avec les sérums de malades.
210
250
130
160
190
PF PV PPN1 PPN2
PM (kDa)
A B C
Introduction
- 71 -
Les Ac circulants chez les malades atteints de pemphigus sont avant tout détectés
par immunofluorescence indirecte (IFI). Les substrats les plus utilisés sont la peau
humaine, l’œsophage de singe et la langue de rat. Les Ac donnent un aspect de
fluorescence intercellulaire de l’épiderme identique à celui observé en IFD (Figure 19A).
Ces Ac anti-SIC sont essentiellement d’isotype IgG, en particulier de sous-classe IgG1 et
IgG4 et leur titre est généralement corrélé à l’activité de la maladie. Un marquage
fluorescent de la membrane basale associé à une fluorescence intercellulaire est parfois
observé avec les sérums de PPN mais a occasionnellement été décrit dans certaines
formes de PS (pemphigus de Senear Usher). Par ailleurs, les sérums de PPN marquent en
IFI des substrats habituellement non marqués par les sérums de pemphigus vulgaire ou
superficiels : vessie de rat (qui est le substrat le plus sensible et le plus spécifique [Helou,
1995]), intestin grêle, foie (canalicules biliaires) ou myocarde de rat (stries scalariformes)
[Joly, 2000]. Enfin, d’autres techniques permettent de mettre en évidence la présence
d’autoAc dans le sérum des malades et, feront l’objet d’un développement ultérieur.
B- Localisation et identification des antigènes cibles
La localisation des autoAg reconnus par les autoAc produits chez les malades
atteints de pemphigus a été précisée par des techniques d’immunofluorescence et
d’immunomicroscopie électronique (Figure 19B). Les techniques d’immunoprécipitation et
d’immunoempreinte ont permis de déterminer leur poids moléculaire (Figure 19C). Les
techniques de biologie moléculaire notamment le criblage de banques d’expression
d’ADNc de kératinocytes à l’aide de sérum de malades ont permis le clonage des gènes
codant pour ces autoAg et leur identification (Tableau 13), ainsi que leur production sous
forme recombinante. Ces protéines recombinantes ont permis d’établir la cartographie
des épitopes reconnus par les lymphocytes T et B autoréactifs et sont actuellement
utilisées dans les techniques de détection des autoAc par ELISA, plus rapides et plus
sensibles. Ne serons détaillées dans cette partie que les 3 principales entités de
pemphigus, PF, PV et PPN.
1/ LE PEMPHIGUS VULGAIRE
La localisation ultrastructurale des Ag reconnus par les autoAc au cours du PV a
été étudiée par la visualisation des dépôts d'Ac in vivo en immunomicroscopie
électronique directe avec marquage à la péroxydase ou à l'or. Si tous les auteurs
retrouvent des Ac fixés au niveau de l'espace interkératinocytaire (Figure 19B), leur
localisation ultrastructurale précise reste controversée. En effet, pour la plupart des
auteurs, les dépôts d'Ac sont situés exclusivement au niveau de la portion intercellulaire
des desmosomes (desmoglie) [Akiyama, 1991]. D'autres auteurs retrouvent des dépôts à
Introduction
- 72 -
la fois au niveau des desmosomes et des zones interdesmosomales, laissant entendre que
l'Ag du PV est exprimé au niveau des desmosomes mais aussi sur les régions non
desmosomales de la membrane kératinocytaire [Bedane, 1996]. L'identification de l'Ag
reconnu par les Ac responsables du PV s'est faite par immunoprécipitation d'extraits
kératinocytaires par les sérums de patients. Ces sérums sont capables
d'immunoprécipiter un complexe protéique de 210 kDa. Ce complexe est constitué d'une
protéine de 130 kDa, la Dsg3 et d'une protéine de 85 kDa, la PG [Stanley, 1982]. C'est la
Dsg3 qui est reconnue par les autoAc lorsque les sérums de patients sont testés en
immunoempreinte sur extrait d'épiderme humain ou de tissu bovin [Stanley, 1984]
(Figure 19C). La PG est coprécipitée avec la Dsg3 à laquelle elle est liée par des ponts
disulfures. Elle n'est pas reconnue par les autoAc en immunoempreinte. Le gène codant
pour la Dsg3 a été cloné par criblage de banques d'expression d’ADNc préparées à partir
de kératinocytes avec des sérums de patients [Amagai, 1991 ; Silos, 1996].
2/ LE PEMPHIGUS FOLIACE
Il a été montré dès 1977 que les dépôts d'IgG siègent au niveau de l'espace
interkératinocytaire. Les données les plus récentes ont confirmé la localisation
strictement desmosomale de l'Ag du PF en montrant une colocalisation des Ac de PF avec
ceux dirigés contre la PG et les DP [Rappersberger, 1992]. Les sérums de PS
immunoprécipitent un complexe antigénique de 260 kDa constitué d'une protéine de 160
kDa, la Dsg1, et de la PG. En immunoempreinte, c'est la Dsg1 qui est reconnue par les
sérums de patients atteints de pemphigus séborrhéique, de pemphigus érythémateux, de
PF et de pemphigus endémique [Stanley, 1986a ; Stanley, 1986b] (Figure 19C). Comme
pour la Dsg3, la PG reliée au domaine intracytoplasmique de la Dsg1 qu'elle ancre ainsi
dans la plaque desmosomale, n’est pas reconnue par les autoAc. Le gène de la Dsg1 a été
cloné et séquencé, ce qui a permis de rattacher la Dsg1 comme la Dsg3 à la famille des
cadhérines desmosomales [Nilles, 1991 ; Wheeler, 1991 ; Frank, 2001 ; Hunt, 2001].
3/ LE PEMPHIGUS PARANEOPLASIQUE
L'étude en immunomicroscopie électronique des lésions cutanées de PPN révèle un
marquage de la desmoglie, des plaques desmosomales et de la jonction dermo-
épidermique au niveau des hémidesmosomes, traduisant comme nous le verrons plus
bas, la reconnaissance d'Ag de la desmoglie mais aussi des plaques desmosomales et
hémidesmosomales [Joly, 1994]. Les sérums de patients atteints de PPN
immunoprécipitent un complexe antigénique composé de protéines de 250, 230, 210, 190
et 170 kDa [Anhalt, 1990 ; Anhalt, 1997] (Figure 19C). La quasi-totalité de ces bandes est
maintenant identifiée. L'Ag de 250 kDa correspond à la DPI [Oursler, 1992], celui de 230
Introduction
- 73 -
kDa à l'Ag majeur de la pemphigoïde bulleuse (BPAG1) ; la bande de 210 kDa est
constituée d'un doublet correspondant à la DPII et à l'ENV [Kim, 1997] ; enfin l'Ag de 190
kDa a été cloné et correspond à la PPL [Aho, 1999 ; Borradori, 1998 ; Kiyokawa, 1998 ;
Mahoney, 1998]. L'Ag de 170 kDa n'est toujours pas identifié. De plus, il a été montré que
l'HD1-plectine, autre membre de la famille des plakines de poids moléculaire élevé (>500
kDa) et donc d'identification difficile en immunoempreinte, est également reconnue par
certains sérums de PPN [Aho, 1999]. Récemment, il a été montré que les sérums de PPN
contiennent non seulement des Ac anti-plakines mais aussi des Ac anti-Dsg dont le rôle
physiopathologique semble de première importance et sera discuté ultérieurement. Enfin,
un cas de PPN avec des Ac anti-PG a été rapporté [Ishii, 2001b].
Tableau 13. Autoantigènes des pemphigus
Pemphigus Autoantigènes (poids moléculaire)
Pemphigus superficiels
Desmogléine 1 (160 kDa)
Pemphigus vulgaire Desmogléine 3 (130 kDa) Desmogléine 1
Pemphigus herpétiforme Desmogléine 3 (130 kDa) Desmogléine 1
Pemphigus à IgA Desmocolline 1 (105-115 kDa) Desmogléine 3 Desmogléine 1
Pemphigus paranéoplasique Complexe paranéoplasique :
HD1-Plectine (500 kDa) Desmoplakine I (250 kDa) Antigène majeur de la pemphigoïde bulleuse BPAG1 (230 kDa) Desmoplakine II (210 kDa) Envoplakine (210 kDa) Périplakine (190 kDa) Inconnu (170 kDa) Desmogléine 1 Desmogléine 3
Introduction
- 74 -
C- Les anticorps anti-desmogléines
Les autoAc dirigés contre les Dsg et présents dans le sérum des malades,
reconnaissent des épitopes conformationnels, calcium-dépendants, localisés
principalement sur les domaines EC de ces protéines [Amagai, 1995b ; Emery, 1995 ;
Kowalczyk, 1995]. Cependant, une étude récente de Hertl et al démontre que la majorité
des sérums de PV reconnaissent aussi des épitopes non conformationnels localisés sur la
région EC de la Dsg3 et que le titre de ces autoAc est corrélé à l’activité de la maladie
[Muller, 2006]. De même, bien que la réactivité des Ac anti-Dsg soit apparemment
indépendante de la glycosylation des épitopes, une étude a montré la possibilité d’inhiber
la fixation et l’action pathogène des Ac anti-Dsg1 par l’utilisation d’agglutinine de plante
(lectine) ou de certaines glycosidases [Ortiz-Urda, 2003].
L’étude de la cartographie épitopique de ces autoAc montre que la majorité des
autoAc des malades (69,8% des sérums de PF et 77,5% des sérums de PV) reconnaissent
l’extrémité N-terminale, notamment le domaine EC1 et une partie d’EC2 (position 1-161),
précisément les épitopes formés des aminoacides 26-87 de la Dsg1 et 25-88 de la Dsg3
[Sekiguchi, 2001]. Cette réactivité pourrait résulter d’un mécanisme de diversification
progressive de la réponse auto-immune désignée sous le terme d’extension épitopique
intramoléculaire. Ainsi, a t-il été montré par l’équipe de Diaz que les Ac de patients
atteints de pemphigus endémique brésilien (fogo selvagem), réagissent avec le domaine
EC5 de la Dsg1 durant les phases d'inactivité et/ou de rémission de la maladie, et avec le
domaine EC2 pendant la phase active [Li, 2003]. Un phénomène d’extension épitopique
intramoléculaire de la réponse Ac anti-Dsg3 a également été décrit au cours du PV
[Salato, 2005]. L’étude de la cartographie épitopique au cours du PPN montre que la
réponse autoAc dirigée contre la région EC de la Dsg3 est plus diversifiée que celle
observée au cours du PV [Futei, 2003]. Il faut ajouter que le domaine intracellulaire des
Dsg peut être la cible des autoAc chez quelques patients [Ohata, 2001]. Il est désormais
bien établi qu’au cours du pemphigus, la réponse autoAc est polyclonale [Futei, 2000 ;
Sekiguchi, 2001]. L’étude du répertoire B autoréactif a débuté depuis peu, grâce à la
production de scFv (single-chain variable-region fragments) dirigés contre les Dsg et
générés par la méthode de phage display à partir de cellules mononuclées du sang
périphérique (PBMC) isolées chez un patient présentant une forme cutanéomuqueuse de
PV. La caractérisation des scFv ayant une spécificité unique (n=43) a confirmé le
caractère polyclonal de la réponse autoAc comprenant à la fois des Ac pathogènes et non
pathogènes. De plus, les analyses génétiques ont révélé (i) une corrélation entre
l’utilisation préférentielle de certains segments VH et la spécificité antigénique (Dsg1,
Dsg3 ou les 2) ; (ii) l’emploi prédominant de chaînes légères d’isotype λ ; (iii) l’existence
d’hypermutations somatiques dirigées par la Dsg3 [Payne, 2005].
Introduction
- 75 -
L’immunoempreinte a été longtemps utilisée pour détecter la présence d’Ac anti-
Dsg. Sa sensibilité est limitée du fait de la dénaturation des Ag. Des tests ELISA utilisant
les Dsg1 et Dsg3 recombinantes ont donc été développés. Ils ont une sensibilité et une
spécificité de l’ordre de 95% [Ishii, 1997, Amagai, 1999a], et permettent de suivre
l’évolution de la maladie [Cheng, 2002]. Les tests ELISA actuellement commercialisés
(MBL, Medical & Biological Laboratories) constituent un outil rapide de détection et de
dosage des Ac anti-Dsg. Les études de sous-classes menées en ELISA ont confirmé la
quasi exclusivité des IgG4 et IgG1 anti-Dsg chez les malades. La tendance est que les
IgG1 et les IgG4 réagissent respectivement avec des épitopes linéaires et des épitopes
conformationnels des Dsg [Hacker, 2002]. Il semble que ce soit plutôt les IgG4 qui sont
corrélées à l’activité de la maladie et donc qui interviennent dans les processus
physiopathologiques [Warren, 2003]. Dans le PPN, les IgG1 et les IgG2 anti-Dsg3
apparaissent comme les sous-classes les mieux représentées [Futei, 2003]. Les analyses
de réactivité autoAc des sérums de PPN ont en effet montré qu’ils contiennent des Ac anti-
Dsg en plus des Ac anti-plakines. Ces données sont discutées dans le chapitre
« chevauchement de la réponse anticorps ». De manière surprenante, des Ac anti-Dsg ont
été détectés par ELISA dans d’autres pathologies cutanées que les pemphigus : (i) des
anti-Dsg3 chez les souris lupiques notamment les souris MRL lpr/lpr [Nishimura, 2005] ;
(ii) des anti-Dsg1 et anti-Dsg3 à faible titre chez les patients atteint de lichen plan oral
[Lukac, 2006] ; (iii) des anti-Dsg1 chez les malades présentant un syndrome
d’épidermolyse staphylococcique ou staphylococcal scalded skin syndrome [Anzai, 2006].
Aucune donnée ne permet d’affirmer que la production de ces autoAc intervient dans les
processus physiopathologiques de ces maladies. Elle semble plutôt être la résultante d’un
épiphénomène comme par exemple une réactivité croisée dûe à un mimétisme
moléculaire. A cette égard, une étude récente montre que les IgA anti-transglutaminase
présents chez certains malades atteints de maladie coeliaque peuvent réagir de façon
croisée avec la Dsg1, la protéine VP7 du rotavirus, la protéine de choc thermique Hsp60
et le récepteur TLR4 [Zanoni, 2006].
Enfin, les sérums de pemphigus contenant des Ac anti-Dsg1 réagissent avec la
Dsg4 dans 77% des cas. L’exploration de cette réactivité a montré qu’il s’agit en réalité
d’une réactivité croisée des Ac anti-Dsg1 avec la Dsg4 et que les autoAc spécifiques de la
Dsg4 ne possèdent à priori aucun pouvoir pathogène [Nagasaka, 2004].
D- Les anticorps anti-plakines
La PPL et l’ENV sont les autoAg les plus fréquemment reconnus au cours du PPN
[Hashimoto, 1995] et ipso facto, en font les cibles antigèniques les plus spécifiques de la
maladie [Joly, 2000]. Les épitopes exprimés par ces deux protéines sont situés sur les
Introduction
- 76 -
différents domaines à l’exception du domaine C-terminal de la périplakine [Nagata, 2001].
Une étude plus précise de la cartographie épitopique montre que 92% des sérums de PPN
ayant une réactivité anti-190-210 kDa (n=12) reconnaissent le sous-domaine de liaison
(linker) de l’ENV et de la PPL. Plus précisément, le peptide LLDRKSGKQYSIEAALRCRR
contenu dans la région linker de l’envoplakine représente un épitope immunodominant,
reconnu chez 75% des malades. Enfin, il a été montré que les cellules B CD20+
exprimées par les tumeurs de Castleman de malades atteints de PPN ont la capacité de
fixer avec une forte affinité ce peptide immunodominant [Zhang, 2006]. Wang et al ont
montré que la résection des tumeurs de Castleman présentes chez des malades de PPN
aboutit à une disparition des lésions cutanéomuqueuses et des autoAc circulants [Wang,
2004a]. L’analyse immunohistologique des tumeurs a révélé une architecture lymphoïde
comprenant des cellules T regroupées au sein de zones interfolliculaires et des cellules B
prédominantes dans des follicules lymphoïdes. Les auteurs ont montré que les IgG
produites par les tumeurs en culture donnent un marquage fluorescent de l’épithélium
transitionnel de la vessie de souris en IFI et reconnaissent un doublet protéique de 190-
210 kDa en immunoempreinte sur un extrait d’épiderme humain. Par ailleurs, les cellules
B isolées des tumeurs chez les 7 malades expriment et partagent 2 profils de
réarrangement génique de la CDR3 de la chaîne H des IgG [Wang, 2004a]. Ces résultats
suggèrent que des clones B tumoraux produisent des autoAc dirigés contre les protéines
desmosomales notamment, l’ENV et la PER et que ce processus est dirigé par l’Ag. Ces
travaux insistent donc sur le rôle de la tumeur dans l’étiologie auto-immune du PPN. Au
cours du PPN, les autoAc les plus fréquemment détectés, après ceux dirigés contre le
doublet ENV-PPL ciblent les DPI et II, la protéine BPAG1 et la PL [Anhalt, 2004].
Actuellement, très peu d’études ont été réalisées dans le but de caractériser la réponse
anti-plakine dans le PPN. La pathogénicité des Ac anti-plakines reste à démontrer.
La présence d’autoAc anti-plakines a été décrite dans d’autres variétés de
pemphigus : des Ac dirigés contre la PER et l’ENV dans les PV et PF [Kazerounian, 2000 ;
Nagata ; 2001], des Ac anti-PER, anti-ENV et anti-DPI dans le pemphigus colombien
[Abreu-Velez, 2003a] et des Ac anti-BPAG1 chez quelques PF [Karlhofer, 2003]. Par
ailleurs, plusieurs travaux ont dévoilés l’existence d’une production d’Ac anti-DPI et anti-
DPII dans un sous-groupe de malades atteints d’érythème multiforme caractérisé par des
lésions muqueuses [Foedinger, 1995]. Ces autoAc sont dirigés contre un peptide de
l’extrémité C-terminale des DP et plusieurs arguments plaident en faveur de leur rôle
pathogène [Foedinger, 1998].
Introduction
- 77 -
E- Le chevauchement de la réponse autoanticorps au cours des
pemphigus : Conséquence d’un phénomène d’extension
épitopique ?
L'association d'un Ag cible à un type de pemphigus (PV et Dsg3, PF et Dsg1, PPN et
plakines) ne doit pas être considéré au sens strict : en effet, les Dsg 1 et Dsg3 sont en fait
la cible de la réponse auto-immune dans plusieurs types de pemphigus. Entre la moitié et
les deux tiers des patients atteints de PV ont dans leur sérum des Ac anti-Dsg1 en plus
des Ac anti-Dsg3. D'autre part, certains patients atteints de PV peuvent rechuter avec des
manifestations de PS et réciproquement [Ishii, 2000 ; Komai, 2001]. Plusieurs études en
ELISA ont montré que les patients ayant une atteinte muqueuse prédominante n'ont que
des Ac anti-Dsg3 alors que les patients ayant à la fois une atteinte muqueuse et une
atteinte cutanée ont à la fois des Ac anti-Dsg1 et anti-Dsg3 [Harman, 2001]. Il a été
montré dans le modèle de transfert passif d'autoAc au souriceau BALB/c, que les Ac anti-
Dsg1 présents dans les sérums de PV étaient pathogènes et nécessaires, en association
avec les Ac anti-Dsg3, pour produire un clivage épidermique suprabasal. Le profil
sérologique des patients peut être corrélé au type clinique de pemphigus : les sérums ne
contenant que des Ac anti-Dsg1 correspondent à des PS, les sérums ne contenant que
des Ac anti-Dsg3 correspondent à des formes muqueuses prédominantes de PV et les
sérums contenant les deux types d'Ac correspondent à des formes cutanéomuqueuses de
PV (Figure 20) [Amagai, 1999b ; Mahoney, 1999a]. Ainsi, la topographie dans l’épiderme
des lésions cutanées est-elle en accord avec la distribution relative de la Dsg1, fortement
exprimée au niveau des couches superficielles de la peau et celle de la Dsg3 fortement
exprimée au niveau des couches basales de l’épiderme. L’apparition d’Ac anti-Dsg1
parallèlement aux lésions cutanées au cours du PV pourrait constituer une illustration
du phénomène d’extension épitopique intermoléculaire, d’une réponse strictement dirigée
contre la Dsg3 vers une réponse dirigée à la fois contre la Dsg1 et le Dsg3. De manière
intéressante, la transition du phénotype muqueux vers le phénotype cutanéomuqueux
semble être précédée d’une extension de la réponse anti-Dsg3 de la région C-terminale du
domaine EC vers le domaine EC1 de la protéine [Salato, 2005]. Cependant, il a été
rapporté quelques cas de PV avec atteinte cutanéomuqueuse chez lesquels les Ac anti-
Dsg1 étaient détectables précocement au cours de la maladie, avant l’apparition des
lésions cutanées [Harman, 2000]. L’hypothèse alternative à l’extension épitopique, serait
une prédétermination du profil sérologique par le terrain génétique. Des études
complémentaires, s’intéressant aux profils clinique et sérologique des patients atteints de
PV en fonction de marqueurs génétiques et en particulier des gènes HLA de classe II, sont
nécessaires pour confirmer cette hypothèse. Par ailleurs, des Ac anti-Dsg1 sont
fréquemment mis en évidence au cours du pemphigus herpétiforme, et
Introduction
- 78 -
exceptionnellement des Ac anti-Dsg3, faisant de cette variété de pemphigus une variante
de PS ou plus rarement, de pemphigus profond.
Figure 20. Corrélation entre les populations d’anticorps anti-desmogléines et les phénotypes clinico-histologiques de pemphigus. Les sérums de PS contiennent des Ac anti-Dsg1 qui interférent avec la fonction d’adhésion des Dsg1 et induisent une acantholyse superficielle puisque la Dsg3 coexprimée dans les couches basales de l’épiderme compense dans cette zone, la perte d’adhésion médiée par les Ac anti-Dsg1. Au cours du PV de type muqueux, seuls des Ac anti-Dsg3 sont produits et provoquent une acantholyse profondes dans les muqueuses. A eux seuls, ils ne sont pas suffisants pour provoquée des lésions cutanées de par l’expression de la Dsg1 qui compense dans l’épiderme, la détérioration de l’adhésion dépendante de la Dsg3. Le développement du phénotype cutanéomuqueux de PV requiert la présence des 2 populations d’autoAc (anti-Dsg1 et anti-Dsg3).
���� Lésions cutanées : Acantholyse superficielle
(Sous cornée)
���� Lésions muqueuses : Acantholyse profonde
(Supra basale)
���� Lésions cutanéomuqueuses : Acantholyse profonde
(Supra basale)
Pemphigus superficiel
Pemphigus vulgaire (cutanéomuqueux)
Pemphigus vulgaire (muqueux)
PEAU MUQUEUSES
Anti-Dsg1
Anti-Dsg3
Anti-Dsg1 +
Anti-Dsg3
Introduction
- 79 -
Le PPN constitue une seconde illustration du chevauchement de la réponse Ac au
cours des pemphigus [Joly, 1994]. En effet, la mise en évidence en immunoempreinte
d'Ac anti-Dsg3 et anti-Dsg1 dans des sérums de patients atteints de PPN [Joly, 1994 ;
Hashimoto, 1998 ; Martel, 2000], a été confirmée grâce à l'utilisation des tests ELISA
anti-Dsg1 et anti-Dsg3 : 100% des sérums de PPN contiennent des Ac anti-Dsg3 et 65%
des Ac anti-Dsg1 [Amagai, 1998]. Les Ac anti-Dsg3 sont pathogènes, et leur
immunoadsorption supprime le pouvoir pathogène des sérums de PPN lors d'expériences
de transfert passif au souriceau BALB/c. Cette observation pourrait rendre compte des
similitudes tant cliniques (atteinte muqueuse prédominante) qu'histologiques (clivage
suprabasal) du PPN et du PV. Cependant, la relation entre le phénotype clinique (atteinte
muqueuse prédominante ou atteinte cutanéomuqueuse) et le sérotype (Ac anti-Dsg3 seuls
ou associés à des Ac anti-Dsg1) n’est pas retrouvée au cours du PPN [Ohyama, 2001]. De
plus quelques cas de PPN pourraient ne pas présenter d’Ac anti-Dsg [Inaoki, 2001]. Enfin,
l'antigène F12 (de poids moléculaire 185 kDa) décrit initialement pour être reconnu au
niveau des plaques desmosomales et des hémidesmosomes par les sérums de PPN, l'est
également par 1/3 des sérums de PV et de PF [Joly, 1997]. La diversité de la réponse Ac
au cours du PPN et la capacité des sérums à reconnaître des Ag intracellulaires (plakines)
pourrait également constituer une illustration du phénomène d’extension épitopique
[Marzano, 2001 ; Chan, 2000 ; Bowen, 2000].
F- Les anticorps anti-récepteurs à l’acétylcholine
Le dogme établi stipulant que seules des IgG anti-Dsg1/Dsg3 ont la capacité
d’induire un pemphigus chez la souris par transfert passif, a été remis en cause par les
travaux de l’équipe de Grando. Celui-ci réfute les résultats des expériences
d’immunoadsorption des sérums sur les Dsg recombinantes dans la mesure où elles sont
exprimées sous forme de protéines de fusion avec le domaine constant des IgG et
pourraient ainsi fixer des Ac ayant une autre spécificité. C’est en partant de cette idée que
Nguyen et al ont montré que les IgG de PV immunopurifiées sur les Dsg1 et Dsg3
recombinantes reconnaissent en immunoempreinte des bandes de différents poids
moléculaires ne correspondant à aucune des 2 protéines [Nguyen, 2000a]. De plus, cet
auteur a montré que les IgG d’un sérum de PV (ne contenant pas d’Ac anti-Dsg1)
immunopurifiées sur la Dsg3 recombinante sont capables d’induire une acantholyse chez
le souriceau Dsg3-/- et chez la souris bal (invalidée pour la Dsg3) et produisent en IFD un
marquage de type intercellulaire [Nguyen, 2000a ; Vu, 1998]. Par immunocriblage de
banque d’expression dADNc, cette équipe a identifié un nouvel autoAg reconnu par les Ac
élués d’une bande à 75kDa reconnue par un sérum de PV [Nguyen, 2000c]. Ces Ac
produisent en IFI un aspect de marquage de la SIC et sont capables d’induire une
Introduction
- 80 -
acantholyse sur des kératinocytes en culture monocouche. Ils reconnaissent une nouvelle
protéine, nommée pemphaxine (ou annexine 31), capable de lier l’ACh. La préadsorption
de sérums de PV en présence de pemphaxine recombinante inhibe leur pouvoir
acantholytique par transfert passif. Cependant, les Ac anti-pemphaxine, immunopurifiés
sur l’Ag recombinant, ne sont pas pathogènes à eux seuls. Ajoutés aux sérums
préadsorbés, ils restaurent leur pouvoir pathogène. Le rôle d’un autre récepteur de l’ACh,
l’α9 AChR a également été évoqué sur l’observation que des IgG de PV bloquent la
capacité d’un Acm anti-α9 AchR de donner en IFI sur œsophage de singe un marquage de
la SIC [Nguyen, 2000b]. En immunoempreinte utilisant comme substrat un extrait
d’épiderme, cet Ac reconnaît une bande de 50 kDa. Il est capable d’induire une
acantholyse sur des kératinocytes en culture monocouche.
La présence d’Ac dirigés contre des récepteurs à l’ACh au cours du pemphigus est
donc possible même si les données disponibles jusqu’à présent ne permettent pas
d’estimer leur prévalence ni d’affirmer leur rôle dans la physiopathologie de la maladie
(qui sera abordé plus bas). Les Dsg restent donc, jusqu’à preuve du contraire, les Ag
majeurs des pemphigus.
III. LA PHYSIOPATHOLOGIE DU PEMPHIGUS
A- La pathogénicité des autoanticorps
La pathogénicité des autoAc a été clairement montrée dans le PV, le PS [Anhalt,
1982 ; Roscoe, 1985] et le PPN [Amagai, 1998]. D'abord suspecté sur des éléments
d'observation clinique tels que l'évolution parallèle du taux d'Ac et de l'activité de la
maladie, l'efficacité des plasmaphérèses et les cas de pemphigus néonatal transitoire
induits par transfert transplacentaire des autoAc, le rôle pathogène des Ac a ensuite été
montré dans des modèles d'acantholyse in vitro et in vivo. Récemment, un modèle
expérimental murin de PV a permis de mieux comprendre les mécanismes
physiopathologiques à l’origine de la maladie.
1/ PREUVES INDIRECTES
Relation entre l’activité de la maladie et le taux d’anticorps circulants
Plusieurs études ont permis de montrer une corrélation entre le titre des Ac anti-
SIC et l'activité de la maladie [Fitzpatrick, 1980]. Cette corrélation semble plus forte pour
les pemphigus graves avec un taux élevé d'Ac et est retrouvée aussi bien au cours du PV
qu’au cours des PS. Après rémission, le risque de récidive est plus élevé chez les patients
chez lesquels persistent des Ac circulants détectables en IFI. La présence d’Ac fixés in vivo
constituerait également un facteur prédictif de rechute. La surveillance du titre des Ac
anti-SIC en IFI reflétant l'activité de la maladie, constitue donc un élément de surveillance
Introduction
- 81 -
essentiel chez les patients traités ou en rémission [David, 1989]. L’avènement des
techniques ELISA pour la détection et le titrage des Ac anti-Dsg et le diagnostic des
pemphigus a permis par ailleurs de démontrer une corrélation positive entre le titre des
Ac circulants dirigés contre les Dsg1/Dsg3 et l’activité de la maladie [Ishii, 1997 ; Amagai,
1999a ; Cheng, 2002]. Cependant, certaines observations telles que l'association d'une
forme sévère de la maladie à un faible titre d’Ac anti-Dsg et inversement, suggèrent que le
score établi par les tests ELISA ne reflètent pas de manière absolue l’activité de la maladie
[Harman, 2001], probablement parce qu'ils détectent la présence d'autoAc sans activité
pathogène. A cet égard, l'élaboration par Ishii et al d’un test quantitatif de mesure de
l’activité pathogène des Ac anti-Dsg3 montre qu’un même titre d’autoAc peut s'observer
durant les phases active ou de rémission tandis que la valeur du score de dissociation des
kératinocytes est corrélée avec l’activité de la maladie [Ishii, 2005]. Ces résultats montrent
que la réponse Ac dirigée contre les Dsg en plus d’être polyclonale, est hétérogène en
terme de pouvoir pathogène.
Pemphigus néonatal
Chez les femmes atteintes de PV, il existe un risque de pemphigus néonatal par
passage transplacentaire des IgG maternelles. Dans ce cas, le nouveau-né présente des
lésions cliniques et histologiques de la maladie ainsi qu'une analyse en IFD positive
[Chowdhury, 1998]. La plupart des nouveau-nés présentent des Ac circulants qui
disparaissent en 2 semaines à 2 mois parallèlement aux signes cliniques et aux Ac
maternels. Ces observations plaident fortement en faveur du rôle pathogène des autoAc
d'origine maternelle chez le nouveau-né [Hup, 1986]. Au cours des PS et en particulier au
cours du pemphigus endémique, aucun cas de pemphigus néonatal n'a été rapporté.
Cependant certains nouveau-nés présentent des dépôts interkératinocytaires d'IgG ainsi
que des Ac circulants détectés en IFI [Avalos-Diaz, 2000]. L'absence de lésions cliniques
est expliquée par l’expression de Dsg3 dans les couches superficielles de l’épiderme chez
l’embryon. En effet, contrairement à l’adulte, la Dsg3 serait coexprimée chez le nouveau-
né avec la Dsg1 dans les couches superficielles où elle compenserait le défaut d’adhésion
induit par les autoAc ne rendant possible la survenue d’un pemphigus néonatal que par
la transmission transplacentaire d’Ac anti-Dsg1 et anti-Dsg3 [Wu, 2000]. Cette théorie de
la « compensation des Dsg » rendrait compte de l’absence de PS néonataux à l’inverse du
PV néonatal.
Introduction
- 82 -
2/ MODELES EXPERIMENTAUX
Modèles d’acantholyse in vitro (Figure 21A)
Ces modèles permettent d’étudier le pouvoir pathogène des Ac sur des
kératinocytes ayant une différentiation aussi proche que possible de celle des
kératinocytes in vivo. Les modèles utilisés sont des cultures de peau humaine totale, des
cultures organotypiques ou des cultures de kératinocytes, modèle moins physiologique
mais permettant de quantifier l'acantholyse. Le rôle pathogène des IgA dans le pemphigus
à IgA a été montré à l'aide de cette technique. Ces modèles ont également permis l'étude
ultrastructurale des modifications cellulaires induites par la fixation des Ac à la surface
des kératinocytes : les IgG sériques de pemphigus sont internalisées dans les cellules
acantholytiques au sein de vésicules d'endocytose qui fusionnent avec les lysosomes. Il se
produit ensuite une réorganisation du cytosquelette au niveau des filaments
intermédiaires de kératine et des microtubules [Kitajima, 1986]. Enfin, très récemment la
mise au point d’un test quantitatif basé sur la mesure de la dissociation des kératinocytes
cultivés en monocouche en présence de sérum humain permet d’évaluer très précisément
l’activité pathogène des Ac anti-Dsg3 [Ishii, 2005].
Modèles d’acantholyse in vivo (Figure 21B)
Un modèle animal mis au point par Anhalt et al en 1982 [Anhalt, 1982], a
permis d'apporter la preuve définitive de la pathogénicité des Ac au cours du
pemphigus. L’injection intrapéritonéale à des souriceaux nouveau-nés BALB/c d’IgG
purifiées à partir de sérums de PV, de PS ou de PPN, entraîne, en 18 à 72 heures, des
lésions cutanées semblables à celles observées dans la maladie humaine. L'image
histologique et l'analyse en IFD de ces lésions sont superposables à celles du
pemphigus humain, de même que les modifications ultrastructurales observées en
microscopie électronique. L’acantholyse obtenue est dose-dépendante et spécifique.
Dans ce modèle, les Ac pathogènes du pemphigus endémique sont les IgG4. Ce modèle
a également permis de montrer le rôle pathogène des Ac anti-Dsg3 au cours du PPN.
Un autre modèle expérimental de pemphigus consiste à greffer de la peau humaine à
des souris immunodéficientes (SCID) reconstituées avec des lymphocytes sanguins de
patients atteints de pemphigus [Juhasz, 1993]. Par ailleurs, un Ac polyclonal
pathogène a été dérivé par immunisation d'une souris BALB/c avec de la Dsg3
recombinante [Fan, 1999]. Enfin plus récemment, la pathogénicité d’un Acm anti-
Dsg3 généré à partir des cellules B isolées d’un malade de PV a été établie par son
transfert à des souriceaux BALB/c [Yeh, 2006].
Introduction
- 83 -
A. In vitro B. In vivo : Transfert passif
C. In vivo : Modèle murin de pemphigus vulgaire
Figure 21. Modèles de pathogénicité des anticorps anti-desmogléines.
Culture de peau humaine ou de kératinocytes
IgG/A purifiées à partir
des sérums de malades Acantholyse
IgG purifiées à partir des sérums de malades / Acm anti-Dsg3 pathogènes
Balb/C
SCID porteuse d’un greffon de peau humaine
Lymphocytes de malades
Caractéristiques clin iques, histologiques et immunologiques typiques de la maladie humaine
Souris Dsg3-/- Absence de Dsg3
rDsg3
Souris Rag2-/- Absence de lymphocytes
Splénocytes
Souris malade Présence de Dsg3 endogène et de lymphocytes T et B anti-Dsg3
Hybridome sécrétant l’Acm AK23
Souris Rag2-/- Formation d’une ascite AK23
Introduction
- 84 -
Modèle murin de pemphigus vulgaire (Figure 21C)
Un élégant modèle murin de PV a été développé par Amagaï et al qui ont transféré
les splénocytes de souris déficientes pour la Dsg3 ou Dsg3 Knock out (Dsg3-/-) [Koch,
1997] immunisées avec la Dsg3 recombinante de souris, à des souris receveuses Rag-2-/-
(dépourvues de lymphocytes T et B). Les souris receveuses développent des lésions dont
les aspects cliniques, histologiques et immunopathologiques sont similaires à ceux des
patients atteints de PV [Amagaï, 2000, Ohyama, 2002]. Plus précisément, l'analyse du
modèle montre : (i) la production d’IgG anti-Dsg3 dans le sérum des souris receveuses, 4
jours après le transfert des cellules spléniques dont le titre augmente rapidement pour
atteindre un plateau au 21e jour ; les IgG anti-Dsg3 circulantes persistent jusqu’à 6
mois ; (ii) des dépôts d’IgG à la surface des kératinocytes dans la peau et les muqueuses
orales et oesophagiennes ; (iii) une perte d’adhésion intercellulaire épithéliale aboutissant
à une acantholyse suprabasale dans la muqueuse orale et l’œsophage ; (iv) une spongiose
à éosinophiles ; (iv) une perte de poids (les lésions orales perturbant l’alimentation) et le
développement d’érosions cutanées croûteuses ainsi que des plaques d’alopécie. En
revanche, aucun changement phénotypique ou pathologique n’est observé chez les souris
Rag-2-/- recevant des splénocytes de souris Dsg3+/-. Afin de déterminer si la production
des autoAc pathogènes est initiée par une rupture de la tolérance au niveau des cellules T
ou des cellules B, les auteurs ont transféré à des souris Rag-2-/-, différentes combinaisons
de cellules T et B purifiées à partir des souris Dsg3-/-, Dsg3+/- ou de souris normales.
Seules les souris ayant reçu les cellules T et B isolées des souris Dsg3-/- produisent des
Ac anti-Dsg3 à l’origine de la maladie [Tsunoda, 2002]. Ces constatations suggèrent que
chez les souris et très probablement chez l’homme, la tolérance vis à vis de la Dsg3 est à
la fois établie dans les populations lymphocytaires T et B, et qu’une rupture de la
tolérance au niveau des cellules T et B est nécessaire à la production d’IgG anti-Dsg3
pathogènes et à l’expression de la maladie. Plus récemment, une étude montre que les
lymphocytes B et T naïfs isolés de souris déficientes pour la Dsg3 mais non immunisées
avec l’autoAg recombinant sont capables d’induire la production d’Ac anti-Dsg3
pathogènes et le développement de la maladie quand elles sont transférées chez les souris
Rag-2-/- receveuses [Aoki-Ota, 2004]. Ces résultats démontrent que les lymphocytes T
autoréactifs naïfs peuvent s’activer en réponse à la présentation de la Dsg3 par les
cellules dendritiques et/ou les cellules de Langerhans des souris receveuses. Ce modèle
est informatif et permet d’analyser les mécanismes de rupture de la tolérance
périphérique vis à vis de la Dsg3. A cet égard, afin d’étudier les mécanismes de tolérance
et de rupture de tolérance, Ota et al ont généré une souris exprimant une IgM de surface
transgénique spécifique de la Dgs3 issue d’un Acm anti-Dsg3 non pathogène. Bien que
les cellules B autoréactives fonctionnellement compétentes soient présentes dans la rate
Introduction
- 85 -
et les ganglions lymphatiques et que les IgM anti-Dsg3 soient sécrétées dans le sérum des
souris, celles-ci ne développent aucune des manifestations de la maladie humaine [Ota,
2004]. Ces données indiquent que les cellules B autoréactives vis à vis de la Dsg3 sont
capables de se développer en présence de l’autoAg cible mais qu’elles restent indifférentes
vis à vis de cet autoAg. En outre, le développement de la maladie chez les souris Rag-2-/-
transférées avec des splénocytes peut être abrogé par l’injection préalable d’un Acm anti-
CD154. Le blocage de l’interaction CD40/CD154 induit une tolérance vis à vis de la Dsg3
chez ces souris du fait de l’inhibition de la production d’autoAc anti-Dsg3 qui peut
persister durant 70 jours malgré l’immunisation avec la Dsg3. Cette tolérance est
transférable puisque le cotransfert des splénocytes de souris traitées avec l’Acm anti-
CD154 et des splénocytes de souris Dsg3-/- suppriment la production d’Ac anti-Dsg3 chez
les souris receveuses [Aoki-Ota, 2006]. Ces résultats suggèrent que l’interaction
CD40/CD154 est indispensable à la production d’autoAc anti-Dsg3 et que des cellules
régulatrices spécifiques de l’Ag sont générées par la suppression de cette interaction, ce
qui pourrait représenter un intérêt thérapeutique.
Par ailleurs, le groupe de Amagaï a montré que la maladie peut être induite par
transfert passif chez les souris adultes normales, d’un Acm anti-Dsg3 (AK23) dérivé des
souris Rag2-/- receveuses des splénocytes des souris Dsg3-/- immunisées (Figure 21C). Cet
Acm de sous-classe IgG1 est dirigé contre un épitope conformationnel, calcium-
dépendant de l’extrémité N-terminale de la Dsg3 (aminoacides 1 à 63). Il reconnaît
spécifiquement 4 résidus aminoacides (V3, K7, P8 et D59), supposés former l’interface
d’adhésion des Dsg entre-elles [Tsunoda, 2003]. Très récemment, 10 Acm anti-Dsg3
différents ont été dérivés des souris receveuses et leur spécificité vis-à-vis des épitopes
cibles et leur pouvoir pathogène sur des cultures de kératinocytes caractérisés. Les
expériences de pathogénicité réalisées par le transfert des hybridomes à des souris
adultes Rag2-/- ont montré que chaque Acm pris individuellement n’a pas la capacité de
reproduire la maladie chez l’animal. Cependant, l’injection de différentes combinaisons
d’hybridomes sécrétant des IgG hétérogènes en terme de pouvoir pathogène et de
spécificité épitopique induit le développement du phénotype de PV chez les souris
receveuses [Kawasaki, 2006]. Ainsi, la pathogénicité de la réponse autoAc est-elle la
conséquence d’un effet synergique des différents Ac anti-Dsg3 et pourrait refléter la
réponse polyclonale observée chez l’homme.
B- Les mécanismes physiopathologiques
Le desmosome constitue le principal système de jonction interkératinocytaire. Les
cadhérines desmosomales jouent un rôle important dans l'adhésion interkératinocytaire
en reliant les deux demi-desmosomes. Ce rôle a été montré récemment grâce à un modèle
Introduction
- 86 -
de souris invalidée pour le gène de la Dsg3 (Dsg3null ou Dsg3-/-) [Koch, 1997]. En effet ces
animaux qui n'expriment pas la Dsg3, présentent un retard de croissance lié à des lésions
oropharyngées semblables à celle observées au cours du pemphigus et gênant
l'alimentation. La présence d'une acantholyse suprabasale et d'une disjonction des
desmosomes a été montrée par l'examen de biopsies muqueuses en histologie standard et
microscopie électronique. La survenue de lésions proches de celles du PV chez la souris
bal (présentant une mutation du gène de la Dsg3 responsable d'un codon stop), constitue
une autre preuve du rôle de cette protéine desmosomale dans l'adhésion
interkératinocytaire [Montagutelli, 1997]. Les mécanismes par lesquels les autoAc
perturbent la fonction d'adhésion des Dsg restent controversés. Certaines théories font
intervenir un blocage direct de la fonction adhésive des Dsg par les Ac. D’’autres
suggèrent que l’acantholyse résulterait de la transduction de signaux cellulaires initiée
par la fixation des autoAc.
1/ INHIBITION DE LA FONCTION D’ADHESION DES DESMOGLEINES
De nombreux arguments sont en faveur d'une altération spécifique des fonctions
adhésives de la Dsg1 et de la Dsg3 par les Ac correspondants. En effet, une stricte
corrélation entre la spécificité des Ac transférés au souriceau nouveau-né (Ac anti-Dsg3
et/ou anti-Dsg1) et le phénotype clinique et histologique de la maladie développée par
l'animal a pu être montrée [Mahoney, 1999a] (Figure 20). Chez les patients atteints de PV,
la présence d'Ac anti-Dsg1 en plus des Ac anti-Dsg3 est corrélée à l'extension des lésions
cutanées [Ding, 1997 ; Ishii, 1997]. Au contraire, les patients n’ayant que des Ac anti-
Dsg3 ont une atteinte muqueuse pure. La topographie des lésions est en accord [Amagai,
1999b] avec la distribution relative de la Dsg1, fortement exprimée au niveau de la peau,
et celle de la Dsg3 fortement exprimée sur toute l'épaisseur de la muqueuse orale et sur
les couches les plus basales de l'épiderme [Amagai, 1996 ; Shirakata, 1998]. Ainsi,
l’acantholyse profonde du PV est-elle souvent la conséquence d’une action combinée d’Ac
dirigés contre la Dsg1 et contre la Dsg3. Les Ac anti-Dsg1 seuls n’entraînent en effet
qu’une acantholyse superficielle puisque la Dsg3, présente dans les couches basales,
compense la perte de la fonction d’adhésion de la Dsg1 induite par les autoAc, tandis que
les Ac anti-Dsg3 seuls peuvent entraîner une perte d'adhésion dans les muqueuses du
fait de l’expression prépondérante de la Dsg3 à ce niveau. La possibilité de compensation
des Dsg entre-elles dans leur fonction d’adhésion cellulaire (théorie dite de la
compensation) a été confirmée par l’étude d’une souris Dsg3-/- transgénique pour la Dsg1
caractérisée par la substitution de la Dsg3 par la Dsg1 [Hanakawa, 2002].
Introduction
- 87 -
Les mécanismes par lesquels les Ac anti-Dsg inhibent l'adhésion
interkératinocytaire ne sont pas précisés. Plusieurs mécanismes sont suggérés : l’Ac
pourrait agir par un simple masquage du site d'interaction entre les Dsg au niveau de la
desmoglie ou au niveau du site d’interaction entre Dsg et plaque desmosomale en mimant
des séquences situées sur l’extrémité C-terminale des desmogléines [Gilbert, 1997]. Cette
hypothèse de l’inhibition de la fonction d’adhésion des Dsg par les autoAc est sujette à
controverse. En effet, une récente étude in vitro a montré que les IgG purifiées à partir du
sérum de PF causent la dissociation de kératinocytes humains en culture sans inhiber les
interactions des Dsg1 entre-elles par encombrement stérique mais par un autre
mécanisme, très certainement lié au déclenchement de signaux cellulaires par les autoAc
[Waschke, 2005].
2/ TRANSDUCTION DE SIGNAUX CELLULAIRES
Activation de protéases
Une des hypothèses permettant d'expliquer l'acantholyse induite par les autoAc au
cours du pemphigus repose sur la sécrétion par les kératinocytes d'activateurs de
protéases responsables de la dégradation des glycoprotéines de la desmoglie. Cette
hypothèse est fondée sur la mise en évidence d'une activité protéasique et d'une sécrétion
d'activateur du plasminogène par des kératinocytes en culture lors de l'adjonction d'Ac
purifiés à partir du sérum de patients atteints de pemphigus [Hashimoto, 1983]. Une
activité protéasique a également été mise en évidence in vivo dans les liquides de bulles
prélevés chez des malades atteints de pemphigus. Le principal activateur sécrété est de
type urokinase [Hashimoto, 1983]. Il a été montré que les Ac stimulent l'expression à la
surface des kératinocytes du récepteur de l'activateur du plasminogène [Seishima, 1997].
L'activation du plasminogène entraîne la production de plasmine, enzyme protéolytique
capable de digérer les protéines de la desmoglie [Schaefer, 1996 ; Xue, 1998]. Par ailleurs,
des inhibiteurs de protéases et de l’urokinase (anticorps anti-urokinase, acide
traxénomique, phoshatidylinositol phospholipase) sont capables d'inhiber l'acantholyse
induite par les Ac de PV dans différents modèles expérimentaux de PV (souriceau
BALB/c, culture de peau humaine, lignée carcinomateuse DJM-1) [Asano, 2001]. De la
même façon, l'adjonction de plasminogène sur des cultures de peau humaine est capable
de majorer l'acantholyse induite par ces Ac. Enfin, les kératinocytes sont capables de
sécréter deux inhibiteurs de l'activateur du plasminogène (dont l'un peut prévenir
l'acantholyse induite par les IgG de pemphigus) qui interviendraient dans la régulation de
l'activité protéasique induite par le kératinocyte.
Par ailleurs, la fixation des Ac de PV à la surface des kératinocytes induit
l'activation de signaux de transduction intracellulaire pouvant être à l'origine de
l'augmentation d'activité du plasminogène. En effet, sur des kératinocytes en culture, les
Introduction
- 88 -
anticorps de PV et de PF induisent de façon spécifique une augmentation de la
concentration intracellulaire en Ca2+ faisant suite à une augmentation de l'inositol 1,4,5-
triphosphate (IP3) [Seishima, 1995] secondaire à l'hydrolyse de l'inositol biphosphate par
la phospholipase C [Esaki, 1995]. Les Ac de PV sont également capables d'induire une
activation de la Protéine Kinase C (PKC) [Kitajima, 1999 ; Osada, 1997]. L’implication de
la transduction de ces signaux intracellulaires a par ailleurs fait l’objet d’une confirmation
récente [Sanchez-Carpintero, 2004]. Or l'activation de la PKC est capable d’induire une
augmentation d'activité des activateurs du plasminogène et l'expression de son récepteur.
Il est donc proposé que l'activation du kératinocyte par les autoAc aboutit à la sécrétion
d'activateurs du plasminogène [Kitajima, 1999]. Un certain nombre de données
expérimentales sont cependant en contradiction avec le rôle du plasminogène dans
l'acantholyse. En effet, l’augmentation de l'activateur du plasminogène est peu spécifique
et a été rapportée dans d'autres lésions cutanées dépourvues d'acantholyse. Par ailleurs,
une étude utilisant la microscopie confocale, l’immunomicroscopie électronique et la
technique FOAM (Fluorescent overlay antigen mapping) a montré que la dégradation
protéolytique des desmosomes est un phénomène secondaire survenant sur des
desmosomes déjà dissociés [Kowalewski, 2001]. Enfin, la démonstration que le système
plasminogène-plasmine, n'est pas nécessaire à l'acantholyse a été fournie par Mahoney et
al qui ont montré qu'un souriceau nouveau-né invalidé pour le gène de l'urokinase
développe des lésions de pemphigus similaires à celles d’une souris normale après
transfert passif d'autoAc de PV et de PF [Mahoney, 1999b]. Ainsi, le système
plasminogène-plasmine pourrait n'intervenir que secondairement dans l’acantholyse et
jouer un rôle uniquement dans l'extension des lésions.
Enfin, une étude récente montre que le système kinine est activé au niveau
systémique chez les patients atteints de pemphigus endémique brésilien conduisant
notamment au relargage de l’activateur tissulaire du plasminogène ou encore à la
synthèse de cytokines proinflammatoires (TNFα, IL1 et IL6). Il est donc possible que les
enzymes impliquées dans ce système i.e., les kallikréines, puissent participer à la
formation des lésions bien que cette activation enzymatique puisse aussi refléter un
« réflexe » à l’inflammation cutanée [Rosatelli, 2005].
Phosphorylation des protéines desmosomales et désorganisation du desmosome
Des données récentes permettent de proposer un autre mécanisme lésionnel des
autoAc : la fixation des Ac de PV à la surface des kératinocytes induirait une
phosphorylation de la Dsg3 [Aoyama, 1999a] qui pourrait induire la dissociation de la
Dsg3 et de la PG. Une première étude d’analyse du transcriptome de kératinocytes en
culture en présence d’IgG de PV montre que la fixation des Ac à leurs cibles entraîne la
Introduction
- 89 -
diminution de la transcription de 198 gènes notamment des protéines d’adhésion
desmosomales (Dsg3, PER, DP) et l’augmentation de la transcription de 31 gènes dont
celui de la collagénase. Ces travaux ont confirmé la phosphorylation autoAc dépendante
de certaines molécules d’adhésion particulièrement la Dsg3 (niveau de phosphorylation
augmentée de 300%) [Nguyen, 2004]. Par ailleurs, l’induction d’une acantholyse induite
par les IgG de PV est impossible quant les kératinocytes en culture proviennent
d’embryons de souris PG-/- et est restaurée après transfection des kératinocytes PG-/- par
le gène de la PG [Caldelari, 2001]. La PG ayant un rôle de signalisation dans les
phénomènes de prolifération/différentiation au niveau des épithéliums, il est proposé que
les Ac de pemphigus agissent en altérant les mécanismes de différenciation cellulaire à
l’origine de la constitution des desmosomes. Ainsi, les Ac anti-Dsg3 n’induiraient-ils pas
une dissociation des desmosomes déjà formés, mais la formation de desmosomes
anormaux dépourvus de Dsg3 comme cela a été montré sur une lignée cellulaire
carcinomateuse (DJM-1) [Aoyama, 1999b]. La déplétion des desmosomes en Dsg3
pourrait être liée à la fixation des Ac sur des regroupements de Dsg3 exprimés à la
membrane cellulaire avant leur intégration dans le desmosome en induisant leur
internalisation dans la cellule [Sato, 2000]. Enfin, plusieurs travaux semblent indiquer
que les Ac ne cliveraient pas les desmosomes déjà formés mais perturberaient les
mécanismes cellulaires conduisant à la formation et au renouvellement des desmosomes
[Kitajima, 1999 ; Ishii, 2001a ; Cirillo, 2006].
Une étude récente montre l’intervention d’une nouvelle cascade d’événements
moléculaires mise en jeu par la fixation des Ac anti-Dsg3 : une augmentation du
recyclage de la Dsg3 et de la PG exprimées à la membrane kératinocytaire qui aboutit à
un appauvrissement de la réserve nucléaire en PG ; l’abrogation de la suppression de c-
Myc médiée par la PG requise pour le maintien des cellules souches de l’épiderme dans
leur niche et le contrôle de la différenciation kératinocytaire. Ainsi, les Ac anti-Dsg3
induisent-ils, par l’intermédiaire de la PG, la surexpression kératinocytaire de c-Myc qui
est impliqué dans l’affaiblissement de l’adhésion interkératinocytaire [Williamson, 2006].
L’implication des autoAc de pemphigus dans le désassemblage du complexe
desmosomal a été confirmée. La fixation des IgG purifiées des malades de PV aux
kératinocytes en culture entraîne un affaiblissement de l’adhésion interkératinocytaire dû
à une dissociation des desmosomes. Les complexes IgG/Dsg3 en association avec la PG
sont rapidement internalisés à partir de la surface cellulaire et transportés jusqu’aux
compartiments endosomiaux et lysosomiaux. Cette endocytose de la Dsg3 coïncide avec
une rétraction du réseau de filaments de kératine [Calkins, 2006]. Les auteurs émettent
l’hypothèse de l’intervention de la PG dans l’internalisation des cadhérines desmosomales
médiée par les autoAc. Toutefois, il faut indiquer que les modifications du cytosquelette
Introduction
- 90 -
de kératine associée à la séparation de 2 demi desmosomes n’est pas une résultante
absolue de l’action des Ac anti-Dsg3 comme ont pu le démontrer in vivo Shimazu et al. En
effet, l’acantholyse Ac dépendante impliquée dans le modèle murin de PV n’est pas
caractérisée par la rétraction des filaments de kératine [Shimizu, 2004].
Certains mécanismes d’activation de la voie de signalisation desmosomale induite
par les Ac anti-Dsg3 ont été mis en lumière. En effet, les protéines Hsp27 (Heat shock
protein 27) et p38MAPK (p38 mitogen activating protein kinase) sont rapidement
phosphorylées en réponse à la fixation des IgG anti-Dsg3 à leur cible. L’inhibition de
l’activité de la p38MAPK prévient plusieurs effets de l’action des Ac anti-Dsg3 : la
phosphorylation d’Hsp27, la rétraction des filaments de kératine et la réorganisation du
réseau d’actine. L’hypothèse soulevée pour expliquer ces résultats est une cascade de
signaux cellulaires qui se déroule de la manière suivante : (i) la fixation des autoAc à la
Dsg3 provoque la phosphorylation de la p38MAKP ; (ii) cette dernière phosphoryle à son
tour la kinase MAPKAP2 (MAP kinase activated protein kinase 2) ; (iii) la MAPKAP2
phosphorylée active la protéine Hsp27 par phosphorylation ; (iv) l’Hsp27 phosphorylée
entraîne la réorganisation des filaments de kératine et d’actine [Berkowitz, 2005].
Les récepteurs à l’acétylcholine et l’immunopharmacologie du pemphigus [Grando,
2000] (Figure 22)
Les données obtenues par l’équipe de Grando sur la réactivité des autoAc anti-
récepteur de l’ACh ont permis à ces auteurs d’émettre une théorie sur son rôle dans la
physiopathologie du pemphigus. Les relations potentielles entre les Ac du pemphigus et
les voies de signalisation cellulaire de l’Ach et des glucocorticoïdes sont illustrées dans la
figure 23. L’action immunopharmacologique des Ac de pemphigus pourrait résider dans
une altération de la régulation du développement et de l’adhésion kératinocytaire médiée
par l’Ach (via la pemphaxine par exemple). En effet, l’Ach est un messager qui utilise
différentes protéines kinases dont l’activité peut moduler de façon immédiate ou retardée
les propriétés adhésives des kératinocytes. L’acantholyse résulterait des effets cumulatifs
et synergiques des autoAc dirigés contre des Ag membranaires du kératinocyte : des
molécules régulatrices du développement et de l’adhésion (i.e. les récepteurs à l’Ach) et
des molécules d’adhésion cellulaire (i.e. les cadhérines desmosomales).
Plusieurs arguments soulignent l’action stimulatrice des glucocorticoïdes sur l’axe
de signalisation de l’Ach telle que l’augmentation de l’expression kératinocytaire de la
pemphaxine par la méthylprédnisolone. Ainsi, cette capacité des glucocorticoïdes pourrait
expliquer leur effet anti-acantholytique observé in vitro sur des cultures d’explant de peau
humaine. A cet égard, l’analyse du transcriptome de kératinocytes traités par la
méthylprénisolone montre que cette molécule a des effets réciproques par rapport à ceux
Introduction
- 91 -
induits par les IgG de malades atteints de PV : elle augmente l’expression de 14 gènes
codant pour des protéines impliquées dans l’adhésion cellulaire, la régulation du cycle
cellulaire et l’apoptose ainsi que pour des marqueurs de différenciation. La
méthylprénisolone bloque l’effet acantholytique des IgG de PV et abolit la phosphorylation
des molécules d’adhésion comme la Dsg3 induite par ces autoAc. Par ailleurs, les
analyses par immunoempreinte montrent qu’elle augmente l’expression des cadhérines E
(235%), de la Dsg1 (228%) et de la Dsg3 (148%) [Nguyen, 2004].
Figure 22. Immunopharmacologie du pemphigus. Ce schéma illustre les mécanismes biochimiques intracellulaires potentiellement impliqués dans les effets acantholytiques des autoAc du pemphigus et des effets anti-acantholytiques des glucocorticoïdes (GS) et des cholinomimétiques. ACh, acétylcholine ; AChR, récepteurs à l’ACh ; Dsg, desmogléines ; Gp, protéine G ; IP3, inositol triphsphate ; PX, pemphaxine.
PX αααα9
AChR
ACh
R-Gp
cAMP
Ca2+
IP3
cGMP
Second messagers Influx
Ionique
KINASES
Phosphorylation de protéines
Expression de gènes
GS
Dsg1
Dsg3
Synthèse d’Ach Expression d’AChR
Assemblage/Désassemblage des desmosomes et du cytosquelette
Modulation de l’expression/fonctions
de l’ACh
AGGREGATION
Introduction
- 92 -
3/ APOPTOSE KERATINOCYTAIRE
Le déclenchement de l'apoptose kératinocytaire induite par les autoAc anti-Dsg
est un mécanisme lésionnel suspecté dans le processus acantholytique [Milner, 1999]. Il
a été montré que la plupart des kératinocytes de la couche suprabasale de la peau
périlésionnelle d'un patient atteint de PV sont en voie d'apoptose. Le sérum du malade est
caractérisé par une concentration élevée en ligand de la molécule Fas et provoque
l'apoptose de kératinocytes normaux en culture par un mécanisme dépendant de
l'activation de la caspase 8 [Puviani, 2003]. In vitro, quand les cultures de kératinocytes
HaCaT sont traitées avec les IgG isolées d'un patient atteint de PV (de type
cutanéomuqueux) et dirigées contre la Dsg3, la Dsg1 et la PG, une acantholyse des
kératinocytes est observée, associée à une augmentation de l'apoptose. Ce processus
apoptotique est caractérisé par une activation de la caspase 3, une diminution de
l'expression de Bcl-2 et une augmentation de celle de Bax [Pelacho, 2004]. Ces résultats
ont été étayés par la démonstration que l'apoptose des kératinocytes observée au niveau
des lésions de PV survient préalablement à l'acantholyse et que les IgG des malades
atteints de PV (Ac : Dsg3+ Dsg1+/-) induisent l'apoptose des kératinocytes normaux et des
lignées de kératinocytes HaCaT et A431. Cette apoptose des kératinocytes en culture est
caractérisée par : (i) une sécrétion du ligand de Fas (FasL) soluble dans le milieu de
culture ; (ii) une concentration intracellulaire augmentée en molécules Fas et FasL
(soluble et membranaire) et en protéines pro-apoptotiques p53 et Bax, ainsi qu’une
diminution de l'expression de Bcl-2 ; (iii) un enrichissement de ces cellules en caspase 8
et une activation des caspases 1 et 3 ; (iv) une agrégation des molécules Fas et FasL avec
la caspase 8 aboutissant à la formation du complexe DISC (Death-inducing signaling
complex) à la surface kératinocytaire [Wang, 2004b]. Par ailleurs, cette mort
kératinocytaire induite par les IgG anti-Dsg3/Dsg1 et dépendante de Fas est exacerbée
dans les cultures de kératinocytes sénescents suggérant que la fréquence et la sévérité de
la maladie observées chez les sujets âgés sont corrélées à une susceptibilité accrue à ce
processus apoptotique [Wang, 2004c]. Enfin, l’incubation de kératinocytes humains avec
le captopril, un inhibiteur de l’enzyme ACE (Angiotensin-converting enzyme) utilisé comme
anti-hypertenseur et capable d’induire un pemphigus de type médicamenteux, provoque
une apoptose similaire à celle observée avec le sérum de patient atteint de PV aboutissant
in fine, à une surexpression de la protéine de choc thermique Hsp70 et de l’enzyme iNOS
(surproduction de monoxyde d’azote) ainsi qu’à une inhibition de la transglutaminase
kératinocytaire [Baroni, 2004]. L’ensemble de ces données plaide en faveur du rôle
apoptotique des IgG dirigées contre des Dsg et de la participation de ce phénomène de
mort cellulaire programmée à la perte de l’adhésion interkératinocytaire à l’origine des
pemphigus et laisse entrevoir la possibilité d’un développement thérapeutique. A ce
Introduction
- 93 -
propos, l’équipe de Grando a découvert un nouveau mode d’action des immunoglobulines
intraveineuses (IgIV) utilisées pour le traitement des pemphigus qui passerait par
l’augmentation de l’expression de 2 inhibiteurs de l’apoptose : les protéines FLIP (FLICE
inhibitory protein) et calpastatine qui inhibent respectivement l’activité des caspases et de
la calpaïne [Arredondo, 2005].
IV. GENETIQUE DES PEMPHIGUS
A- L’association au locus HLA
Plusieurs arguments font suspecter une susceptibilité génétique à la maladie. Des
cas de pemphigus familiaux, bien que rares, ont été décrits [Revenga-Arranz, 1996]. Des
autoAc sont trouvés dans 40 à 70% des cas dans le sérum des collatéraux de patients
atteints de pemphigus [Brandsen, 1997]. La transmission de ce phénotype partiel est
fortement liée à la transmission des haplotypes HLA de susceptibilité au PV [Ahmed,
1993]. La différence entre patients et collatéraux réside dans le titre des autoAc qui est
plus faible chez les apparentés indemnes, et dans leur isotype IgG4 qui n’est jamais
observé chez les apparentés [Ahmed, 1993; Brandsen, 1997; Kricheli, 2000]. Ces
résultats évoquent l’intervention de facteurs génétiques de transmission mendélienne, et
plus particulièrement du CMH, dans la capacité à produire des autoAc non pathogènes,
alors que d’autres facteurs, génétiques ou environnementaux, seraient nécessaires au
passage vers la pathogénicité (commutation de classe vers les IgG4, augmentation du titre
des autoAc). Par ailleurs, le PV est plus fréquent dans certains groupes ethniques, en
particulier chez les juifs ashkénazes [Simon, 1980]. En Afrique du Sud, la répartition du
PV et du PF est très différente en fonction de l’origine ethnique (80% des patients atteints
de PV sont d’origine indienne et 80% des patients atteints de PF sont noirs) [Aboobaker,
2001]. Le pemphigus endémique brésilien (fogo selvagem) sévit avec une fréquence très
augmentée dans certaines régions d'Amérique du Sud [Diaz, 1989] et illustre le double
rôle de l’environnement et de la génétique dans le déterminisme de la maladie, puisque
plus de la moitié des personnes vivant en zone d’endémie serait porteuse d’Ac non
pathogènes et que la maladie ne se développerait que chez les sujets porteurs des gènes
HLA de susceptibilité [Warren, 2000]. Enfin, l'argument déterminant repose sur la forte
association entre le pemphigus et certains Ag du complexe majeur d'histocompatibilité
essentiellement de classe II [Ahmed, 1990 ; Ahmed, 1991]. Cette association du PV à
certains allèles HLA de classe II a été révélée en 1980 puis constamment confirmée par
des études réalisées dans différentes ethnies (Tableau 14). La démonstration de
l’association du PS avec les allèles HLA de classe II est plus récente et a été faite dans les
formes sporadique et endémique de la maladie (Tableau 15).
Introduction
- 94 -
Tableau 14. Allèles HLA de susceptibilité au pemphigus vulgaire
n Populations
Contrôles Patients
Allèles
Caucasoïdes
Juifs
ashkénazes
26
DR4, DQw8
Français 106 37 DRB1*0402, 1401; DQB1*0302; 0503
Indiens 89 37 DRB1*1404 ; DRB1*0202; DQA1*0101;
DQB1*0503
Italiens 128 61 DRB1*0402, DRB1*1401; DQB1*0503
Sardes – 16 DRB1*0402; DQA1*0301 ; DQB1*0302
Pakistanais – 19 DRB1*1404; DQA1*0101; DQB1*0503
Espagnols 200 26 DRB1*0402, 1401; DQB1*0503, 0302
Américains 44 38 DR4
Mongoloïdes
Japonais
525 55 DRB1*0403, 0406; DRB1*1401, 1405, 1406
Tableau 15. Allèles HLA de susceptibilité au pemphigus superficiel
n
Populations
Controles Patients
Allèles
PS sporadique
Français 106 20 DRB1*0404 ; DRB1*0102
Italiens 128 26 DRB1*04 ; DRB1*1404 ; DQB1*0503
Japonais 525 7 DRB1*04 ; DRB1*0403, *0406
DRB1*14; DRB1*1401, *1405, *1406
PS endémique
Brésiliens 182 147 DRB1*0101, *0102, *0103 ;
DRB1*0404, *0406, *0410 ;
DRB1*1406, *1601
50 38 DRB1*0102
Tunisiens 100 28 DR4
Introduction
- 95 -
Certains gènes HLA de classe I ont été décrits avec une plus grande fréquence chez
les patients atteints de pemphigus. Ainsi, la fréquence des Ag HLA-A10 et de son sous-
type A26 est-elle augmentée chez les patients d'origine juive et japonaise, atteints de
pemphigus vulgaire ou foliacé. Chez les malades d’origine espagnole, la fréquence du
sous-type HLA-B28 est significativement augmentée [Gonzales-Escribano, 1998]. Par
ailleurs, les ADN de patients juifs et de sujets sains porteurs des allèles de susceptibilité
au PV à l’aide de marqueurs « microsatellite » recouvrants la totalité du locus du CMH ont
été analysés. Quatre allèles localisés dans une région HLA de classe I proche du locus
HLA-A ont été identifiés comme associés à la maladie [Slomov, 2003]. Une étude plus
approfondie utilisant 26 marqueurs SNP (couvrant une région chromosomique de 6.105
pb) révèle que les 4 marqueurs informatifs sont localisés dans le gène HLA-G [Gazit,
2004]. En particulier, un variant allélique correspondant à une insertion/délétion de 14
pb dans l’exon 8 de ce gène est associé à la maladie. Chez la majorité des patients
(porteurs de la délétion), la perte du fragment de 14 pb, que l’on sait être corrélée à une
augmentation de la stabilité des ARNm HLA-G, pourrait conduire à une surexpression de
ces molécules et in fine à une rupture de la tolérance vis à vis des Ag du soi.
Cependant, ce sont les gènes HLA de classe II qui semblent être le plus associés à
la maladie. En effet, il a été montré dans différents groupes ethniques que les génériques
DR4 et DR14 qui sont en déséquilibre de liaison avec respectivement les allèles
DQB1*0302 et DQB1*0503, constituent des facteurs de prédisposition à la maladie.
L'allèle DRB1*0402 (un des allèles DR4) est le principal allèle de susceptibilité au PV
retrouvé chez les Juifs ashkénazes (92%), et dans d'autres populations comme les
Américains non juifs, les Iraniens (85%), les Italiens (33%), les Espagnols et les Sardes
(81%). Au Japon, d'autres allèles DR4 ont été trouvés en association avec le PV
(DRB1*0403, *0404 et *0406). Pour les populations non juives, ce sont DR14
(DRB1*1401 et *1404) qui apparaissent comme les principaux allèles de susceptibilité
comme cela a été montré chez les Américains caucasiens non juifs, chez les Européens,
les Italiens, les Sardes, les Indiens et les Pakistanais. Dans les études japonaises, 2
autres allèles DR14, DRB1*1405 et *1406, sont associés au PV et montrent aussi le rôle
de prédisposition de DRB1*1401 [Ahmed, 1990 ; Ahmed, 1991 ; Yamashina, 1998].
L'association au locus HLA de classe II est aussi établie pour les PS notamment le
pemphigus endémique brésilien où un allèle DR1 ainsi que des allèles DR4 et DR14 sont
incriminés. En effet des études réalisées au Brésil au sein de populations non
amérindiennes et de différentes tribus indiennes ont permis d'identifier DRB1*0102,
DRB1*0404 et DRB1*1402 et 1406 comme les allèles de susceptibilité à la maladie
[Moraes, 1997 ; Hans-Filho, 1999]. Récemment, une large étude cas-témoins menée au
Introduction
- 96 -
sein de la population brésilienne a révélé le rôle des interactions alléliques dans la
susceptibilité/résistance à la maladie. Celle-ci confirme les associations positives déjà
connues, met en évidence d’autres allèles de susceptibilité (DRB1*0101, *0103; DRB1
*0410 et DRB1 *1601) et indique que certains allèles confèrent la protection (DRB1*0301;
DRB1*0701; DRB1*0801; DRB1*1101, *1104 et DRB1*1402). Les allèles de
susceptibilité sont semi-dominants par rapport aux allèles neutres et, les allèles
protecteurs semi-dominants par rapport aux allèles susceptibles et dominants par
rapport aux allèles neutres [Pavoni, 2003]. Cette étude met donc l’accent sur le rôle
crucial des gènes HLA-DRB1 dans la modulation de la susceptibilité et de la protection
au pemphigus. Trois études concernent la forme sporadique de PS. De l’étude réalisée en
France [Loiseau, 2000], il ressort une association avec deux des allèles de susceptibilité
au fogo selvagem : DRB1*0102 et DRB1*0404. Des études réalisées en Italie [Lombardi,
1999] et au Japon [Miyagawa, 1999b], il ressort une association avec des allèles
précédemment décrits en association avec le PV : DRB1*0402 et DRB1*1401 en Italie,
DRB1*0406 et DRB1*1401 au Japon. Concernant le pemphigus tunisien, des études
préliminaires montrent une association avec l’haplotype DR4. Certaines de ces études
mettent en exergue le rôle protecteur de certains allèles HLA de classe II tels que DRβ1*13
et DRβ1*07 respectivement chez les malades espagnols [Gonzales-Escribano, 1998] et
italiens [Lombardi, 1996].
Le locus HLA de classe II est aussi impliqué dans le déterminisme génétique d’une
troisième forme de pemphigus, le PPN. En effet, notre groupe a démontré que l’allèle
DRB1*03 est significativement augmenté chez les malades (61,5%) comparés aux sujets
contrôles (21%), aux malades atteints de PV (3%) et de PF (6%,). Il est intéressant de
remarquer que les génériques DR4 et DR14 qui sont associés aux PS et au PV ne sont
pas impliqués dans la susceptibilité génétique au PPN. Une hypothèse séduisante est que
chez les malades, les molécules HLA DRB1*03 pourraient permettre la présentation de
peptides dérivés des protéines de la famille plakines aux cellules T autoréactives [Martel,
2003].
L'association entre HLA et MAI ne relève pas d'un mécanisme univoque puisqu'elle
peut rendre compte du rôle propre des molécules HLA mais aussi d'un autre gène de
susceptibilité en déséquilibre de liaison avec les gènes du CMH. De plus, le déséquilibre
de liaison entre les gènes HLA de classe II eux-mêmes, et particulièrement entre les locus
DR et DQ, ne permet pas, à la vue des seules études d'association de déterminer quel
allèle est responsable de la susceptibilité. Les études fonctionnelles de prolifération vis à
vis de l'autoAg s'avèrent ici particulièrement informatives, puisqu'en testant la
prolifération des lymphocytes T de patients dans différents contextes HLA de classe II,
elles permettent d'étudier le rôle des molécules de prédisposition dans la présentation de
Introduction
- 97 -
l'autoAg aux lymphocytes T autoréactifs. Les résultats de ces études plaident en faveur
du rôle direct des molécules DR de susceptibilité dans la présentation de l'autoAg.
Wucherpfennig et al ont été les premiers à montrer que la prolifération des lymphocytes T
provenant de patients atteints de PV est restreinte par la molécule DRB1*0402
[Wucherpfennig, 1995]. Lin et al ont confirmé ce résultat et montré une restriction par la
molécule DRB1*1401 et une absence de restriction par les molécules DQ ou DP [Lin,
1997]. Hertl et al ont quant à eux montré que si DRB1*0402 est capable de restreindre la
réponse T chez certains patients, des allèles ayant une séquence proche mais
appartenant au groupe DR11 ainsi que l'allèle DQB1*0301 peuvent également présenter
des peptides de Dsg3 aux lymphocytes T [Hertl, 1998a]. Ces auteurs ont démontré que la
reconnaissance de peptides de la Dsg3 par les clones T spécifiques isolés chez les patients
atteints de PV et chez les sujets sains porteurs des allèles de susceptibilité au PV est
restreinte par les molécules HLA DRB1*0402 et/ou DQB1*0503 [Hertl, 1998b ; Veldman,
2004b]. La totalité des peptides identifiés dans l’étude comporte des résidus aminoacides
conservés en position 1, 4 et 6 avec un aminoacide de charge positif (Arginine ou Lysine)
en position 4 qui constitue potentiellement un motif d’ancrage aux molécules DRB1*0402
[Veldman, 2004b]. La réactivité lymphocytaire T dirigée contre les différents épitopes de la
Dsg3 est restreinte par les molécules HLA de classe II et est indépendante du
développement de la maladie puisqu’elle est aussi présente chez les sujets sains. Enfin,
dans le PS endémique, la réponse proliférative T est restreinte par les molécules HLA-DR
[Lin, 2000].
D'autres arguments plaidant en faveur du rôle direct des gènes HLA de classe II de
susceptibilité proviennent de l'analyse des différentes molécules HLA impliquées dans le
PV. En effet, ces molécules partagent des caractéristiques structurales, en particulier, des
résidus conservés au niveau des positions de la poche HLA impliquées dans la liaison
peptidique. Ces résidus sont retrouvés en position 26, 67, 70, 71 et 86 de la chaîne β de
la molécule DR [Miyagawa, 1999b]. De plus, par des techniques de mutagenèse dirigée, il
a été démontré que la charge négative de la poche P4 de la molécule DRB1*0402, dûe à
un acide glutamique en position β71, est nécessaire à la présentation sélective de
peptides issus de la Dsg3 (Figure 23) [Wucherpfennig, 1995]. Ce concept de propriétés
communes aux allèles HLA de classe II de susceptibilité, a initialement été appliqué au
pemphigus endémique brésilien pour lequel tous les allèles de susceptibilité rapportés
partagent un épitope commun (shared epitope) en position 67-74 de la chaîne β de la
molécule DR. Pris isolément, cet épitope constitue le facteur de susceptibilité le plus
significatif à la maladie [Moraes, 1997].
Introduction
- 98 -
Figure 23. Position des résidus polymorphiques de la chaîne ββββ dans la poche d’ancrage des peptides de la molécule HLA-DR. Dans la molécule DRβ1*0402, les résidus DRβ 70 et 71 possèdent une charge négative et sont localisés dans poche P4 (cercle pointillé). La molécule DRβ1*0402 ainsi que la molécule apparentée *0414 sont les seuls allèles DR4 à avoir des résidus DRβ 70 et 71 à charge négative dans la poche P4 qui sont très certainement responsables de la fixation de peptides provenant de la Dsg3. Tous les autres sous-types DR4 ont une charge positive à la position DRβ71.
Si les gènes HLA semblent jouer un rôle significatif dans la susceptibilité au
pemphigus, ils n'expliquent vraisemblablement pas à eux seuls le déterminisme de la
maladie. En effet, il a été montré que des sujets sains ainsi que des collatéraux de
patients atteints de PV, et portant les allèles HLA de susceptibilité ont des anticorps anti-
SIC détectables en IFD et en IFI à un titre cependant plus faible que chez les malades
[Mohimen, 1993] ainsi que des lymphocytes T sanguins dirigés contre la Dsg3, sans
présenter de lésion clinique de pemphigus. D'autres facteurs, génétiques ou
environnementaux sont donc probablement nécessaires à la production d'Ac pathogènes.
Pour ce qui est des facteurs d'environnement, le rôle des médicaments [Ruocco, 1993] (un
certain nombre de médicaments en particulier les thiolés comme la pénicillamine, étant
reconnu comme facteur déclenchant de certains PS : cf. pemphigus médicamenteux), des
virus, de certains aliments (ail), des brûlures ainsi que l'exposition aux UV a été évoqué
dans le déterminisme de la maladie. Des éléments d'explication pourraient venir de
l'étude des différentes associations morbides décrites au cours du pemphigus :
86
74 71
70
67
37
57
Introduction
- 99 -
association entre pemphigus et d'autres MAI (en particulier myasthénie, lupus et PR),
association entre pemphigus et cancers (thymomes et syndrome lymphoprolifératifs)
[Udey, 1999]. L’expression anormale (qualitativement ou quantitativement) au niveau des
cellules tumorales et en particulier des lymphocytes B tumoraux au cours des
hémopathies lymphoïdes constitue à cet égard une voie de recherche. Enfin, le modèle du
PS brésilien pourrait se révéler particulièrement informatif. En effet la zone d'endémie
correspond à l'habitat d'une mouche piqueuse (black fly) [Eaton, 1998 ; Sampaio, 1994].
Il a été proposé que le fogo selvagem serait, chez des sujets présentant un terrain
génétique de prédisposition, la conséquence d'une réaction initiée par un mimétisme
moléculaire entre un agent infectieux transmis par l'insecte et la Dsg1 (cf facteurs
environnementaux des pemphigus). La forte incidence des Ac anti-Dsg1 (55% de la
population) et celle plus faible des Ac anti-Dsg3 (36% de la population) trouvée dans la
population générale vivant en zone d’endémie, alors que la maladie ne se développe que
chez les sujets porteurs des haplotypes HLA de susceptibilité, parait compatible avec cette
hypothèse [Warren, 2000 ; Hilario-Vargas, 2006].
B- Le polymorphisme génique des desmogléines
La description d’un polymorphisme du gène DSG1 chez le bovin [Puttagunta,
1994], nous a incité à examiner la possibilité du rôle d’un variant polymorphique du gène
codant la Dsg1 humaine dans le déterminisme génétique de la maladie. Nous avons
d'abord mis en évidence un polymorphisme du gène DSG1, localisé sur l’exon 7 qui code
avec les exons 5 et 6 pour le domaine EC2 de la protéine (Figure 12). Ce polymorphisme
consiste en un SNP en position 809 (substitution d’une thymine par une cytosine). Par
une approche de type gène candidat et dans une étude cas-contrôles portant sur 31
patients français atteints de PF et 84 contrôles, il a été observé que la maladie est
associée à l’allèle C (809) et de façon plus spécifique, au génotype 809 homozygote (C/C)
(Figure 24A) [Martel, 2001b]. Nous avons retrouvé cette association chez les malades
tunisiens (n=49), chez lesquels il existe une augmentation significative de la fréquence du
génotype C/C (809) comparée aux témoins (42,9% vs 22%). Ainsi, le génotype C/C du
SNP (809) identifié comme facteur de susceptibilité au PF en France, intervient-il
également dans la susceptibilité au pemphigus endémique tunisien [Ben Ayed, 2002]. La
distribution de ce variant allélique a aussi été comparée entre 134 patients atteints de
pemphigus brésilien et 227 sujets contrôles. Bien qu’une tendance vers une
augmentation de la fréquence du SNP (809) (p=0.078) et du génotype C/C 809 soit
observée chez les malades, la différence n’est pas statistiquement significative suggérant
que ce polymorphisme de la Dsg1 n’intervient probablement pas dans le déterminisme
génétique du fogo selvagem [Petz-Erler, 2005].
Introduction
- 100 -
Figure 24. Distribution génotypique du SNP 809 et de la combinaison DR4/SNP809 C/C chez les malades atteints de pemphigus foliacé et chez les sujets sains. Le diagramme A représente la distribution génotypique du SNP 809 chez les malades caucasiens (n=31) atteints de PF et les sujets sains caucasiens (n=84). La fréquence du SNP 809 à l’état homozygote (C/C) apparaît augmentée chez les patients (41,9%) par rapport aux contrôles (20,2%) (p=0,03). Ce marqueur polymorphe est donc associé au PF. Le diagramme B montre la distribution de la combinaison DR4/SNP809 C/C chez les patients atteints de PF (n=31) et chez des sujets sains (n=84) et indique que cette combinaison génétique est un facteur de risque à la maladie (p=1.10-4).
Comme précédemment cité, les génériques DR4 et DR14 sont associés au PS.
Soixante quatorze pour-cent des patients portent au moins un de ces allèles contre
seulement 38,1% des témoins. Notre analyse de la distribution relative des facteurs de
risque DRB1*04 et génotype C/C (809) a montré que ces deux facteurs ne se répartissent
pas, chez les patients, de façon aléatoire l’un par rapport à l’autre. En effet, la
116
20
78
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
PF Sujets sains
DR4 et SNP 809 C/C Non DR4 et SNP 809 C/C
13
17
14
46
214
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PF Sujets sains
SNP 809 T/T
SNP 809 C/TSNP 809 C/C
A
B
Introduction
- 101 -
comparaison des risques relatifs conférés par ces facteurs et une étude statistique par
régression logistique ont démontré une interaction synergique dite épistatique entre ces
deux facteurs de risque et que leur combinaison augmente de manière significativement
plus forte l’association à la maladie (Figure 24B) [Martel, 2001b]. Cette interaction
épistatique est donc une combinaison des deux facteurs de risques, l’allèle DRB1*04 et le
génotype C/C (809), qui fournit le plus fort facteur de prédisposition à la maladie
comparé au risque conféré par chacun des facteurs pris individuellement. Dans l’état
actuel de nos connaissances, rien ne permet d’affirmer que ce SNP est fonctionnel et qu’il
n’exerce pas son rôle de prédisposition en raison d’un déséquilibre de liaison avec un
autre polymorphisme situé sur le gène DSG1 (sur une région codante ou sur une région
régulatrice), voire sur un gène proche. Cependant, de façon intéressante, ce
polymorphisme est situé sur une région codante du gène DSG1, contrairement aux
polymorphismes de l’insuline ou du récepteur à l’ACh impliqués dans le diabète de type 1
et la myasthénie et qui siègent respectivement en 5' du gène INS et sur le premier intron
du gène CHRNA. Cependant, la substitution T/C (809) est une substitution silencieuse si
bien que malgré sa situation sur une région codante, le rôle du SNP (809) ne peut
s’expliquer par une modification directe de la séquence de l’autoAg.
La recherche de polymorphisme sur le gène codant la Dsg3 a établi la présence de
46 SNP sur le gène DSG3. Cinq d’entre eux ont été sélectionnés puis analysés dans une
étude cas-témoins comportant 90 patients atteints de PV dont 62 d’origine nord-
européenne et 28 d’origine nord-indienne et 2 groupes contrôle des mêmes ethnies (154
nord-européens et 98 nord-indiens). Les analyses de la distribution relative des
haplotypes définis par ces 5 marqueurs polymorphes ont montré une association
significative entre l’haplotype DSG3*TCCTC et les malades nord-européens et entre
l’haplotype DSG3*TCCCC et les malades indiens [Capon, 2006].
C- Autres gènes candidats
L’intervention d’autres gènes du locus HLA dans la prédisposition au pemphigus a
été étudiée. La variabilité génétique des gènes du Tumor necrosis factor (TNF) et de la
Lymphotoxin alpha (LTA) localisés dans la région HLA de classe III, a été analysée dans
une étude cas-témoins comprenant une large série de patients atteints de fogo selvagem.
Cependant, aucune association entre un variant polymorphe de ces gènes et la maladie
n’a été mise en évidence indiquant que la variabilité génétique de ces deux cytokines aux
propriétés immunorégulatrices ne participe pas à la susceptibilité/résistance au
pemphigus endémique brésilien [Roxo, 2003]. Toutefois, une étude a montré une
association positive entre un polymorphisme localisé dans le promoteur du gène TNFα et
le PS [Torzecka, 2003]. Aucun polymorphisme des gènes TAP1 et TAP2 localisés dans le
Introduction
- 102 -
locus HLA de classe II et qui codent pour des transporteurs associés à l’apprêtement des
Ag, n’intervient dans la susceptibilité au pemphigus chez les malades japonais [Niizeki,
2004]. Certains gènes de cytokines mises en cause dans la physiopathologie du
pemphigus, ont été étudiés. Un SNP localisé en position 174 du gène IL6 est associé à la
survenue du fogo selvagem : le génotype C/C étant protecteur et l’allèle G prédisposant à
la maladie [Pereira, 2004]. Par ailleurs, cette étude montre qu’ aucun variant
polymorphique des gènes codant pour l’IL1α, l’IL1β, ou leur antagoniste (IL1Ra), l’IL10,
l’IL4 et son récepteur (IL4R) n’est associé à la survenue du PS brésilien.
Il est légitime de concevoir que certains gènes impliqués dans le contrôle des voies
de régulation de la réponse immune puissent participer à la susceptibilité au pemphigus.
Une étude cas-témoins récente a testé cette hypothèse par l’analyse de variants alléliques
de 2 molécules impliquées dans les processus d’apoptose, TP53 et BAX. Néanmoins,
aucune variation allélique et génotypique n’a été mise en évidence entre les patients
atteints de pemphigus brésilien et les sujets contrôles [Kohler, 2006].
Enfin, Pavoni et al ont comparés les fréquences alléliques et génotypiques de 2 SNP
localisés sur le gène CTLA4 entre une cohorte de malades atteints de fogo selavagem
(n=118) et une population de sujets contrôles (n=291). Bien que le polymorphisme
génique de la molécule CTLA4 prédispose à plusieurs MAI, les variations alléliques du
promoteur et l’exon 1 du géne CTLA4 ne sont pas associées à la survenue du fogo
selvagem [Pavoni, 2006].
V. LA REPONSE LYMPHOCYTAIRE T AU COURS DES PEMPHIGUS
Certains auteurs ont montré la présence chez des patients atteints de pemphigus
de clones T circulants capables de reconnaître l'autoAg sous forme recombinante ou
peptidique, c'est à dire la Dsg3 dans le PV et la Dsg1 dans le fogo selvagem [Lin, 1997 ;
Hertl, 1998a ; Hertl, 1998b ; Lin, 2000 ; Nishifuji, 2000]. Ces clones correspondent à des
lymphocytes T CD4+ mémoires sécrétant des cytokines de type Th2 (IL4, IL6 et IL10)
impliquées dans la commutation de classe vers les IgG4, sous-classe principale des Ac
pathogènes dans le pemphigus. L’implication de lymphocytes T CD4+ ayant un profil Th2
a été confirmée par l’étude en immunohistochimie de l’infiltrat cellulaire présent dans des
lésions de PV et de PF [Caproni, 2001 ; Santi, 2001]. La cartographie épitopique T de la
Dsg3 a été entreprise grâce à l'utilisation de peptides synthétiques et de protéines
recombinantes tronquées. De multiples épitopes T ont été identifiés, répartis sur les
segments EC1 à EC5 de la région EC de la desmogléine 3 (Figure 25). L'hypothèse
avancée pour rendre compte de cette diversité est que la réponse T pourrait être initiée
contre un épitope immunodominant et que des phénomènes d’extension épitopique
viendraient secondairement diversifier cette réponse. L'évolution d'une réponse
Introduction
- 103 -
initialement dirigée contre la Dsg3 vers une réponse dirigée à la fois contre la Dsg3 et la
Dsg1 au cours du PV en est une illustration. L’étude de la dichotomie des cellules T anti-
Dsg3 de type Th1 et Th2 chez les patients atteints de PV et chez des sujets sains porteurs
des allèles HLA DRβ1*0402 et DQβ1*0503 montre que : (i) l’expression de ces molécules
HLA de susceptibilité au PV est essentielle pour la reconnaissance des peptides de la
Dsg3 chez les patients et les sujets sains ; (ii) ces derniers ne présentent qu’une réponse
anti-Dsg3 de type Th1 ; (iii) chez les malades, la fréquence des cellules Th1 est augmentée
durant la phase chronique de la maladie ; (iv) l’émergence de cellules Th2 anti-Dsg3 est
restreinte aux malades et fondamentale pour la production des autoAc anti-Dsg3
[Veldman, 2003]. L’association entre la réponse lymphocytaire Th2 anti-Dsg3, la
production d’autoAc et l’activité du PV a été récemment confirmée [Rizzo, 2005]. Les
données de cartographie épitopique de la région EC complète de la Dsg3 montrent que
86% des clones T étudiés (n=97) réagissent avec un nombre limité de peptides. Cinq
peptides localisés sur les domaines EC1 et EC2 sont reconnus à la fois par les clones
isolés chez les patients ou chez les sujets sains porteurs des allèles DRB1*0402 ou
DQB1*0503; deux peptides du domaines du domaine EC3 et un peptide du domaine EC5
sont reconnus par les clones T isolés respectivement chez les patients et chez les sujets
sains (Figure 25). Il est intéressant de noter que la majorité des clones T anti-Dsg3 (47,
4%) réagissent contre le peptide 96-112 de la protéine qui constitue l’épitope
immunodominant de la réponse autoAc au cours de la maladie. Par ailleurs, ces
réactivités sont restreintes par les molécules HLA de prédisposition au PV et aucun
processus d’extension épitopique intramoléculaire ne semble participer à la diversification
de la réponse T puisqu’il n’existe aucune corrélation entre phénotype clinique et
spécificité des peptides reconnus par les clones T anti-Dsg3 [Veldman, 2004b] (Figure 26).
Figure 25. Cartographie épitopique T des domaines extracellulaires de la desmogléine 3. Plusieurs épitopes répartis sur la région extracellulaire de la Dsg3 sont reconnus par les clones lymphocytaires T isolés de patients atteints de PV (orange). L’épitope immunodominant ciblé par la réponse autoAc est indiqué sur le domaine EC1 (vert).
C N EC1 EC2 EC3 EC4 EC5
Dsg3 (78-94)
Dsg3 (96-112)
Dsg3 (189-205)
Dsg3 (205-221)
Dsg3 (250-266)
Dsg3 (342-358)
Dsg3 (376-392)
Dsg3 (483-499)
Introduction
- 104 -
Figure 26. La réponse T au cours du pemphigus vulgaire. La production d’autoAc anti-Dsg par les cellules B autoréactives est probablement régulée par des lymphocytes T CD4+ de type Th1 et Th2 dirigés contre la Dsg1 et la Dsg3. Les cellules T autoréactives reconnaissent des peptides de la région extracellulaire de la Dsg3 présentées par les molécules HLA de classe II DRB1*0402 et DQB1*0503 portées par les CPA notamment, des cellules dendritiques et des cellules B. Des cellules T réagissant avec les mêmes épitopes de la Dsg3 sont présents chez les sujets sains porteurs des allèles de susceptibilité au PV mentionnés ci-dessus. Néanmoins, l’existence de cellules régulatrices de type Tr1, détectées plus fréquemment chez les individus sains comparés aux malades de PV, contrôlerait la réponse T anti-Dsg3. A l’instar, la diminution du nombre de cellules Tr1 chez les patients pourrait conduire à un défaut d’immunorégulation et donc à une rupture de la tolérance périphérique vis-à-vis de la Dsg3.
CPA CD4+
TH2
CPA CD4+
TH1
IL-4, IL-5, IL-13
IFNγ
CD8+
Epiderme
B
Ganglion lymphatique
Capillaire sanguin
Tr1
IL-10, TGF-β
Introduction
- 105 -
Pour ce qui est des PS, l’étude de la réponse T est plus modeste. Dans la forme
endémique, des lymphocytes T proliférant vis à vis des domaines EC de la Dsg1 sont
présents chez les malades et sécrètent des cytokines de type Th2 [Lin, 2000]. Les travaux
de l’équipe de Hertl montrent que les lymphocytes T anti-Dsg1 de type Th2 et Th1 sont
détectés à des fréquences similaires chez les patients atteints de PF et chez les sujets
sains [Gebhard, 2005]. Aucune donnée de cartographie épitopique n’est actuellement
disponible.
Des études de la réponse T ont été entreprises par l’analyse structurale des
segments géniques codant pour la chaîne β des TCR exprimés par des clones T
spécifiques de la Dsg3 ou de la Dsg1, générés à partir de cellules T autoréactives isolées
de malades atteints de pemphigus. Au cours du fogo selvagem, l’analyse de la chaîne β
du TCR de 17 clones T anti-Dsg1 montre une variabilité dans l’utilisation des différents
segments géniques suggérant que la réponse lymphocytaire T dirigée contre la Dsg1 est
de nature oligoclonale et donc, que l’induction et/ou la progression de la maladie n’est
pas dépendante d’un seul type de TCR [Moestra, 2002]. Chez les malades atteints de PV,
l’analyse du répertoire T autoréactif en fonction des épitopes reconnus, montre une
corrélation entre l’utilisation préférentielle de certains segments Vβ et Vα du TCR
exprimés par les clones T anti-Dsg3 et la spécificité des peptides reconnus sur la Dsg3
(Vα22Vβ13 pour l’épitope Dsg3 (145-192), Vα10Vβ7 pour l’épitope Dsg3 (240-303) et
Vβ17 pour l’épitope Dsg3 (570-614)) [Hacker-Foegen, 2003].
Le rôle des populations de lymphocytes T régulateurs dans la survenue des
pemphigus n'a été abordé que récemment. Veldman et al ont montré que des cellules T
CD4+/CD45RO+, GITR+, TGF-βm+, spécifiques de la Dsg3 et sécrétrices d’IL10, sont
isolées de sujets sains (porteurs des allèles HLA de susceptibilité au PV) mais sont plus
rarement détectées chez les malades (5,5/105 PBMC vs 2,2/105 PBMC). Ces cellules Tr1
stimulées par l’Ag sécrètent de l’IL10, du TGF-β et de l’IL5 et, prolifèrent en réponse à
l’IL2 (mais pas en réponse à la Dsg3 ou à des stimulus mitogèniques). Elles sont capables
d’inhiber la prolifération de clones T spécifiques de la Dsg3 ou de la toxine tétanique de
manière Ag spécifique. Cette fonction immunosuppressive étant liée à la production
d’IL10 et de TGF-β [Veldman, 2004a]. Les cellules Tr1 semblent en conséquence être
impliquées de façon critique dans la maintenance et la restauration de la tolérance vis à
vis de la Dsg3 puisque des lymphocytes T autoréactifs dirigés contre des peptides
communs de la Dsg3 sont détectés à la fois chez les malades atteints de PV et chez les
sujets sains porteurs des allèles de susceptibilité à la maladie. Ces cellules Tr1
spécifiques de la Dsg3 expriment constitutivement le facteur Foxp3 qui caractérise la
population de lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25high. L’inhibition de l’expression de
Foxp3 par un oligonucléotide antisens aboutit chez ces cellules Tr1 à : (i) une perte
Introduction
- 106 -
d’expression des molécules GITR et CTLA-4; (ii) une sécrétion d’IL2; (iii) une réponse
proliférative vis à vis de la Dsg3; (iv) une perte de leur activité suppressive sur des clones
Th2 spécifiques de la Dsg3 [Veldman, 2006]. Ainsi, l’inhibition de l’expression des ARNm
Foxp3 induit-elle une transition du phénotype Tr1 à celui de Th2. Le phénotype et la
fonction des cellules Tr1 humaines sont donc directement liés à l’expression du facteur
Foxp3.
Enfin, une étude récente montre que les cellules NK contribuent au biais de la
réponse immune vers une réponse T de type TH2 chez les malades de PV par une
altération de la voie de signalisation médiée par l'IL-12 et une expression cellulaire
augmentée de l'IL10 et de l'IL5 [Takahashi, 2006].
A l’heure actuelle, aucune caractérisation précise de la réponse lymphocytaire T au
cours du pemphigus à IgA et du PPN n’a été entreprise. Toutefois, certains arguments
suggèrent que la réponse T dans le PPN pourrait être médiée par des cellules CD8+
[Hoffman, 2003].
VI. LES FACTEURS ENVIRONNEMENTAUX ET EXOGENES DU PEMPHIGUS
A- L’épidémiologie des pemphigus endémiques
Les pemphigus endémiques partagent des caractéristiques cliniques, histologiques
et immunologiques avec la forme sporadique de PS mais présentent des caractéristiques
épidémiologiques très particulières et sévissent avec une prévalence augmentée dans
certaines régions du monde plus particulièrement au Brésil, en Colombie et en Tunisie
(Figure 27).
1/ LE FOGO SELVAGEM
Le pemphigus endémique a été décrit initialement par Paes-Leme en 1903 dans
certaines régions du Brésil où il est connu depuis des siècles, sous le nom de fogo
selvagem (« feu sauvage ») en référence à la symptomatologie fonctionnelle ressentie par
les Indiens atteints par la maladie [Friedman, 1995]. Le fogo selvagem sévit en fait dans
une zone plus vaste que le seul Brésil. Des foyers de la maladie sont connus dans
plusieurs pays d’Amérique Centrale (Paraguay) et du Sud (Colombie, Argentine, Bolivie,
Pérou, Salvador). Néanmoins, ce sont les études menées au Brésil notamment dans la
région du Limao Verde (Figure 27B) qui ont permis de définir avec précision
l’épidémiologie de la maladie. Tous les foyers décrits sont situés dans des régions
partageant des caractéristiques géographiques précises ; elles sont situées entre le 40e et
60e degré de longitude, et le 5e et 25e degré de latitude entre 400 et 1000 m d'altitude, ce
qui correspond aux zones subtropicales. La maladie survient essentiellement dans des
zones rurales, touchant principalement des agriculteurs ayant un faible niveau de vie et
Introduction
- 107 -
vivant à proximité de cours d’eau. L'incidence de la maladie s’accroît fortement pendant la
période des pluies quand la densité d’insectes est la plus élevée, et varie fortement d'une
année à l'autre [Hans-Filho, 1999]. Dans les zones d'endémie, la maladie touche à la fois
les Amérindiens et des sujets d'origine non-indienne.
Figure 27. Les pemphigus endémiques. Trois types de pemphigus endémiques ont été individualisés (A) ; le pemphigus brésilien ou fogo selvagem qui sévit plus particulièrement dans la région du Limao Verde (B), le pemphigus colombien dans la région de El Bagre (C) et le pemphigus tunisien dans le sud de la Tunisie (D).
Limao Verde
El Bagre
B C D
A
Fogo Selvagem
Pemphigus Colombien
Pemphigus Tunisien
Sud Tunisien
Introduction
- 108 -
L’hypothèse d’un agent infectieux transmis par une mouche noire, la simulie, a été
formulée mais reste à démontrer. En effet, la zone d’endémie correspond à l’habitat d’une
mouche, la simulie (borrachudo ou simulium pruinosum). Une étude comparant la
répartition des différentes espèces de simulie dans une région d'endémie par rapport aux
régions voisines a par ailleurs montré une très nette prédominance de simulium
nigrimanum dans la zone d'endémie, faisant de cet insecte un vecteur potentiel de la
maladie. Récemment, une étude cas-témoins réalisée dans le Limao Verde a montré en
outre que les habitats des malades hébergent plus fréquemment des ectoparasites de
l’ordre des Hemiptera que sont les punaises (63% vs 32%) et les réduves (60% vs 29%)
ainsi que certains rongeurs (13% vs 1%) [Aoki, 2004]. Il n’y a pas de transmission
interhumaine de la maladie.
Si les facteurs d’environnement jouent un rôle important, le fond génétique
intervient également. En effet de nombreux cas familiaux sont observés et une association
forte entre la maladie et certains gènes HLA de classe II a été démontrée (cf. Génétique
des pemphigus). De façon intéressante, les gènes de susceptibilité retrouvés chez les non-
Amérindiens comme dans plusieurs tribus indiennes partagent une séquence commune
sur une région du gène codant une partie de la molécule de classe II cruciale pour la
présentation peptidique. Il apparaît donc clairement que le fogo selvagem fait intervenir
des facteurs d'environnement qui ne peuvent induire la maladie que sur un terrain
génétique de prédisposition. L'hypothèse d'une réaction immunitaire croisée entre un
agent infectieux transmis par la simulie et les Ag kératinocytaires, ne pouvant se
développer que chez les sujets porteurs des molécules HLA de classe II appropriées, est
avancée et mérite d’être confortée [Hans-Filho, 1999]. A cet égard, Diaz et al ont
récemment démontré la présence d’Ac anti-Dgs1 non pathogènes dans le sérum de
patients atteints de maladies parasitaires et infectieuses résidant dans les mêmes régions
brésiliennes que le fogo selvagem [Diaz, 2004]. Les prévalences les plus significatives ont
été trouvées chez les malades atteints d’onchocercose (83%), de leishmaniose (43%) ou de
maladie de Chagas (58%). Plus précisément, l’étude de la cartographie épitopique de la
Dsg1 indique que les sérums de ces malades réagissent avec le domaine EC5 de la
protéine. Les auteurs soulèvent l’hypothèse d’un mimétisme moléculaire entre un Ag
contenu dans la salive des insectes hématophages porteurs des parasites à l’origine de
l’onchocercose, de la leishmaniose et de la maladie de Chagas. En effet, la salive de
vecteurs hématophages est une source d’Ag sensibilisants capables d’induire une
production d’Ac chez l’homme [Barral, 2000]. Ainsi, l’immunisation avec un Ag
environnemental aboutirait-elle à une réaction croisée avec le domaine EC5 de la Dsg1 et
ipso facto, à une réponse autoAc anti-EC5 non pathogènes qui chez une minorité de
Introduction
- 109 -
sujets, pourrait se diversifier par extension épitopique intramoléculaire jusqu’à une
réponse pathogénique dirigée contre les domaines EC1 et EC2 de la Dsg1 [Li, 2003].
2/ LE PEMPHIGUS TUNISIEN
En Tunisie, le pemphigus présente des caractéristiques épidémiologiques
particulières [Bastuji-Garin, 1995], le rapprochant à certains égards du pemphigus
brésilien. Son incidence est plus élevée qu’en France (6,7 cas/an/million d'habitants vs
1,7 cas/an/million d'habitants) avec une prédominance des formes superficielles (61%
des cas), faisant du pemphigus la maladie bulleuse la plus fréquente en Tunisie. Ce
pemphigus touche plus les femmes avec un sexe ratio F/M de 4,1 (contre 1,2 en France).
Alors qu’en France l'incidence de la maladie croît avec l'âge, en Tunisie l'incidence est
plus élevée chez les femmes jeunes. Elle atteint 15,5 cas par an et par million d'habitants
chez les femmes de 25-34 ans. La maladie est plus fréquente dans les zones rurales et
chez les sujets vivant dans des conditions socio-économiques modestes. Aucun cas
familial n'a été observé. Une étude cas-témoins récente portant sur 68 femmes atteintes
de PS endémique tunisien et ayant pour but d’évaluer le rôle de facteurs
environnementaux, a mis en évidence plusieurs facteurs de risque : la cosmétique
traditionnelle, la fréquentation des hammams, le dépeçage de la volaille, le contact avec
des ruminants et les piqûres de guêpes, abeilles et araignées [Bastuji-Garin, 2002]. Il
existe donc des similitudes marquées entre le pemphigus endémique brésilien et le
pemphigus tunisien puisqu'il s'agit dans les deux cas de PS touchant avec une incidence
accrue des sujets jeunes vivant dans des conditions modestes en zone rurale. Cependant
dans la forme tunisienne, il existe une prédominance féminine non observée dans la
forme brésilienne. De plus les cas familiaux, fréquents au cours du pemphigus
endémique brésilien, ne sont pas ou peu observés en Tunisie où la maladie touche
exceptionnellement les enfants. Les facteurs étiologiques, qu'ils soient génétiques ou
environnementaux, restent à préciser dans cette forme particulière de la maladie.
3/ LE PEMPHIGUS COLOMBIEN
Une forme endémique unique de PS sévissant dans le nord de la Colombie a été
individualisée et possède des caractéristiques différentes de celles du fogo selvagem ou du
pemphigus tunisien. Le pemphigus endémique colombien touche les zones rurales
entourant la région El Bagre (Figure 27C). Les malades sont majoritairement des hommes
(95,4%) dont 98% sont des mineurs, des agriculteurs ou des sylviculteurs ayant un bas
niveau de vie. Plus de 40% d’entre eux présentent les caractéristiques cliniques et
histologiques du pemphigus érythémateux (association pemphigus et lupus) affectant par
ailleurs d’autres organes que la peau [Abreu-Velez, 2003b]. L’analyse de la réactivité des
Introduction
- 110 -
autoAc montre une hétérogénéité similaire à celle observée au cours du PPN, mais sans
association à une néoplasie [Abreu-Velez, 2003a]
B- Les facteurs exogènes
1/ LES PEMPHIGUS MEDICAMENTEUX
On distingue deux catégories distinctes de pemphigus médicamenteux : 1° les
pemphigus auto-immuns déclenchés ou aggravés par une prise médicamenteuse. Ces cas
se présentent et évoluent comme des pemphigus classiques, le médicament n'intervenant
que dans le déclenchement du processus auto-immun sur un terrain génétiquement
prédisposé [Mutasim, 1993] ; 2° les pemphigus induits, pour lesquels le médicament
inducteur joue un rôle majeur dans la survenue de la maladie. Ces cas sont souvent de
gravité modérée et régressent spontanément à l'arrêt du médicament inducteur. Les
médicaments inducteurs de pemphigus médicamenteux peuvent être séparés en deux
groupes comportant les médicaments thiolés d'une part, et non thiolés d'autre part
[Anhalt, 1989]. La plupart des médicaments inducteurs comportent des groupements
thiolés dans leur formule (pénicillamine, captopril, bucillamine, thiopronine) alors que
d'autres doivent être métabolisés pour générer ces groupements thiol (pyritinol, sels d'or,
pénicilline, céphalosporine, piroxicams). Cependant, certains médicaments (pyrazolone,
énalapril) ne comportent aucun groupement soufré mais des groupements amides
[Ruocco, 1993]. L'induction d'une acantholyse par les médicaments fait probablement
intervenir à la fois un mécanisme biochimique et l'induction d'une réponse auto-immune,
les deux mécanismes ne s'excluant pas mutuellement [Ruocco, 1993]. En effet, a été
montré sur de la peau humaine en culture, que l'adjonction de médicaments inducteurs
(comme la cantharidine) était capable d'induire une acantholyse. Cette action directement
acantholytique permet d'expliquer les cas de pemphigus induit dans lesquels il n'est pas
retrouvé d'Ac anti-épiderme. Différents mécanismes ont été évoqués. La fixation du
médicament à la surface des kératinocytes pourrait interférer directement avec les
fonctions d'adhésion des cadhérines desmosomales, activer in situ des enzymes
protéolytiques ou inhiber des enzymes jouant un rôle dans l'adhésion
interkératinocytaire. Cependant, la plupart des pemphigus médicamenteux sont auto-
immuns et liés à la présence d'autoAc pathogènes.
2/ LES RADIATIONS, LES FACTEURS DE CONTACT, LES VIRUS ET LES ALIMENTS
De rares cas de pemphigus induits par des radiations ionisantes sont décrits dans
la littérature [Delaporte, 1991]. Quelques observations pourraient indiquer un rôle
possible des UV dans l'induction et l’aggravation des pemphigus [Reis, 2000 ; Sanchez-
Introduction
- 111 -
Palacios, 2004]. De rares observations de pemphigus développés après dermatite de
contact à différents produits chimiques ont été rapportées.
L'herpès simplex virus joue souvent le rôle d'infection opportuniste. Cependant,
dans certains cas l'infection virale précède la survenue du pemphigus et certains auteurs
évoquent donc un potentiel rôle inducteur. Une étude récente a montré la présence plus
fréquente d’ADN de HHV-8 (human herpesvirus-8) dans la peau et dans les PBMC ainsi
que d’IgG sériques spécifiques d’oligopeptides d’HHV-8 chez les malades atteints de
pemphigus comparés à des individus sains [Wang, 2005]. Des cas de pemphigus faisant
suite à une primo-infection à EBV et à CMV et survenant chez des patients VIH positifs
ont été observés.
Certains aliments ont été incriminés dans l’induction, l’entretien ou l’aggravation
de pemphigus en particulier, ceux renfermant des composés chimiques comportant des
groupements thiols, isothiocyanates et phénols [Ruocco, 2001]. Ces groupements sont
par exemple retrouvés dans les tannins, certaines épices et les plantes du groupe allium
(oignon, ail, poireaux) au même titre que dans certains médicaments inducteurs
(penicillamine, captopril) [Brenner, 1994]. Des études in vitro ont confirmés le pouvoir des
allyls et des tannins qui sont en outre capables d’augmenter la prolifération et la
cytotoxicité de lymphocytes T [Brenner, 1995 ; Brenner, 2000] Leur action pourrait donc
passer à la fois par un mécanisme biochimique direct et par une action sur le système
immunitaire, chez des sujets génétiquement prédisposés.
VII. LES TRAITEMENTS DES PEMPHIGUS
L'introduction des corticoïdes dans les années 50 a révolutionné le pronostic du
pemphigus en faisant chuter la mortalité de 75 % à 30%. Ils constituent toujours le
traitement le plus efficace et le seul capable d'induire, chez la plupart des patients, une
rémission dans des délais acceptables [Lever, 1953]. Cependant, leur utilisation souvent
prolongée et à fortes doses, est grevée d'une morbidité et d'une mortalité iatrogènes
importantes et rend compte pour une part de la mortalité résiduelle de la maladie. C'est la
raison pour laquelle d'autres thérapeutiques (immunosuppresseurs, Disulone, sels d'or,
tétracyclines, plasmaphérèse…) ont été proposées avec pour double but de diminuer les
doses de corticoïdes administrées et d'augmenter l'efficacité thérapeutique. Ces
traitements sont parfois utilisés en monothérapie en remplacement des corticoïdes, dans
les formes modérées ou en cas de contre-indication absolue des corticoïdes. Ailleurs, ils
trouvent leur indication comme traitement adjuvant en cas de contre-indication relative
des corticoïdes nécessitant une diminution des doses, en cas de réponse incomplète aux
corticoïdes (corticorésistance), en cas de rechute au cours de la décroissance de la
corticothérapie (corticodépendance), ou comme traitement d'entretien à l'arrêt des
Introduction
- 112 -
corticoïdes. Leur utilisation systématique de première intention reste controversée car
aucune étude randomisée n'a pu montrer un bénéfice réel lié à leur utilisation par
rapport à une corticothérapie générale seule. Depuis leur utilisation, le taux moyen de
rémission n'est d'ailleurs passé que de 28,9% dans les années 1950 chez des patients
recevant une corticothérapie seule, à 20,5% ces dix dernières années. De plus, si la
mortalité du pemphigus est passée au-dessous de 10%, il est difficile de déterminer la
responsabilité relative des traitements adjuvants, de la meilleure prévention et de la
meilleure prise en charge des effets secondaires de la corticothérapie, et du diagnostic
plus précoce de la maladie [Bystryn, 1984].
Deux autres types de traitements pourraient s’avérer particulièrement
prometteurs. Premièrement, plusieurs travaux ont démontré l’efficacité de
l’administration d’immunoglobulines intraveineuses (IgIV) dans le traitement des
pemphigus [Bystryn, 2005]. Bien que les mécanismes d’action soient complexes et non
élucidés, le traitement par les Ig IV permet de diminuer très nettement, rapidement et
sélectivement le titre des Ac du pemphigus dans le sérum des patients. Toutefois, les
malades ne répondent pas de façon équivalente à ce traitement. Celui-ci combiné à des
agents cytotoxiques capables de prévenir la synthèse de novo d’autoAc, pourrait être
particulièrement efficace dans le contrôle de la maladie chez les patients non répondeurs
aux thérapies conventionnelles. En second lieu, de nombreux cas reportés dans la
littérature ont confirmé le bien fondé du traitement des pemphigus par immunothérapie
anti-CD20 ou Rituximab. Le Rituximab (Mabthera®) est un Acm chimérique humanisé
dirigé contre la molécule CD20 exprimée par les lymphocytes B et pré-B mais pas par les
plasmocytes. Le Rituximab induit une destruction des populations lymphocytaires CD20+
qui s’est révélée très efficace dans le traitement de lymphomes non Hodgkiniens et de
certaines MAI. Dans une étude prospective, nous avons traité 22 patients atteints de
formes sévères de pemphigus par Rituximab (375 mg/m2/semaine) [Joly, manuscrit en
préparation] et analysé les effets de cette immunothérapie sur les réponses immunes
cellulaires et humorales au cours de la maladie [Musette, manuscrit en préparation]. Les
résultats cliniques et immunologiques de cette étude sont présentés en annexe.
La recherche de nouveaux traitements (nouveaux immunosuppresseurs,
immunothérapie spécifique) capables de se substituer aux corticoïdes et présentant des
effets secondaires moins importants constitue un défi thérapeutique. Les connaissances
acquises dans la physiopathologie du pemphigus (caractérisation de l'Ag, de la réponse B
et de la réponse T, exploration des mécanismes pathogènes) laissent entrevoir des
utilisations possibles d'une immunothérapie spécifique [Stanley, 2000]: destruction des
cellules B autoréactives in vivo par des Ag recombinants couplés à des toxines
cytotoxiques [Proby, 2000], immuno-adsortion spécifique des autoAc par affinité pour l'Ag
Introduction
- 113 -
recombinant [Amagai, 1994 ; Amagai, 1995a], vaccination peptidique [Anhalt, 2001b],
déviation de la réponse Th2 responsable de la production d'IgG4 par l'utilisation de
cytokines Th1 ou simple inhibition de la prolifération T par l'IL-10, utilisation
d'inhibiteurs de protéases. Une étude montre par ailleurs que des Ac anti-idotypes
produits par immunisation de lapins avec les fragments F(ab’)2 d’IgG de patients atteints
de PF, inhibent la pathogénicité de ces IgG chez la souris BALB/c [Alvarado-Flores, 2001].
L’immunoadsorption ex vivo des Ac pathogènes à l’aide d’Ac anti-idiotype pourrait donc
constituer une nouvelle voie thérapeutique. De plus, la découverte de molécules actives
sur la maladie mais présentant moins d'effets secondaires que les corticoïdes permettrait
de diminuer la mortalité encore liée essentiellement aux complications du traitement
(intérêt potentiel du mycophénolate mofetil ou des nouveaux macrolides
immunosuppresseurs du type tracrolimus, sirolimus ou ascomycine).
Objectifs de thèse
114
OBJECTIFS DE THESE
L’objectif de ce travail est d’étudier le rôle de la Dsg1 dans la réponse auto-immune
au cours des pemphigus. Depuis plus d’une décennie, le rôle de l’autoAg lui-même dans
l’initiation, la propagation et la pérennisation de la réponse auto-immune a été conforté
par de nombreux arguments expérimentaux. Dans notre équipe, le rôle de la Dsg1 au
cours des pemphigus a été envisagé à la suite d’un ensemble de travaux démontrant
notamment l’implication d’un polymorphisme du gène DSG1 dans le déterminisme
génétique du PF. Certaines des hypothèses à la base de ce travail de thèse ont été
élaborées à partir d’observations fortuites faites au cours de l’étude et de la
caractérisation de la réponse auto-immune anti-Dsg1 au cours de la maladie ou de
l’analyse du gène DSG1 à partir des transcrits.
Dans un premier temps, nous avons cherché à démontrer l’existence dans
l’épiderme humain, d’une isoforme tronquée de la Dsg1 ainsi que son implication dans
la réponse auto-immune au cours des pemphigus. Au préalable, nous avons confirmé
l’existence, dans l’épiderme humain, des messagers alternatifs de la Dsg1 à l’origine de
la production de cette isoforme, que nous avons mis en évidence lors du séquençage
de l’ADNc codant pour la région EC de la Dsg1. Depuis une vingtaine d’années, la liste
des autoAg subissant un épissage alternatif à l’origine de transcrits
alternatifs/isoformes protéiques n’a cessé de s’allonger et, dans certains cas, ce
mécanisme intervient à divers niveaux de la réponse auto-immune. Plus
particulièrement, l’existence d’une réponse autoAc ou lymphocytaire T dirigée
spécifiquement contre des isoformes d’autoAg, a été démontrée dans différentes MAI. A
la lumière de ces travaux, nous avons recherché l’expression protéique de cette
isoforme tronquée de la Dsg1 dans l’épiderme humain puis évalué la capacité de
peptides spécifiques de cette protéine à se fixer aux molécules HLA de prédisposition
au pemphigus et à induire la prolifération de PMBC isolées chez les malades.
Dans une seconde partie, mon travail a consisté en la caractérisation de la
réponse Ac induite par l’immunisation de souris normales avec la région EC
recombinante de la Dsg1. Certains de ces animaux développent, à côté de la réponse
IgG anti-Dsg1, des Ac dirigés contre d’autres protéines épidermiques. Cinq Acm
représentatifs des différentes spécificités détectées dans les sérums de ces souris ont
été produits. Deux de ces Acm ne réagissent pas avec la Dsg1 mais reconnaissent des
protéines de plus haut poids moléculaire. Nous avons cherché à les identifier afin de
comprendre ce phénomène de diversification de la réponse Ac. Dans cette optique,
nous avons choisi comme stratégie d’identification, l’immunocriblage de carte
protéique 2D d’épiderme humain. Cette approche a nécessité la réalisation d’une carte
2D des protéines épidermiques de haut poids moléculaire et par conséquent, une
Objectifs de thèse
115
adaptation du procédé technique d’électrophorèse bidimensionnelle à cette
problématique.
Enfin, de nombreux transcrits codant pour des Ag tissus-spécifiques
notamment des autoAg cibles au cours de certaines MAI sont exprimés dans le
thymus humain, en particulier par les CPA thymiques. Ainsi, la présentation de
peptides autoantigèniques aux thymocytes en cours de maturation participe-t-elle à
l'aquisition de la tolérance immune via la sélection négative de cellules T autoréactives
ou la sélection positive de lymphocytes T régulateurs. Afin de mieux comprendre les
mécanismes de tolérance vis-à-vis de la Dsg1, nous avons étudié son expression dans
le thymus humain à partir de fragments thymiques provenant de sujets sains. La
signification des résultats observés sera discutée.
116
MATERIELS
&
METHODES
Matériels & Méthodes
117
MATERIELS & METHODES
A- Les patients
1/ DIAGNOSTIC
Vingt et un patients présentant un PF (n=8) et un PV (n=13), de même que 6
malades atteints de pemphigoïde bulleuse vus dans les services de dermatologie du
« groupe français d'étude sur les bulles » ont été inclus dans notre étude. Les patients ont
donné leur consentement pour participer à cette étude. Le diagnostic clinique de la
maladie a été confirmé par : (i) analyse histologique, (ii) IFD sur biopsie de peau
périlésionnelle, (iii) l'analyse des sérums par IFI sur coupes d'œsophage de singe (The
Binding Site, Birmingham, UK) ou de peau humaine clivée au NaCl 1 M, par
immunoempreinte sur un extrait d'épiderme humain et par ELISA (MBL, Nagano, Japon)
pour détecter des IgG anti-Dsg1/3 chez les patients atteints de pemphigus et des IgG
anti-BP180 chez les malades atteints de pemphigoïde bulleuse. Les malades atteints de
pemphigus sont classés en 3 groupes selon leur statut clinique (3 phases de la maladie) :
(i) la phase active définie comme le développement de novo, d'érosions/bulles cutanées
et/ou muqueuses chez les malades non traités, (ii) la phase chronique définie comme une
rémission incomplète ou une rechute chez les patients présentant un traitement
immunossupresseur, (iii) la rémission clinique définie comme l'absence de (nouvelles)
lésions depuis 6 mois chez les patients traités.
2/ LE GENOTYPAGE HLA DE CLASSE II
L'ADN génomique est extrait à partir de 2 ml de sang prélevé sur des tubes
héparinés chez les malades atteints de pemphigus à l'aide du kit QIAamp® DNA Blood
Midi Kit (Qiagen Inc, Valencia, CA) et utilisé pour le génotypage HLA DRB1 comme
précédemment décrit [Martel, 2000].
B- La quantification des transcrits normaux et alternatifs de la
desmogléine 1 dans l’épiderme humain
1/ SOURCE TISSULAIRE
Les fragments d’épiderme humain ont été obtenus à partir de pièces de résection
chirurgicale issues de plasties mammaires, pratiquées chez des sujets normaux (Clinique
Saint-Antoine, Bois-Guillaume, France). L’épiderme est séparé du derme au scalpel et
plongé immédiatement dans l’azote liquide. Les différents prélèvements qui nous ont été
fournis, désignés HE (Human Epidermis) suivi d’un numéro, sont utilisés comme source
d’ARN totaux d’épiderme humain et comme substrat tissulaire pour la préparation
d’extrait protéique.
Matériels & Méthodes
118
Les fragments de thymus humain ont été prélevés chez des sujets subissant une
thymectomie pour une pathologie cardiovasculaire (CHU Charles Nicolle, Rouen; Hôpital
Marie Lannelongue, Le Plessis-Robinson).
2/ EXTRACTION DES ARN ET TRANSCRIPTION INVERSE
Les fragments d’épiderme humain (100 mg) et de thymus humain sont tout
d’abord broyés dans l’azote liquide pour être réduits en poudre. Les ARN totaux sont
ensuite extraits à l'aide du réactif TRIzol™ (Life Technologies, Eragny, France) selon les
instructions du fournisseur. Après extraction, la présence et la qualité des ARN sont
vérifiées après migration électrophorètique (8V/cm) sur un gel d’agarose à 1 % dans du
tampon de migration TAE (0,04 M Tris Acétate, 1mM EDTA. Les bandes d’ARN (28S, 18S
et 5S) sont ensuite révélées sous les UV après immersion du gel dans une solution de
TAE contenant du Bromure d’éthidium (BET) (1 µg/ml) durant 30 min. La quantification
de ces ARN est ensuite réalisée par mesure spectrophotométrique à 260 nm. La
transcription inverse des ARN messagers (ARNm) en ADN complémentaires (ADNc) est
réalisée en utilisant des hexamères présentant toutes les combinaisons possibles des 4
nucléotides qui vont s’hybrider sur les ARN, permettant ainsi d’initier la synthèse d’ADNc
par la Moloney-Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Life
Technologies). Un tube contenant 5 µg d’ARN, complété à 22 µl avec de l’eau, est incubé à
66 °C pendant 5 min afin de détruire les structures secondaires de l’ARN puis placé 5 min
sur la glace. Le mélange composé de : 2 µl d’hexamères aléatoires pdN6 à 100 pmol/µl
(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 2 µl de dNTP (25 mM chacun) (Invitrogen, Carlsbad,
CA), 8 µl du tampon de la transcriptase inverse (Invitrogen), 1 µl de RNAsin (40 U/ µl)
(Invitrogen), 4 µl de dithiotréitol (DTT) 0,1 M (Invitrogen) et 1 µl de M-MLV RT (200 U/µl)
(Invitrogen), est ensuite ajouté au tube contenant les ARN qui est alors placé à 37 °C
pendant 1 h. La réaction est ensuite arrêtée par une incubation à 95 °C pendant 5 min.
3/ AMPLIFICATION DES SEQUENCES ADNc SPECIFIQUES DES TRANSCRIPTS NORMAUX ET
ALTERNATIFS DE LA DESMOGLEINE 1
Une amplification préalable par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
d’une séquence de 549 pb présente sur les ADNc spécifiques des ARNm de la
glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), gène « domestique » ayant une
répartition a priori ubiquitaire et constante dans un tissu donné, est réalisée afin de
contrôler la synthèse des ADNc par la transcription inverse. Afin de mettre en évidence
leur existence dans la peau humaine de sujets sains, des amplifications par PCR de
séquences d’ADNc spécifiques des transcrits normaux (DSG1) et alternatifs (DSG1-AT) de
la Dsg1 sont réalisées. Ces réactions de PCR sont réalisées à l’aide de couple d’amorces
Matériels & Méthodes
119
P
S
EC1
EC2
Codon Stop
INT6
DSG1 sens
DSG1 antisens
DSG1-AT sens
DSG1-AT antisens
Insertion Intron 6
Exon 7
Exon 1 Exon 2
Exon 3
Exon 4
Exon 5
Exon 6
Exon 8
spécifiques de chaque produit (Figure 28, Tableau 16), dans les milieux réactionnels et les
conditions qui sont détaillés dans les tableaux 17 et 18. Les produits d’amplification
mélangés à une solution de dépôt sont ensuite déposés sur un gel d’agarose à 1 % pour
subir une séparation électrophorètique. La taille des bandes d’ADN révélées sous les UV
est vérifiée par comparaison avec la migration du marqueur de taille GeneRuler 100 bp
DNA Ladder (MBI Fermentas, Vilnius, Lituanie).
M D W S F F R V V A V L F I F L V V 18 ATG GAC TGG AGT TTC TTC AGA GTA GTT GCA GTG CTG TTC ATT TTT CTG GTG GTG 54 V E V N S E F R I Q V R D Y N T K N 36 GTA GAA GTT AAC AGT GAA TTC CGA ATC CAG GTA AGA GAT TAT AAC ACT AAA AAT 108 G T I K W H S I R R Q K R E W I K F 54 GGC ACC ATC AAA TGG CAT TCA ATC CGA AGG CAG AAA CGT GAA TGG ATC AAG TTC 162 A A A C R E G E D N S K R N P I A K 72 GCA GCA GCC TGT CGT GAA GGT GAA GAC AAC TCA AAG AGG AAC CCA ATC GCC AAA 216 I H S D C A A N Q Q V T Y R I S G V 90 ATT CAC TCA GAT TGT GCT GCA AAC CAG CAA GTT ACA TAC CGC ATC TCT GGA GTA 270 G I D Q P P Y G I F V I N Q K T G E 108 GGA ATT GAT CAG CCA CCA TAT GGG ATC TTT GTC ATT AAT CAG AAA ACT GGT GAA 324 I N I T S I V D R E V T P F F I I Y 126 ATT AAT ATA ACA TCC ATA GTT GAT CGA GAG GTC ACT CCT TTC TTC ATT ATC TAC 378 C R A L N S M G Q D L E R P L E L R 144 TGC CGA GCT CTG AAC TCA ATG GGC CAA GAT TTA GAG AGG CCT CTA GAG CTC AGA 432 V R V L D I N D N P P V F S M A T F 162 GTC AGG GTT TTG GAT ATA AAT GAC AAC CCT CCA GTG TTT TCA ATG GCT ACA TTT 486 A G Q I E E N S N A N T L V M I L N 180 GCA GGA CAA ATA GAA GAA AAT TCT AAT GCA AAT ACA CTG GTG ATG ATA CTC AAT 540 A T D A D E P N N L N S K I A F K I 198 GCT ACT GAC GCA GAT GAA CCG AAC AAT TTG AAC TCA AAA ATA GCC TTC AAG ATT 594 I R Q E P S D S P M F I I N R N T G 216 ATA AGA CAA GAA CCT TCA GAT TCA CCA ATG TTT ATT ATC AAC AGA AAT ACT GGA 648 E I R T M N N F L D R E I Y V N V E 234 GAA ATT CGA ACG ATG AAT AAT TTT CTA GAC AGA GAG ATT TAT GTA AAC GTT GAG 702 P T F Q R T L H K T K * 245 CCA ACT TTT CAA AGA ACT TTA CAT AAG ACA AAG TAA AGG CTG TCT ACG TCA AGT 756 GTG ATA TTG CCT GTA ATA TGT ATT TTT AGC AAT ACG GCC AGT ATG CTC TTG CTG 810 TAA GAG GCT CTG ACC GAG ATG GCG GGG CAG ATG GCA TGT CAG CGG AAT GTG AGT 864 GCA ACA TTA AAA TCC TCG ATG TCA ATG ATA ATA TCC CTT ACA TGG AAC AGT CTT 918 CAT ATA CC 926
Figure 28. Séquences nucléique et protéique de l’isoforme tronquée de la desmogléine 1. La figure montre la séquence ADNc spécifique du transcrits alternatif codant pour l’isoforme tronquée de la Dsg1. Cette isoforme est composée dans l’orientation N- à C-terminale, des séquences signal et propeptide, du domaine EC1, de la région 157–227 du domaine EC2 et d’un peptide de 17 aminoacides, nommé INT6 (surligné en noir), à l’extrémité C-terminal. Ce peptide INT6 est codé par l’extrémité 3´ d’une insertion intronique correspondant à une séquence de 101 pb de l’intron 6 du gène DSG1 (surligné en gris). Les amorces DSG1 sens et antisens sont utilisées pour amplifier les ADNc spécifiques des ARNm normaux de la Dsg1 et les amorces DSG1-AT sens et antisens, ceux spécifiques des transcrits alternatifs de la Dsg1.
Matériels & Méthodes
120
Tableau 16. Séquences des amorces utilisées pour la l’amplification des séquences
ADNc spécifiques des transcrits GAPDH, DSG1 et DSG1-AT
Gène amplifié
Amorce sens Amorce antisens Taille (pb)
GAPDH 5´-TGC CAT CAA CGA CCC CTT CA-3´ 5´-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3´ 549
DSG1 5´-AAT GGC TAC ATT TGC AGG ACA-3´ 5´-ATC TCG GTC AGA GCC TCT TAC A-
3´ 256
DSG1-AT 5´-TAG ACA GAG AGA TTT ATG TAA AVG TTG-3´
5´-TAT TAC AGG CAA TAT CAC ACT TGA C-3´ 101
Tableau 17. Composition du mélange réactionnel de PCR pour l’amplification des séquences ADNc spécifiques des transcrits GAPDH, DSG1 et DSG1-AT
Réactifs Volumes
Matrice (ADNc) 5 µl
Mélange des 4 dNTPs (12,5 mM chacun) (Promega) 1 µl
Tampon de la TaqDNA Polymérase (10X) (Promega) 5 µl
MgCl2 25 mM (Promega) 3 µl
Amorce sens (100 pmol/µl) + amorce antisens (100 pmol/µl)
0,25 µl + 0,25 µl
TaqDNA Polymérase 5 U/µl (Promega) 0,5 µl
H2O q.s.p. 50 µl
Tableau 18. Phases de la réaction de PCR classique pour l’amplification des séquences ADNc spécifiques des transcrits GAPDH, DSG1 et DSG1-AT
Phases Durée Température Nombre de cycles
Dénaturation initiale
3 min 94 °C 1
Dénaturation 1 min 94 °C
Hybridation 30 sec 58 °C à 60 °C*
Elongation 30 sec 72 °C
35 à 40
Elongation finale
5 min 72 °C 1
* : la température d'hybridation est 58°C pour les PCR GAPDH et DSG1-AT, et de 60°C pour la PCR DSG1.
Matériels & Méthodes
121
4/ QUANTIFICATION DES TRANSCRITS NORMAUX ET ALTERNATIFS DE LA DESMOGLEINE 1 PAR
PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL
Principe de la PCR en temps réel sur l’appareil LightCycler (Figure 29)
Le principe de base de la PCR quantitative (Q-PCR) en temps réel est la mesure
récurrente d’un signal fluorescent, qui est proportionnel à la quantité de produit
amplifié, avec pour objectif de mesurer l’accumulation des produits d’amplification au
cours de la réaction et de déterminer la quantité initiale de matrice dans le milieu
réactionnel. Le LightCycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Allemagne)
est un appareil automatisé de quantification en temps réel par fluorimétrie de produits
de PCR. Il est composé d’un thermocycleur à air pulsé permettant des variations
thermiques extrêmement rapides et d’un micro-spectrofluorimètre pour la détection de
la fluorescence. Cet appareil est relié à un ordinateur qui permet l’acquisition des
données en temps réel et le paramétrage via une interface graphique. C’est la mesure
de la fluorescence émise par le SYBR Green, agent intercalant et fluorescent, qui
permet de quantifier les produits synthétisés à chaque cycle. Avec l’appareil
LightCycler™, la mesure de la quantité de matrice présente initialement dans
l’échantillon est réalisée par comparaison du point de croisement ou crossing point
(Cp) de la courbe d’amplification du gène étudié par rapport à celui obtenu par
l’amplification d’un ADN contrôle standard, constitué soit d’un plasmide soit de
produits de PCR purifiés de concentration connue. Le Cp représente le nombre de
cycles pour lequel la courbe d’amplification coupe une ligne de base correspondant au
seuil de détection de la fluorescence, seuil au-dessous duquel toute fluorescence est
considérée comme du bruit de fond. A chaque cycle de la réaction de PCR, les
capillaires en verre (fermés par un bouchon) sont placés devant une diode émettant à
470 nm. Le SYBR Green titré dans le milieu réactionnel devient fluorescent et réémet
une fluorescence à 530 nm dont l’intensité est directement proportionnelle à la
concentration d’ADN. Il est nécessaire de préciser que ce n’est qu’une fois lié à l’ADN
double brin qu’il peut émettre le signal fluorescent, détectée par le micro-
spectrofluorimètre.
Le SYBR Green est un agent intercalant qui s’incorpore à toutes les molécules
d’acide nucléique double brin. Comme il est non spécifique de séquence, des
détections d’amplifications non spécifiques ou de formation de dimères d’amorces
peuvent venir altérer l’interprétation des résultats. Pour pallier à ce problème,
l’établissement d’une courbe de fusion, à la fin de la réaction de PCR, permet de
détecter la présence d’un ou de plusieurs produits d’amplification. Cette étape
consiste en une dénaturation des amplicons à 94°C pour obtenir des molécules d’ADN
simple brin, qui sont ensuite réappariées à la température d’hybridation des amorces
Matériels & Méthodes
122
A B C
D E
2
1
3
1 3
2
augmentée de 5°C. Une augmentation lente (0,1°C par seconde) jusqu’à 94°C permet
un désappariement progressif et lent des molécules ADN et donc une diminution lente
de la fluorescence émise. Lorsque la température de fusion (Tm) du produit amplifié
est atteinte, 50 % de la quantité totale de ce produit sont simple brin, entraînant une
diminution visible à l’écran de la fluorescence. Le calcul effectué par le logiciel du
LightCycler de la dérivée première de la fluorescence sur la température (-dF/dT)
permet d’obtenir une courbe qui donne un pic à la Tm du produit amplifié. La courbe
de fusion permet donc de différencier les produits spécifiques des produits non
spécifiques et de constater la présence de contaminants ou la formation de dimères
d’amorces.
Figure 29. Principe de la PCR en temps réel sur l’appareil LightCycler. Le principe de base de la PCR quantitative (Q-PCR) en temps réel est la mesure récurrente d’un signal fluorescent, qui est proportionnel à la quantité de produit amplifié, avec pour objectif de mesurer l’accumulation des produits d’amplification au cours de la réaction et de déterminer la quantité initiale de matrice dans le milieu réactionnel. C’est la mesure de la fluorescence émise par le SYBR Green, agent intercalent et fluorescent, qui permet de quantifier les produits synthétisés à chaque cycle. La PCR se déroule en 3 phases : La dénaturation (A) ; l’ADN dénaturé est sous forme simple brin, le SYBR Green est libre dans le capillaire et aucune fluorescence n’est émise. L’hybridation (B) ; les amorces se fixent à leurs séquences complémentaires sur l’ADN, le SYBR Green commence à s’intercaler et une émission de fluorescence apparaît. L’élongation (C) ; Le SYBR Green s’incorpore en grande quantité et l’émission de la fluorescence augmente. A la fin de la phase d’élongation, la totalité de l’ADN est double brin, la fluorescence observée est maximale (plateau). Les courbes d’amplification permettent de suivre l’intensité de la fluorescence émisse en fonction du nombre de cycle de la réaction de PCR par exemple, de 3 ADNc différents (C). La spécificité des produits d’amplification est contrôlée par l’établissement d’une courbe de fusion à la fin de la PCR (D).
Matériels & Méthodes
123
Amplification des séquences ADNc d’intérêt par Q-PCR en temps réel
Les réactions de Q-PCR quantitative en temps réel utilisant le SYBR Green
sont réalisées à l’aide du kit Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche Molecular
Biochemicals). La composition du milieu réactionnel de PCR (pour chaque capillaire)
est détaillée dans le tableau 19. Les capillaires sont ensuite centrifugés et placés dans
l’appareil LightCycler. Celui-ci est alors programmé via son interface graphique pour
les différentes phases de la réaction selon le programme décrit dans le tableau 20.
Après une étape finale de refroidissement (destinée à éviter que le bloc chauffant ne
s’endommage), le logiciel d’analyse des données permet l’accès à l’ensemble des
résultats de l’expérience (courbes d’amplification, courbes de fusion…).
Tableau 19. Composition du milieu réactionnel des réactions de Q-PCR en temps
réel sur LightCycler pour l’amplification des ADNc GAPDH, DSG1 et DSG1-AT.
Réactifs Volumes
MgCl2 25 mM (Roche Molecular Biochemicals) 1,6 µl
Amorce sens (10 pmol/µl) 1 µl
Amorce antisens (10 pmol/µl) 1 µl
Fast Start Master SYBR Green I
(Roche Molecular Biochemicals)* 2 µl
H2O (Roche Molecular Biochemicals) q.s.p. 18 µl
ADNc ou matrice servant de contrôle externe 2 µl
* : Ce réactif est constitué de l’enzyme FastStart (Taq polymérase Hot Start) auquel est ajouté un mélange contenant le SYBR Green I, les dNTPs, le tampon de PCR et 1 mM de MgCl2.
Matériels & Méthodes
124
Tableau 20. Phases de la réaction de Q-PCR en temps réel sur LightCycler pour l’amplification des ADNc GAPDH, DSG1 et DSG1-AT.
Phases Durée Température Nombre de cycles
Dénaturation initiale 10 min 94 °C 1
Phases d’amplification
Dénaturation 20 sec 94 °C
Hybridation 10 sec 61 ou 62 °C*
Elongation 12 ou 22
sec* 72 °C
40
Phases de « fusion » Rapports de montée en
température
Dénaturation 10 sec 94 °C 20°C/sec
Réappariement 30 sec 66 ou 67°C** 20°C/sec
Montée en température 94 °C 0,1°C/sec
Refroidissement de l’appareil
1 min 40 °C
* : La température d’hybridation de 61°C et la durée d’élongation de 12 sec pour l’amplification des ADNc DSG1 (transcrits normaux et alternatifs) sont remplacés par une température de 62°C et une durée de 22 sec pour l’amplification des ADNc GAPDH ; ** : correspond à la température d’hybridation + 5°C.
Normalisation et quantification des transcrits normaux et alternatifs de la
desmogléine 1
Pour déterminer le nombre absolu de copies des transcrits étudiés, des produits
de PCR spécifiques de chaque type de transcrits (GAPDH, DSG1 et transcrits
alternatifs de la Dsg1 : DSG1-AT) sont utilisés pour générer des courbes standard de
calibration, basées sur des dilutions en série. Ces produits sont obtenus par PCR
classique puis purifiés après migration sur un gel d’agarose à 1 % avec le kit Qiaquick
Gel Extraction Kit (Qiagen). La quantification est réalisée après séparation
électrophorètique, par comparaison de l’intensité des bandes d’ADN visualisées sous
les UV à celles du marqueur de concentration Mass Ruler DNA Ladder (MBI
Fermentas) ainsi que par mesure spectrophotométrique à 260 nm.
Matériels & Méthodes
125
La conversion des µg en nombre de copies (n) est donnée par la formule
suivante : n = [(m x 1515)/Nbp] x 10-12 x N (m, masse en µg de matrice utilisée pour
l’amplification ; Nbp, nombre de paires de bases du fragment amplifié ; N, constante
d’Avogadro = 6,022e23 molécules/mole) [Vandenbroucke, 2001 ; Karsai, 2002]. La
courbe de calibration représente le Cp en fonction du nombre de copies pour chaque
point de dilution. Les gammes sont constituées de 5 points avec un facteur de dilution
égal à 10.
Ces gammes servent aussi à calculer l’efficacité de la PCR. En effet, une PCR est
considérée comme quantitative quand elle est efficace, c’est-à-dire quand son efficacité
(e) est proche de 100 %, cas idéal où, à chaque cycle, la quantité d’ADN amplifié est
doublée. Dans la plupart des cas, l’efficacité est comprise entre 80 et 90 % dans les
premiers cycles d’amplification. Pour vérifier l’efficacité d’une PCR donnée et valider
les conditions d’amplification, il convient de réaliser une amplification à partir d’une
gamme de dilution de matrice, afin de tracer la droite de régression de cette gamme et
d’en déterminer la pente (p). La valeur de p obtenue permet de calculer l’efficacité de
chacune des PCR mises au point. En effet, au cours de la phase exponentielle de la
PCR, l’efficacité est donnée par la formule : e = 10–1/p. Lorsque la valeur de p = -3,32
l'efficacité de PCR est de 2, soit de 100 %.
Le logiciel calcule également le taux d’erreur : pour une gamme de dilution de 4
points, il doit être inférieur à 0,1 et pour une gamme de dilution de 5 points, inférieur
à 0,2. Le nombre de copies des ADNc spécifiques des transcrits GAPDH, DSG1 et
DSG1-AT pour chaque échantillon testé est déterminé par le logiciel du LightCycler™ à
partir des courbes de calibration correspondante. Au cours d’une même expérience et
pour chaque échantillon, les ADNc des différents transcrits étudiés sont quantifiés (en
triplicate) en même temps que les dilutions en série de produits de PCR
correspondants (en triplicate). Pour corriger les variations inter-essais dûes à la
qualité de l’ARN et à l’efficacité de la transcription inverse entre les échantillons, les
données obtenues pour les deux types de transcrits DSG1 sont normalisées en
divisant le nombre de copies de l’ADNc cible par celui du gène domestique utilisé en
l’occurrence, GAPDH [Raaijmakers, 2002]. Les résultats quantitatifs (quantité absolue)
sont présentés comme un nombre de copies du transcrit cible (DSG1 et DSG1-AT) pour
1000 copies de GAPDH [Wellmann, 2001 ; Marcucci, 2001]. La quantité relative des
transcrits alternatifs DSG1 est évaluée dans les 9 échantillons (en pourcentage), en
réalisant le rapport entre le nombre de copies d’ADNc DSG1-AT et le nombre total de
copies d’ADNc spécifiques des 2 types de transcrits DSG1 soit la formule suivante :
[nDSG1-AT/(nDSG1-AT + nDSG1)] x 100.
Matériels & Méthodes
126
C- Production des desmogléines 1 recombinantes
1/ PRODUCTION DE LA PROTEINE REC1/5-DSG1
La région EC complète de la Dsg1 est produite sous forme d’une protéine
recombinante fusionnée à l’extrémité C-terminale, à 2 séquences peptidiques, le
peptide FLAG et un peptide composé de 6 résidus histidine. La production de cette
protéine recombinante, nommée rEC1/5-Dsg1, est réalisée dans le système
baculovirus/cellules d’insectes. Ce système possède deux avantages principaux pour
la synthèse d’Ag recombinants, il permet une production en masse de la
baculoprotéine et la réalisation par la machinerie cellulaire des cellules d’insectes, de
nombreuses modifications post-traductionnelles qui peuvent participer aux propriétés
immunogèniques de la protéine. La synthèse de la baculoprotéine se déroule en deux
étapes principales : 1° Une étape de génétique moléculaire qui consiste en la
fabrication d’un virus recombinant (Figure 30) ; 2° Une étape de biologie cellulaire qui
consiste en la culture des cellules d’insectes infectées par le virus recombinant qui
produisent la protéine recombinante (Figure 31)
ADNc rEC1/5-Dsg1 SP TAG
Vecteur « cassette » de clonage pGEM4Z
Vecteur de transfert p119
Baculovirus AcSLP10
P10 P10’
CDSph
PrP10
1
2
3
4
pGEM4Z-rEC1/5-Dsg1
P119-rEC1/5-Dsg1
AcSLP-rEC1/5-Dsg1
5
Figure 30. Représentation schématique des principales étapes de la production d’un baculovirus recombinant utilisé pour la synthèse de la protéine rEC1/5-Dsg1. La séquence d’ADNc codant pour la région EC complète de la Dsg1 est clonée dans un vecteur cassette entre les séquences codant pour le peptide signal et le propeptide de la Dsg1 (SP) et celles codant pour les peptides FLAG et Histidine (6 résidus) (1). La cassette (composée des séquences PS, rEC1/5-Dsg1, FLAG et Histidine) est ensuite extraite du vecteur par double digestion enzymatique (2) et insérée dans le vecteur de transfert (3). Les séquences P10 présentes à la fois sur le vecteur de transfert et sur le baculovirus vont permettre la recombinaison homologue entre ces 2 vecteurs (4). La production du baculovirus recombinant (5) aboutit à la substitution du gène de la polyédrine (CDSph) (responsable de la formation dans les baculovirus sauvages d’inclusions sous forme de polyèdres) par la cassette, permettant ainsi leur sélection via la perte de ce phénotype dit « inclusions négatives ». La production de la protéine recombinante (région EC de la Dsg1 fusionnée aux peptides FLAG et Histidine) est réalisée via l’infection de cellules d’insectes avec le baculovirus recombinant. PrP10 : promoteur du gène CDSph.
Matériels & Méthodes
127
Figure 31. Organigramme des étapes expérimentales de la production de la
baculoprotéine recombinante
1 CO-TRANFECTION Recombinaison homologue entre le vecteur de transfert et le
baculovirus AcSLP10
2 SELECTION DE VIRUS RECOMBINANTS Par la méthode des plages de lyse
3 AMPLIFICATION VIRALE Suivie par une analyse du culot cellulaire et du surnageant de
culture par immunoempreinte avec l’Ac anti-FLAG
4 PURIFICATION DU VIRUS RECOMBINANT Par la méthode des plages de lyse
6 CINETIQUE D’EXPRESSION PROTEIQUE Analyses par immunoempreinte avec l’Ac anti-FLAG
5 AMPLIFICATION VIRALE Suivie par une analyse du culot cellulaire et du surnageant de
culture par immunoempreinte avec l’Ac anti-FLAG
7 PRODUCTION EN MASSE ET PURIFICATION DE LA BACULOPROTEINE
Purification de la protéine par chromatographie d’affinité sur une colonne anti-FLAG suivie par un contrôle de la pureté par une
coloration du gel SDS-PAGE au bleu brillant et une immunoempreinte avec l’Ac anti-FLAG
Matériels & Méthodes
128
Préparation du vecteur « cassette » de clonage
Les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) humaines sont isolées par
centrifugation sur gradient de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Les ARN
totaux sont ensuite extraits à partir de 107 PBMC à l'aide du réactif TRIzol™ (Life
Technologies). La synthèse des ADNc est réalisée par transcription inverse de ces ARN
avec une amorce oligo-dT (Invitrogen), en utilisant la M-MLV RT (Life Technologies). Un
fragment d’ADN codant pour le peptide signal et le propeptide (SP) de la Dsg1 humaine
est amplifié par PCR « nichée » à partir des ADNc générés. La double PCR est effectuée en
utilisant les amorces SP sens (5´-CTT GGT CTT GGA TGT AAG AGA ATC C-3´) et SP
reverse (5´-CTC CAG AGA TGC GGT ATG TAA CTT-3´) comme amorces externes et les
amorces SP-BamH I (5´-GAG ATG GAC TGG AGT TTC TTC AGA G-3´) et SP-Hind/Pfl23 II
(5´-CGT AAG CTT AGC GTA CGT TTC TGC CTT CGG ATT GAA TG-3´) comme amorces
internes (Figure 32) en suivant les conditions d’amplification indiquées dans les tableaux
21 et 22.
Tableau 21. Composition du milieu réactionnel de PCR « nichée » pour l’amplification des séquences ADNc codant pour le peptide signal et le propeptide
de la Dsg1 humaine
Réactifs Volumes
Matrice (ADNc) 5 µl
Mélange des 4 dNTPs (25 mM chacun) 1,5 µl
Tampon de la TaqDNA Polymérase 5 µl
Amorces sens (100 pmol/µl) + antisens (100 pmol/µl) 0,5 µl + 0,5 µl
TaqDNA Polymérase (Perkin-Elmer) 1,5 U
H2O q.s.p. 50 µl
Tableau 22. Phases de l’amplification par PCR « nichée »* des séquences ADNc codant pour le peptide signal et le propeptide de la Dsg1 humaine
Phases Durée Température Nombre de cycles
Dénaturation initiale
3 min 94 °C 1
Dénaturation 1 min 94 °C
Hybridation 30 s 60 °C
Elongation 1 min 72 °C
35
Elongation finale 5 min 72 °C 1
* : Ces conditions sont celles des 2 PCR successives
Matériels & Méthodes
129
E1
E2 E3
E5
E4
E6
E7
E8
E9
E10
E11
Amorce SP Sens
Amorce SPAntisens
Amorce SP-BamH I
Amorce SP-Hind/Pfl23 II
Amorce rEC1/5-S
Amorce rEC1/5-R
S
P
EC1
EC2
EC3
EC4
EC5
TGA GTG GGA GAA AGG AAA AGA ACA GAG AAG AAC AAA CAA AAC TCC CTT GGT CTT 54 GGA TGT AAG AGA ATC CAG CAG AGA TGG ACT GGA GTT TCT TCA GAG TAG TTG CAG 108 TGC TGT TCA TTT TTC TGG TGG TGG TAG AAG TTA ACA GTG AAT TCC GAA TCC AGG 162 TAA GAG ATT ATA ACA CTA AAA ATG GCA CCA TCA AAT GGC ATT CAA TCC GAA GGC 216 AGA AAC GTG AAT GGA TCA AGT TCG CAG CAG CCT GTC GTG AAG GTG AAG ACA ACT 270 CAA AGA GGA ACC CAA TCG CCA AAA TTC ACT CAG ATT GTG CTG CAA ACC AGC AAG 324 TTA CAT ACC GCA TCT CTG GAG TAG GAA TTG ATC AGC CAC CAT ATG GGA TCT TTG 378 TCA TTA ATC AGA AAA CTG GTG AAA TTA ATA TAA CAT CCA TAG TTG ATC GAG AGG 432 TCA CTC CTT TCT TCA TTA TCT ACT GCC GAG CTC TGA ACT CAA TGG GCC AAG ATT 486 TAG AGA GGC CTC TAG AGC TCA GAG TCA GGG TTT TGG ATA TAA ATG ACA ACC CTC 540 CAG TGT TTT CAA TGG CTA CAT TTG CAG GAC AAA TAG AAG AAA ATT CTA ATG CAA 594 ATA CAC TGG TGA TGA TAC TCA ATG CTA CTG ACG CAG ATG AAC CGA ACA ATT TGA 648 ACT CAA AAA TAG CCT TCA AGA TTA TAA GAC AAG AAC CTT CAG ATT CAC CAA TGT 702 TTA TTA TCA ACA GAA ATA CTG GAG AAA TTC GAA CGA TGA ATA ATT TTC TAG ACA 756 GAG AGC AAT ACG GCC AGT ATG CTC TTG CTG TAA GAG GCT CTG ACC GAG ATG GTG 810 GGG CAG ATG GCA TGT CAG CGG AAT GTG AGT GCA ACA TTA AAA TCC TCG ATG TCA 864 ATG ATA ATA TCC CTT ACA TGG AAC AGT CTT CAT ATA CCA TAG AAA TTC AAG AAA 918 ATA CTC TAA ATT CAA ATT TGC TCG AGA TTA GAG TAA TTG ATT TGG ATG AAG AGT 972 TCT CAG CTA ACT GGA TGG CAG TAA TTT TCT TTA TCT CTG GAA ATG AAG GAA ATT 1026 GGT TTG AGA TAG AAA TGA ATG AAA GAA CAA ATG TGG GAA TTT TAA AGG TTG TTA 1080 AGC CCT TAG ATT ATG AAG CTA TGC AGA GTC TGC AAC TCA GTA TTG GTG TCA GAA 1134 ATA AAG CTG AAT TTC ATC ATT CAA TTA TGT CTC AAT ATA AAC TGA AAG CAT CTG 1188 CAA TTT CTG TGA CTG TGT TAA ATG TAA TTG AAG GCC CAG TGT TTC GTC CAG GTT 1242 CAA AGA CAT ATG TTG TAA CTG GTA ATA TGG GAT CAA ATG ATA AAG TGG GAG ACT 1296 TTG TAG CTA CTG ACC TGG ACA CAG GTA GAC CTT CAA CGA CTG TTA GGT ATG TAA 1350 TGG GAA ATA ATC CAG CTG ACC TGC TAG CTG TTG ATT CAA GAA CAG GCA AAC TCA 1404 CTT TGA AAA ATA AAG TTA CCA AGG AAC AGT ACA ATA TGC TCG GAG GAA AAT ACC 1458 AAG GAA CGA TTC TCT CTA TAG ATG ATA ATC TTC AAA GAA CTT GCA CTG GTA CAA 1512 TTA ATA TTA ACA TTC AAA GTT TTG GTA ATG ACG ACA GGA CTA ATA CAG AGC CGA 1566 ACA CTA AAA TTA CTA CCA ATA CTG GCA GAC AAG AAA GTA CTT CTT CCA CTA ACT 1620 ATG ATA CCA GCA CAA CTT CTA CTG ACT CTA GCC AAG TAT ATT CTT CTG AAC CCG 1674 GAA ACG GAG CCA AAG ATT TGT TAT CAG ACA ATG TAC ATT TTG GTC CTG CTG GCA 1728
Figure 32. Séquence nucléique codant pour la région extracellulaire de la desmogléine 1 humaine. Les séquences sur lesquelles s’hybrident les amorces utilisées pour les différentes amplifications par PCR sont surlignées en couleur. Un fragment d’ADN codant pour le peptide signal (S) et pour le propeptide (P) de la Dsg1 sont amplifiés par PCR « nichée » à partir des ADNc générés par transcription reverse en utilisant les amorces SP sens et SP reverse comme amorces externes et les amorces SP-BamH I et SP-Hind/Pfl23 II comme amorces internes. Le fragment d’ADNc codant pour les domaines extracellulaires EC1 à EC5 de la protéine est obtenu par PCR en utilisant les amorces rEC1/5-S et rEC1/5-R, s’hybridant respectivement à l’extrémité 5´ de la séquence codant pour le domaine EC1 et à l’extrémité 3´ de celle codant pour le domaine EC5. Les exons (E) sont indiqués sous la séquence nucléique.
Matériels & Méthodes
130
Les produits de PCR (180 pb), préalablement contrôlés sur gel, sont purifiés par le
kit Qiaquick Gel Extraction (Qiagen Inc.) et quantifiés en référence au marqueur de taille
100 bp (GibcoBRL Life technologies) après migration électrophorètique sur un gel
d’agarose à 1,5%. Les ADNc SP et le vecteur pGEM4Z (Promega, Madison, WI) sont
ensuite double digérés par les enzymes de restriction BamH I et Hind III (New England
Biolabs Inc., Beverly, MA) (Tableau 23). Les produits digérés sont contrôlés sur gel
d'agarose 1%, purifiés et quantifiés comme précédemment décrit. La ligation de l’insert
(17 ng) avec le vecteur pGEM4Z (83 ng) s'effectue durant 1 h à 37°C en présence d’1 unité
(U) de T4 DNA ligase (New England Biolabs Inc.) diluée dans son tampon. Cinq µl du
milieu de ligation sont ajoutés à 100 µl de bactéries compétentes DH5α (GibcoBRL Life
technologies). Une incubation de 30 min dans la glace et un choc thermique de 45 sec à
42°C suivis d’une incubation de 2 min dans la glace permettent la transformation des
bactéries compétentes. Les bactéries transformées sont cultivées 1 h à 37°C dans 500 µl
de milieu LB liquide (10 g/l de N-bactotryptone, 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCl).
La solution bactérienne est étalée à raison de 100 µl sur un milieu LB-agar : LB liquide,
15 g/l d'agar, contenant 50 µg/ml d'ampicilline. Les boîtes sont incubées la nuit à 37°C.
Le vecteur pGEM4Z possède un gène de résistance à l'ampicilline. Seules les bactéries
ayant incorporées le plasmide se développent sur le milieu de sélection contenant
l'antibiotique. Afin de ne sélectionner que les clones transformés par le plasmide
recombinant, une PCR de vérification sur colonie est réalisée en utilisant les amorces
M13S (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' et M13R (5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3')
(Tableaux 24 et 25).
Tableau 23. Composition du mélange réactionnel de la double digestion par les enzymes de restriction BamHI et Hind III
* : cette étape de digestion est suivie par une incubation de 10 min à 65°C.
pGEM4Z Produit de PCR SP
Matrice 300 ng 5 µg Tampon BamH I 10X 5 µl 5 µl BamH I (1U/µl) 1 µl 5 µl Hind III (1U/µl) 1 µl 5 µl BSA 100X 0,5 µl 0,5 µl Eau Qsp 50 µl °C/min 37°C/60 min*
Matériels & Méthodes
131
Tableau 24. Composition du mélange réactionnel de la PCR utilisant les amorces M13
Réactifs Volumes
Matrice ADNc
Mélange des 4 dNTPs (40 mM chacun)
Inoculum bactérien
0,75 µl
Tampon de la TaqDNA Polymérase 5 µl
Amorces M13S (100 pmol/µl) + M13R (100 pmol/µl) 0,25 µl + 0,25 µl
MgCl2 25 mM
BSA
3 µl
0,25 µl
TaqDNA Polymérase (MBI Fermentas) 2,5 U
H2O q.s.p. 50 µl
Tableau 25. Phases de la réaction de PCR utilisant les amorces M13
Phases Durée Température Nombre de cycles
Dénaturation initiale
3 min 94 °C 1
Dénaturation 1 min 94 °C
Hybridation 30 s 55 °C
Elongation 30 s 72 °C
35
Elongation finale
5 min 72 °C 1
La taille des produits de PCR (650 pb) est ensuite contrôlée par électrophorèse sur
un gel d’agarose à 1,5%. Les clones positifs comportant un insert ayant la taille attendue,
sont repiqués sur du milieu LB-agar (ampicilline 50 µg/ml) et cultivés durant la nuit à
37°C. Une préculture de 2 ml de LB (ampicilline 50 µg/ml) est ensemencée avec chaque
clone et incubée durant 8 h à 37°C. La culture bactérienne est centrifugée à 5000 g
durant 10 min à 4°C. L’extraction plasmidique est réalisée à l’aide du kit Qiagen plasmid
purification (Qiagen Inc.). Après vérification de sa taille par électrophorèse sur un gel
d’agarose, l’ADN plasmidique est quantifié par spectrophotométrie à 280 nm. La séquence
ADN du plasmide comportant l’insert est séquencée en utilisant le kit Big Dye®
Terminator v3.1 Cycle sequencing (Applied Biosystems, Warrington, UK) à l’aide des
amorces M13S et M13R (Tableaux 26 et 27).
Matériels & Méthodes
132
Tableau 26. Composition du mélange réactionnel de séquençage sur le séquenceur 16 capillaires AB3100 (Applied Biosystems)
Réactifs Volumes
Matrice ADN (30 à 100 ng) 1 µl
Tampon 5X (Applied Biosystems) 1,5 µl
Amorces M13 (3,2 µM) 1 µl
Prémix du kit (Applied Biosystems) 1 µl
Eau 5,5 µl
Tableau 27. Phases de la réaction de séquençage sur le séquenceur 16 capillaires AB3100 (Applied Biosystems)
Phases Durée Température Nombre de cycles
Dénaturation initiale
2 min 95 °C 1
Dénaturation 10 sec 96 °C
Hybridation 5 sec 50 °C
Elongation 3 min 72 °C
30
Les produits sont ensuite purifiés de la manière suivante : 1 µl d’EDTA 125 mM, 1
µl d’acétate de sodium et 25 µl d’éthanol 100% sont ajoutés à chacun des essais. Le
mélange est incubé 15 min à température ambiante puis centrifugé 30 min à 1200 g. Le
surnageant est éliminé, le culot d’ADN est lavé avec 35 µl d’éthanol 75% et centrifugé 10
min à 1200 g. Le surnageant est éliminé et le culot préalablement séché est repris dans
15 µl de formamide (Sigma). Les réactions de séquences sont transférer sur la plaque du
séquenceur capillaire et dénaturé 2 min 30 à 95°C puis, analysées avec le séquenceur 16
capillaires AB3100 (Applied Biosystems). Les séquences obtenues sont comparées, grâce
au programme BLAST, à celles contenues dans les banques de données disponibles sur
Internet.
Matériels & Méthodes
133
Le vecteur pGEM4Z comportant l’insert SP (5 µg) subit une double digestion par
les enzymes de restriction Pfl23 II (10 U) (MBI Fermentas) et Hind III (6 U) (New England
Biolabs Inc.) durant une nuit à 37°C pour permettre l'introduction de séquences dites
« TAG » codant pour le peptide FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) et 6 résidus
histidine ainsi qu’un codon stop. Ces séquences sont clonées dans le vecteur digéré par la
technique des dimères d’oligonucléotides. Elles utilisent 2 oligonucléotides
complémentaires en leur centre et protubérants à leurs extrémités en site de restriction
Pfl23 II et Hind III : FLAG-S, 5'-GTACG-GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG-CAT
CAT CAC CAT CAC CAT-TA-3' (site Pfl23 II-FLAG-His-STOP, site Hind III); FLAG-R, 3'-
AGC-TTA-ATG GTG ATG GTG ATG ATG-CTT GTC ATC GTC GTC CTT GTA GTC-C-3'
(site Hind III-STOP-His, FLAG-site Pfl23 II). L’oligonucléotide FLAG-S (100 pmol) subit
une phosphorylation en présence d’ATP (1 mM) grâce à la T4 polynucleotide kinase
(New England Biolabs Inc.) durant 30 min à 37°C puis l’étape de ligation est réalisée
comme décrite dans le tableau 28. Les étapes de transformation des bactéries
compétentes, de criblage par PCR des clones positifs et de séquençage grâce aux
amorces M13 sont identiques à celles décrites précédemment. Le vecteur pGEM4Z-SP-
TAG résultant contient un site de clonage unique Pfl23 II permettant le clonage de
l’insert codant pour la région EC de la Dsg1 et des séquences TAG utilisables pour
contrôler sa production par immunoempreinte ainsi que sa purification par
chromatographie d’affinité (Figure 33).
Tableau 28. Conditions expérimentales de la ligation entre le vecteur pGEM4Z-SP et les séquences codant les peptides FLAG et Histidine
Réactifs
pGEM4Z-SP double digéré 3 pmol
Oligo FLAG-R 3 pmol
Oligo FLAG-S phosphorylé 3 pmol
Eau Qsp 17 µl
Hybridation des oligonucléotides 5 min à 80°C puis refroidissement à
température ambiante
T4 DNA ligase 1 U/µl (Biolaps)
1 µl
Tampon de la T4 DNA ligase 10X
Ligation
2µl
3 h à température ambiante
Matériels & Méthodes
134
pGEM4Z
pGEM4Z
CCCGGGAGTCCCGAGATGGACTGGAGTTTCTTCAGAGTAGTTGCAGT BamH I Peptide signal
GCTGTTCATTTTTCTGGTGGTGGTAGAAGTTAACAGTGAATTCCGAAT Propeptide
CCAGGTAAGAGATTATAACACTAAAAATGGCACCATCAAATGGCATT
CAATCCGAAGGCAGAAACGTACGGACTACAAGGACGACGATGACAA Pfl23 II FLAG GCATCATCACCATCACCATTAAGCTTGTCTCCC Histidines Stop Hind III Figure 33. Structure de la « cassette » de clonage du vecteur pGEM4Z-SP-TAG.
Clonage de la région extracellulaire de la desmogléine 1
La séquence d’ADN codant pour la région EC de la Dsg1 humaine est amplifiée par
PCR à partir des ADNc générés à l’aide des amorces rEC1/5-S (5´-GAA TGG ATC AAG
TTC GCA GCA GCC-3´) et rEC1/5-R (5´-CGG CGT ACG AGG ACC AAA ATG TAC ATT
GTC TG-3´) (Figure 32, tableaux 29 et 30). Les produits de PCR (1497 pb), préalablement
contrôlés sur gel, sont purifiés et quantifiés comme précédemment décrit. Le produit de
PCR rEC1/5-Dsg1 et le vecteur cassette sont digérés par l’enzyme Pfl23 II (Tableau 31).
Les produits digérés sont contrôlés sur gel d'agarose 0,8%, purifiés et quantifiés comme
précédemment décrit. La ligation de l’insert (25 ng) avec le vecteur cassette préalablement
déphosphorylé (175 ng) s'effectue durant 1 h à 37°C en présence d’1 U de T4 DNA ligase
(New England Biolabs Inc.). Les étapes de transformation des bactéries compétentes, de
criblage par PCR des clones positifs et de séquençage grâce aux amorces M13 sont
identiques à celles décrites précédemment.
Matériels & Méthodes
135
Tableau 29. Composition du mélange réactionnel pour l’amplification par PCR de la
séquence ADNc codant pour la région extracellulaire de la Dsg1
Réactifs Volumes
Matrice (ADNc) 1 µl
Mélange des 4 dNTPs (10 mM chacun) 1,5 µl
Tampon de la TaqDNA Polymérase 10X
MgCl2 25 mM
10 µl
6 µl
Amorces rEC1/5-S (100 pmol/µl) + rEC1/5-R (100 pmol/µl) 0,5 µl + 0,5 µl
TaqDNA Polymérase (MBI Fermentas) 0,5 µl
BSA
H2O
0,5 µl
q.s.p. 100 µl
Tableau 30. Phases de la réaction de PCR pour l’amplification de la séquence ADNc codant pour la région extracellulaire de la Dsg1
Phases Durée Température Nombre de cycles
Dénaturation initiale 3 min 94 °C 1
Dénaturation 1 min 94 °C
Hybridation 1 min 30 58 °C
Elongation 3 min 72 °C
35
Elongation finale 10 min 72 °C 1
Tableau 31. Mélange réactionnel de la digestion par l’enzyme Pfl23 II
* : cette étape de digestion est suivi par une incubation de 10 min à 65°C
Vecteur cassette Produit de PCR rEC1/5-Dsg1
Matrice 150 ng 6 µg Tampons Y+/Tango™ 5 µl 5 µl Pfl23 II (3U/µl) 2 µl 2 µl
BSA 100X 0,5 µl 0,5 µl Eau Qsp 50 µl °C/min 37°C/une nuit*
Matériels & Méthodes
136
Préparation du vecteur de transfert
Le vecteur pGEM4Z-SP-TAG est double digéré par les enzymes BamH I et Hind III
(New England Biolabs Inc.) pour permettre l’introduction de la cassette comportant
l’insert rEC1/5-Dsg1 dans le vecteur de transfert p119 [Chaabihi, 1993] double digéré
par les enzymes Bgl II et Hind III (Tableau 32). Après leurs purifications et quantifications,
la ligation de la cassette rEC1/5-Dsg1 (45 ng) avec le vecteur p119 (155 ng) s'effectue
durant 1 h à 37°C en présence d’1 U de T4 DNA ligase (New England Biolabs Inc.) L’étape
de transformation des bactéries compétentes est réalisée comme précédemment décrite.
Le criblage des clones bactériens est réalisé par la PCR utilisant les amorces de clonage
(rEC1/5-S et rEC1/5-R). Les plasmides sont extraits et séquencés avec l’amorce p119S
(5'-GAA TCA TTC CAG CTT TTG GAC-3) selon le protocole déjà décrit. Une culture de 200
ml de milieu est ensemencée avec le clone bactérien d’intérêt (cultivé en préculture de 2ml
de milieu) et incubée une nuit à 37°C. Le vecteur de transfert comportant l’insert rEC1/5-
Dsg1 est ensuite extrait à l’aide du kit Qiagen plasmid purification (Qiagen Inc.).
Tableau 32. Composition du mélange réactionnel de la double digestion du
vecteur de transfert p119
* : cette étape de digestion est suivie par une incubation
de 10 min à 65°C.
Cotransfection des cellules d’insectes et production du virus recombinant
Les cellules d'insectes Sf9 (Spodoptera frugiperda) sont co-transfectées avec le
vecteur de transfert recombinant et l'ADN viral AcSLP10 [Chaabihi, 1993] par lipofection
[Felgner and Ringold, 1989]. Il y a alors infection des cellules d’insectes puis synthèse de
particules virales. AcSLP10 est un baculovirus modifié possédant une copie du gène
codant pour la protéine polyédrine placée sous le contrôle du promoteur de la protéine
P10. La recombinaison homologue entre le virus et le vecteur de transfert recombinant
aboutit à la création d'un virus recombinant dans lequel le gène codant pour la polyédrine
a été remplacé par la cassette recombinante. Les virus recombinants sont isolés par la
technique des plages de lyse [Summers et Smith, 1987] (Figure 34).
p119
Matrice 10 µg
Tampon 2 10X 5 µl
Bgl II (10 U/µl) 1 µl
Hind III (20 U/µl) 0,5 µl
Eau Qsp 50 µl
°C/min 37°C/une nuit*
Matériels & Méthodes
137
Figure 34. Organigramme des étapes expérimentales de la purification des baculovirus recombinants par la technique des plages de lyse
1PREPARATION DES CELLULES SF9 Les cellules sont réparties en plaque de culture 24 puits
(2.106/puits) � 1 h à température ambiante
2 DILUTION VIRALE Le virus à purifier est dilué en série dans du milieu TGV3
3 INFECTION Les dilutions virales sont ajoutées aux puits de culture après
élimination du surnageant (1 plaque/dilution) � 1 h à température ambiante
4 COULAGE D’AGAROSE 2 ml d’une solution d’agarose (0,6 g d’agarose, 15 ml d’eau, 44 ml
de milieu TGV3) est coulée dans chaque puits de culture � A température ambiante jusqu’à l’apparition des plages de lyse
5 COLORATION AU ROUGE NEUTRE 1 ml de rouge neutre (dilué au 1 : 15 dans du milieu TGV1) est
déposé dans chaque puits � 1 h à température ambiante et élimination du rouge neutre
� 1 nuit à température ambiante
6 CAROTTAGE Les plages de lyse avec occlusion négative, repérées au
microscope, sont prélevées par carottage � Conservation à 4°C de la carotte dans 1 ml de mili eu TGV3
Matériels & Méthodes
138
Les plages de lyse à phénotype « occlusion négative » sont différenciées de celles à
phénotype « occlusion positive ». En effet, lorsque les cellules d’insectes sont infectées par
un virus non recombinant, le gène de la polyédrine est exprimé et l’apparition d’inclusions
sous forme de polyèdres est observée; il s’agit du phénotype « occlusion positive ». Lorsque
les cellules d’insectes sont infectées par un virus recombinant, le gène de la polyédrine est
substitué par l’insert recombinant, aucun polyèdre n’est observé; il s’agit du phénotype «
occlusion négative ». Les plages de lyse qui correspondent à un virus recombinant sont
dénombrées afin de déterminer le titre viral du surnageant initial. L’isolement des virus
recombinants se fait en prélevant par carottage les plages de lyse isolées.
Les virus recombinants sont ensuite amplifiés de la façon suivante. Une
suspension cellulaire à 106 cellules Sf9/ml de milieu Sf900 II (Invitrogen) est cultivée 1h à
température ambiante. Le surnageant est éliminé, la suspension virale (0,3 ml) et du
milieu Sf900 II, SVF 2,5% sont ajoutés à la culture qui est incubée 1 h à température
ambiante. Les cellules sont ensuite cultivées 4 à 5 j à température ambiante après
addition de milieu Sf900 II, SVF 2,5% (4 ml). Le surnageant de culture et le culot
cellulaire sont récupérés après centrifugation 5 min à 5000 rpm, 4°C et conservés. Une
seconde amplification est réalisée à partir des clones issus des surnageants de
l’amplification précédente ceci, dans le but d’obtenir un stock de virus nécessaire à la
production de la protéine. Les protéines contenues dans les surnageants et les culots
cellulaires récupérés à la suite des 2 amplifications successives sont séparées par une
électrophorèse SDS (sodium dodecyl sulfate)-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS-
PAGE) dans un gel de polyacrylamide de porosité 14% (Tableau 33) et analysés par
immunoempreinte en utilisant un Ac anti-FLAG (Sigma) et des Ac secondaires de chèvre
anti-IgG de souris couplés à peroxydase selon la procédure expérimentale décrite
ultérieurement.
Tableau 33. Composition du gel de polyacrylamide de porosité 14% utilisé pour la séparation électrophorètique des protéines par SDS-PAGE
Solution Gel de
séparation* Gel de
concentration**
Acrylamide/,BIS 40% Tris 1 M pH 8,8 Tris 0,375 pH 6,8 SDS 10% Persulfate d’ammonium 50 g/l TEMED Eau
8,75 ml 9,4 ml
250 µl 625 µl 6,25 µl 3,04 ml
1,2 ml
4,2 ml 125 µl 1 ml 5 µl
6,1 ml
* : pour 4 mini-gels (7 cm x 6,5 cm x 1mm) ou 2 gels criterion (11 cm x 8 cm x 1 mm); ** : Ce gel de concentration est substitué par un gel d’agarose 0,1% pour la fabrication des gels utilisés lors de l’électrophorèse bidimensionnelle.
Matériels & Méthodes
139
Production et purification de la protéine rEC1/5-Dsg1
La cinétique d’expression est réalisée avec les cellules Sf9 infectées avec le
baculovirus recombinant codant pour la protéine rEC1/5-Dsg1 à des unités de
multiplicité d’infection (m.o.i) de 1, 2, 5 ou 10. A différents temps, un aliquot de
surnageant est prélevé pour être analysé en immunoempreinte avec l’Ac anti-FLAG.
Pour une expression à large échelle, 5×108 cellules Sf9 sont infectées durant 1h avec
20 ml de milieu contenant le virus recombinant à une m.o.i de 1 puis, sont transférées
dans 480 ml de milieu Sf900 II (Invitrogen) et cultivées à 28°C durant 96 h. La
suspension cellulaire est ensuite centrifugée 15 min à 5000 rpm et le surnageant est
récupéré et conservé à -80°C en vue de la purification de la baculoprotéine rEC1/5-
Dsg1.
Le surnageant contenant la protéine rEC1/5-Dsg1, comportant la séquence
FLAG, est introduit dans une colonne de chromatographie d’affinité anti-FLAG
équilibrée avec une solution de 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4 (TBS), 30
µg/ml E64 (Roche, Mannheim, Germany), leupeptine à 10 µg/ml et pepstatine à 10
µg/ml. La colonne est lavée avec 40 ml de tampon TBS et la protéine fixée est éluée
par compétition avec 15 ml d’une solution de TBS contenant l’octapeptide FLAG (0,1
mg/ml). Des fractions (1 ml) sont collectées, séparées par électrophorèse SDS-PAGE et
analysées par immunoempreinte avec l’Ac anti-FLAG. Les fractions contenant la
protéine recombinante sont rassemblées et subissent une concentration à l’aide de
centrifugation sur des filtres Ultrafree-15 (Millipore, Billerica, MA).
2/ SYNTHESE DE LA FORME TRONQUEE DE LA DESMOGLEINE 1
L’isoforme tronquée de la Dsg1 a été obtenue sous une forme recombinante,
appelée EC1/2-INT6, en utilisant un système de transcription/traduction in vitro.
Amplification de l’ADNc codant pour la protéine EC1/2-INT6
Les ADNc générés à partir des ARN totaux extraits de l’épiderme humain (méthode
décrite précédemment) sont utilisés pour amplifier par PCR la séquence codante pour la
protéine EC1/2-INT6. Dans un volume total de 100 µl, 10 µl d’ADNc sont mis en présence
de 0,5 µM de chaque amorce (amorce sens : 5´-GAA TGG ATC AAG TTC GCA GCA G-3´ et
amorce reverse : 5´-TTA CTT TGT CTT ATG TAA AGT TCT TTG-3´) (GibcoBRL Life
technologies) (Tableau 34 et 35). Les produits de PCR sont purifiés par le kit Qiaquick Gel
Extraction (Qiagen Inc.) et quantifiés en référence au marqueur de taille 100 bp
(GibcoBRL Life technologies) après électrophorèse sur un gel d’agarose à 3%.
Matériels & Méthodes
140
Tableau 34. Composition du milieu réactionnel de PCR pour l’amplification de la séquence ADNc codant pour la protéine EC1/2-INT6
Réactifs Volumes
Matrice (ADNc) 5 µl
Mélange des 4 dNTPs (10 mM chacun) 1 µl
Tampon de la TaqDNA Polymérase 5 µl
Amorces sens (100 pmol/µl) + antisens (100 pmol/µl) 0,25 µl + 0,25 µl
TaqDNA Polymérase DyNazyme™ EXT (Finnymes Oy) 1µl
H2O q.s.p. 50 µl
Tableau 35. Phases de l’amplification par PCR de la séquence ADNc codant pour la protéine EC1/2-INT6
Phases Durée Température Nombre de cycles
Dénaturation initiale
3 min 94 °C 1
Dénaturation 1 min 94 °C
Hybridation 1 min 61 °C
Elongation 1 min 72 °C
35
Elongation finale 5 min 72 °C 1
Clonage de l’insert codant pour la protéine EC1/2-INT6
Les amplimères sont digérés durant une nuit à 37°C dans un volume total de 50 µl
contenant 522 ng d'ADNc codant pour EC1/2-INT6 et 20 U des enzymes de restriction ;
ApaI et BamHI (Stratagene, La Jolla, CA) dans leur tampon respectif. Le vecteur de
traduction in vitro pSPUTK (Stratagene) est digéré 2 h à 37°C dans les mêmes conditions
réactionnelles. L’insert EC1/2-INT6 et le plasmide pSPUTK digérés sont respectivement
purifiés à l'aide des kits QIAquick gel extraction et Qiagen plasmid purification (Qiagen
Inc.) et quantifiés après migration par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,5% en
référence au marqueur de bas poids moléculaire (GibcoBRL Life technologies). La ligation
de l’insert (120 ng) avec le vecteur pSPUTK (250 ng) s'effectue durant une nuit à 16°C en
présence de 20 U/µl de T4 DNA ligase (New England Biolabs Inc.) diluée dans son
tampon. Dix µl du milieu de ligation sont ajoutés à 100 µl de bactéries compétentes DH5α
Matériels & Méthodes
141
(GibcoBRL Life technologies). La transformation des bactéries compétentes et leur culture
ont été décrites précédemment.
Le vecteur pSPUTK possède un gène de résistance à l'ampicilline. Seules les
bactéries ayant incorporées le plasmide se développent sur le milieu de sélection
contenant l'antibiotique. Afin de ne sélectionner que les clones transformés par le
plasmide recombinant, une PCR de vérification sur colonie est réalisée en utilisant les
amorces SP6 (5´-ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT A-3´) et T7 (5´-GTA ATA CGA CTC ACT
ATA GGG C-3´) (Invitrogen) spécifiques des séquences qui flanquent le site de clonage du
vecteur pSPUTK (Tableau 36 et 37).
Tableau 36. Composition du mélange réactionnel de la PCR utilisant les amorces SP6 et T7
Réactifs Volumes
Matrice (ADNc) Inoculum bactérien
Mélange des 4 dNTPs (10 mM chacun) 1 µl
Tampon de la TaqDNA Polymérase 5 µl
Amorces SP6 (100 pmol/µl) + T7 (100 pmol/µl) 1 µl + 01 µl
TaqDNA Polymérase (Roche) 0,25 µl
H2O q.s.p. 50 µl
Tableau 37. Phases de la réaction de PCR utilisant les amorces SP6 et T7
Phases Durée Température Nombre de cycles
Dénaturation initiale
5 min 94 °C 1
Dénaturation 1 min 94 °C
Hybridation 1 min 51 °C
Elongation 1 min 72 °C
30
Elongation finale
5 min 72 °C 1
Matériels & Méthodes
142
La taille des amplimères est vérifiée par électrophorèse sur un gel d’agarose à 0,8%
en référence au marqueur de taille 1kb (New England Biolabs Inc.). Les clones positifs
comportant un insert ayant la taille attendue, sont repiqués sur du milieu LB-agar
(ampicilline 50 µg/ml) et cultivés durant une nuit à 37°C. Une préculture de 2 ml de LB
(ampicilline 50 µg/ml) est ensemencée avec chaque clone et incubée durant 8 h à 37°C.
Une culture de 200 ml du même milieu est ensemencée avec 200 µl de préculture. Les
bactéries transformées sont ensuite cultivées une nuit à 37°C. La culture bactérienne est
centrifugée à 5000 g durant 10 min à 4°C. L’extraction plasmidique est réalisée à l’aide
du kit Qiagen plasmid purification (Qiagen Inc.). Après vérification de sa taille par
électrophorèse sur un gel d’agarose, l’ADN plasmidique est quantifié et séquencé (à l’aide
des amorces SP6 et T7) comme précédemment décrit.
Synthèse in vitro de la protéine EC1/2-INT6
La production de la protéine EC1/2-INT6 est réalisée grâce au système TNT® SP6
quick coupled transcription/translation (Promega) qui combine les réactions de
transcription et de traduction in vitro de protéines eucaryotes dans un lysat de
réticulocytes de lapin. Ce système utilise le promoteur SP6 présent sur le plasmide
pSPUTK in vitro Translation Vector (Stratagene) dans lequel est cloné l’insert codant pour
la protéine EC1/2-INT6. La synthèse est réalisée dans un volume réactionnel de 50 µl
comprenant 2 µg de vecteur recombinant incubés avec 40 µl de TNT® SP6 quick Master
Mix (extrait de réticulocytes), 1 µl de méthionine (1 mM) et 2 µl de Transcend™ tRNA
pendant 1 h 30 à 30°C. Ce mélange réactionnel est ensuite dilué dans 100 µl de tampon
TBS et incubé 7 min à 30°C. Après 2 lavages avec du tampon TBS, 100 µl de billes
d'avidine SoftLink™ (Promega) sont mis en contact avec ce mélange réactionnel et
homogénéisés toutes les 15 min pendant 1 h à 4°C. La purification des protéines
traduites in vitro est basée sur l'affinité de la biotine pour l'avidine. En effet durant la
traduction, l'utilisation de Transcend™ tRNA (Promega) permet d'incorporer à la protéine
en cours de synthèse des résidus lysine biotinylés (Figure 35). Après 5 lavages avec du
tampon TBS, les protéines fixées sur les billes sont décrochées par l’ajout de 75 µl d’une
solution de Laëmmli (Tris 0,5 M pH 6,8, glycérol 20%, SDS 40%, bleu de Bromophénol
0,009%, DTT 10%) et chauffage pendant 5 min à 100°C. La production de la protéine est
ensuite contrôlée, après migration électrophorètique SDS-PAGE dans un gel de
polyacrylamide de porosité 14% (Tableau 33), par immunoempreinte en utilisant de la
streptavidine couplée à la peroxydase (Promega) et une révélation par
chimioluminescence.
Matériels & Méthodes
143
Figure 35. Structure du Transcend™ tRNA utilisé comme système de purification et de détection des protéines synthétisées par transcription/traduction in vitro. La lysine portée par l’ARN de transfert (ARNt) est liée par l’intermédiaire d’un bras espaceur, à une molécule de biotine. Les protéines en cours de traduction incorporent des résidus lysine biotinylés. Ce système permet à la fois la purification (basée sur l’affinité) des protéines synthétisées in vitro, sur une résine couplée à des molécules d’avidine ainsi que leur détection par immunoempreinte en utilisant de la streptavidine couplé à la peroxydase.
D- La production et la caractérisation d’anticorps monoclonaux
anti-desmogléine 1 et d’anticorps polyclonaux dirigés contre son
isoforme tronquée
Afin de mettre en évidence l’expression de l’isoforme tronquée de la Dsg1 dans
l’épiderme humain, nous avons adopté une stratégie expérimentale basée sur la
production de 2 anti-sérums spécifiquement dirigés contre cette protéine : le premier
produit chez le lapin est dirigé contre le peptide de la région EC2 (184-194) ; et le second
produit chez la souris est dirigé contre le peptide INT6 (Figure 35). Par ailleurs, afin
d’obtenir des Acm anti-Dsg1, des souris CD1 et BALB/c ont été immunisées avec la
baculoprotéine rEC1/5-Dsg1 purifiée.
ARNt
Lysine Bras espaceur Biotine
Matériels & Méthodes
144
Figure 36. Représentation schématique des principales étapes de la production d'Ac polyclonaux anti-peptides de l’isoforme tronquée de la Dsg1. Deux peptides synthétiques correspondants à des séquences présentes sur l'isoforme tronquée de la Dsg1, les peptides EC2(184-194) et INT6 (1), sont couplés à la thyroglobuline bovine (TB) sous l'action d'une solution de glutaraldéhyde 0,025 M, selon le système haptène/protéine porteuse (2). Des lapins NZW et des souris CD1 sont respectivement immunisés avec les peptides EC2 et INT6 couplés à la TB (3). La présence d'IgG dirigées contre ces peptides dans le sérum des animaux est recherchée par des techniques d'ELISA utilisant les peptides comme Ag et d'immunoempreinte utilisant la protéine EC1/2-INT6 (isoforme tronquée recombinante) comme Ag (4).
ELISA peptides
INT
6
S P EC1 EC2 INT6
C N
+
184ADEPNNLNSK194
EC
2
IYNVEPTFQRTLHKTK
+
Thyroglobuline
Peptides
1
3 3
4 4
22
Isoforme tronquée de la Dsg1
Immunoempreinte sur EC1/2-INT6
Matériels & Méthodes
145
1/ COUPLAGE DES PEPTIDES A LA THYROGLOBULINE BOVINE
Deux peptides de l’isoforme tronquée de la Dsg1 ont été synthétisés, purifiés
(pureté >99%) et contrôlés par spectrométrie de masse (INSERM U413, IFRMP23, Mont
Saint Aignan, France) en vue du protocole d’immunisation : le peptide INT6
(IYVNVEPTFQRTLHKTK) codé par une séquence présente sur l’insertion intronique
(intron 6) et spécifique de l’isoforme tronquée de la Dsg1 ; le peptide EC2(184-193)
(ADEPNNLNSK) choisi sur des critères d’hydrophobicité, d’accessibilité et d’antigénicité,
est présent à la fois dans la Dsg1 et la forme tronquée. Ces peptides ont été couplés à la
thyroglobuline bovine (TB), selon le système haptène/protéine porteuse d'après la
procédure expérimentale suivante : 6,5 mg de chaque peptide sont dissous dans 0,5 ml
d’HCl 1 mM et dilués dans 3,5 ml de tampon phosphate 0,05 M pH 7,5 contenant 95 mg
de TB (Sigma). Les solutions sont complétées avec 200 µl de tampon phosphate 0,05 M
pH 7,5. Une solution de glutaraldéhyde 0,025 M (0,1 ml) est ajoutée aux solutions qui
sont ensuite traitées à 5 min d’intervalle avec 9 fois 200 µl de glutaraldéhyde 0,025 M et
400 µl en final. Les mélanges réactionnels de couplage (6,5 ml au total) de chaque peptide
sont dialysés durant 24 h à 4°C contre 1 l de tampon PBS. Les solutions de peptides
couplés sont ajustées à 15 ml, aliquotées et conservées à -20°C.
2/ IMMUNISATION DES ANIMAUX
Des lapins NZW (New Zealand White) et des souris CD1 (Charles River
Laboratories, L’arbresle, France) sont immunisés avec les peptides couplés à la TB selon
le protocole d’immunisation suivant. Les souris et les lapins sont immunisés
respectivement avec 40 µg de peptide INT6 (injection intrapéritonéale) et 200 µg de
peptide EC2(184-193) (injection sous-cutanée) émulsifiés avec de l’adjuvant complet de
Freund (ACF). Des rappels d’immunisation (8 au total) sont exécutés toutes les 3
semaines durant 7 mois avec une quantité identique de peptides couplés et émulsifiés
avec de l’adjuvant incomplet de Freund (AIF).
Des souris CD1 et BALB/c (Charles River Laboratories) sont immunisées (injection
intrapéritonéale) avec la protéine rEC1/5-Dsg1 purifiée (20 µg) émulsifiée avec de l’ACF.
Les rappels d’immunisation (6 au total) sont exécutés tout les 10 j durant 2 mois avec
une quantité identique de protéine émulsifiée avec de l’AIF puis 3 fois pendant la semaine
précédant la fusion cellulaire.
Les prélèvements sanguins précédant chaque immunisation sont opérés sur une
veine auriculaire du lapin et dans le sinus rétro-orbital de la souris puis, soumis à une
décantation à 4°C durant une nuit avant d’être centrifugés 10 min à 3000 rpm. Le sérum
prélevé au dessus du culot de globules rouges est aliquoté et conservé à -20°C.
Matériels & Méthodes
146
3/ DETECTION DE LA PRODUCTION D’ANTICORPS SPECIFIQUES CHEZ LES ANIMAUX
IMMUNISES
ELISA peptides
Les puits de plaques ELISA Maxisorp® (96 puits) (Nalge nunc internationnal,
Roskilde, Danemark) sont recouverts par 100 µl d’une solution de peptide EC2(184-193)
ou INT6 (10 µg/ml) durant une nuit à 4°C. Après 3 lavages avec du tampon PBS-tween
0,1% (PBS-T), les puits sont saturés avec 200 µl de tampon PBS-tween 1%, sucrose 5%,
lait 3% durant 1 h à température ambiante. Les sérums de souris ou de lapin (100 µl),
dilués au 1 :100 dans du tampon PBS-T, sérum albumine bovine 1% sont incubés
pendant 1 h. Après 3 lavages, les puits sont incubés 1 h à température ambiante avec
100 µl d’Ac de chèvre anti-IgG de lapin ou de souris biotinylés (Caltag Laboratories, San
Francisco, CA) (dilués au 1 :10000 dans du tampon PBS-T). Après 3 lavages, les puits
sont incubés avec 100 µl de streptavidine couplée à la phosphatase alcaline (Caltag
Laboratories) (diluée au 1 :10000 dans du tampon PBS-T) pendant 10 min. Enfin, les
puits sont incubés avec 100 µl de solution de substrat (2 pastilles de p-nitrophényl
phosphate, 9 ml de tampon NaCl 1,5 M, 1 ml de tampon Tris 1 M pH 9,8) durant 10 à 30
min à 30°C. Les lectures de densité optique (DO) sont effectuées à 405 nm sur le lecteur
ELISA iEMS (Labosystems, Helsinki, Finland). Les essais sont réalisés en duplicate, et les
valeurs de DO obtenues avec chaque sérum incubé sur des puits non recouverts de
peptides sont soustraites à celles obtenues avec les sérums testés sur des puits
recouverts de peptide. Afin de contrôler la spécificité des essais, les sérums pré-immuns
sont inclus dans chaque expérience.
ELISA rEC1/5-Dsg1
Les puits de plaques ELISA Maxisorp® (Nalge nunc internationnal) sont recouverts
par 100 µl d’une solution de la protéine rEC1/5-Dsg1 purifiée (10 µg/ml) durant une nuit
à 4°C. Après 3 lavages avec une solution de TBS (25 mM Tris-HCl pH 7,4, 136 mM NaCl,
2,6 mM KCl), Tween 0,05% (TBS-T), 1 mM Ca2+, les puits sont saturés avec 200 µl de
TBS-T, 1 mM Ca2+, sucrose 5%, lait 3% durant 1 h à température ambiante. Les puits
sont incubés pendant 1 h avec les sérums de souris (1 : 50) ou les Acm (1 : 100) dilués
dans du tampon TBS-T, 1 mM Ca2+. Après 3 lavages, les puits sont incubés 1 h avec des
Ac de chèvre anti-IgG de souris couplés à la phosphatase alcaline (Rockland, Gilbertsville,
PA) (dilués au 1 : 2000 dans du tampon TBS-T, 1 mM Ca2+). Après 3 lavages, la révélation
s’effectue en incubant les puits avec 100 µl de solution de substrat (2 pastilles de p-
nitrophényl phosphate, 9 ml de tampon NaCl 1,5 M, 1 ml de tampon Tris 1 M pH 9,8)
durant 20 min à température ambiante. Les mesures de DO sont effectuées à 450 nm sur
le lecteur ELISA iEMS (Labosystems). Les essais sont réalisés en duplicate.
Matériels & Méthodes
147
Immunofluorescence indirecte (IFI)
Les sérums des souris CD1 et des lapins NZW immunisés avec les peptides
couplés sont analysés par IFI sur des coupes de peau humaine. Les sérums des souris
CD1 et BALB/c immunisées avec la protéine rEC1/5-Dsg1 ainsi que les Acm produits à
partir de ces souris sont analysés sur des coupes de peau humaine et d’œsophage de
souris. Les sections de tissus sont incubés avec les sérums des animaux immunisés
(1 :25 et/ou 1 :50) ou avec les Acm (1 :100). Après 3 lavages en PBS, les sections sont
incubées avec des Ac de chèvre anti-IgG de lapin couplés au FITC ou des d’Ac de
chèvre anti-IgG de souris couplés au FITC (1 :100) (Sigma). Après lavages, les
préparations sont montées entre lame et lamelle en milieu glycérol et, sont observées
sous un microscope à fluorescence (Zeiss, Jena, Germany).
Immunoempreinte sur extrait protéique d’épiderme humain
L’extraction des protéines de l’épiderme humain est réalisée de la manière
suivante. L’épiderme est séparé du derme par une incubation de la peau humaine de
sujets sains dans une solution de NaCl 1M durant une nuit sous agitation. Les protéines
sont extraites par l’incubation des fragments d’épiderme (détaché du derme) dans une
solution de Tris 65 mM pH 6,8, SDS 2%, DTT 1mM, antiprotéases (10 ng/ml) (Sigma). Le
mélange est ensuite traité aux ultrasons (Vibra Cell, Bioblock Scientific, Illkirch, France),
chauffé 10 min à 100°C et centrifugés 30 min à 15000 rpm. Les solutions sont prélevées,
conservés à -80°C ou utilisées immédiatement, diluées au 1 :2 dans du tampon de
Laëmmli et chauffées 3 min à 100°C. Les protéines sont séparées par une migration
électrophorètique SDS-PAGE de 2 h à 120 V dans un gel de polyacrylamide de porosité
4% Novex® (Invitrogen, Groningen, Netherlands) ou de 14% (Tableau 33). Le marqueur
BenchMark™ (Invitrogen) est utilisé comme standard de poids moléculaire dans toutes
les migrations SDS-PAGE. Après transfert sur une membrane de nitrocellulose Hybond™-
C extra (Amersham pharmacia biotech) durant 2 h à 30 V, les protéines sont colorées au
rouge Ponceau (Sigma) et la membrane est décolorée dans une solution d’acide acétique
5%.
Les protéines fixées sur les bandelettes découpées à partir de la membrane sont
tout d’abord saturées dans du tampon TBS-T, lait 5% durant 1h sous agitation. Après un
lavage avec du tampon TBS-T, les protéines sont incubées 1 h avec les sérums des
animaux (avant et après immunisation) ou avec les Acm (dilués respectivement au 1 : 50
et 1 :100 dans du tampon TBS-T, lait 5%). Après 4 lavages, les bandelettes sont incubées
1 h avec des Ac de chèvre anti-IgG de lapin couplés à la peroxydase (1 : 20 000) ou des Ac
de lapin anti-IgG de souris couplés à la peroxydase (1 : 80 000). Après 4 lavages, les
protéines immunoréactives sont révélées par chimioluminescence à l’aide des solutions
Matériels & Méthodes
148
ECL™ (Amersham pharmacia biotech). Certaines expériences d’immunoempreinte sont
réalisées à l’aide d’une révélation fluorescente à 2 couleurs détectée dans l’infrarouge et
seront détaillées ultérieurement (immunoempreinte à fluorescence infrarouge).
4/ PRODUCTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX
Génération des hybridomes
Les cellules de myélome SPO/2 (ATCC, Manassas, VA) sont cultivées dans du
milieu complet RPMI 1640 (Cambrex Bio Science, Verviers, Belgique), SVF 20%,
antibiotiques-antimycotiques (Gibco), pyruvate 1 mM (Sigma) jusqu’à leur phase
exponentielle de croissance. Après 3 lavages avec du milieu RPMI 1640, les cellules de
myélome et les cellules isolées de la rate des souris produisant des IgG dirigées contre la
Dsg1 (et contre d’autres protéines épidermiques) sont dénombrées à l’aide d’une cellule de
Malassez, après coloration au bleu de Trypan (Gibco BRL). Les 2 suspensions cellulaires
sont ensuite mélangées à raison d’un ratio cellules de myélome/cellules spléniques de
1/5 à 1/10. Le mélange cellulaire est centrifugé 10 min à 1500 rpm, le surnageant est
éliminé et le culot subit une seconde centrifugation de 30 sec à 2500 rpm. Le surnageant
est éliminé et du polyéthylène glycol (PEG) (Sigma) dilué au 1 : 2 avec du milieu RPMI
1640, préalablement chauffé à 37°C, est ajouté au mélange cellulaire à raison de 0,5-1 ml
en 1 min (en agitant le tube dans de l’eau à 37°C pendant) suivi par une agitation douce
de 2 min à l'aide de la pointe de la pipette. Le mélange est dilué avec du milieu RPMI
1640 (2 ml en 2 min puis 7 ml en 3 min). Les cellules centrifugées 10 min à 700 rpm sont
remises en suspension à raison de 105 cellules/ml de milieu complet auquel est ajoutée
une solution d'hypoxanthine 20 µM, thymidine 0,32 µM (HT Media Supplement (50×)
Hybri-Max, Sigma), aminoptérine 4 nM (Sigma), à raison de 2 ml pour 100 ml de
suspension cellulaire. Les cellules sont ensuite réparties dans les puits de plaques de
culture 96 puits (Costar, Cambridge, MA) contenant des macrophages péritonéaux de
souris BALB/c et cultivées à 37°C sous une atmosphère contenant 5 % de CO2 pendant 1
semaine. A partir de 8 j, les clones hybrides apparaissent, le milieu qui les contient est
remplacé par du milieu complet neuf. Lorsque les clones occupent le tiers du puits, les
surnageants sont prélevés dans le but de rechercher la présence d’IgG anti-Dsg1 par les
techniques d’ELISA en utilisant la protéine rEC1/5-Dsg1 comme Ag et par IFI sur coupe
d’épiderme humain. Préalablement à l’étape de clonage, les puits contenant des clones
produisant des IgG dirigés contre les Ag d’intérêt sont transférés dans des puits (2 ml de
milieu complet) de plaque 24 puits (Costar) et peuvent être conservés par congélation une
fois les cellules expandues.
Matériels & Méthodes
149
Clonage des hybridomes
Le clonage est réalisé par dilution limite. Ce procédé consiste à répartir la
suspension cellulaire d’hybridomes pour obtenir une cellule par puits. Les cellules issues
du puits d’intérêt sont diluées avec du milieu complet et, réparties dans les puits de
plaque (96 puits) contenant des thymocytes de souris BALB/c. Les cellules sont ensuite
cultivées à 37°C sous une atmosphère contenant 5 % de CO2 pendant 1 semaine. Lorsque
les puits ne contiennent qu’un seul clone et que sa taille est suffisante, le surnageant est
prélevé pour rechercher la présence d’Ac dirigés contre les Ag épidermiques d’intérêt. Les
puits sont dédoublés afin d’augmenter la taille de la culture et les clones positifs cultivés
sont centrifugés 10 min à 1200 rpm. Le culot cellulaire est resuspendu dans 300 µl de
SVF puis 500 µl de RPMI 1640, SVF 10%, DMSO 20% sont ajoutés avant la conservation
à -80°C du clone numéroté.
E- L’identification des protéines épidermiques cibles par
immunocriblage
1/ IMMUNOCRIBLAGE DE CARTE PROTEIQUE 2D D’EPIDERME HUMAIN (Figure 37)
Préparation d’un extrait protéique d’épiderme humain
La procédure expérimentale utilisée pour l’extraction des protéines est adaptée de
celle décrite par Görg et al [Görg, 1997]. L'épiderme humain provenant de plastie
mammaire et séparé mécaniquement du derme au scalpel, est tout d’abord broyé dans
l'azote liquide. La poudre obtenue est mise en suspension une solution d’acétone, TCA
(Acide trichloracétique) 10%, DTT 0,12%. Les tubes sont ensuite placés une nuit à -20°C
(pour éviter la dénaturation des protéines par les solvants organiques) puis centrifugés à
15000 g durant 30 min à 4°C. Les culots sont resuspendus dans une solution d’acétone,
DTT 0,2% et placés 1 heure à -20°C. Les essais sont centrifugés 30 min à 15000 g (4°C)
puis les culots sont séchés jusqu'à une déshydratation complète. Les culots sont ensuite
resuspendus dans une solution de lyse : urée 9 M, CHAPS (ou 3-[(3-chlolamido-
propyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate) 2%, DTT 1% et la suspension est incubée
1 h à température ambiante. Un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Sigma) est alors
ajouté aux essais qui subissent ensuite un traitement aux ultrasons. L’étape finale de la
préparation de l’extrait protéique consiste en une centrifugation à 15000 g durant 20
minute (4°C).
Matériels & Méthodes
150
Figure 37. Représentation schématique des principales étapes de l’identification de protéines cibles d’anticorps par immunocriblage de carte protéique 2D couplé à la spectrométrie de masse. Les tissus sont préparés ou les cellules cultivées (1). Les protéines sont extraites (2) et séparées par une électrophorèse bidimensionnelle (3). Les protéines sont transférées sur une membrane avec laquelle, une immunoempreinte est exécutée en utilisant l’Ac d’intérêt (4). La protéine immunoréactive est repérée sur le gel bidimensionnel coloré au bleu de Coomassie (Carte protéique 2D) (4’), excisée de la carte protéique 2D et digérée par la trypsine. Un spectre de masse est obtenu après analyses des peptides générés lors de la digestion trypsique par spectrométrie de masse MALDI-ToF (5). La comparaison de ce spectre avec ceux des protéines répertoriées dans les bases de données permet l’identification univoque de la protéine d’intérêt (6).
4’ Carte protéique 2D
1 Préparation du tissu, culture cellulaire
2 Extraction protéique
3 Elecrophorèse bidimensionnelle
4 Immunoempreinte
699.0 1259.4 1819.8 2380.2 2940.6 3501.0
Mass (m/z)
0
2.9E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NR(2.00)=>DI=>M C=>MC[BP = 2211.1, 28767]
S1
2211.1040
2239.1324
842.50892283.1773
1189.66671859.8615 2225.1206832.3184
2297.19101987.08261205.66011519.6546
1546.7103 1940.9430 2189.97021126.5663709.34072914.48522564.16122173.9635816.4187 1632.7379 1970.0421 2807.29831179.5955
948.4314 1424.7747 1802.9344 2419.2380 2696.35622194.9181
5 Obtention d’un spectre de masse MALDI-ToF
6 Identification des protéiques cibles via les banques de données
Matériels & Méthodes
151
Au cours de la mise au point d’une carte protéique 2D d’épiderme humain
comportant des protéines de haut poids moléculaire, une seconde procédure d’extraction
protéique adaptée de celle décrite par Rabilloud et Chevallet [Rabilloud et Chevallet, 2000]
a été employée. Dans ce cas, les culots tissulaires séchés sont repris dans 1 volume de
Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, sucrose 0,25 mM et 4 volumes d’urée 9,6 M, CHAPS
5%, spermine 25 mM, DTT 50 mM. La suspension est ensuite 1 h à température
ambiante en présence d’inhibiteurs de protéases et ultracentrifugée à 250 000 g pendant
1 h à 4°C.
Pour les 2 procédures, les surnageants prélevés sont utilisés directement ou
aliquotés et conservés à -80°C en vue d’une utilisation ultérieure pour la réhydratation
des bandelettes à gradient de pH immobilisé (GPI).
Réhydratation des bandelettes GPI
Des bandelettes ReadyStrip™ de gel de polyacrylamide de 11 cm à gradient de pH
préformé (pH 3-10) non linéaire (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) sont utilisées. Ces
bandelettes subissent en premier lieu, une réhydratation passive pendant une nuit à
température ambiante. Cette étape se déroule de la manière suivante : l’échantillon
protéique (60 µl, issu de la méthode de Görg et al) est ajusté à un volume de 190 µl avec
la solution de réhydratation : solution de lyse contenant du bleu de Bromophénol et des
ampholytes (Bio-Lyte 3-10 ampholyte, Bio-Rad). Alternativement, la réhydratation des
bandelettes GPI avant l’insertion active des protéines durant la première dimension qui
est décrite ci-dessous est réalisée dans 200 µl de solution de réhydratation sans extrait
protéique. Dans les 2 cas, la solution est déposée uniformément sur un portoir de
réhydratation, dans une tranchée ajustée aux dimensions de la bandelette. La bandelette
de gel est alors appliquée sur cette solution protéique et le couvercle du portoir refermé.
Première dimension : Isoélectrofocalisation des protéines
Les protéines sont tout d’abord séparées selon leur point isoélectrique (pI) par une
étape d’isoélectrofocalisation (IEF). Les bandelettes GPI réhydratées avec l’extrait
protéique sont transférées dans les rainures d’un plateau de focalisation, en contact avec
les 2 électrodes (préalablement recouvertes de papier buvard humide) puis recouvertes
d’huile minérale. Le plateau de focalisation est ensuite placé dans l’appareil Protean® IEF
cell system (Bio-Rad) pour subir l’étape d’IEF. La migration électrophorètique s’effectue à
35000 V/h avec un voltage maximal de 8000 V à atteindre.
Pour la mise au point d’une carte protéique 2D d’épiderme humain comportant des
protéines de haut poids moléculaire, les protéines sont activement insérées dans le gel
GPI de la manière suivante : 90 µl d’échantillon protéique (issu de l’extraction adaptée de
Matériels & Méthodes
152
Rabilloud et Chevallet) sont appliqués à l’extrémité basique du gel GPI (à proximité de la
cathode) ou à l’extrémité acide du gel (à proximité de la anode) à l’aide du système cup
loading tray for the Protean® IEF cell system (Bio-Rad) selon les instructions du
fournisseur. Les bandelettes GPI placées dans le plateau de réhydratation sont ensuite
recouvertes d’huile minérale et transférées dans l’appareil Protean® IEF cell system (Bio-
Rad). L’étape de migration électrophorètique s’effectue durant 20 h à 6000 V.
A la fin de la première dimension, les bandelettes peuvent être immédiatement
utilisées pour la deuxième dimension ou conservées à -20°C durant plusieurs semaines.
Equilibrage des bandelettes GPI
L’équilibrage est une étape fondamentale permettant aux protéines de sortir du gel
de première dimension et de s’insérer dans celui de la deuxième dimension. Elle permet
de solubiliser à nouveau les protéines, de réduire les ponts disulfures, de bloquer les
fonctions SH libres et, enfin, de saturer uniformément les protéines en charges négatives.
L’équilibrage des bandelettes est réalisé en les incubant successivement dans 2 solutions
préparées extemporanément (Tableau 38).
Tableau 38. Composition des solutions de réhydratation des bandelettes GPI
Deuxième dimension : Séparation des protéines par SDS-PAGE
Une fois l’équilibrage des bandelettes effectué, les protéines sont séparées selon
leur poids moléculaire par migration électrophorètique SDS-PAGE. Pour cette étape, des
gels de polyacrylamide de 2 types sont utilisés : des gels commerciaux précoulés
Criterion™ XT à gradient de porosité 3-8% (Bio-Rad Laboratories) ou des gels de porosité
constante 14% (11 cm x 8 cm x 1 mm) (Tableau 33). Une solution d’agarose (0,5%
d’agarose SeaPlaque® (Cambrex Bio Science, Rockland, ME) dans du tampon de
migration contenant 0,1% de SDS) fraîchement préparée et chauffée à 80°C est coulé au
Solution 1 Solution 2
Urée 3,6 g 3,6 g
Tris 1,34 M pH 6,8 0,37 ml 0,37 ml
SDS 0,2 g 0,2 g
Glycérol 3 ml 3 ml
DTT 0,2 g
Iodoacétamide 0,25 g
Bleu de Bromophénol 10% 30 µl
Eau bidistillée Qsp 10 ml Qsp 10 ml
Temps d’incubation 20 min 30 min
Matériels & Méthodes
153
dessus du gel, les bandelettes préalablement équilibrées y sont ensuite insérées jusqu’au
bord supérieur du gel. Après gélification de l’agarose, les gels sont placés dans la cuve de
seconde dimension, Criterion® Dodeca™ Cell system (Bio-Rad) puis recouverts de
tampon de migration. La migration électrophorètique des protéines s’opère à un voltage
de 120 V durant 2 h. Cette étape achevée, les gels sont soit colorés au bleu de Coomassie
G-250 pour obtenir des cartes protéiques 2D, soit transférés sur une membrane de
nitrocellulose en vue d’une immunoempreinte.
Coloration des protéines de la carte 2D
Pour être colorés au bleu de Coomassie, les gels sont incubés une nuit sous
agitation dans une solution d’éthanol 50%, acide orthophosphorique (20 g/l) puis rincés 3
fois 30 min avec de l’eau bidistillée. Les gels sont ensuite incubés 1 h dans une solution
de méthanol 34%, sulfate d’ammonium (170 g/l), acide orthophosphorique (20 g/l) puis 3
à 4 jours dans cette même solution mais contenant du bleu de Coomassie G-250 à 0,67
g/l (Sigma). Enfin, les gels rincés avec de l’eau bidistillée sont numérisés à l’aide d’un
scanner (UMAX technologies Inc., Dallas, TX) et l’image acquise est transférée sur le
logiciel Phoretix™ 2D (Nonlinear Dynamics Ltd, Newcastle upon Tyne, UK) afin de repérer
et d’annoter chaque tache protéique d’intérêt en vue de leur identification ultérieure.
Identification des protéines
Immunoempreinte à fluorescence infrarouge
L’immunoempreinte à fluorescence infrarouge est basée sur la révélation d’une
immunoempreinte par la détection infrarouge simultanée de 2 longueurs d’onde émises
par 2 molécules fluorescentes (2 couleurs) couplées chacune à des Ac secondaires dirigés
contre les IgG de 2 espèces animales différentes. Ce procédé, plus sensible que la
chimioluminescence, permet l’utilisation simultanée de 2 sondes Ac d’espèce différentes
pour la détection d’une même cible protéique. Lorsque qu’une protéine est reconnue par
les 2 Ac, la surimposition des 2 signaux fluorescents (vert et rouge) donne un marquage
jaune.
Les protéines séparées par électrophorèse bidimensionnelle sont transférées sur
une membrane de nitrocellulose comme précédemment décrit. La membrane est saturée
dans du tampon TBS-T, lait 5% durant 2 h sous agitation. Après un lavage avec du
tampon TBS-T, elles sont simultanément incubées 2 h avec soit les sérums (1 : 50) de
souris et de lapin immunisés avec les peptides de l’isoforme tronquée de la Dsg1, soit avec
les Acm isolés des souris immunisées avec la protéine rEC1/5-Dsg1 (1 : 100) et le sérum
d’un patient atteint de PPN (1 : 200). Après 4 lavages, les membranes sont incubées 1 h
simultanément soit avec des Ac de chèvre anti-IgG humaines couplés à la biotine (1 :
Matériels & Méthodes
154
20000) (Caltag Laboratories) et des Ac de lapin anti-IgG de souris couplés à l’Alexa Fluor®
680 (1 : 6000) (Molecular Probes, Eugene, OR), soit avec des Ac de chèvre anti-IgG de
lapin (1 : 2000) et des Ac de chèvre anti-IgG de souris couplés à l’Alexa Fluor® 680. Après
4 lavages, les membranes sont incubées 1 h avec de la streptavidine couplée à l’IRDye
800 (1 : 6000) (Rockland, Gilbertsville, PA). La réaction est révélée, après lavages de la
membrane, à l’aide du scanner Odyssey™ Infrared Imaging (LI-COR Biosciences, Lincoln,
NE).
Excision du gel et digestion trypsique des protéines
L’excision des taches protéiques du gel est réalisée grâce à l’utilisation de
l’automate Ettan Spot Picker (Amersham Biosciences) piloté informatiquement par le
logiciel Phoretix™ 2D (Nonlinear Dynamics Ltd). Après l’excision, l’automate dépose les
morceaux de gel contenant la protéine d’intérêt dans le puit d’une plaque 96 puits
(Costar) qui est ensuite transférée dans l’appareil de digestion Ettan Digester (Amersham
Biosciences). Cet automate piloté informatiquement va combiner les étapes de lavages et
de séchage du fragment de gel ainsi que la digestion trypsique de la protéine qu’il
contient. Cette étape va permettre l’extraction du fragment de gel, des peptides issus de la
digestion en vue de leur identification par spectrométrie de masse. Le protocole de
digestion comprend : (i) 3 cycles de lavage du morceau de gel excisé de 30 min avec une
solution de méthanol 50%, bicarbonate d’ammonium (NH4HCO3) 50 mM puis 2 cycles de
20 min avec de l’acétonitrile; (ii) un séchage du morceau de gel de 40 min; (iii) la digestion
trypsique en utilisant une solution de trypsine seule (qui clive les protéines après les
aminoacides basiques, lysine et arginine) (Trypsine (Sigma), TCA 0,01%, NH4HCO3 50
mM, acétonitrile 9%) durant 2 h puis associée à une solution de NH4HCO3 50 mM
pendant 4 h; (iv) le transfert de chacune des solutions peptidiques au sein d’une nouvelle
plaque 96 puits et leur incubation avec une solution d’acétonitrile 50%, TCA 0,1%
pendant 20 min ; (v) le séchage précèdant l’analyse des peptides par spectrométrie de
masse.
Spectrométrie de masse MALDI-ToF et identification des protéines
A la suite de la digestion trypsique, les peptides sont réhydratés dans une solution
d’acétonitrile 50%, TCA 0,1%, puis mélangés à volume égal avec la matrice (composé
d’acide 7.5 mg/ml α-cyano-4-hydroxy cinnamique à 7.5 mg/ml (LaserBio Labs, Sophia
Antipolis, France) saturée avec une solution d’acétonitrile 50%, TCA 0,1%) et
immédiatement appliqués sur la cible MALDI-ToF (Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization-Time of Flight). Les échantillons sont analysés par un spectromètre
de masse de MALDI-ToF Voyager-DE™ PRO (Applied Biosystems) en mode reflector. Cet
Matériels & Méthodes
155
appareil ionise les fragments peptidiques et calcule leur masse par leur « temps de vol »
après accélération dans un champ magnétique. L’analyse est obtenue sous forme d’un
spectre composé de pics correspond au rapport masse/charge (m/z) de chacun des ions
générés. La calibration externe de l’appareil est effectuée avec le Proteomix-Peptide
calibration Mix4 (LaserBio Labs). Les spectres sont accumulés manuellement à partir de
différentes acquisitions pour améliorer le ratio signal/bruit de fond. La comparaison de
ces spectres expérimentaux avec les spectres virtuels de protéines enregistrés dans les
bases de données (Swiss-Prot) accessibles sur Internet à l’aide d’un programme (Aldente,
serveur Expasy) permet l’identification de la protéine d’intérêt. L’identification des
protéines cibles est réalisée en triplicate.
2/ IMMUNOCRIBLAGE DE BANQUE D’EXPRESSION D’ADNc DE KERATINOCYTES HUMAINS
(Figure 38)
L’immunocriblage est réalisé sur la banque d’expression d’ADNc de kératinocytes
λgt11 (Clontech laboratories, Palo Alto, CA). Pour effectuer ce criblage, il est nécessaire
d’obtenir une concentration optimale de plages de lyse (pfu) et donc de connaître le titre
de la banque primaire. Celui-ci, déterminé par étalement de différentes dilutions, est de
1010 pfu/ml. Afin d’obtenir une concentration appropriée de pfu (environ 50000 pour 100
cm2), les phages sont dilués (au 1 : 2500000) dans du milieu de dilution des phages. Pour
étaler les plages de lyses, la souche bactérienne Y 1050- (E. coli) est infectée avec les
phages de la banque d’expression λgt11. Les plages de lyse sont dénombrées dans les
boîtes de culture après 4 h d’incubation à 42°C. La bactérie synthétise les polypeptides
codés par l’ADN du phage puis le phage lyse son hôte et infecte les bactéries voisines. Des
membranes de nitrocellulose HybondTM-C extra (Amersham pharmacia biotech),
préalablement incubées dans une solution à 10 mM d’isopropyl-β-D-
thiogalactopyranoside (IPTG) (Euromedex, Mundolsheim, France), sont déposées sur le
milieu de culture. L’expression protéique, sous le contrôle du promoteur du gène de la β-
Galactosidase, est alors induite par l’IPTG lors d’une seconde incubation de 4 h à 37°C
durant laquelle les polypeptides synthétisés se fixent sur les filtres de nitrocellulose.
Après un lavage (PBS-T), les filtres sont saturés une nuit à 4°C avec une solution de PBS-
T, 5% lait et subissent une analyse par immunoempreinte avec l’Acm à tester (1 : 100) en
utilisant des Ac de chèvre anti-IgG de souris couplés à la peroxydase suivie d’une
révélation par chimioluminescence.
Les ADNc des clones exprimant les peptides immunoréactifs sont amplifiés
directement à partir de la colonie bactérienne par PCR en utilisant le couple d’amorces,
5´-GAC TCC TGG AGC CCG-3´; 3´-CGC GGC CAG CGA TGG-5´ (Eurogentec, Seraing,
Belgium), spécifiques des séquences qui bordent le site de clonage EcoRI (Tableau 39 et
Matériels & Méthodes
156
40). Les produits de PCR sont purifiés et séquencés à l’aide de ces mêmes amorces selon
la méthode précédemment décrite.
Figure 38. Représentation schématique des principales étapes de l’identification de protéines cibles d’anticorps par immunocriblage de banque d’expression d’ADNc. Les bactéries infectées par les phages de la banque sont cultivées 4 h à 42°C (1). L'expression protéique est induite par le dépôt sur le milieu de culture, d'une membrane de nitrocellulose imprégnée par une solution d'IPTG (2). Après 4 h de culture à 42°C, les peptides synthétisés sont transférés sur la membrane qui est lavée puis utilisée en immunoempreinte avec l'Ac d'intérêt (3). Le clone de la banque exprimant la protéine immunoréactive est prélevé afin d'être isolé et amplifié (4). L'ADNc exprimé par ce clone est amplifié par PCR à l'aide d'amorces bordant le site de clonage du phage (5). Les produits de PCR sont ensuite purifiés et séquencés. Les séquences sont comparées aux banques de données disponibles sur Internet permettant l'identification de la cible protéique de l'Ac d'intérêt (6).
Tableau 39. Composition du mélange réactionnel de la PCR de criblage des clones de la banque λgt11
Réactifs Volumes
Matrice ADNc
Mélange des 4 dNTPs (40 mM chacun)
Inoculum bactérien
0,75 µl
Tampon de la TaqDNA Polymérase 5 µl
Amorces 5´GT11 (100 pmol/µl) + 3´T11Neu (100 pmol/µl) 1 µl + 1 µl
TaqDNA Polymérase DyNazyme™ EXT (Finnymes Oy) 0,25 µl
H2O q.s.p. 50 µl
1111
6666
2222 3333
4444 5555
4 h - 42°C 4 h - 42°C
Souche bactérienne Y1050
Phages de la banque d'expression d'ADNc
Milieu de culture
Membrane de nitrocellulose + IPTG
Immunoempreinte révélée par chimioluminescence
Matériels & Méthodes
157
Tableau 40. Phases de la réaction de PCR de criblage des clones de la banque λgt11
Phases Durée Température Nombre de cycles
Dénaturation initiale
5 min 94 °C 1
Dénaturation 1 min 94 °C
Hybridation 1 min 30 54 °C
Elongation 3 min 72 °C
30
Elongation finale
10 min 72 °C 1
F- L’étude fonctionnelle de peptides spécifiques de l’isoforme
tronquée de la desmogléine 1
1/ CAPACITE DE LIAISON DES PEPTIDES AUX MOLECULES HLA DE CLASSE II
Pour cette étude, 4 peptides spécifiques de l’isoforme tronquée de la Dsg1 ont été
synthétisés, purifiés (pureté >99%) et contrôlés par spectrométrie de masse (INSERM
U413, IFRMP23, Mont Saint Aignan, France). Ces peptides de 20 aminoacides,
chevauchent le domaine EC2 et la séquence peptidique INT6 de l’isoforme tronquée de la
Dsg1 : EC2/INT6 211-230 (INRNTGEIRTMNNFLDREIY) ; EC2/INT6 216-235
(GEIRTMNNFLDREIYVNVEP) ; EC2/INT6 221-240 (MNNFLDREIYNVEPTFQRT);
EC2/INT6 226-245 (DREIYVNVEPTFQRTLHKTK). La capacité de ces peptides de se fixer
aux molécules HLA de classe II : DRB1*0101, *0401, *0102 et *0402 a été étudiée par
une technique d’ELISA compétition (Département d’Ingénierie et d’Etudes des Protéines,
CEA-Saclay, Gif-sur-Yvette, France) précédemment décrite (Texier, 2000 ; Texier, 2001).
Brièvement, les molécules HLA de classe II sont immunopurifiées par chromatographie
d’affinité à l’aide de l’Ac monomorphe L243 (American Type Culture Collection,
Manassas, VA) couplé à de la protéine A sépharose à partir d’un lysat de lignées
cellulaires HOM-2 (DRB1*0101), BOLETH (DRB1*0401), MZ07 (DRB1*0102) et YAR
(DRB1*0402). Les peptides d’intérêt, dilués en série, sont incubés 24 à 72 h avec des
peptides compétiteurs biotinylés (d’affinité optimale pour ces molécules HLA-DR) et les
molécules HLA-DR purifiées à tester dans un tampon à pH 6 (10 mM phosphate, 150 mM
NaCl, 10 mM citrate, 0,003% thimerosal). Ces peptides compétiteurs sont le peptide HA
306-318 (PKYVKQNTLKLAT) pour les molécules DRB1*0101 (1 nM) et DRB1*0401 (30
nM) et le peptide ALK (AALAAAKAAAAAA) pour les molécules DRB1*0102 (10 nM) et
DRB1*0402 (10 nM). Après neutralisation, les mélanges (100 µl) sont incubés 2 h à
température ambiante dans les puits de plaque ELISA Maxisorp® (Nalge nunc
Matériels & Méthodes
158
internationnal) recouverts par l’anticorps L243 (10 µg/ml). Après lavages, la présence de
peptides biotinylés est révélée par la fluorescence émise et détectée à 450 nm (Fluorite
1000 fluorometer, Dynex, Issy les moulineaux, France) conséquence de l’addition d’un
conjugué streptavidine couplé à la phosphatase alcaline et du substrat 4-
methylumbelliferyl phosphate. La fixation maximale est déterminée par l’incubation des
peptides compétiteurs avec les molécules HLA-DR purifiées en absence des peptides de la
forme tronquée de la Dsg1. Les expériences sont réalisées en triplicate et les données sont
exprimées comme la concentration de peptide d’intérêt qui prévient la fixation de 50% du
peptide compétiteur (IC50).
2/ PROLIFERATION LYMPHOCYTAIRE
Les PBMC humaines de patients atteints de PF (n=8), de PV (n=13) et de
pemphigoïde bulleuse (n=6) sont isolés par centrifugation sur gradient de Ficoll-Hypaque
(Pharmacia). Après 3 lavages au PBS, les cellules sont dénombrées à l’aide d’une cellule
de Malassez, après coloration au bleu de Trypan (Gibco BRL). Les cellules sont ensuite
ramenées à la concentration de 106 cellules par ml de milieu RPMI 1640 (Cambrex Bio
Science) supplémenté par 10% de plasma autologue décomplémenté (56°C, 30 min) et
mises en culture en triplicate sur une plaque (96 puits) Nunclon™ (Nalge nunc
international) à raison de 200 µl par puits (soit 2.105 cellules). Les cellules sont stimulées
par l’adjonction des peptides EC2/INT6 216-235 ou EC2/INT6 226-245 (20 µg/ml). Après
l’addition des différents peptides à la culture cellulaire, les plaques sont placées à 37°C
sous une atmosphère contenant 5% de CO2 pendant 6 jours. Un contrôle négatif de
stimulation correspond à la mesure de la stimulation de la prolifération spontanée des
cellules, sans adjonction de peptides et les contrôles positifs de stimulation, à la mesure
de prolifération cellulaire induite par la phytohémagglutinine (PHA) (Sigma) à 5 µg/ml.
La prolifération cellulaire est quantifiée par la mesure de l’incorporation de
thymidine tritiée (Amersham Biosciences). Un µCi de thymidine tritiée est ajouté dans
chaque puits 18 h avant la récolte des cellules. La récolte s’effectue sur un filtre (Wallac
Inc., Gaithersburg, MD) à l’aide d’un récolteur de cellules (Perkin Elmer Applied
Biosystems). Chaque filtre est placé dans un film plastique contenant du liquide
scintillant (Wallac Inc.) qui est par la suite refermé et placé dans une cassette. La
radioactivité est mesurée à l’aide d’un compteur β (Wallac Inc.). Les résultats sont
exprimés en coups par minute (cpm). Afin de pouvoir comparer les résultats obtenus
entre les différents patients, ceux-ci sont exprimés en index de stimulation (SI, stimulation
index). La médiane des proliférations induites par les peptides antigéniques est rapportée
à celle des proliférations spontanées. Un SI supérieur ou égal à 2 est considéré comme
positif.
159
RESULTATS
Résultats
160
RESULTATS
A- Un épitope T spécifique d’une isoforme tronquée de la
desmogléine 1, générée par épissage alternatif, se fixe à la
molécule HLA DRβ1*0102 de susceptibilité au pemphigus
superficiel
Afin de produire la région EC complète de la Dsg1, nous avons séquencé un
fragment d’ADNc obtenu successivement par reverse transcription d’ARNm extraits de
kératinocytes humains en utilisant une amorce oligo-dT et amplification par PCR à l’aide
d’amorces localisées respectivement aux extrémités 5´ et 3´ des séquences codantes pour
les domaines EC1 et EC5 de la protéine [Mouquet, 2006]. De façon surprenante, nous
avons identifié des transcrits alternatifs de la Dsg1 caractérisés par une insertion
intronique de 101 pb correspondante à l’extrémité 3´ de l’intron 6 du gène DSG1 et
localisée entre les exons 6 et 7 qui codent avec l’exon 5 pour le domaine EC2 de la
protéine (Figure 39). Cette insertion comporte un codon stop qui pourrait conduire à
l’arrêt de la traduction et donc à la production d’une isoforme tronquée de la Dsg1. Dans
cette éventualité, cette isoforme serait constituée du domaine EC1, de la séquence 158-
227 du domaine EC2 de la Dsg1 et d’un peptide supplémentaire à l’extrémité C-terminale
(INT6 ; 17 aminoacides) codé par l’insertion intronique et absent de la forme
transmembranaire de la Dsg1.
Figure 39. Epissage alternatif à l’origine d’une isoforme tronquée de la Dsg1. Les transcrits alternatifs de la Dsg1 sont caractérisés par une insertion intronique de 101 pb correspondante à l’extrémité 3´ de l’intron 6 du gène DSG1 et localisée entre les exons 6 et 7 qui codent avec l’exon 5 pour le domaine EC2 de la protéine. Cette insertion comporte un codon stop qui pourrait conduire à l’arrêt de la traduction et donc, à la production d’une isoforme tronquée de la Dsg1. Dans l’éventualité de sa synthèse, cette isoforme serait constituée du domaine EC1, de la séquence 158-227 du domaine EC2 de la Dsg1 et d’un peptide supplémentaire à l’extrémité C-ter (INT6 ; 17 aminoacides) codé par l’insertion intronique et absent de la forme transmembranaire de la Dsg1.
ARNm matures
STOP
*809
EXON 6 EXON 6 EXON 7 EXON 7
EXON 6 EXON 7 INTRON 6
ARNm immature DSG1
Transcrit normal DSG1
Transcrit alternatif DSG1
5’
5’
5’ 3’ 3’
3’
Dsg 1
C N
C N
S P EC1 EC2 EC3 EC4 AE S P EC1 EC2 INT6
1 158 227 245
Isoforme tronquée de la Dsg 1
101 pb
Résultats
161
L’existence de ces ARNm DSG1 alternatifs dans l’épiderme humain a été confirmée
par PCR via l’amplification d’une séquence d’ADNc spécifiques de ces transcrits ceci pour
l’ensemble des donneurs sains testés (n=9). Les analyses en PCR quantitative montrent
que ces transcrits alternatifs représentent en moyenne 15% (variation interindividuelle de
6 à 30%) de la totalité des ARNm DSG1 (normaux et alternatifs).
Afin de confirmer l’expression de cette isoforme tronquée de la Dsg1 (poids
moléculaire théorique de 22,4 kDa) dans l’épiderme humain, des antisérums dirigés
contre les peptides EC2(184-194) (commun à la Dsg1 et à son isoforme tronquée) et INT6
(uniquement présent sur l'isoforme de la Dsg1) ont été produits et caractérisés. En
immunoempreinte, ces Ac polyclonaux qui reconnaissent l’isoforme tronquée
recombinante, réagissent également avec des protéines présentes dans un extrait
d’épiderme humain. Plus précisément, l’Ac anti-EC2(184-194) reconnaît un doublet
protéique de 25 kDa et les Ac anti-INT6 (n=4), une protéine unique de 25 kDa.
Néanmoins, les expériences de comarquage par immunoempreinte infrarouge montrent
qu’une seule et même bande protéique de 25 kDa est reconnue par les Ac anti-EC2(184-
194) et anti-INT6. Ces résultats ont par ailleurs été confirmés par immunoempreinte
infrarouge sur une carte protéique 2D d’épiderme humain. En effet, les 2 Ac anti-isoforme
tronquée de la Dsg1 réagissent avec une protéine unique ayant les coordonnées de poids
moléculaire et de pI attendus. De plus, cette protéine de 25 kDa qui est détectée par
immunoempreinte dans un extrait de kératinocytes en culture primaire, n’est pas
exprimée dans d’autres tissus épithéliaux tels que le rein et l’intestin grêle. Enfin, les Ac
anti-INT6 donnent un marquage fluorescent des kératinocytes des couches basales de
l’épiderme en IFI sur coupes de peau humaine.
Une récente étude in silico a montré que les séquences spécifiques d’isoformes
protéiques générées par épissage alternatif pouvaient constituer des épitopes cibles de la
réponse lymphocytaire T restreinte par des molécules HLA de classe I et II. De plus,
l’existence d’une réponse auto-immune T dirigée contre des épitopes spécifiques
d'isoformes de l’autoAg MBP a été démontrée dans la SEP. Nous avons donc en premier
lieu évalué la capacité de 4 peptides spécifiques de l’isoforme tronquée de la Dsg1 à se
fixer aux molécules HLA DRB1*0101, *0102 et *0402, précédemment décrites comme
allèles de susceptibilité au PS. Ces analyses réalisées par compétition dans un test ELISA
utilisant des peptides « traceur » d’affinité optimale pour différentes molécules HLA,
montrent que seul le peptide EC2/INT6 216-235 se fixe avec une forte affinité aux
molécules HLA testées, en particulier à la molécule DRB1*0102. Nous avons ensuite
évalué la capacité de ce peptide EC2/INT6 216-235 à induire la prolifération de PBMC
isolées chez les patients atteints de PF et de PV. Nos résultats montrent que les PBMC
prolifèrent en réponse à ce peptide de l’isoforme tronquée de la Dsg1 chez 50% des
Résultats
162
patients atteints de PF (n=7) et 7,7% des patients atteints de PV (n=14), contrairement à
ceux isolés des patients atteints de pemphigoïde bulleuse (n=6). Ces résultats ont fait
l’objet d’une publication dans The Journal of Immunology.
Résultats
163
ARTICLE 1
A Truncated Alternative Spliced Isoform of Human
Desmoglein 1 Contains a Specific T-Cell Epitope Binding to the
Pemphigus Foliaceus-Associated HLA Class II DRβ1*0102
Molecule.
H. Mouquet, S. Farci, P. Joly, L. Drouot, J. Leblond, J. Leprince, M.
C. Tonon, P. Loiseau, D. Charron, B. Maillère, F. Tron, D. Gilbert.
J. Immunol. 2006:177;6517-26.
A Truncated Alternative Spliced Isoform of HumanDesmoglein 1 Contains a Specific T Cell Epitope Binding to thePemphigus Foliaceus-Associated HLA Class II DR�1*0102Molecule1
Hugo Mouquet,* Sandrine Farci,† Pascal Joly,* Bernard Maillere,† Jonathan Leblond,*Laurent Drouot,* Jerome Leprince,‡ Marie Christine Tonon,‡ Pascale Loiseau,§
Dominique Charron,§ Francois Tron,2* and Daniele Gilbert*
Desmogleins (Dsg) are transmembrane glycoproteins of the desmosome that allow a cell-cell adhesion between keratinocytes andcomprise four different isoforms (Dsg1 to Dsg4). Two Dsg are targeted by pathogenic autoantibodies produced in the course ofautoimmune bullous skin diseases, Dsg1 in pemphigus foliaceus (PF), and Dsg3 and Dsg1 in pemphigus vulgaris. The geneticsusceptibility to PF is associated with certain HLA class II alleles, which are thought to participate in disease pathogenesis throughtheir capacity to accommodate autoantigen-derived peptides and present them to autoreactive T cells. So far, a unique isoform ofDsg1 has been described in humans, which includes several immunodominant T cell epitopes. In this study, we describe analternative transcript of DSG1, which contains a 101-bp insertion corresponding to the 3� end of DSG1-intron 6 and introducinga stop codon in the nucleotide sequence. This alternative transcript leads to the synthesis of a truncated isoform of Dsg1 expressedin normal human epidermis. This isoform bears a specific peptide sequence that binds to the PF-associated HLA class IIDR�1*0102 molecule as shown in a HLA-DR peptide-binding assay, and induces PF T cell proliferation. These data provide anillustration of an autoantigen encoded by alternative spliced transcript that may participate in the pathogenesis of the disease bybearing PF-associated HLA class II restricted-epitope. The Journal of Immunology, 2006, 177: 6517–6526.
A lternative splicing of premessenger RNA is an importantmolecular mechanism allowing the cells to synthesize alarge number of proteins from a limited number of genes
(1). Indeed, whereas the human genome encodes between 30,000and 60,000 genes, the human proteome consists of at least 9.104
proteins, suggesting, notably by bioinformatic analysis, that 42%of randomly selected gene transcripts undergo alternative splicing.Different varieties of splicing mechanisms have been described(1), which may lead to the synthesis of multiple isoforms from asingle mRNA transcript.
Self-Ags play a major role in the occurrence of autoimmunediseases because they participate in both the initiation and main-tenance of the autoimmune response and the development of le-sional immune effectors (2). Several mechanisms have been pro-posed to explain why self proteins may become immunogenic (3).
Among these, alternative splicing might operate through the pro-duction at the periphery of novel B or T epitopes to which lym-phocytes have not been tolerized during their maturation in centrallymphoid organs. The role of alternative spliced variants of proteinself Ags in the breakage of immune tolerance has been demon-strated in several autoimmune diseases (4, 5).
Desmogleins (Dsg)3 consist of four different desmosomal trans-membrane glycoproteins belonging to the desmosomal cadherinfamily (Dsg1 to Dsg4), which are encoded by separate genes lo-cated within the 250-kb cadherin cluster of the 18q12.1 chromo-some (6). Desmosomal cadherins comprise five extracellular (EC)domains, a transmembrane domain, and a cytoplasmic region con-taining five domains, and allow a calcium-dependent cell-cell ad-hesion critical for desmosomal junction. Dsg2 is detected in alldesmosome-possessing tissues, whereas Dsg1 and Dsg3 are re-stricted to stratified squamous epithelia-like epidermis (7). Dsg1 isthe autoantigen of pemphigus foliaceus (PF), an autoimmune blis-tering skin disease characterized by an autoantibody response di-rected against conformational calcium-dependent epitopes of theDsg1 EC domains, particularly the N-terminal adhesive region(EC1 and EC2 domains) (8–10). Anti-Dsg1 autoantibodies arepathogenic because, when transferred to normal mice, their in vivobinding to Dsg1 leads to a loss of adhesion between keratinocytescalled acantholysis and the formation of intraepidermal blisters(11, 12). The tolerance breakdown against Dsg1 is not restricted toPF, because anti-Dsg1 Abs can also be found in other forms ofpemphigus, including pemphigus vulgaris (PV) and paraneoplastic
*Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Unite 519, Faculte deMedecine et de Pharmacie, Rouen, France; †Departement d’Ingenierie et d’Etudes desProteines, Commissariat a l’Energie Atomique-Saclay, Gif sur Yvette, France; ‡In-stitut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Unite 413, Mont Saint Aig-nan, France; and §Laboratoire d’Immunologie et d’Histocompatibilite, Institut Na-tional de la Sante et de la Recherche Medicale, Unite 396, Paris, France
Received for publication December 23, 2005. Accepted for publication August7, 2006.
The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of pagecharges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordancewith 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.1 This work was supported by funds from the Institut National de la Sante et de laRecherche Medicale. H.M. is the recipient of a fellowship from the Conseil Regionalde Haute-Normandie.2 Address correspondence and reprint requests to Dr. Francois Tron, Institut Nationalde la Sante et de la Recherche Medicale, Unite 519, Faculte de Medecine et dePharmacie, 22 boulevard Gambetta, 76183 Rouen Cedex 1, France. E-mail address:[email protected]
3 Abbreviations used in this paper: Dsg, desmoglein; EC, extracellular; PF, pemphi-gus foliaceus; PV, pemphigus vulgaris; BP, bullous pemphigoid; BT, bovine thyro-globulin; IRF, infrared fluorescent; SI, stimulation index; pI, isoelectric point; MBP,myelin basic protein; NZ, New Zealand.
The Journal of Immunology
Copyright © 2006 by The American Association of Immunologists, Inc. 0022-1767/06/$02.00
pemphigus (13, 14). The production of anti-Dsg1 Abs is dependenton Dsg1-specific Th lymphocytes, which exhibit a memory T cellphenotype and a Th2-like cytokine profile and are detected in PFpatients (15). Like in most autoimmune diseases, HLA class IIgenes contribute to genetic susceptibility of PF, particularly DR1,DR4, and DR14. Several alleles of these haplotypes are associatedwith PF, including DRB1*0102, which has been found recurring indifferent studies (16–19), notably those involving French PF pa-tients (17, 19). The major mechanism proposed to explain the as-sociation between MHC class II genes and autoimmune diseases isthat disease-associated alleles can efficiently accommodate autoan-tigen-derived peptides initiating and sustaining the autoreactive Tcell response. Thus, in PF, a major objective is to identify T cellepitope peptides of Dsg1 that could initiate the autoimmune re-sponse (15).
In this study, we describe alternative transcript of DSG1 gene(DSG1-AT) containing an intronic insertion of 101 bp in normalhuman skin. This insertion introduces a stop codon that leads to thesynthesis of a truncated isoform of Dsg1 carrying amino acid se-quences encoded by intronic sequences and absent from the nativeDsg1. This Dsg1-truncated isoform was shown to be expressed innormal human epidermis and to bear a specific peptide sequencebinding to the PF-associated DRB1*0102 molecule and inducing aT cell response in PF patients.
Materials and MethodsPatients
Peripheral blood was obtained from 21 adult patients with PF (n � 8) orPV (n � 13) as well as from 6 patients with bullous pemphigoid (BP)(Table I), who were seen in Dermatology Departments of the French Bul-
Table I. Clinical phenotype, HLA DR�1 alleles, and autoantibody profile of PF and PV patients
Patient Sex/Age HLA DR�1ClinicalStatusa
Clinical Phenotypeb
Medication(per day)c
Autoantibody Profile (IgG)d
Skin Mucosa Anti-Dsg1 Anti-Dsg3
PF1 M/73 0102, 1302 Remission None None 3 mg PDN - -PF2 F/48 0101, 1601 Acute
onsetExtensive erosions
on the trunkNone 0.05% CP 165 -
PF3 F/50 11, 14 Remission None None 5 mg PDN,15 mgMTX/week
- -
PF4 F/60 0402, 08 Remission None None 7 mg PDN 36 -PF5 F/39 13, 14 Remission None None 100 mg
AZA- -
PF6 F/63 0101, 16 Remission None None 8 mg PDN 202 -PF7 F/52 0102, 04 Chronic
activeErythematous and
squamouserosions
None ND - -
PF8 M/73 12, 13 Acuteonset
Chronic prurit None None - -
PV1* M/77 03, 11 Acuteonset
Crusty erosions ofthe face, scalpand neck
Extensive oral erosionsand crusty erosionsof the lips
None 55 132
PV2* M/82 0402, 0404 Acuteonset
Crusty erosions ofthe face
Erosions of the palate,buccal mucosa andnostrils
None 22 154
PV3* M/70 0408, 14 Remission None None 14 mg PDN - 60PV4* M/26 0402, 08 Remission None None 10 mg PDN - 211PV5* F/50 0402, 14 Remission None None 7 mg PDN - 175PV6 F/28 08, 15 Acute
onsetNone Erosions of the oral
cavity, oropharynx,larynx and trachea
None - 104
PV7 F/47 08, 13 Chronicactive
None Pharyngeal lesions 16 mg PDN - 76
PV8* F/78 0402, 11 Chronicactive
Erosion of the leftinferior eyelid
Erosions of the buccalmucosa, gingiva andnostril
25 mgMTX/week,0.03%tacrolimus
- 90
PV9* M/32 0402, 13 Chronicactive
Erosions of thescalp
Buccal erosions 70 mg PDN - 36
PV10 F/79 07, 1404 Chronicactive
None Erosions of the palateand buccal mucosa
0.5 mgPDN/kg
- 120
PV11 M/74 0402, 13 Remission None None 8 mg PDN,2 g MPM
- -
PV12* M/41 0402, 13 Chronicactive
Erosions on thetrunk
Labial/gingival erosion 100 mgAZA, 7mg PDN
- 154
PV13* F/13 0402, 0402 Chronicactive
Erythematouseruption
Lesions of the oralcavity
1 mg PDN/kg
- 51
a As defined in Materials and Methods.b At the time of the study.c AZA, azathioprine; CP, clobetasol propionate; MPM, mycophenolate mofetil; PDN, prednisone;d Values are expressed in units per milliter of sera (U/ml). Values � 20 U/ml (anti-Dsg1) and 14 U/ml (anti-Dsg3) were considered significant (-, NS values).* PV patients with a mucocutaneous clinical phenotype during an active phase of the disease.
6518 TRUNCATED ALTERNATIVE SPLICED ISOFORM OF Dsg1
lous Study Group. All patients gave written consent to participate in thisstudy. Clinical diagnosis of PF, PV, and BP was confirmed by histopa-thology, direct immunofluorescence microscopy on perilesional skin, andserum analysis including indirect immunofluorescence microscopy onmonkey esophagus (The Binding Site), or salt-split human foreskin sec-tions, immunoblotting on human epidermis extract, and commercialELISAs (Medical and Biological Laboratories), to detect circulating anti-Dsg1/3 and anti-BP180 autoantibodies in pemphigus and BP patients, re-spectively. Active-onset of the disease was defined as de novo developmentof blisters/erosions on skin and/or mucosa of untreated patients. Chronicactive pemphigus was defined as incomplete remission or relapse in pa-tients with immunosuppressive treatment. Clinical remission was definedas treated patients who had not experienced new cutaneous and/or mucosallesions for �6 mo before the study.
HLA class II typing
Genomic DNA was extracted from whole blood (2 ml) of pemphigus pa-tients using QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen) and used for HLAclass II DR�1 typing as described previously (19).
RT-PCR analysis
Mammary surgery specimens of normal skin were used as source of epi-dermis. Total RNA was extracted from nine human epidermis using TRIzolreagent (Invitrogen Life Technologies). The cDNA was obtained by tran-scription of random-primed RNA by Moloney murine leukemia virus re-verse transcriptase (Invitrogen Life Technologies), and then subjected toPCR amplification (RT-PCR). Primers used to amplify specific gene prod-ucts were as follows: GAPDH sense, 5�-TGC CAT CAA CGA CCC CTTCA-3�; GAPDH antisense, 5�-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3�;DSG1 sense, 5�-AAT GGC TAC ATT TGC AGG ACA-3�; DSG1 anti-sense, 5�-ATC TCG GTC AGA GCC TCT TAC A-3�; DSG1-AT sense,5�-TAG ACA GAG AGA TTT ATG TAA ACG TTG-3�; DSG1-AT an-tisense, 5�-TAT TAC AGG CAA TAT CAC ACT TGA C-3�. PCR con-ditions for GAPDH comprised one cycle of 94°C for 5 min, 35 cycles of94°C for 1 min, 58°C for 30 s, and 72°C for 30 s, and a final elongation stepof 72°C for 4 min. For PCR of DSG1 cDNA, conditions were identicalexcept for the time of initial denaturation step and the annealing temper-ature, which were 4 min and 58°C, respectively. To amplify DSG1-ATcDNA, PCR conditions comprised 94°C for 4 min, 40 cycles of 94°C for1 min, 58°C for 30 s, and 72°C for 30 s, and a final elongation step of 72°Cfor 4 min. All PCR were performed in a volume of 50 �l using an Ep-pendorf thermocycler, with 2.5 U of Taq polymerase (Promega). Ampli-fication products (15 �l) were separated and visualized by ethidium bro-mide-stained 1.5% agarose gel electrophoresis.
Quantitative real-time PCR analysis
The cDNA synthesis of the nine human epidermis samples is describedabove. Quantitative real-time PCR were performed using the LightCyclerthermocycler system (Roche Molecular Biochemicals). Amplification re-actions were conducted using the FastStart DNA Master SYBR Green I kit(Roche) according to the manufacturer’s instructions in a total volume of20 �l in glass capillaries, containing 2 �l of cDNA sample, 2 �l of Fast-Start DNA Master SYBR Green I, 2 mM MgCl2, and 10 pmol of eachprimer. PCR amplifications of DSG1 and DSG1-AT cDNAs were con-ducted simultaneously and comprised one cycle of 94°C for 10 min, 50cycles of 94°C for 20 s, 61°C for 10 s, and 72°C for 12 s. PCR conditionsfor GAPDH amplification comprised one cycle of 94°C for 10 min, 40cycles of 94°C for 20 s, 62°C for 10 s, and 72°C for 22 s. At the end ofamplification cycles, PCR products were subjected to melting temperatureanalysis in 3 steps: 1) 10 s for 94°C (20°C/s), 2) 30 s for 66°C (20°C/s), and3) a slight temperature increase of 0.1°C/s until 94°C to generate fusioncurves. Data acquisition and analysis were conducted using LightCycler3.5 software.
To determine the absolute copy number of target transcripts, purifiedGAPDH, DSG1, and DSG1-AT cDNAs were used to generate calibrationcurves. cDNAs were amplified by classic PCR as described above, purifiedusing the Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen), and quantified with bothmeasure of the absorbance at 260 nm and comigration on a 1.5% agarosegel with the Mass Ruler DNA Ladder (MBI Fermentas). Conversion ofmicrograms to copy number was done using the following formula: n(copy) � [(m � 1515)/Nbp] � 10�12 � N (m: �g of dsDNA, Nbp: lengthof the amplicon in bp, N: the constant of Avogadro). Serial dilutions wereused to create calibration curves by plotting the threshold cycle vs theknown copy number of each purified amplimer in the dilutions (20, 21).PCR efficiency was calculated using calibration curves with the followingformula: e � 10�1/s (s: slope) (with an efficiency equal of 2 (s � �3.32)that give an optimal value of 100%). For each human epidermis sample,
calibrators spanning five dilution points, GAPDH or DSG1 and AT-DSG1cDNAs, and nontemplate controls were amplified in triplicate, simulta-neously in one LightCycler run. Following each run, amplification reac-tions and amplimer sizes were checked by ethidium bromide-stained 1.5%agarose gel electrophoresis.
To correct for differences in both RNA quality and quantity betweensamples, data were normalized by dividing the copy number of DSG1 orDSG1-AT cDNA by the copy number of GAPDH (22). Quantitative resultsare presented as copies of the target cDNA per 1000 copies of GAPDH (23,24). Relative quantity of DSG1-alternative transcript was determined, di-viding the absolute copy number of these mRNAs by those of the totalDsg1 mRNAs (normal and alternative).
Peptides
Six peptides of the Dsg1-truncated isoform were synthesized, purified byHPLC (with purity �99%), and controlled by mass spectrometry (Institutde la Sante et de la Recherche Medicale, Unite 413). Two peptides wereused in the immunization protocol (see below): the INT6 peptide(IYVNVEPTFQRTLHKTK) encoded by the intron 6 insertion is specificto the Dsg1-truncated isoform; and the EC2 (184 –193) peptide(ADEPNNLNSK) is present in both Dsg1 and Dsg1-truncated proteins,and was chosen on the basis of antigenicity, accessibility, and hydrophi-licity criteria. Four overlapping 20-mer peptides between the EC2 domainand INT6 peptide of the Dsg1-truncated isoform, EC2/INT6 211–230(INRNTGEIRTMNNFLDREIY), EC2/INT6 216–235 (GEIRTMNNFLDREIYVNVEP), EC2/INT6 221–240 (MNNFLDREIYNVEPTFQRT),and EC2/INT6 226–245 (DREIYVNVEPTFQRTLHKTK), were used inthe HLA-DR peptide-binding assays.
Animals and immunization
New Zealand (NZ) White rabbits and CD1 mice were purchased fromCharles River Laboratories. For animal immunization, EC2 (184–193) andINT6 synthetic peptides were coupled to bovine thyroglobulin (BT) usingglutaraldehyde. Mice and rabbits were primed respectively with 40 �g(i.p.) and 200 �g (s.c.) of BT-coupled peptides emulsified in CFA andboosted eight times every 3 wk for 7 mo with BT-coupled peptides in IFA.IgG anti-EC2 (184–193) or anti-INT6 peptides were detected by ELISAusing the corresponding peptide as Ags and immunoblotting of purifiedrecombinant Dsg1-truncated isoform synthetized by in vitro transcription/translation (EC1/2-INT6).
Peptide ELISA
Ninety-six-well microtiter plates (Maxisorb Nunc) were coated with 100 �lof EC2 (184–193) or INT6 synthetic peptides (10 �g/ml), in PBS andincubated overnight at 4°C. After washing three times with PBS-0.1%Tween 20 (PBST), wells were blocked with PBS-1% Tween 20–5% su-crose-3% milk powder for 1 h at room temperature. After removal of ex-cess blocking solution, mouse or rabbit sera (1/100 in PBST-1% BSA)were added and incubated 1 h at room temperature. After washing withPBST, the plates were incubated with 1/10,000-fold diluted biotin-conju-gated goat anti-mouse or anti-rabbit IgG (Caltag Laboratories) for 1 h.After three washes, 1/10,000-fold diluted alcalin phosphatase-conjugatedstreptavidin (Caltag Laboratories) was added for 30 min at room temper-ature. The plates were washed, and labeling was revealed by adding 100 �lof p-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich). OD were determined at 405nm with an ELISA reader (Labosystems). All assays were run in duplicate,and background values given by each animal serum tested in uncoatedwells were subtracted. To control the specificity of the assay, preimmunesera were included in each experiment.
Indirect immunofluorescence assay
Mouse and rabbit sera (1/50) were analyzed by indirect immunofluorescenceon human foreskin sections using FITC-conjugated rabbit anti-mouse IgG Absor FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG Abs (Sigma-Aldrich) as the tracer.Sections were examined using a fluorescence microscope (Zeiss).
In vitro transcription translation
The Dsg1-truncated isoform was obtained as a recombinant polypeptide,called EC1/2-INT6, using an in vitro transcription-translation system.cDNA coding for EC1/2-INT6 was prepared from human epidermis RNAs,
6519The Journal of Immunology
and was amplified with a specific pair of primers: 5�-GAA TGG ATC AAGTTC GCA GCA G-3� (sense); 5�-TTA CTT TGT CTT ATG TAA AGTTCT TTG-3� (antisense). The purified PCR product was cloned in-frame inthe pSPUTK in vitro translation vector (Stratagene) at the ApaI and BamHIrestriction sites and sequenced with an automated sequencer (PerkinElmerApplied Biosystems), using the SP6 and T7 primers. Sequences werealigned and analyzed using the GenBank/EMBL databases (National Cen-ter for Biotechnology Information/Basic Local Alignment Search Tool net-work service). Then, 2 �g of plasmid preparation were used for in vitroexpression in the TNT6 SP6 Quick Coupled Transcription-Translation Sys-tem (Promega) according to the manufacturer’s instructions. To obtain pu-rified product, 2 �l of Transcend Biotin-Lysyl tRNA (Promega) wereadded to the reaction mixture, and the biotinylated polypeptides were cap-tured by SoftLink Avidin Resin (Promega) and eluted with Laemmli so-lution. The production and purity of EC1/2-INT6 were controlled by SDS-PAGE analysis on a 14% separating gel followed by immunoblotting witha peroxidase-conjugated streptavidin (Promega).
Immunoblot analysis
Mammary surgery specimens of normal human skin were used as thesource of epidermis. Protein extraction was performed as described previ-ously (25). Total protein extracts (75 �g/well) of normal kidney and smallintestine were also used as the other source of epidermal cells. Proteinswere separated by SDS-PAGE with a 14% separating gel according to theLaemmli’s method and electrotransferred onto nitrocellulose membranes.The filters were then saturated for 1 h in TBS-0.05% Tween 20 (TBST)�5% dry milk, and incubated with rabbit or mouse sera (1/50) inTBST-5% dry milk for 2 h. After washing, filters were incubated for 1 hwith 1/20,000-diluted peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG or1/80,000-diluted peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgG (Sigma-Aldrich) in TBST-5% dry milk. The filters were washed and revealed bychemiluminescence reaction (ECL Supersignal; Amersham Biosciences).For infrared fluorescent (IRF) immunoblot experiments performed with theOdyssey Infrared Imaging system, procedures were followed as describedpreviously (26). Briefly, after a saturating step, the membranes were incu-bated simultaneously with rabbit anti-EC2 and mouse anti-INT6 sera (1/50) for 2 h, then the membranes were incubated simultaneously with bi-otin-conjugated goat anti-rabbit IgG (Caltag Laboratories) and Alexa Fluor680-conjugated goat anti-mouse IgG (Molecular Probes) (1/6,000) for 1 h.Finally, membranes were incubated for 1 h with IRDye 800-conjugatedstreptavidin (Rockland) (1/6,000), and examined with the Odyssey InfraredImaging system (LI-COR Biosciences).
Two-dimensional-PAGE immunoblot analysis
Human epidermis was ground with a liquid nitrogen-cooled mortar andpestle, and proteins were extracted from the resulting powder as previouslydescribed by Gorg et al. (27). The protein extract (60 �l) was then sub-jected to two-dimensional-PAGE in which the first dimension was con-ducted on ReadyStrip IPG strips (11 cm, nonlinear pH 3–10 gradients;Bio-Rad) using the PROTEAN IEF cell system (Bio-Rad) according to themanufacturer’s instructions. After IPG strip equilibration, the second di-mension was run on 14% polyacrylamide gel (11 cm � 8 cm � 1 mm)using the Criterion Dodeca Cell system (Bio-Rad). Finally, gels were trans-ferred onto nitrocellulose membranes. The IRF immunoblot analysis onprotein-map replica was performed as described above.
HLA-DR peptide-binding assays
HLA-DRB1*0101, *0401, *0102, and *0402 molecules were immunopu-rified using L243 monomorphic Abs from HOM-2, BOLETH (a gift fromDr. C. de Toma, Centre d’Etude du Polymorphisme Humain, Paris,France), MZ07, and YAR cell lines, respectively. The binding capacities ofthe peptides were investigated in a competitive ELISA as described pre-viously (28, 29). Briefly, the biotinylated peptide was incubated at pH 6with a dose range of peptides to be tested and a fixed quantity of HLA-DRmolecules. After 24–72 h, HLA-DR peptide complexes were trapped byL243 Abs adsorbed on ELISA plates. After washing, presence of the bi-otinylated peptide was revealed using streptavidin-alkaline phosphataseconjugate (Amersham Biosciences) and 4-methylumbelliferyl phos-phate substrate. Emitted fluorescence was measured at 450 nm uponexcitation at 365 nm. The biotinylated peptides used were as follows:HA 306 –318 (PKYVKQNTLKLAT) for HLA-DRB1*0101 (1 nM) andHLA-DRB1*0401 (30 nM); and ALK (AALAAAKAAAAAA) forHLA-DRB1*0102 (10 nM) and HLA-DRB1*0402 (10 nM). Data wereexpressed as the concentration of peptide that prevented binding of 50%of the labeled peptide (IC50). Each value is the mean from two inde-pendent experiments.
Proliferation assays
PBMC from pemphigus patients (2 PF and 1 PV) were isolated by Ficoll-Hypaque Plus (Amersham Biosciences) density gradient separation.Two � 105 PBMC were cultured in triplicate in 200 �l of RPMI 1640(Cambrex BioScience) supplemented with 10% autologous plasma andcontaining either EC2/INT6 216–235 peptide, EC2/INT6 226–245 peptide(20 �g/ml), or PHA (Sigma-Aldrich) at 5 �g/ml for 6 days at 37°C in 5%CO2. PBMC cultures were preformed without peptide and served as neg-ative controls in each experiment. Cells in each individual well were pulsedwith 1 �Ci of [3H]thymidine (Amersham Biosciences) during the last 18 hof incubation, and were then harvested using an automated cell harvester(PerkinElmer Applied Biosystems). Proliferation of PBMC was deter-mined by measuring the [3H]thymidine uptake (cpm) on a beta counter(Wallac). Data were presented both as average cpm � SD and as stimu-lation index (SI): cpm of cells treated with EC2/INT6 peptides/cpm of cellswithout peptide. A SI �2 was considered as a positive response.
ResultscDNA amplification of DSG1-alternative transcript in humanepidermis
To produce recombinant Dsg1, we previously sequenced a cDNAfragment encoding the entire EC domain of the protein (EC1–EC5)that was obtained by transcription of oligo(dT)-primed keratino-cyte RNAs followed by nested PCR using primers located respec-tively at the 5� and 3� end of the nucleotide sequences encodingEC1 and EC5 (26). Surprisingly, we also found cDNAs corre-sponding to alternative DSG1 mRNAs that contained a 101-bpinsertion corresponding to the 3� end of intron 6 localized betweenexon 6 and exon 7, which both code with exon 5 for the EC2 ECdomain of Dsg1 (Fig. 1A). The intron 6 insertion contains a stopcodon that could lead to a premature stop of the translation andthus to the production of a truncated isoform of Dsg1. If synthe-sized, this isoform would be composed of the EC1 domain, a partof the EC2 domain (158–227 aas), and an additional 17-mer pep-tide encoded by the intron 6 insertion (INT6) and absent from thetransmembrane Dsg1 (Fig. 1B). To confirm the existence of DSG1-alternative transcript (DSG1-AT) in human epidermis, we ampli-fied a specific cDNA sequence (amplimer of 101 bp) obtainedfrom epidermis mRNAs, by PCR using primer sense (DSG1-ATsense) and primer antisense (DSG1-AT antisense) hybridizing theexon 6-intron 6 junction and the intron 6, respectively (Fig. 1A).Alternative transcripts of DSG1 were detected in all human epi-dermis samples tested (n � 9) (Fig. 2A). Moreover, both DSG1-transcripts were also detected in cultured keratinocytes from hu-man epidermis (data not shown). Therefore, alternative mRNAs ofDSG1 are physiologically expressed by keratinocytes of humanepidermis.
Quantification of DSG1-alternative transcript in humanepidermis
To quantify the expression of DSG1-alternative transcripts in hu-man epidermis, we performed quantitative real-time PCR usingLightCycler thermocycler. The efficiency of PCR amplificationswas checked using standard curves generated by serial dilutions ofpurified DSG1-AT, DSG1, and GAPDH amplimers. PCR werevery efficient, reaching an efficiency of 99.5% for GAPDH, DSG1,and DSG1-AT amplifications (Fig. 2B), and allowing the quanti-fication of the two DSG1 transcripts. Quantitative real-time PCRwere then conducted for the nine human epidermis samples, andthe specificity of each amplified product was confirmed by thefusion curve analysis (Fig. 2, C and D). Data obtained were nor-malized with GAPDH to evaluate the absolute copy number ofboth DSG1 and DSG1-AT transcripts in each of the nine samples(Fig. 2E). The relative quantity of alternative transcript of Dsg1
6520 TRUNCATED ALTERNATIVE SPLICED ISOFORM OF Dsg1
FIGURE 1. Nucleotide and aminoacid sequences of the truncated iso-form of Dsg1. cDNA sequence of thealternative mRNAs that encode foramino acids of a truncated isoform ofDsg1 (A). This isoform is composedof the signal peptide (S), the prose-quence (P), the EC1 domain, and apart of the EC2 domain (157–227 aas)of Dsg1, and contains an additional17-mer peptide (INT6) (black high-lighting) encoded by a 101-bp in-tronic insertion corresponding to the3� end of the intron 6 (gray highlight-ing). This insertion introduces a stopcodon that prematurely stops thetranslation of the protein. Comparedwith Dsg1 (B), its truncated isoformlacks the major part of the EC do-mains (a part of EC2 domain to theEC anchor domain (EA)) as well asthe transmembrane domain (TM) andthe entire intracellular domains of thenative Dsg1. Primers used to amplifycDNA sequence of normal (DSG1sense and DSG1 antisense) and alter-native transcripts of DSG1 (DSG1-ATsense and DSG1-AT antisense) are in-dicated on the cDNA sequence (A, un-derlined nucleotides).
6521The Journal of Immunology
expressed in human epidermis ranged from 6 to 30% with an av-erage of �15% (Fig. 2F). Therefore, one can conclude to an in-terindividual variability of the DSG1-alternative transcript expres-sion in normal human skin.
Production and characterization of polyclonal Abs directedagainst EC2 and INT6 peptides
All CD1 mice immunized with the INT6 peptide, specific of theDsg1-truncated isoform, and the NZ rabbit immunized with theEC2 (184–193) peptide, present in both Dsg1 and Dsg1-truncatedproteins, produced IgG reacting with INT6 and EC2 peptides in asolid phase ELISA, respectively (Fig. 3A). Anti-peptide sera werethen tested for their capacity to react with the recombinant trun-cated isoform of Dsg1 (EC1/2-INT6) by immunoblot analysis.Both anti-INT6 and anti-EC2 sera reacted with EC1/2-INT6 re-combinant polypeptide that exhibited a molecular mass of 25-kDa(Fig. 3B). Next, to determine whether anti-EC2 peptide Abs alsorecognized the 184–193 aa sequence present in native Dsg1, in-direct immunofluorescence analysis of human foreskin and immu-noblotting experiment of human epidermis were performed withthe rabbit antiserum. IgG anti-EC2 bound to the intercellular spaceof human epidermis (Fig. 4B) with a labeling pattern similar to thatobtained with PF anti-Dsg1 Abs on human foreskin sections (Fig.4A). Interestingly, anti-INT6 mouse sera gave a labeling pattern ofhuman epidermis located at the suprabasal keratinocyte level (Fig.4C). IgG anti-EC2 also reacted with a 160-kDa protein present inhuman epidermis extract that comigrated with Dsg1 (Fig. 5A).
FIGURE 2. Amplification and quantification of normal (DSG1) and al-ternative (DSG1-AT) transcripts of DSG1 in human epidermis by quanti-tative real-time PCR. Specific cDNA sequences of the DSG1-normal tran-script (256 bp) and -alternative transcript (DSG1-AT) (101 bp) wereamplified by classical PCR (HE1, HE2, and HE3 are representative ofamplifications obtained with all human epidermis samples (HE)) (A).Quantitative real-time PCR were performed using the LightCycler thermo-cycler system. To determine the absolute copy number of target transcripts,purified GAPDH, DSG1 and DSG1-AT cDNAs were used to generate cal-ibration curves, which were also permitted to evaluate the PCR efficienciesusing the formula: e � 10�1/s (s, slope) (with an efficiency equal to 2 (s ��3.32) that give an optimal value of 100%). PCR efficiencies for GAPDH,DSG1, and DSG1-AT amplifications were identical (s � �3.340; e �99.5%) (B). GAPDH, DSG1, and DSG1-AT amplifications of the nine hu-man epidermis samples were then performed using the LightCycler ther-mocycler. A typical amplification of the HE1 sample is shown in C. Thespecifics of each amplified product were confirmed by fusion curve anal-ysis (D). Copies of each target cDNA per 1000 copies of GAPDH (absolutecopy number of cDNA) (E) allowed to evaluate the relative quantity ofDSG1-AT: the absolute copy number of DSG1-alternative mRNAs wasdivided by those of total Dsg1 mRNAs (normal and alternative) (F). Re-sults are presented in percentages.
FIGURE 3. Binding capacity of peptide-immunized animal sera to (A)peptides, assessed by ELISA and to (B) recombinant truncated isoform ofDsg1 (EC1/2-INT6) by immunoblotting. A, EC2 (184–193) or INT6 pep-tide-coated ELISA plates were saturated, incubated successively with rab-bit or mouse sera (1/100) (immune sera (f) or preimmune sera (�)), bi-otin-conjugated goat anti-mouse or anti-rabbit IgG, and phosphatase-conjugated streptavidin. The reaction was revealed by adding p-nitrophenylphosphate. OD were determined at 405 nm. NZ White rabbit serum; CD1,CD1 mouse sera. B, The purified biotinylated-EC1/2-INT6 recombinantprotein was electrotransferred onto nitrocellulose filters that were then sat-urated, incubated with mouse or rabbit serum (1/50) and with peroxidase-conjugated goat anti-mouse or anti-rabbit IgG, and revealed by chemilu-minescence reaction. Lane 1, peroxidase-conjugated streptavidin; lane 2,anti-EC2-NZ rabbit serum; lanes 3–6, anti-INT6-CD1 mouse sera; lane 7,preimmune NZ rabbit serum; lanes 8–11, preimmune CD1 mouse sera.
6522 TRUNCATED ALTERNATIVE SPLICED ISOFORM OF Dsg1
Abs directed against the recombinant truncated isoform ofDsg1 also recognize a 25-kDa protein expressed by humanepidermal cells
Once characterized, anti-EC2 and anti-INT6 sera were used asspecific probes in immunoblot experiments on epidermal extract todetermine the existence of the truncated isoform of Dsg1 in humanepidermis. All four anti-INT6 sera reacted with a 25-kDa polypep-tide doublet; whereas anti-EC2 serum reacted with a single 25-kDaprotein. None of the preimmune sera bound to epidermal proteinswith this molecular mass (Fig. 5A). Immunoblotting with anti-INT6 sera showed that the 25-kDa polypeptide doublet was alsopresent in a cultured-keratinocyte extract (data not shown). Whenthe replica was incubated with anti-INT6 and anti-EC2 sera simul-taneously, the IRF immunoblot showed that the lower band of the25-kDa polypeptide doublet was recognized by both sera (Fig. 5B,lane 3, yellow band) as well as the 25-kDa recombinant Dsg1-truncated isoform (Fig. 5C, lane 3, yellow band). In contrast, bothDsg1 and Dsg1-truncated isoform were not detected in other testedhuman epithelial tissues like kidney and small intestine (data notshown). Thus, the immunological identity of the 25-kDa proteinpresent in human epidermal extract with the recombinant Dsg1-truncated isoform constitutes a first strong argument speaking forthe Dsg1-truncated isoform expression in human epidermal cells.This argument was further supported by an IRF immunoblot anal-ysis of a two-dimensional-PAGE-separated human epidermis pro-tein map with anti-INT6 and anti-EC2 sera as specific probes ofthe truncated isoform of Dsg1. Both sera bound to a single epi-
dermal protein (Fig. 6), which had molecular mass and isoelectricpoint (pI) coordinates (25-kDa, pI 4.7) close to those theoreticallycalculated for the truncated isoform of Dsg1 (22.4-kDa, pI 5.5)(Fig. 6C, yellow spot) (data obtained in triplicate), and that cor-respond to the lower band of the 25-kDa polypeptide doublet rec-ognized by both anti-INT6 and anti-EC2 sera in IRF immunoblot-ting experiments.
A specific amino acid sequence of the truncated isoform of Dsg1binds to the DR�1*0102 molecule
The truncated isoform of Dsg1 bears amino acid sequences that areabsent from the transmembrane Dsg1, particularly the INT6 pep-tide and peptide-overlapping sequences with INT6 and the EC2domain. This observation is reminiscent of the two isoforms ofmyelin basic protein (MBP) (21.5-kDa and 20.2-kDa), which areexpressed during the remyelinization process, and contain an exon2-encoded protein, X2MBP, which is absent from the major iso-form of MBP (18.5-kDa). In multiple sclerosis, specific T cellresponses directed against X2MBP were associated with the dis-ease (30). To test the possibility that peptides of the Dsg1-trun-cated isoform bind to HLA class II molecules that predispose toPF, we synthetized four overlapping 20-mer peptides between EC2domain and INT6 peptide (EC2/INT6 211–230, EC2/INT6 216–235, EC2/INT6 221–240, and EC2/INT6 226–245) and evaluatedby a competitive ELISA, their relative binding capacity to HLAclass II, DR�1*0102, and DR�1*0402, which were previouslydemonstrated to be associated with the disease in French PF pa-tients (17, 19). Interestingly, the EC2/INT6 216–235 peptidebound to the DR�1*0101, *0102, *0401, and *0402 molecules,because it exhibited toward all these molecules IC50 values inferiorto the binding activity threshold of 1000 nM (Table II). Moreover,as compared with the reference peptides that are very good bind-ers, its IC50 was of 3.4 toward DRB1*0102 and less high a factorof 20 toward DRB1*0101, *0401, and *0402 molecules. It can
FIGURE 4. Indirect immunofluorescence assay of anti-peptide sera onhuman foreskin. Tissue sections were incubated with anti-EC2 or anti-INT6 sera, washed, and incubated with FITC-conjugated rabbit anti-mouseIgG Abs or FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG Abs (original magnifi-cation, �400). Anti-EC2 serum (B) gave an intercellular labeling pattern ofthe epidermis similar to that obtained with an anti-Dsg1-positive PF serum(A). Anti-INT6 sera gave a labeling pattern of suprabasal keratinocytes (C)that was not observed with preimmune sera (D).
FIGURE 5. Classical (A) and IRF immunoblot analyses (B and C) ofanti-peptide sera. Human epidermis extract (A and B) or biotinylated-EC1/2-INT6 recombinant protein (C) were separated by SDS-PAGE and elec-trotransferred onto nitrocellulose filters. Saturated filters were incubatedwith rabbit or mouse serum (1/50) then with peroxidase-conjugated goatanti-mouse or anti-rabbit IgG and revealed by chemiluminescence reaction.A, Lane 1, Anti-EC2-NZ rabbit serum; lane 2, preimmune NZ rabbit se-rum; lane 3, CD1–3 anti-INT6 serum; lane 4, CD1–42 anti-INT6 serum;lane 5, CD1–71 anti-INT6 serum; lane 6, CD1–72 anti-INT6 serum; lanes7–10, preimmune CD1 mouse sera. For IRF immunoblot analysis, satu-rated filters were incubated simultaneously with anti-EC2-NZ rabbit serumand anti-INT6-CD1 mouse sera, and, after washing, simultaneously withbiotin-conjugated goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 680-conjugatedgoat anti-mouse IgG, and finally with IRDye 800-conjugated streptavidin.Replicas were examined with the Odyssey Infrared Imaging system. B andC, Lane 1, Anti-EC2-NZ rabbit serum; lane 2, anti-INT6 mouse serum;lane 3, anti-EC2-NZ rabbit serum plus anti-INT6 mouse serum; lane 4,preimmune NZ rabbit and CD1 mouse sera. IRF immunoblot analysisshows that both anti-EC2-NZ rabbit and anti-INT6 mouse sera bound to the25-kDa protein with the superimposed red and green signals giving theyellow band.
6523The Journal of Immunology
therefore be considered as a good peptide binder for thesemolecules.
A specific amino acid sequence of the truncated isoform of Dsg1induces the proliferation of PBMC from PF patients
To determine whether T cells proliferate in response to the EC2/INT6 216–235 peptide, we performed proliferation assays withPBMC from PF (n � 8) and PV (n � 13) patients (Table I). PBMCfrom four PF (PF1, PF2, PF5, and PF7) (50%) and one PV (PV4)(7.7%) patients showed a proliferative response to the EC2/INT6216–235 peptide, whereas cells from only one PF patient (PF5)proliferated in presence of the EC2/INT6 226–245 peptide (Fig.7). Interestingly, two PF patients (PF1 and PF7) whose PBMCshowed a positive response to the EC2/INT6 216–235 peptide(SI � 3.2 and 3, respectively), carry the DR�1*0102 allele (Fig.7C). PBMC from PF2 patient, who carries the DR�1*0101 allelepreviously reported to be overrepresented in PF (31) and shown tobind efficiently to EC2/INT6 216–235 peptide in our study, pro-liferated in response to this peptide (SI � 2.2). Only one PV pa-tient carrying the DR�1*0402 allele, which was detected in 8 of 13PV patients (Fig. 7B), exhibited a significant T cell proliferationinduced by the EC2/INT6 216–235 peptide (SI � 5) (Fig. 7B). Nocorrelation was observed between the capacity of T cells to pro-
liferate in response to the EC2/INT6 216–235 peptide and thepresence of anti-Dsg1 Abs at the time of the study. Finally, T cellsfrom BP patients (n � 6) did not proliferate in presence of theEC2/INT6 226–245 peptide (Fig. 7C).
Therefore, these data indicate that a specific amino acid se-quence of the truncated isoform of Dsg1 that efficiently bound tothe DR�1*0102 molecule also can induce the proliferation of Tcells from PF patients.
DiscussionWe described, for the first time, the existence of alternative tran-script of DSG1 in human epidermis. The transcript contains a101-bp insertion, which corresponds to 3� end of DSG1-intron 6and introduces a new stop codon in the nucleotide sequence. Thestop codon is located 51 nucleotides downstream from the begin-ning of intron 6 insertion and leads to the translation of a truncatedisoform of Dsg1 constituted of the Dsg1-EC1 domain, a part of theDsg1-EC2 domain and an additional 17-mer peptide encoded bythe first 51 nucleotides of the intron 6 insertion. Polyclonal Absdirected against the EC2 and the intron-encoded (INT6) peptidesreacted not only with the recombinant truncated isoform of Dsg1but also with a 25-kDa epidermal protein present in a two-dimen-sional-PAGE-separated human epidermis protein map. Indeed, theimmunoreactive protein had molecular mass and pI coordinatessimilar to the theoretical coordinates of the truncated isoform ofDsg1. In addition, immunoblot analysis of human keratinocytes inprimary culture with the anti-INT6 serum showed that this 25-kDaprotein was synthesized by human keratinocytes. No protein witha 25-kDa molecular mass and recognized by anti-INT6 sera couldbe detected in other tested organs. Thus, our results demonstratethat a truncated isoform of Dsg1 encoded by alternative transcriptis physiologically expressed in the epidermis of normal individualsand by keratinocytes. They also provide another ex vivo demon-stration that the major autoantigen target of the autoimmune re-sponse observed during an organ-specific autoimmune disease, hasan alternative spliced isoform. Indeed, it has been recently esti-mated on the basis of an in silico study that autoantigens display ahigher frequency (100 vs 42%) of alternative splicing than tran-scripts of randomly selected non-autoantigens, suggesting that al-ternative splicing plays a role in the pathogenesis of systemic andorgan-specific autoimmune diseases. In addition, this in silicostudy indicated that a significantly higher rate of noncanonicalsplicing was observed in autoantigen transcripts compared withthose of randomly selected genes (80 vs 1%) (32). Interestingly,the posttranscriptional splicing of Dsg1 observed in our study is
FIGURE 6. IRF immunoblotting of a two-dimensional-PAGE-sepa-rated human epidermis protein map with anti-peptide sera. Human epider-mis extract was separated by two-dimensional-PAGE and electrotrans-ferred onto nitrocellulose membranes, which were incubatedsimultaneously with anti-EC2-NZ rabbit serum and anti-INT6 mouse sera,and, after washing, simultaneously with biotin-conjugated goat anti-rabbitIgG and Alexa Fluor 680-conjugated goat anti-mouse IgG, and finally withIRDye 800-conjugated streptavidin. Replicas were examined with the Od-yssey Infrared Imaging system. A, anti-INT6 mouse serum; B, anti-EC2-NZ rabbit serum; C, anti-EC2-NZ rabbit serum plus anti-INT6 mouseserum. IRF immunoblot analysis shows that both anti-EC2-NZ rabbit andanti-INT6 mouse sera bound to a single 25-kDa protein with the superim-posed red and green signals giving the yellow spot (immunoreactive spotsare magnified at the right bottom corner). Molecular masses are indicatedon the ordinate and pI in abscissa.
Table II. Binding capacities of 20-mer peptides overlapping EC2domain and INT6 peptide of the truncated isoform of Dsg1 toimmunopurified HLA-DR molecules.a
Peptides
DR�1 Alleles
0101 0102 0401 0402
Biotinylated peptidesHA 1 30ALK 63 39Dsg1-truncated
isoform peptidesEC2/INT6 211–230 2828 2426 5000 2289EC2/INT6 216–235 95 215 387 391EC2/INT6 221–240 1732 - 1732 -EC2/INT6 226–245 4899 - - -
a IC50 values (nM) inferior to 1,000 nM are in bold; -, activity superior to 100,000nM. Blank, peptides were not tested. HA, hemagglutinin.
6524 TRUNCATED ALTERNATIVE SPLICED ISOFORM OF Dsg1
noncanonical because the intron 6 flanking sequences do not sharethe 5�-GT and 3�-AG consensus sequence.
This truncated isoform of Dsg1 may have different roles. First,from a physiological viewpoint, this truncated isoform that lacksthe major part of the EC domain, the transmembrane domain, andthe entire intracellular domain of the native Dsg1, could be solu-ble, unable to exert cell-cell adhesion function, and thus could
induce a fragility of desmosomal junction. Indeed, it was previ-ously shown that in vitro-synthesized truncated form of Dsg1 com-promises desmosomes when added to keratinocyte tumor cell lineculture (33). Second, and from an immunological viewpoint, it iswell established that the translation of autoantigen isoforms en-coded by alternative transcripts can play a role in the initiation andmaintenance of systemic or organ-specific autoimmune responsesthrough different mechanisms (32). A first mechanism proposesthat an autoantigen isoform expressed in the thymus and lacking aT cell epitope borne by the full autoantigen expressed at the pe-riphery, may prevent clonal deletion of autoreactive T cells. Thisis illustrated by murine experimental allergic encephalomyelitis inwhich the thymic expression of DM20, a shorter form of the pro-teolipid protein lacking 35-aa stretch, has been correlated with thepresence of autoreactive T cells specific to the complete form ofproteolipid protein expressed in the CNS but excluded from thethymus (4). Similarly, an alternatively spliced transcript of thepancreatic islet cell Ag 512 (ICA512/IA-2), which lacks sequencethat encodes several T cell epitopes and is exclusively expressed inthymus, has been described and could be responsible for a toler-ance breakdown against ICA512/IA-2 in type 1 diabetes (5). Ac-cording to another mechanism, autoantigen isoforms could containnew epitopes susceptible to be recognized specifically by autore-active T cells or autoantibodies. For example, in multiple sclerosis,specific T cell responses against X2MBP, an exon 2-encoded pro-tein expressed by two isoforms of MBP during remyelinizationprocess (21.5- and 20.2-kDa) and, absent from the major isoformof MBP (18.5-kDa), were correlated with disease progression (30).Closer to our observation is the demonstration that a truncated andsoluble isoform of the IL-6 signal-transducing molecule gp130,which is translated from alternatively spliced mRNA, contains aspecific epitope frequently targeted by the autoimmune response inpatients with rheumatoid arthritis (34). One should add that the insilico study cited above (32) showed, by using appropriate algo-rithms, that most alternative spliced isoform regions of autoanti-gens encode potential MHC class I- and/or class II-restricted T cellepitopes.
These considerations prompted us to examine the potential roleof the truncated isoform of Dsg1 in the T cell autoimmune re-sponse occurring in the course of PF. We tested the possibility thatspecific amino acid sequences of the truncated protein could bindto PF-associated HLA class II molecules. We thus set up anHLA-DR peptide-binding assay to evaluate the relative bindingaffinities of four peptides overlapping EC2 domain and INT6 se-quences to four HLA class II molecules. The overlapping peptideEC2/INT6 216–235 of the Dsg1-truncated isoform bound to allHLA-DR molecules tested and to the PF-related DR�1*0102 al-lele with the highest affinity. Moreover, the EC2/INT6 216–235peptide was able to induce T cell proliferation in four PF patients(50%). Three of them carried the HLA class II alleles (DR�1*0102and *0101) shown to accommodate with a high affinity the selectedpeptide in our binding experiments. Although the subtype of theDR14 molecule expressed by the fourth PF patient, whose PBMCproliferated was not determined, one should mention that severalPF-associated DR14 molecules, namely *1401 and *1406, shareamino acid residues (LLEQRRAA) at critical positions of the pep-tide-binding groove with DR�1*0102 and *0101 (31). One shouldalso note that T cells from a DR�1*0101 PF patient (PF6) did notproliferate when stimulated by the selected EC2/INT6 peptide, al-though the patient had a high anti-Dsg1 Ab titer (202 U/ml). As amatter of fact, T cell proliferation not only requires peptide pre-sentation by APCs but also a sufficient number of peptide-specificT cells with adequate functional properties. Thus, on the one handand according to their HLA class II genotype and T cell repertoire,
FIGURE 7. Proliferative responses of PBMC from pemphigus patientsto EC2/INT6 216–235 and 226–245 peptides. The proliferation of PBMCfrom 8 PF (A) and 13 PV (B) patients cultured without peptides (u), withthe EC2/INT6 226–245 peptide (�) or EC2/INT6 216–235 peptide (f),was determined by the uptake of [3H]thymidine after 6 days. Proliferationassays were performed in triplicate and are expressed as average cpm �SD. SI representing the ratio of cpm in cultures with EC2/INT6 peptides(226–245 (‚) or 216–335 (Œ)) and cultures without peptides are shown inC. A SI �2 was considered as a positive response. Cells from four PF(50%) and one PV (7.7%) patients showed a proliferative response to theEC2/INT6 216–235 peptide, whereas cells from the BP patients did not.
6525The Journal of Immunology
not all PF patients may have the capacity to mount an autoimmuneresponse to the T cell epitope borne by the Dsg1-truncated iso-form, and, on the other hand, the clinical status (remission vs acuteonset) and the therapeutic regimen may modulate the proliferativecapacity of T cells. Among 13 PV patients, only one had a T cellproliferative response to the EC2/INT6 216–235 peptide. Interest-ingly, this patient had a mucocutaneous phenotype of the diseaseand carried the DR�1*0402 allele that also was shown to bind theDsg1-truncated isoform-derived peptide. PBMC obtained fromother mucocutaneous PV bearing the DR�1*0402 allele did notproliferate, indicating that this PV-associated HLA class II allele isper se not sufficient to trigger T cell proliferation and that othermolecular and cellular factors are required.
Therefore, on the basis of results observed in PF patients, one canhypothesize that the soluble Dsg1-truncated isoform is processed byAPCs bearing DR�1*0102 molecules, which then present specificepitope EC2/INT6 216–235 to autoreactive T cells. Once primed,these T cells could activate Dsg1-specific B-cells and, finally, triggerthe production of anti-Dsg1 autoantibodies.
In conclusion, we demonstrated the existence of a truncated iso-form of Dsg1 in human epidermis, encoded by alternative tran-script, and possessing a specific peptide bound by PF-associatedHLA class II DR�1*0102 molecules that could participate in thetolerance breakage to Dsg1.
AcknowledgmentsWe thank dermatologists of the French Bullous Study Group who haveparticipated in this study.
DisclosuresThe authors have no financial conflict of interest.
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6526 TRUNCATED ALTERNATIVE SPLICED ISOFORM OF Dsg1
Résultats
164
B- L’immunisation de souris normales avec la desmogléine 1 induit une
diversification de réponse anticorps vis à vis d’autres composants
du desmosome
L’étude des propriétés et des modes d’action des autoAc produits au cours des
pemphigus a été cruciale pour l’identification des autoaAg épidermiques qui sont la cible
de la réponse auto-immune, la compréhension des mécanismes physiopathologiques à
l’origine de la maladie et le développement d’outils diagnostiques et thérapeutiques. A cet
égard, la caractérisation des Acm anti-Dsg générés à partir de souris immunisées avec les
Dsg recombinantes a notamment participé de façon essentielle à la dissection des
phénomènes moléculaires impliqués dans la physiopathologie des pemphigus.
L’objectif initial de notre travail a consisté à produire des Acm dirigés contre la
Dsg1. Nous avons donc produit dans le système d’expression baculovirus/cellules
d’insecte, la région extracellulaire (EC) recombinante de la Dsg1 (rEC1/5-Dsg1) qui
comporte à son extrémité C-terminale des peptides histidine et un FLAG permettant sa
purification par chromatographie d’affinité. Des souris normales BALB/c et CD1 (10 de
chaque) ont été immunisées avec la protéine rEC1/5-Dsg1 purifiée. La production des
IgG anti-Dsg1 dans le sérum des souris, contrôlée par ELISA utilisant rEC1/5-Dsg1
comme Ag, a été observée chez l’ensemble des animaux immunisés. La reconnaissance de
la région EC de la Dsg1 par les sérums a été testée par immunoempreinte de la protéine
rEC1/5-Dsg1 et d'un extrait protéique d’épiderme humain. Ces analyses ont montré que
les sérums des souris BALB/c-2 (B2) et CD1-2 (C2) réagissent à la fois avec la Dsg1 et
avec d’autres protéines épidermiques de plus haut poids moléculaire. Les sérums des
souris B2 et C2 reconnaissent respectivement, une protéine de 190 kDa et un doublet
protéique de 190-210 kDa. Quatre animaux dont les souris B2 et C2 ont été sélectionnés
pour la fusion des splénocytes murins avec le myélome SP2/O. Trois hybridomes (1N5,
1D8 et 8C3) ont été selectionnés sur leur capacité à sécréter des IgG réagissant avec la
protéine rEC1/5-Dsg1 en ELISA puis clonés. Les analyses en IFI montrent que ces Acm
donnent un marquage fluorescent « en résille » de l’épiderme humain identique à celui
observé avec des IgG anti-Dsg1 mais contrairement aux sérums des souris dont ils sont
isolés, ne se fixent pas aux cellules épithéliales de l’œsophage de souris. A l’instar de
l’Acm 8C3, 1N5 et 1D8 reconnaissent en immunoempreinte la protéine rEC1/5-Dsg1 et la
Dsg1 présente dans l’extrait d’épiderme humain.
Deux autres hybridomes, CK1 et 10A1, qui dérivent respectivement des souris C1
et B2 dont les sérums réagissent avec d’autres Ag épidermiques en plus de la Dsg1, ont
été sélectionnés par IFI et clonés. L’Acm CK1 donne à la fois un marquage fluorescent de
la SIC et de la membrane basale sur les sections de prépuce humain et d’œsophage de
souris. Les analyses en immunoempreinte sur un extrait d’épiderme humain montrent
Résultats
165
que tout comme le sérum parental, CK1 reconnaît un doublet protéique de 190-210 kDa.
L’Acm 10A1 donne un marquage intercellulaire des tissus épithéliaux humain et murin
en IFI et reconnaît en immunoempreinte, une protéine unique de 190 kDa présente dans
un extrait d’épiderme humain. De plus, les expériences de comarquage par
immunoempreinte infrarouge montrent que les protéines réagissant avec CK1 et 10A1
sont aussi reconnues par le sérum d’un patient atteint de PPN.
Afin d’identifier les Ag de 190 et 210 kDa, ces Acm ont été utilisés pour
l’immunocriblage d’une carte protéique 2D d’épiderme humain. Il est à noter qu’une
optimisation technique du procédé d’électrophorèse bidimensionnelle a préalablement été
nécessaire afin d’accroître la représentativité des protéines de haut poids moléculaire (>
150 kDa) sur la carte 2D, quasiment absentes du gel quand la migration est effectuée
selon la méthode conventionnelle. Les analyses des spectres de masse des taches
protéiques de 190 et 210 kDa reconnues en immunoempreinte sur la carte protéique 2D
et obtenues après excision du gel d’acrylamide, digestion trypsique et spectrométrie de
masse MALDI-ToF démontrent que 10A1 reconnaît la périplakine (190 kDa) et CK1, à la
fois l’envoplakine (210 kDa) et la périplakine. Par ailleurs, l’immunocriblage d’une banque
d’expression d’ADNc de kératinocytes humains avec CK1 et réalisé en parallèle de la
stratégie d’identification décrite précédemment montrent que cet Acm reconnaît plus
précisément le sous-domaine de liaison (linker subdomain) de l’envoplakine qui partage
environ 50% d’identité avec celui de la périplakine. Ces résultats ont fait l’objet d’une
publication dans Proteomics.
Résultats
166
ARTICLE 2
Proteomic Analysis of the Autoantibody Response Following
Immunization with a Single Autoantigen.
H. Mouquet, L. Drouot, R. Charlionnet, C. Arnoult, F. Bonnet-
Bayeux, M. Thomas, J. Leprince, P. Joly, F. Tron, D. Gilbert.
Proteomics 2006:6;4829–37.
RESEARCH ARTICLE
Proteomic analysis of the autoantibody response
following immunization with a single autoantigen
Hugo Mouquet1, Laurent Drouot1, Roland Charlionnet1, Christophe Arnoult1,Florence Bonnet-Bayeux1, Marlène Thomas1, Jérôme Leprince2, Pascal Joly1,Francois Tron1 and Danièle Gilbert1
1 Inserm, U519 and IFR23, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Rouen, France2 Inserm, U413, Mont Saint Aignan, France
In most autoimmune diseases, the autoantibody response is directed against several antigens ofthe target organ whose identification is crucial for understanding the physiopathological process.Thus, technologies allowing a characterization of the whole autoantibody pattern of both humanand experimental autoimmune diseases are required. Here we have used immunoproteomicanalysis of human epidermal extracts to characterize the diversity of the anti-desmosome anti-body response induced in normal mice immunized with desmoglein 1, the major autoantigen ofpemphigus foliaceus, an autoimmune blistering skin disease. In particular, this analysis enablesus to characterize the binding properties of anti-desmosome mAbs derived from these mice andto show that the autoantibody response induced upon immunization with a single autoantigentargets different epidermal autoantigens with a pattern similar to that observed in certain varietyof human pemphigus.
Received: August 25, 2005Revised: May 5, 2006
Accepted: May 17, 2006
Keywords:
Antigen spreading / Desmoglein 1 / Immunoproteomics / Pemphigus / Plakins
Proteomics 2006, 6, 4829–4837 4829
1 Introduction
Autoantigens play a major role in the physiopathology ofautoimmune diseases. They participate in the breakage oflymphocyte tolerance and thus initiate the B and T cell auto-immune response as demonstrated, in humans, by theextinction of the autoimmune response when the targetantigens are eliminated and, in animals, by the induction ofan autoimmune disease upon immunization with a single
autoantigen. In addition, autoantigens not only initiate anddrive the autoimmune response, they also participate in itsdiversification. Indeed, in most if not all autoimmune dis-eases, the autoimmune response is directed against severalantigens of the target organ [1]. This diversification isthought to progress from one antigen to another through theepitope spreading phenomenon whose cellular and molecu-lar mechanisms still remain obscure [2]. Identification of thedifferent target antigens of the autoantibody response is thusan important step in both human and experimental auto-immune diseases, and requires technologies allowing anoverview of the full-blown autoantibody specificities. In thisregard, we previously showed that proteomic analysis was apowerful tool to identify and characterize the different auto-antibody populations produced in a spontaneous mousemodel of systemic lupus erythematosus, a prototype of non-organ-specific autoimmune diseases [3].
Desmoglein 1 (Dsg1) is a 160-kDa desmosomal trans-membrane glycoprotein belonging to the cadherin family.Desmosomal cadherins allow calcium-dependent cell–cell
Correspondence: Professor Francois Tron, Inserm U519, Facultéde Médecine et de Pharmacie, 22, boulevard Gambetta, 76183Rouen Cedex 1, FranceE-mail: [email protected]: 133-2-3288-8186
Abbreviations: Dsg, desmoglein; rEC1/5-Dsg1, recombinantextracellular domain of human desmoglein 1; PF, pemphigusfoliaceus; EC, extracellular; PNP, paraneoplastic pemphigus; i.p.,intraperitoneal; IIF, indirect immunofluorescence; IRF, infraredfluorescence; PS, signal sequence and propeptide
DOI 10.1002/pmic.200600257
© 2006 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.proteomics-journal.com
4830 H. Mouquet et al. Proteomics 2006, 6, 4829–4837
adhesion through homophilic interactions of their extra-cellular (EC) domains [4]. Dsg1 expression is restricted tostratified squamous epithelia, like the epidermis [5], whereits function is critical for keratinocyte adhesion mediated bydesmosomes. Dsg1 is the autoantigen of pemphigus folia-ceus (PF), an autoimmune blistering skin disease character-ized by an autoantibody response directed against con-formational calcium-dependent epitopes of the Dsg1 EC do-main, particularly the N-terminal adhesive region (EC1 andEC2 domains) [6–8]. Anti-Dsg1 autoantibodies are patho-genic because, when transferred into normal mice, theirin vivo binding to Dsg1 leads to the loss of adhesion betweenkeratinocytes and the formation of intraepidermal blisters[9]. The production of anti-Dsg1 antibodies is not restrictedto PF. Indeed, solid-phase ELISAs using recombinant Dsg1,which are more sensitive than immunoblot analysis of epi-dermal extract, allowed the presence of these antibodies to bedemonstrated in other forms of pemphigus, including pem-phigus vulgaris and paraneoplastic pemphigus (PNP) [10,11]. The tolerance breakdown observed in pemphigus mayalso involve other keratinocyte autoantigens [10–12]. Forexample, immunoblot analysis of normal human epidermalextracts with PNP sera showed that they consistently reactwith a doublet of 210- and 190-kDa proteins identified,respectively, as envoplakin and periplakin, which are mem-bers of the plakin family and components of the intracyto-plasmic plaque of desmosomes. This reactivity pattern ishighly sensitive and specific for PNP, while it is veryuncommon in pemphigus vulgaris, PF and endemic PF sera[13–15]. Taken together, these observations indicate thediversification and the overlapping distribution of autoanti-body responses observed in the course of these differentvarieties of autoimmune blistering skin diseases.
Here, we show by proteomic analysis that: (i) miceimmunized with the recombinant baculoprotein corre-sponding to the EC domain of human Dsg1 (rEC1/5-Dsg1)developed autoantibodies directed against not only Dsg1 butalso other epidermal antigens; (ii) these antigens were iden-tified as envoplakin and periplakin; (iii) the antigen-inducedautoantibody specificities were similar to those observed incertain varieties of human pemphigus; and (iv) this technol-ogy constitutes an appropriate approach to study the diver-sity of the autoantibody response in autoantigen-inducedautoimmunity.
2 Materials and methods
2.1 Mice and immunization
Eight-week-old BALB/c and CD1 mice were purchased fromCharles River Laboratories (L’Arbresle, France). Ten mice,five of each strain, were injected intraperitoneally (i.p.) withpurified rEC1/5-Dsg1. Mice were primed with rEC1/5-Dsg1(20 mg) emulsified in complete Freund adjuvant and boostedsix times, every 10 days for 2 months with rEC1/5-Dsg1 in
incomplete Freund’s adjuvant. Finally, mice were boosteddaily for 3 consecutive days with soluble rEC1/5-Dsg1 justbefore the fusion procedure. Control mice were immunizedwith irrelevant autoantigens, six with B23-nucleophosmin [3]and ten with myelin oligodendrocyte glycoprotein. IgG anti-Dsg1 were detected by rEC1/5-Dsg1 ELISA, immunoblottingon purified rEC1/5-Dsg1 baculoprotein or human epidermisas the substrates, and indirect immunofluorescence (IIF) onhuman foreskin and mouse esophagus.
2.2 Plasmid constructs
Total RNA was extracted from human peripheral bloodmononuclear cells (107 cells) using TRIzol reagent (LifeTechnologies, Eragny, France). The cDNA was obtained bytranscription of oligo (dT)-primed RNA by Moloney murineleukemia virus reverse transcriptase (Life Technologies). ADNA fragment encoding the signal sequence and propeptide(PS) of human Dsg1 was amplified from the cDNA by nestedPCR using PS sense (PSS) and reverse (PSR) as externalprimers and PS-BamH I and PS-Hind/Pfl23 II as internalprimers. The purified PCR product was cloned intopGEM4Z vector (Promega, Madison, WI, USA) at the BamHI/Hind III sites. A synthetic oligonucleotide correspondingto restriction site Pfl23 II, FLAG tag (DYKDDDDK), hexa-histidine (His) tag, stop codon and restriction site Hind IIIwas inserted between Pfl23 II and Hind III sites to constructcassette vector, pGEM–PS–TAG. This plasmid allows thecloning of different domains of the DSG1 gene. A cDNAfragment coding EC domains 1–5 (EC1–EC5) of Dsg1 (rEC1/5-Dsg1) was obtained by nested PCR using primers located atthe 5’ end of the nucleotide sequence encoding EC1 and atthe 3’ end that encodes EC5, flanked by Pfl23 II site andcloned into Pfl23 II-digested pGEM–PS–TAG. The BamHI–Hind III fragment of the resultant plasmid was insertedinto the Bgl II/Hind III sites of p119 transfer vector [16] forbaculoviral expression.
2.3 Synthesis of rEC1/5-Dsg1 in baculovirus
expression system
To generate recombinant baculovirus, 46106 Sf9 insect cellswere co-transfected with 500 ng viral DNA AcSLp10 and 5 mgpB rEC1/5-Dsg1 using the lipofection method (DOTAP,Boehringer, Mannheim, Germany) [17]. Recombinant bacu-loviruses were isolated by plaque purification as previouslydescribed [18]. For large-scale expression of rEC1/5-Dsg1,56108 Sf9 cells were infected for 1 h in 20 mL containingrecombinant baculovirus at a multiplicity of infection units/cell (MOI) of 1, then transferred into a 1-L spinner flaskcontaining 480 mL of Sf900 II medium (Life Technologies)and maintained in culture at 287C. At 96 h post infection,cells were pelleted by centrifugation at 5000 rpm for 15 minand the supernatant was collected and stored at 2807C untilpurification.
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Proteomics 2006, 6, 4829–4837 Clinical Applications 4831
2.4 Purification of rEC1/5-Dsg1
FLAG-tagged rEC1/5-Dsg1 was layered onto a 5-mL columnof anti-FLAG affinity gel equilibrated with 50 mM Tris-HCl,150 mM NaCl, pH 7.4 (TBS), 30 mg/mL E64 (Roche, Mann-heim, Germany), 10 mg/mL leupeptin and 10 mg/mL pep-statin. The column was washed with 40 mL TBS and thebound proteins were eluted with 15 mL TBS containing theFLAG octapeptide (0.1 mg/mL). Eluted proteins were sepa-rated by SDS–PAGE in 10% separating gels, and were eithertransferred onto NC membranes followed by Western blotanalysis with an anti-FLAG mAb to monitor protein produc-tion or stained with CBB G-250 (Sigma) to check the proteinpurity. The final concentration (750 mg/mL) was determinedby the Bradford method using Bio-Rad protein assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
2.5 Cell fusion
Spleen cells from immunized mice were collected 4 daysafter the last i.p. injection of purified rEC1/5-Dsg1 and fusedwith the non-secreting SP2/O myeloma cell line as pre-viously described [19]. Hybridomas were selected based onthe capacity of their supernatants to react with rEC1/5-Dsg1in a solid-phase ELISA and to bind to human epidermis, asassessed by IIF and immunoblot experiments.
2.6 rEC1/5-Dsg1 ELISA
The wells of 96-well microtiter plates (Maxisorb Nunc, Ros-kilde, Denmark) were coated with 100 mL purified rEC1/5-Dsg1 (10 mg/mL) and processed as described previously [20].Hybridoma supernatants (1:2), mouse sera (1:50) or mAbs(1:100) were added and incubated for 1 h at room tempera-ture. After washing, the plates were incubated with 2000-fold–diluted phosphatase alkaline-conjugated goat anti-mouse IgG (Rockland, Gilbertsville, PA, USA) for 1 h atroom temperature. The plates were washed and labeling wasrevealed by adding 100 mL p-nitrophenyl phosphate (Sigma).Absorbance was determined at 405 nm with an ELISA reader(Labosystems, Les Ulis, France). Preimmune mouse sera(n = 10) were included in each experiment.
2.7 Indirect immunofluorescence assay
Mouse sera (1:25) or mAbs (1:100) were analyzed by IIF onhuman foreskin and mouse esophagus sections using FITC-conjugated rabbit anti-mouse IgG antibodies (Sigma) as thetracer. Sections were examined using a fluorescence micro-scope (Zeiss, Jena, Germany).
2.8 Immunoblot analysis
Mammary surgery specimens of normal human skin wereused as the source of epidermis. Proteins were extracted,separated by 1-D PAGE and blotted onto NC membranes as
previously described [20]. The filters were then saturated andincubated with mouse serum (1:50), hybridoma supernatant(1:2) or mAbs (1:100) in PBST-5% dry milk for 2 h. Afterwashing, filters were incubated for 1 h with 1:80 000-dilutedperoxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgG (Sigma) inPBST–5% dry milk. For IgG-subclass determination, biotin-conjugated rabbit anti-mouse IgG1, IgG2a, IgG2b or IgG3(Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA) was used andincubated with peroxidase-conjugated streptavidin (1:500)(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) for 30 min. Thefilters were washed and revealed by chemiluminescencereaction (ECL™, Amersham). Some experiments were per-formed using infrared fluorescence (IRF) immunoblot anal-ysis. Membranes were saturated overnight at 47C withblocking buffer (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) diluted inTBS (1:2), then incubated simultaneously with humanserum (PNP or PF) (1:200) and mAb (10A1 or CK1) (1:100)for 2 h. After washing with TBS–0.1% Tween 20, the mem-branes were incubated simultaneously with biotin-con-jugated goat anti-human IgG (Caltag Laboratories) and AlexaFluor® 680-conjugated rabbit anti-mouse IgG (MolecularProbes, Eugene, OR) (1:6000) for 1 h. Finally, after washing,membranes were incubated for 1 h with IRDye 800-con-jugated streptavidin (Rockland, Gilbertsville, PA, USA)(1:6000), washed and examined with the Odyssey™ InfraredImaging system (LI-COR).
2.9 2-DE
Human epidermis was ground with a liquid nitrogen-cooledmortar and pestle, and the resulting powder was resus-pended in acetone, 10% TCA, 0.12% DTT to remove residualsalts coming from the 1 M NaCl solution that was used toseparate the epidermis from the dermis. The suspension wasincubated overnight at 2207C and then centrifuged at15 0006g for 30 min (47C). The pellet was resuspended inacetone, 0.2% DTT and incubated for 1 h at 2207C. Thesuspension was centrifuged at 15 0006g for 30 min (47C),and proteins were extracted from the dried pellet as pre-viously described by Rabilloud and Chevallet [21]. Briefly, thepowdered epidermis was resuspended in 1 volume of 10 mMTris pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.25 mM sucrose and 4 volumes of9.6 M urea, 5% CHAPS, 25 mM spermine, 50 mM DTT. Thesuspension was incubated at room temperature for 1 h andthen ultracentrifuged at 250 0006g for 1 h (47C). The pro-tein-containing supernatant was removed and then sub-jected to 2-DE. The first dimension was carried out onReadyStrip™ IPG strips (11 cm, non-linear pH 3–10 gra-dients; Bio-Rad Laboratories) that were rehydrated for 16 h in200 mL rehydration buffer (8 M urea, 2% CHAPS, 1% DTT, atrace of bromophenol blue, 0.2% Bio-Lyte ampholytes 3–10;Bio-Rad Laboratories) or in 200 mL protein extract mixed withrehydration buffer (1:2). For IPG strips that were rehydratedwithout protein extract, the protein solution (90 mL) wasapplied on the basic extremity of rehydrated IPG strips (nearthe cathode) or on the acid extremity of rehydrated IPG strips
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4832 H. Mouquet et al. Proteomics 2006, 6, 4829–4837
(near the anode) using the cup loading tray for the Protean®
IEF cell system (Bio-Rad) according to the manufacturer’sinstructions. For IEF, the Protean® IEF cell was used at 207Cwith fast voltage ramping at a maximum voltage of 6000 Vfor 20 h. After IPG strip equilibration, the second dimensionwas run on 3–8% Criterion™ XT precast gel(11 cm68 cm61 mm) (Bio-Rad) using the Criterion®
Dodeca™ Cell system (Bio-Rad). BenchMark™ pre-stainedprotein ladder (Invitrogen) was used as molecular weightstandard in the second dimension step. Finally, gels wereeither transferred onto NC membranes or stained withCBB G-250 (Sigma). CBB-stained 2-DE gels were scanned,digitalized with 2-D phoretix software (Alphelys, Plaisir,France) and compared with the immunoblotted replica tolocalize the recognized protein spots.
2.10 Protein identification
The immunoreactive spots were excised from polyacryl-amide gels with Ettan Spot Picker (Amersham) and digestedby trypsin (proteomics grade, Sigma) with Ettan Digester(Amersham). Peptides were rehydrated with 50% ACN,0.1% TFA and mixed on the MALDI-TOF target (AppliedBiosystems) with an equal matrix volume of 7.5 mg/mlCHCA (LaserBio Labs, Sophia Antipolis, France) saturatedwith 50% ACN, 0.1% TFA. Samples were analyzed by MSwith an MALDI-TOF Voyager-DE™ PRO (Applied Biosys-tems) using a delayed ion extraction and ion mirror reflectormass spectrometer. The instrument settings were: reflectormode with positive polarity, 100 ns delay extraction time, 70–80% grid voltage and 20 000 V accelerating voltage. Lasershots at 500 per spectrum were used to acquire 1 spectrumwith a mass range of 700–4000 Da. External calibration wascarried out using the Proteomix–Peptide calibration Mix4(LaserBio Labs). Spectra were accumulated manually fromdifferent acquisitions to improve resolution and S/N ratio.Spectra obtained were compared to those registered in pro-tein databases (Swiss-Prot) using the Aldente program(Expasy server). The identification of immunoreactive spotswas performed in triplicate.
2.11 Screening of a ºgt11 expression library
A human keratinocyte lgt11 expression library was pur-chased from Clontech Laboratories (Palo Alto, CA). Recom-binant phages were screened at a density of 36107 PFU/mL.The plates were incubated at 427C for 4 h, overlaid with NCmembranes saturated with isopropyl thiogalactopyranoside(IPTG) and further incubated for 4 h at 377C. Membraneswere saturated with PBS–5% dry milk at 47C overnight andincubated with hybridoma supernatants (1:2) for 2 h at roomtemperature. After washing with PBST, membranes wereincubated for 1 h with peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgG, washed and labeling was revealed by chemilu-minescence reaction.
cDNA inserts from positive clones were amplified byPCR directly on the plaque with a set of primers situatedaround the EcoR I cloning site: 5’-GAC TCC TGG AGCCCG-3’; 3’-CGC GGC CAG CGA TGG-5’ (Eurogentec, Ser-aing, Belgium). The purified PCR product was sequencedwith an automated sequencer (Perkin-Elmer Applied Biosys-tems, Foster City, CA, USA), using the same primers as forthe PCR. Sequences were aligned and analyzed using theGenBank/EMBL databases (NCBI/BLAST network service).
3 Results
3.1 Characterization of the autoantibody response
induced in Dsg1-immunized mice
The EC1/5-Dsg1 construct was sequenced and shown tomatch exactly with the canonical sequence. rEC1/5-Dsg1 wassecreted into the culture supernatant of infected Sf9 cells,affinity purified and subjected to immunoblotting with anti-FLAG mAb. rEC1/5-Dsg1 was detected at 75 kDa (data notshown). All BALB/c and CD1 mice, five of each, immunizedwith rEC1/5-Dsg1, produced IgG reacting with rEC1/5-Dsg1in a solid-phase ELISA (Fig. 1A). By immunoblot analysis,BALB/c and CD1 mouse sera reacted with rEC1/5-Dsg1(Fig. 1B) and with Dsg1 that is present as a 160-kDa proteinin human epidermis extract and recognized by a PF serum(Fig. 1C). This analysis showed that CD1 mouse 2 serumalso bound to a 190–210-kDa doublet and BALB/c mouse 2serum to an additional 190-kDa epidermal protein (Fig. 1C,lanes C2 and B2). By IIF, most of these mouse sera stainednot only human epidermis but also mouse esophagus sec-tions with an intercellular labeling pattern (Fig. 1D), indi-cating that they contained IgG directed against mouse stra-tified epithelium antigens. In contrast, none of the controlsera obtained from mice immunized with either B23-nucleophosmin (n = 6) or myelin oligodendrocyte glycopro-tein (n = 10), bound human or mouse epithelial cells by IIFor desmosome autoantigens by immunoblotting (data notshown).
Hybridomas were generated from the splenocytes of twoanti-Dsg1 antibody-positive mice (BALB/c mouse 1 and CD1mouse 1). Three (1N5, 1D8 and 8C3), selected based on thecapacity of their supernatants to react with rEC1/5-Dsg1 byELISA (Fig. 1A), were subsequently cloned; their immuno-logical properties are summarized in Table 1. By IIF on hu-man foreskin sections, all three mAbs bound to the inter-cellular space of human epidermis with a labeling patternsimilar to that obtained with PF serum (Fig. 1D). Immuno-blot analysis showed that 1N5 and 1D8 bound to rEC1/5-Dsg1 (Fig. 1B), and to Dsg1 protein present in human epi-dermal extract and recognized by PF serum, while 8C3 thatderived from BALB/c mouse 1 did not (Fig. 1C). This obser-vation suggests that the latter is directed against a con-formational epitope of Dsg1 as much as the use of higherconcentration of anti-Dsg1 IgG in 8C3 supernatant did not
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Figure 1. Binding capacities of Dsg1-immunized mouse sera and anti-Dsg1 mAbs. (A) rEC1/5-Dsg1 ELISA: rEC1/5-Dsg1-coated (1 mg) ELISAplates were saturated, incubated with mouse serum (1:50) or hybridoma supernatants (1:2) followed by phosphatase alkaline-conjugatedgoat anti-mouse IgG, and revealed by adding p-nitrophenyl phosphate. Absorbance was determined at 405 nm. B = BALB/c mice, C = CD1mice. Immunoblot analysis on rEC1/5-Dsg1 (B) or human epidermis extract (C). Saturated filters were incubated with mouse serum (1:50)or hybridoma supernatants (1:2), followed by peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgG, and revealed by chemiluminescence reaction.Anti-Flag mAb (F) or pemphigus foliaceus serum (PF) were used as controls in (B) and (C), respectively. Molecular masses are indicated onthe left. The detection of the intermediate band at approximately 200 kDa (C, lanes C2) was not reproducible. (D) IIF assays on humanforeskin and mouse esophagus sections. Tissue sections were incubated with mouse sera (1:25) or hybridoma supernatants (1:2), washedand incubated with FITC-conjugated rabbit anti-mouse IgG antibodies (magnification 6400). CD1 mouse 1 (C1), CD1 mouse 2 (C2), BALB/cmouse 2 (B2) as well as all three mAbs (1N5, 1D8 and 8C3) gave an intercellular labeling pattern of human epidermis similar to thatobtained with an anti-Dsg1-positive PF serum. On mouse esophagus sections, the three mouse sera also gave an intercellular staining;1N5, 1D8 and 8C3 did not bind to the tissue sections (8C3 is not shown).
Table 1. Immunological characterization of mAbs derived from normal mice immunized with the extracellulardomain of Dsg1
mAb Isotype ELISA IIF assay Immunoblotting
Human skin Mouseesophagus
rEC1/5-Dsg1 Human epi-dermis (kDa)
1N5 IgG1 1 IC 2 1 1601D8 IgG1 1 IC 2 1 1608C3 IgG3 1 IC 2 2 2
CK1 IgG1 2 IC1BM IC1BM 2 190–21010A1 IgG3 2 IC IC 2 190
IC: intercellular labeling; BM: basement membrane labeling.
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permit the revelation of its binding to Dsg1 by immunoblotanalysis (data not shown). In contrast to the correspondingmouse sera (CD1 mouse 1), 1N5 and 1D8 did not bind tomouse esophagus sections (Fig. 1D).
Two hybridomas, CK1 and 10A1, were derived from CD1mouse 2 and BALB/c mouse 2, respectively, whose serareacted with other epidermal antigens in addition to Dsg1.They were selected by IIF and cloned. CK1 gave both base-ment membrane and intercellular labeling of human andmouse sections by IIF (Fig. 2A). By immunoblotting on hu-man epidermis, CK1 recognized a doublet of 190- and 210-kDa proteins, which was identical to that bound by the par-ental mouse serum. This doublet was also recognized byPNP sera, as demonstrated by the IRF immunoblot analysis
Figure 2. Characterization of mAbs directed against other epi-dermal antigens. (A) IIF assays on human foreskin and mouseesophagus sections of CK1 and 10A1. CK1 and 10A1 gave anintercellular labeling pattern of the epidermis but CK1 alsolabeled the basement membrane of the dermoepidermal junc-tion. (magnification 6400). (B) IRF immunoblot analysis of CK1and 10A1 on human epidermis. Saturated filters were incubatedsimultaneously with hybridoma supernatant and PNP serum,and, after washing, simultaneously with biotin-conjugated goatanti-human IgG and Alexa Fluor® 680-conjugated rabbit anti-mouse IgG, and finally with IRDye 800-conjugated streptavidin.Replicas were examined with the Odyssey™ Infrared Imagingsystem. PF, pemphigus foliaceus serum. Molecular masses areindicated on the left. The yellow bands indicate the co-labeling ofred- and green-labeled proteins.
(Fig. 2B) (Table 1). 10A1 gave an intercellular labeling pat-tern of human foreskin and mouse esophagus by IIF(Fig. 2A) and recognized a unique 190-kDa protein on thehuman epidermal extract immunoblot, which comigratedwith the 190-kDa polypeptide consistently detected by thePNP serum (Fig. 2B).
3.2 10A1 mAb recognizes periplakin, and CK1 both
periplakin and envoplakin on a 2-DE human
epidermis protein map
To identify the epidermal proteins targeted by 10A1 andCK1 mAbs, we carried out 2-DE of normal human epi-dermis extract. First, we established a 2-DE human epi-dermis protein map using a passive insertion of proteinsinto the IPG-strip during the rehydration process. Thisapproach allowed us to visualize the 190-kDa protein in the2-DE gel stained by CBB G-250 (Fig. 3A, black arrow) andto show that the 190-kDa protein was bound by both 10A1and CK1 mAbs (data not shown). However, in the 2-DEgel, the density of the 190-kDa protein spot was weak andthe 210-kDa protein could not be visualized due to thelimited protein loading capacities of the IPG 2-DE methodfor proteins of high molecular masses. Therefore, toincrease the entry of high molecular weight proteins intothe IPG-strip, proteins were actively inserted during IEFprocess by loading the epidermal extract at the basic extre-mity of the IPG strip. This method facilitates the entry ofhigh molecular weight proteins into the IPG-strip andthus, increases the density of spots detected in the CBB-stained 2-DE gel. Accordingly, and by using 10A1 toimmunoscreen this 2-DE human epidermis protein map(Fig. 3C), the immunoreactive protein was visualized as atriplet on the 2-DE gel stained by CBB G-250 (Fig. 3B) andanalyzed by MALDI-TOF MS. The comparison of the massspectra obtained for each spot of the protein triplet withthose contained in Swiss-Prot database allowed us to iden-tify, with high probability, the 190-kDa protein as humanperiplakin, thereby demonstrating that periplakin is thetarget of 10A1 (Table 2).
The same approach was used in a second series ofexperiment to identify the 190- and 210-kDa proteinsbound by CK1. The mAb consistently reacted with aprotein spot that had co-ordinates identical to those ofthe 190-kDa protein recognized by 10A1 and identifiedas periplakin (Fig. 3C). MS analysis of the proteinexcised from the 2-DE gel run in parallel confirmed thatthe 190-kDa protein was periplakin. CK1 also bound to astretch of 210-kDa protein spots with different pI(Fig. 3C). These spots were visualized on the 2-DE gelstained by CBB G-250 (Fig. 3B). MS analysis of the 210-kDa proteins (four spots excised from the 2-DE gel)identified this protein stretch as human envoplakin(Table 2), indicating that CK1 reacted with both peripla-kin and envoplakin.
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Table 2. Identities of epidermal proteins reacting with 10A1 and CK1
Spotno.a)
Proteinidentity
Accession no. TheoreticalMol. mass(kDa)/pI
Peptidematches
Sequencecoverage
p value
1 Periplakin gi)14195005)sp)O60437) 205/5.5 38 24% 1.5e220
2 Periplakin gi)14195005)sp)O60437) 205/5.5 39 24% 5.2e224
3 Periplakin gi)14195005)sp)O60437) 205/5.5 37 20% 1e220
4 Envoplakin gi)14194715)sp)Q92817) 230/6.5 21 14% 5.2e222
5 Envoplakin gi)14194715)sp)Q92817) 230/6.5 27 18% 4e218
6 Envoplakin gi)14194715)sp)Q92817) 230/6.5 31 20% 1e219
7 Envoplakin gi)14194715)sp)Q92817) 230/6.5 28 20% 3.9e224
a) Protein spots were described in Fig. 3.
Figure 3. Immunoscreening of a 2-DE human epidermis protein map with 10A1 and CK1 mAbs. (A, B) The epidermis extract was separatedby 2-DE using passive IPG strip-insertion of epidermal proteins during the rehydration process (A) or active insertion at the basic extremityof the IPG strip during IEF using the cup loading tray system (B). Gels were either electrotransferred onto NC membranes or stained withCBB G-250. (C) 10A1 and CK1 were used to immunoblot 2-DE human epidermis protein maps. Both, 10A1 and CK1 bound to a 190-kDaprotein triplet and CK1 also reacted with a stretch of 210-kDa protein spots that were only visualized on the 2-DE gel performed with activeinsertion of proteins at the basic extremity of the strips. The immunoreactive proteins were visualized on CBB-stained 2D gels (B), excisedfrom polyacrylamide gels, digested by trypsin and analyzed by MALDI-TOF MS. Although a single CBB-stained 2-DE gel is shown, the spotsbound by 10A1 and CK1 were picked up from separate gels. Spectra obtained were compared to those registered in protein databases(Swiss-Prot) using the Aldente program (Expasy server).
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3.3 CK1 reacted with the linker subdomain of
envoplakin
While we were setting up the experimental conditions of the2-DE gel procedure to identify the CK1 protein targets, weimmunoscreened in parallel a lgt11 human keratinocytecDNA expression library. Approximately 106 clones from thelgt11 library were screened with CK1. Immunoreactiveclone LC6, was repeatedly recognized by CK1 after fiverounds of amplification, and selected. PCR amplification ofthe cDNA insert, using a pair of lgt11 cloning primers,revealed that LC6 carried a 486-bp cDNA insert. Sequenceanalysis of this insert predicted an open reading frame of435 bp encoding a polypeptide (145 amino acids) corre-sponding to the main part of the linker subdomain of humanenvoplakin (Fig. 4). Finally, CK1 reactivity was confirmed byimmunoblotting using the recombinant envoplakin poly-peptide (1687–1831) as the substrate and was identical to thatgiven by PNP sera (data not shown).
4 Discussion
The diversification of the autoantibody response representsan important phenomenon in organ- and non-organ-specificautoimmune diseases. In most experimental models ofautoimmunity so far analyzed, the characterization of thisprocess required the successive identification of the targetantigens. The development of proteomic analysis, combin-ing 2-DE of the target organ and MS, offers the possibility tocharacterize the diversity of the antibody specificities inautoimmune diseases. The feasibility of this strategy wasdemonstrated in both human [22, 23] and experimentalautoimmune diseases [3]. In particular we could identify byimmunoscreening of 2-DE HL60 cell protein map severaltargets of autoantibodies contained in sera from(NZW6BXSB)F1 mice, which spontaneously develop sys-temic lupus erythematosus.
Figure 4. Identification of the protein targeted by CK1 mAb. CK1was used to immunoscreen a lgt11 human keratinocyte cDNAexpression library. Sequence analysis of the cDNA indicated thatthe bacterial clone (LC6) reacting with CK1 codes for a peptide of145 amino acids corresponding to the main part of the linkersubdomain (L) of human envoplakin. CCR: coiled-coil rod(domain).
Here we extended this observation to autoantigen-induced organ-specific autoimmunity by showing that theimmunoscreening of 1-DE and 2-DE gels of epidermalextract with sera from mice immunized with a single auto-antigen led to characterization of the different specificities ofthe induced autoantibody response. BALB/c and CD1 micewere immunized with rEC1/5-Dsg1, which led to the pro-duction of IgG anti-Dsg1 in all mice. These antisera reactedwith rEC1/5-Dsg1 in a solid-phase ELISA and bound to a160-kDa protein in 1-DE gel of epidermal extract, also recog-nized by PF serum. Three mAbs were derived from mice thatdeveloped antibodies to only Dsg1 and were shown to beselectively directed against Dsg1. Their immunochemicalproperties reflected those of autoantibodies produced by PFpatients that target both conformational and non-conforma-tional Dsg1 B cell epitopes [10, 12]. Two Dsg1-immunizedmice mounted an immune response against epidermal anti-gens other than Dsg1, as shown by immunoblot analysis ofhuman epidermal extract. Two mAbs secreted by hybrido-mas derived from the spleen cells of these mice allowed us toprecisely characterize the targets of this autoantibody re-sponse. Using the IRF immunoblot analysis of 1-DE with10A1, CK1 and sera from PNP patients whose autoimmuneresponse is characterized by a large breakage of B cell toler-ance to various members of the plakin family and Dsg [15,24], we demonstrated that CK1 and 10A1 protein targetswere also recognized by autoantibodies present in PNP sera.This technology allows efficient comparison of the autoanti-body specificities observed in human autoimmune diseasesand their corresponding experimental models and, thus,may be usefully associated with the basic immunoproteomicapproach. 10A1 reacted with a 190-kDa protein, and CK1with a 190–210-kDa doublet. The immunoscreening of the 2-DE human epidermis protein map combined with MSenabled us to identify the 190- and 210-kDa proteins as peri-plakin and envoplakin, respectively.
In this regard, to increase the entry of high molecularweight proteins into the IPG strip, proteins were actively in-serted during IEF using a loading of the epidermal extract atthe basic (or acid) extremity of the IPG-strip. This strategyallowed the 210-kDa protein bound by CK1 to enter the IPGgel, be visualized in the CBB-stained 2-DE map, excised andfinally identified by MS analysis. It also increased the quan-tity of 190-kDa periplakin in the CBB-stained 2-DE gel as wellas its focusing, and facilitated its identification. Others haveproposed the agarose 2-DE method, which has been pre-viously shown to have higher loading capacity than 2-DEwith IPG gel for IEF, and thus to resolve proteins with highmolecular masses larger than 150 kDa [25, 26]. Interestingly,a recent study showed that proteomics analysis using agar-ose 2-DE and 2-D DIGE methods allowed the expression ofperiplakin to be visualized, identified and compared in peri-tumoral and tumoral esophageal tissue [27].
10A1 and CK1 mAbs were shown to have interestingproperties. Immunoblot analysis of 2-DE human epidermisprotein map combined with MS indicated that both 10A1
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Proteomics 2006, 6, 4829–4837 Clinical Applications 4837
and CK1 mAbs recognized the same 190-kDa protein, peri-plakin. However, they reacted with different periplakin B cellepitopes since CK1 also bound to the 210-kDa envoplakin.The demonstration by immunoscreening of a lgt11 humankeratinocyte cDNA expression library that CK1 recognizedthe linker subdomain of envoplakin explains its reactivitywith the 190–210-kDa doublet. Indeed, the linker subdomainamino acid sequences of envoplakin and periplakin have48% identity, and may exhibit cross-reactivity. Interestingly,the linker subdomain of envoplakin, which has previouslybeen shown to be targeted by the B cell autoimmune re-sponse in the course of PNP [15], was recently demonstratedto be a major epitope recognized by PNP autoantibodies thatbound the 190–210-kDa doublet [28].
CK1 and 10A1 mAbs bound to not only human epi-dermis but also mouse substrates, indicating that they reactwith B cell epitopes shared by human and mouse epidermalmolecules. In this regard, one should note that the linkersubdomain amino acid sequence of envoplakin recognizedby CK1 is highly conserved between human and mouse(88% identity) and that human periplakin shares 76% iden-tity with the murine molecule. Thus, cross-reactivity likelyaccounts for the reactivity of both mAbs with human andmouse substrates.
Whatever the mechanisms involved in the process, ourobservation indicates that proteomic analysis allows thediversification of the autoantibody response in normal miceupon immunization with a single autoantigen to be analyzedefficiently, and that the application of the technology tospontaneous or autoantigen-induced experimental auto-immune diseases could help to decipher the autoreactiveB cell specificities and the mechanisms of B cell tolerancebreakage in autoimmunity.
This work was funded by the Institut de la Santé et de laRecherche Médicale (INSERM). Hugo Mouquet is the recipientof fellowship from the Conseil Régional de Haute-Normandie. Wethank Janet Jacobson for editorial assistance.
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Résultats
167
C- Le transcrit de la desmogléine 1 est exprimé dans le thymus humain
Afin d'éxaminer l'expression thymique du transcrit codant pour la Dsg1, nous
avons collecté 32 fragments de thymus humain (T1 à T32) prélevés chez des sujets
subissant une thymectomie pour une pathologie cardiovasculaire âgés de 1 jour à 60 ans
(moyenne 25,3 ± 21,6 ans). Les analyses par PCR via l'amplification d'une séquence
spécifique de l'ADNc DSG1 montre que 29 thymus (90, 6%) expriment les ARNm DSG1.
Pour les 3 autres thymus, la quantité d'ARN totaux extraits était faible, ce qui explique
certainement l'absence d'amplification du fragment d'ADNc DSG1. Le séquençage des
produits de PCR obtenus à partir de 5 thymus a confirmé la spécificité de l'amplication.
Les analyses par PCR quantitative en temps réel réalisées sur 9 thymus
sélectionnés au hasard et couvrant différents âges (9 jours à 45 ans) indiquent que
l'expression des ARNm DSG1 augmente avec l'âge (r = 0,83; P = 0,008). En effet,
l'expression relative des messagers DSG1 est environ 1,5 fois plus élevée chez les sujets
d'un âge supérieur à 14 ans comparée à ceux dont l'âge ne dépasse pas 14 ans (P =
0,016). Ces résultats feront l'objet d'une publication qui est en préparation.
Résultats
168
ARTICLE 3
Transcript of Desmoglein 1, the Target Autoantigen of
Pemphigus Foliaceus, is Expressed in Human Thymus
H. Mouquet, S. Berrih-Aknin, P. Joly, D. Gilbert, F. Tron
In preparation.
Article 3 - P1
Transcript of Desmoglein 1, the target autoantigen of pemphigus foliaceus, is expressed in
human thymus1
Hugo Mouquet2, Sonia Berrih-Aknin*, Pascal Joly, Danièle Gilbert and François Tron
Inserm, U519, Institut Fédératif de Recherche 23, Rouen, F-76183 France; Faculté de Médecine
et de Pharmacie, Rouen, F-76183 France.
*CNRS UMR 8078-Remodelage Tissulaire et Fonctionnel: Signalisation et Physiopathologie,
Hôpital Marie Lannelongue, Le Plessis-Robinson, France.
Running title: Thymic expression of desmoglein 1 mRNA
Key words: Desmoglein 1, Pemphigus, Autoantigen, Thymus
1This work was funded by the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
(INSERM). 2Hugo Mouquet is the recipient of fellowship from the Conseil Régional de Haute-
Normandie.
Article 3 - P2
ABSTRACT
Desmoglein 1 (Dsg1) is a transmembrane glycoprotein of the desmosome allowing cell-cell
adhesion between keratinocytes whose expression is restricted to stratified squamous epithelia-
like epidermis. Dsg1 is the autoantigen targeted by pathogenic autoantibodies produced in the
course of pemphigus foliaceus and in a way dependent on Dsg1-specific T cells. Herewith, we
demonstrate that mRNA of the DSG1 gene is present in human normal thymus and show by
quantitative real-time PCR analysis that the expression of DSG1 transcript increases with age.
These data provide another illustration of the thymic expression of a tissue-specific autoantigen
involved in an organ-specific autoimmune disease, which may participate in the T-cell tolerance
acquisition.
Article 3 - P3
Introduction
T-cell tolerance to self-antigens is acquired in both thymus (central tolerance) and peripheral
lymphoid organs (peripheral tolerance) through various and complex mechanisms. The T-cell
repertoire expressed in periphery depends on positive and negative selections that take place in
the thymus. Lymphocytes that interact through their TCR with a low to medium affinity with
self-peptides-MHC complex are positively selected whereas those with a high affinity undergo
clonal deletion (negative selection). Thus, the self-antigen diversity expressed by antigen
presenting cells (APC) which are accessible to immature T-cells will determine the extend and
specificity of the T-cell repertoire. Until recently, it was generally thought that central tolerance
did not comprise tissue-restricted self-antigen presentation. However, this view was challenged
by several important papers which demonstrated that a broad set of tissue-specific antigens is
physiologically expressed in human thymus (1, 2). In particular, several major target autoantigens
of various autoimmune diseases such as acetylcholine receptor (3), insulin (4, 5) or myelin basic
protein (6, 7) were shown to be expressed in human thymus.
Desmogleins (Dsg) consist of 4 different transmembrane glycoproteins belonging to the
desmosomal cadherin family (Dsg1 to Dsg4) and allowing a calcium-dependent cell-cell
adhesion critical for desmosomal junction. Dsg2 is detected in all desmosome-possessing tissues
whereas Dsg1 and Dsg3 are restricted to stratified squamous epithelia-like epidermis (8). Dsg1 is
the autoantigen of pemphigus foliaceus (PF), an autoimmune blistering skin disease characterized
by a pathogenic autoantibody response directed against epitopes of the Dsg1 extracellular
domains that leads to a loss of adhesion between keratinocytes and the formation of
intraepidermal blisters (9). The production of anti-Dsg1 antibodies is dependent on Dsg1-specific
T cells which are detected in PF patients (10).
To get insight into the mechanisms involved in tolerance breakdown against Dsg1, we
Article 3 - P4
asked whether transcript of Dsg1 is expressed in human normal thymus.
Results and Discussion
To examine the mRNA expression of DSG1 gene in human thymus, we collected fresh thymic
fragments (T1 to T32) obtained from 32 subjects undergoing cardiac surgery. Their age ranged
from 1 day to 60 years (mean 25.3 ± 21.6 years) (Table I). cDNAs were obtained by transcription
of random-primed RNAs which were extracted from human thymuses. PCR analysis using
DSG1-specific primers showed that 29 thymus samples (90.6%) expressed human DSG1
transcripts (Table I and Figure 1). The absence of DSG1-amplification in 3 thymus samples (T27,
T29 and T31) was likely due to a limited amount of extracted total RNAs. Amplified cDNA
fragments obtained from 5 thymic samples were sequenced and shown to match exactly with the
canonical sequence of DSG1 cDNA.
These data are reminiscent of those previously reported indicating that certain tissue-
restricted autoantigens are expressed in human thymus, particularly those targeted in the course
of antibody-mediated autoimmune diseases such as acetylcholine receptor (3), TSH receptor (11)
or α3 chain of type IV collagen (12). More closely, mRNA encoding the pemphigus vulgaris
autoantigen, Dsg3, has been shown to be expressed in human thymus (8, 13). The demonstration
of the DSG1-transcription in human thymus suggests that Dsg1-derived peptides could be
presented to T cells maturing in the thymus leading to either autoreactive T-cell deletion or
regulatory T-cell development. Nevertheless, since Dsg1-reactive T cells have been identified not
only in PF patients but also in healthy subjects at similar frequency (14), thymic expression of
Dsg1 does not necessarily result in clonal deletion of Dsg1-specific T cells. Thus, it can
hypothesize that Dsg1 expression in human thymus promotes positive selection of regulatory T
cells rather than negative selection of effector T cells. In this regard, Dsg3-specific Tr1 regulatory
Article 3 - P5
T-cells expressing Foxp3 molecule, probably involved in the maintenance of tolerance against
Dsg3, were shown to be less frequently detected in pemphigus vulgaris patients than in controls
(15).
In order to examine interindividual variations of DSG1-transcript expression, quantitative
real-time PCR were then carried out on 9 randomly-selected human thymus samples isolated
from donors at different ages (9 days to 42 years) (Figure 2A). Figure 2B shows the relative
expression of DSG1 mRNA according to age and indicates that DSG1-transcript expression
increased with age (Spearman r = 0.83, P = 0.008). Relative expression of DSG1 mRNA was
approximately 1.5-fold higher in normal individuals over 14 years than in subjects under 14 years
(P = 0.016) (Figure 2C). In contrast to what was observed for several autoantigens expressed in
human thymus at mRNA level whose interindividual variability was shown to be unrelated to age
(6), the thymic expression of DSG1 transcript was clearly shown to be age-dependent. This is
surprising in comparison to the number decrease of thymic cells with age-related thymic
involution, in particular APC, which could present autoantigen-derived peptides to maturing T-
cells. Indeed, reductions of thymic epithelial spaces and dendritic cell number represent typical
features of thymic involution (16, 17). Although the precise mechanism underlying the increased
DSG1-mRNA expression in human thymus remains obscure, we could hypothesize that the
number of certain thymic cells endowed with APC properties and expressing DSG1 transcript
could increase with age. In this respect, in spite of an overall decrease of cellular density in
human thymus with its involution, one should note that the number of thymic B cells have been
shown to be increased with age (18, 19).
Article 3 - P6
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Article 3 - P9
Tableau I. DSG1-mRNA expression in human thymus
ND, not determined.
Thymus Age Sex PCR amplification Relative expression
GAPDH DSG1 of DSG1 mRNA
T1 1 day F + + NDT2 8 days F + + NDT3 9 days F + + 53.5T4 1 month F + + NDT5 2 months F + + 48.3
T6 4 months F + + ND
T7 11 months F + + 55.9
T8 1 year F + + ND
T9 3 years F + + ND
T10 5 years F + + ND
T11 7 years F + + 52.6
T12 10 years F + + 56.4T13 11 years F + + ND
T14 14 years M + + 81.3
T15 14 years M + + ND
T16 21 years M + + 64.1
T17 24 years M + + ND
T18 31 years M + + 82.6
T19 35 years M + + ND
T20 42 years F + + ND
T21 42 years M + + 82.6
T22 43 years M + + ND
T23 44 years M + + ND
T24 46 years M + + ND
T25 46 years M + + ND
T26 47 years M + + ND
T27 48 years ND + - ND
T28 51 years F + + ND
T29 52 years M + - ND
T30 54 years M + + ND
T31 56 years M + - ND
T32 60 years M + + ND
Article 3 - P10
FIGURE 1
T4 T3 T7 T8 T11 T10 T13
T5 T1 T9 T12 T6 T2
T26 T22 T15 T19 T25 T14 T20
T31 T16 T17 T18 T27 T28 T30
T29 T21 T32 T23 T24
GAPDH
GAPDH
GAPDH
GAPDH
GAPDH
DSG1
DSG1
DSG1
DSG1
DSG1
Article 3 - P11
FIGURE 2
T21 (42 years)
GAPDH DSG1
0 10 20 30 40 5045
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95 r=0.83 (P=0.008)
Age (years)
Rel
ativ
e ex
pre
ssio
n o
f D
SG
1 m
RN
A
< 14 years old > 14 years old0
10
20
30
40
50
60
70
80
90P=0.016
Rel
ativ
e ex
pre
ssio
n o
f D
SG
1 m
RN
A
T3 (9 days)
GAPDH DSG1
A
B C
Article 3 - P12
Figure legends.
Figure 1. Agarose gel electrophoresis of DSG1- and GAPDH-amplified products of cDNAs
prepared from human thymus. Fresh thymic fragments were obtained from 32 subjects (T1 to
T32) undergoing cardiac surgery with an age ranging from 1 day to 60 years (mean 25.3 ± years).
All donors gave written consent to participate in this study. Total RNAs were extracted from each
frozen samples of normal thymus using Trizol reagent (Life technologies, Eragny, France).
cDNAs were obtained by transcription of random-primed RNAs (5 µg) by Moloney murine
leukemia virus reverse transcriptase (Life Technologies), and then subjected to PCR
amplification. Primers used to amplify specific gene products were: GAPDH sense, 5´-TGC CAT
CAA CGA CCC CTT CA-3´; GAPDH antisense, 5´-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3´;
DSG1 sense, 5´-AAT GGC TAC ATT TGC AGG ACA-3´; DSG1 antisense, 5´-ATC TCG GTC
AGA GCC TCT TAC A-3 . PCR conditions for GAPDH comprised one cycle of 94°C for 5 min,
35 cycles of 94°C for 1 min, 58°C for 30 s and 72°C for 30 s, and a final elongation step of 72°C
for 4 min. For PCR of DSG1 cDNA, conditions were identical except for the time of initial
denaturation step and the annealing temperature, which were 4 min and 58°C respectively. All
PCR reactions were performed in a volume of 50 µl using an Eppendorf thermocycler, with 2.5 U
Taq polymerase (Promega). Amplification products (15 µl) were separated and visualized by
ethidium bromide-stained 1.5% agarose gel electrophoresis.
Figure 2. Relative expression of DSG1 mRNA in human thymus. Quantitative real-time PCR
were performed using LightCycler thermocycler system (Roche Molecular Biochemicals,
Mannheim, Germany). Amplification reactions were carried out using the FastStart DNA Master
SYBR Green I kit (Roche) according to the manufacturer’s instructions in a total volume of 20 µ l
in glass capillaries, containing 2 µl of cDNA sample, 2 µ l of FastStart DNA Master SYBR Green
Article 3 - P13
I, 2 mM MgCl2 and 10 pmol of each primer. PCR amplifications of GAPDH and DSG1 cDNAs
were carried out simultaneously as previously described (20) and comprised one cycle of 94°C
for 10 min, 40 cycles of 94°C for 20 s, 61°C for 10 s and 72°C for 12 s. At the end of
amplification cycles, PCR products were subjected to melting temperature analysis in 3 steps: 10
s for 94°C (20°C/s), 30 s for 66°C (20°C/s) and slightly temperature increase of 0.1°C/s until
94°C to generate fusion curves. Data acquisition and analysis were carried out using LightCycler
3.5 software (A). For each cDNA amplification, the specificity of the PCR product was assessed
by verifying that there was a single peak in melting curve analysis and by checking the size of the
fragments by ethidium bromide-stained 1.5% agarose gel electrophoresis. Data were normalized
by dividing the DSG1 crossing point (Cp) by the GAPDH Cp and are expressed as DSG1 Cp /
GAPDH Cp ratio x 100 (Relative expression of DSG1 mRNA). Relative expression of DSG1
mRNA in 9 human thymuses according to age of donors was analyzed using the Spearman's
correlation test (B) and was compared between the 2 groups (individuals < 14 years old and > 14
years old) using Fisher corrected χ2 test (C).
Article 3 - P14
FOOTNOTES
3Correspondence: François TRON, INSERM U519, Faculté de Médecine et de Pharmacie, 22,
boulevard Gambetta, 76183 Rouen Cedex 1, France
Tel: 33 2 32 88 80 71
Fax: 33 2 32 88 81 86
E-mail: [email protected]
4Abbreviations
Dsg 1 : desmoglein 1
DSG1 : desmoglein 1 gene
PF : pemphigus foliaceus
APC : antigen presenting cells
Cp : crossing point
169
DISCUSSION
Discussion
- 170 -
DISCUSSION
Il est indéniable que l'autoAg joue un rôle déterminant dans l'initiation, la
propagation et la pérennisation de la réponse auto-immune et ipso facto, dans le
développement de MAI spécifiques et non spécifiques d'organe. De nombreux arguments
sont venus confirmer le bien fondé de cette théorie notamment ceux issus des modèles
expérimentaux de MAI développés chez l'animal. Dans ce cadre, la modification de
l'autoAg par différents mécanismes tels que l'épissage alternatif de leurs transcrits
constitue une hypothèse séduisante pour rendre compte du déclenchement d’un
processus d’auto-immunité chez l’homme. Par ailleurs, considérant la rupture de
tolérance large vis à vis de divers Ag du soi exprimés dans un tissu donné qui est
observée au cours des MAI spécifiques et non spécifiques d'organe, on peut supposer que
la réponse auto-immune initialement dirigée contre l'autoAg « initiateur » puisse s'étendre
à d'autres spécificités antigéniques et ainsi participer à la propagation du processus auto-
immun. Cette diversification de la réponse auto-immune pourrait notamment s'opérer par
des mécanismes d'extension épitopique intermoléculaire. C'est dans cette optique qu' au
cours de ce travail de thèse, nous avons cherché à étudier le rôle d'un autoAg clé des
pemphigus, la Dsg1, et ceci à 2 niveaux de la réponse auto-immune : (i) à la phase
d'initiation, avec l'étude de l'intervention de l'autoAg modifié par d'épissage alternatif dans
la réponse lymphocytaire T chez les malades atteints de pemphigus ; (ii) à la phase de
propagation, avec l'étude de la diversification de la réponse autoAc induite chez des souris
normales immunisées avec un Ag unique.
Dans la première partie de ce travail de thèse, nous montrons pour la première fois
l'existence d'une isoforme tronquée de la Dsg1 produite par un mécanisme d'épissage
alternatif. Nous montrons qu'un épitope spécifique de cette Dsg1 tronquée se fixe aux
molécules HLA de susceptibilité au PS et qu'il est capable d'induire la prolifération de
PBMC isolées chez les malades atteints de PF et porteurs de ces mêmes allèles HLA en
particulier, la molécule DRB1*0102.
Dans un premier temps, nous avons en effet mis en évidence l'existence d'un
épissage alternatif des messagers du gène DSG1. Ces transcrits alternatifs sont exprimés
dans l'épiderme d'individus normaux. Cet épissage est non canonique puisque les
séquences flanquantes de l'intron 6 ne correspondent pas aux séquences consensus 5'-
GT et AG-3'. Il est intéressant de constater que l'existence d'un épissage alternatif de
messagers codant pour d'autres Ag du desmosome a été décrite pour les DP [Virata,
1992], la PG [Ozawa, 1995], la PL [Elliott, 1997] ainsi que pour une protéine
desmosomale récemment identifiée, la kazrine [Groot, 2004]. Dans un contexte plus
général, une récente étude in silico a estimé que les transcrits d'autoAg subissent un
Discussion
- 171 -
épissage alternatif avec une fréquence plus élevée que celle de transcrits correspondant à
des gènes sélectionnés au hasard (100% vs 42%). De plus, cette étude montre que le taux
d'épissage non canonique des transcrits codant pour les autoAg est plus élevé que celui
de gènes sélectionnés au hasard (80% vs 1%) [Ng, 2004]. Actuellement, une vingtaine
d’autoAg ont été décrits dont les transcrits subissent un épissage alternatif avec ou
sans la confirmation de la synthèse d’un variant protéique. Parmi eux, environ 20%
sont caractérisés par l'insertion d'une séquence nucléique quelle soit d'origine
exonique ou intronique comme c'est le cas pour les transcrits alternatifs de la Dsg1.
Bien qu'aucune caractérisation moléculaire précise n’ait été entreprise dans le but
d'examiner l'origine de ce mécanisme dans le cas des transcrits de la Dsg1, l’intervention
du polymorphisme du gène DSG1 (SNP (809)) dans la genèse des transcrits alternatifs
DSG1 constitue une hypothèse séduisante. Dans près de 15% des cas, les mutations
responsables de maladies génétiques interviennent dans l'épissage des ARNm. En effet,
certaines mutations ponctuelles sont situées au niveau des sites régulateurs de l'épissage
soit exoniques soit introniques [Cooper, 1997]. Un modèle très informatif de relation entre
l'épissage alternatif et une MAI est fourni par l’association d'un polymorphisme du gène
CD45 avec la SEP. La présence d’un SNP silencieux (C77G) situé dans l’exon 4 du gène
codant pour la molécule CD45, une tyrosine phosphatase impliquée dans l’activation
lymphocytaire, est corrélée à une augmentation des transcrits contenant l’exon 4 du gène
CD45. Par ailleurs, le SNP C77G est associé à la SEP [Jacobsen, 2000]. Lynch et Weiss
ont montré que ce SNP module l’épissage de l’exon 4 en modifiant un site exonique
régulateur de l’épissage qui inhibe normalement le site d’épissage en 5´ de cet exon
[Lynch et Weiss, 2001]. Ainsi, le rôle d’un SNP dans la régulation de l’épissage est-il
clairement mis en évidence dans ce modèle. Dans le cas du PF, le SNP (809) qui est
localisé 50 pb en 3´ de la fin de l’intron 6 pourrait donc intervenir dans la régulation de
l’épissage des transcrits de la Dsg1 via la modification d’un site exonique régulateur de
l’épissage. Cette hypothèse est à rapprocher de celle formulée par Nakken et al, qui ont
montré une association entre le génotype C/T d’un SNP situé sur l’intron 3 du gène de la
protéine Ro52-kD et la présence d’Ac anti-Ro52-kD au cours du syndrome de Sjögren
[Nakken, 2001]. L’hypothèse soulevée par les auteurs est que ce SNP joue un rôle dans
l’épissage alternatif de l’exon 4 du gène RO52, à l’origine de l'isoforme Ro 52β, délétée du
domaine leucine zipper et qui pourrait intervenir dans la rupture de la tolérance B vis
à vis de la protéine Ro52-kD au cours du syndrome de Sjögren [Chan, 1995]. Par une
approche de type transfection cellulaire de minigéne muté de l'insuline, une étude récente
a mis pour la première fois en évidence la relation de 2 variants polymorphes localisés sur
l'intron 1 du gène INS avec la génération de transcrits alternatifs. L'allèle A du SNP IVS1-
6A/T, localisé sur le site d'épissage 3' de l'intron 1, est associé à une production
Discussion
- 172 -
augmentée de transcrits matures comportant l'intron 1. Ces transcrits alternatifs
induisent une sécrétion d'insuline plus élevée que les transcrits INS normaux. De plus, le
rare polymorphisme IVS1+5insTTGC qui consiste en une insertion localisée à proximité
du site d'épissage 5' de l'intron 1 conduit à l'activation d'un site cryptique d'épissage et à
la production de transcrits alternatifs caractérisés par une insertion de 30 pb en 3' de
l'exon 1 [Kralovicova, 2006]. Ces résulats indiquent que les polymorphismes IVS1-6A/T et
IVS1+5insTTGC sont des variants du gène INS qui affectent l'épissage des ARNm de
l'insuline et que le SNP IVS1-6A/T présent sur le locus IDDM2 de susceptibilité au diabète
de type 1 est un polymorphisme fonctionnel. Toutefois, dans notre modèle l'étude
préliminaire de l'expression des transcrits normaux et alternatifs de la Dsg1 en fonction
du génotype du SNP (809) n'a pas permis de corréler l’un des génotypes à une
augmentation ou une diminution d'un ou des 2 types de transcrits DSG1. De même,
aucune association n'a pu être établie entre un génotype particulier et l'expression
relative des transcrits alternatifs DSG1. Cependant, ces observations ont été faites sur un
faible effectif (n=9). Elles seront donc poursuivies sur un plus grand nombre de sujets
sains permettant une analyse statistique plus puissante.
Dans un second temps, nous avons confirmé l'expression de la Dsg1 tronquée
dans l'épiderme humain normal. En effet, les 2 Ac polyclonaux dirigés contre cette
isoforme de la Dsg1 et qui réagissent avec la forme recombinante de cette protéine
reconnaissent en immunoempreinte une protéine de 25 kDa exprimée dans l'épiderme et
les kératinocytes humains. De plus, ils reconnaissent, dans une analyse en
immunoempreinte d'une carte protéique 2D d'épiderme humain, une protéine unique
caractérisée par des coordonnées de poids moléculaire et de pI (25 kDa, pI 4,7) très
proches de celles attendues pour l'isoforme tronquée de la Dsg1 (22, 4 kDa, pI 5,5). Cette
Dsg1 de 25 kDa n'est pas exprimée dans d'autres tissus épithéliaux tels que l'intestin
grêle ou les reins. Ces résultats indiquent que l'expression de cette isoforme est restreinte
à l'épiderme et qu'elle est vraisemblablement synthétisée par les kératinocytes. Plus
particulièrement, les analyses en IFI montre que les Ac anti-INT6 donnent un marquage
fluorescent des kératinocytes des couches basales de l'épiderme humain. Nos résultats
démontrent qu'une isoforme tronquée de la Dsg1, générée par un mécanisme d'épissage
alternatif, est physiologiquement exprimée dans l'épiderme humain de sujets sains, très
certainement par les kératinocytes des couches basales. Ces travaux fournissent par
ailleurs une autre démonstration ex vivo qu'un autoAg majeur de la réponse auto-
immune au cours de MAI spécifiques d'organe, possède un (des) variant(s) alternatif(s).
Cette isoforme de la Dsg1 pourrait avoir différents rôles. D'un point de vue
physiologique, cette isoforme tronquée ayant perdu la majeure partie de la région EC
ainsi que les domaines transmembranaire et intracellulaires de la Dsg1 devrait être
Discussion
- 173 -
soluble et probablement incapable d'exercer la fonction d'adhésion. La perte de la
propriété adhésive de la Dsg1 pourrait par conséquent aboutir à une fragilisation du
desmosome. En effet, une étude in vitro a montré que l'expression forcée d'une forme
mutante de la Dsg1, amputée d'une partie de sa région EC, dans des cellules épithéliales
en culture compromet l'adhésion desmosomale [Serpente, 2000]. Une même observation
a été faite avec l'expression d'une forme tronquée de la Dsg3 [Hanakawa, 2000]. La
quantification par PCR quantitative en temps réel des transcrits alternatifs de la Dsg1
dans l'épiderme de sujets sains a montré qu'ils représentent de 6 à 30% des transcrits
totaux DSG1. Ces résultats suggèrent qu'il existe une variabilité interindividuelle de
l'expression de la Dsg1 tronquée. Une hypothèse est que chez les patients atteints de
pemphigus, une expression élevée de cette isoforme de la Dsg1 pourrait rendre plus
permissive l'action acantholytique des autoAc anti-Dsg1 pathogènes. Il serait par
conséquent intéressant de quantifier les transcrits alternatifs DSG1 à partir de biopsies
prélevées chez des malades atteints de PF ou d'autres variétés de pemphigus
caractérisées par une réponse autoAc anti-Dsg1. En effet, une modification de
l'expression des transcrits DSG1 pourrait constituer un facteur de susceptibilité à ces
maladies.
D'un point de vu immunologique, il est désormais bien établi que les isoformes
d'autoAg générées par épissage alternatif peuvent jouer un rôle dans l'initiation et la
maintenance des réponses auto-immunes spécifiques et non spécifiques d'organe, à
travers différents mécanismes que nous avons présentés dans l'introduction de ce
mémoire. Un premier mécanisme consiste en la génération d'isoformes d'autoAg
contenant des néo-épitopes susceptibles d'être reconnus spécifiquement par les
lymphocytes T autoréactifs et/ou des autoAc présents chez les malades atteints de MAI.
Les analyses in silico montrent en effet que des séquences spécifiques d’isoformes
d'autoAg, générées par épissage alternatif, peuvent constituer des épitopes cibles des
autoAc et/ou de la réponse lymphocytaire T restreinte par des molécules HLA de classe I
et II [Ng, 2004]. Le modèle le plus éloquent est celui établi par Voskuhl et al dans la SEP
au cours de laquelle une réponse lymphocytaire T restreinte aux molécules HLA
DR2/DQw1 est spécifiquement dirigée contre un peptide, X2MBP, porté par 2 isoformes
de la MBP et absente de l'isoforme majoritaire de cet autoAg [Voskuhl, 1993a ; Voskuhl,
1993b ; Voskuhl, 1994]. Ces travaux nous ont amené à examiner le rôle potentiel de
l'isoforme tronquée de la Dsg1 dans la réponse auto-immune T au cours des pemphigus.
Tout d'abord, afin de tester la possibilité qu'une séquence spécifique de cette isoforme
puisse se fixer certaines molécules HLA de classe II de susceptibilité à la maladie, nous
avons évalué l'affinité relative de 4 peptides chevauchants le domaine EC2 et le peptide
INT6 pour les molécules DRB1*0101, *0102, *0401 et *0402. L'un de ces peptides,
Discussion
- 174 -
EC2/INT6 216-235, se fixe avec une forte affinité à 3 de ces molécules HLA de classe II et
de manière intéressante, avec une haute affinité à la molécule DRB1*0102. Etant donné
que l'allèle DRB1*0102 constitue un facteur de prédisposition au PS [Moraes, 1991 ;
Miyagawa, 1999b ; Pavoni, 2003] notamment, dans la population française [Loiseau,
2000 ; Martel, 2000], nous avons étudié la réponse lymphocytaire T vis à vis du peptide
EC2/INT6 216-235 chez les patients atteints de PF et de PV. Le peptide sélectionné induit
la prolifération des PBMC chez 4 malades atteints de PF (50%). Trois d'entre eux portent
les allèles HLA de classe II (DRB1*0102 et *0101) qui accommodent avec une bonne
affinité le peptide EC2/INT6 216-235. Bien que le sous-type de la molécule DR14
exprimée par le quatrième malade dont les PBMC prolifèrent vis à vis de ce peptide n'ait
pas été déterminé, il est intéressant de rappeler que plusieurs molécules DR14 de
susceptibilité au PS notamment, DRB1*1401 et *1406, partagent des résidus
aminoacides aux positions critiques de la poche d'ancrage peptidique avec les molécules
DRB1*0102 et *0101 [Pavoni, 2003]. Bien qu'un des malades de PF exprime la molécule
DRB1*0101, ses cellules T ne prolifèrent pas lorsqu'ils sont stimulés avec le peptide
EC2/INT6 216-235 ceci, malgré un taux sérique d'Ac anti-Dsg1 très élevé (202 U/ml). Par
conséquent, la prolifération lymphocytaire T ne requiert pas seulement la présentation du
peptide par les CPA mais sans doute aussi un nombre suffisant de cellules T spécifiques
et fonctionnelles. D'une part et en accord avec leur génotype HLA de classe II et leur
répertoire T, les malades atteints de PF n'ont donc probablement pas tous la capacité de
monter une réponse auto-immune T dirigée contre l'épitope porté par l'isoforme tronquée
de la Dsg1. D'autre part, le statut clinique (rémission vs phase active) et le traitement des
patients modulent très certainement la capacité proliférative des lymphocytes T. De
manière intéressante, la fréquence des malades atteints de PV dont les PBMC prolifèrent
en réponse au peptide d'intérêt est plus faible que celle observée chez les malades atteints
de PF (7% vs 50%). Par ailleurs, aucune prolifération des PBMC isolées chez les patients
atteints de pemphigoïde bulleuse n'est induite par le peptide EC2/INT6 216-235.
L'ensemble de ces résultats permet de formuler une hypothèse attractive sur le rôle
de l'isoforme tronquée de la Dsg1 dans la physiopathologie du PF, selon la cascade
d’événements suivante : l’isoforme soluble de la Dsg1 pourrait circuler dans les organes
lymphoïdes secondaires (désequestration anatomique), être apprêtée par des CPA
exprimant notamment la molécule HLA de classe II DRB1*0102 et présentée aux cellules
T spécifiques de ce complexe. Une fois activés, ces lymphocytes T pourraient activer des
cellules B spécifiques et finalement aboutir à la production d’Ac anti-peptide de la Dsg1
tronquée. Enfin, une diversification de la réponse autoAc contre des épitopes de la Dsg1
présents sur les domaines EC1 et EC2 pourrait survenir via un phénomène d’extension
épitopique intramoléculaire. Concernant cette dernière proposition, il est essentiel de
Discussion
- 175 -
mentionner qu’au cours de l’EAE, une réponse lymphocytaire T initialement dirigée contre
des épitopes spécifiques de variants alternatifs, peut se diversifier par des phénomènes
d’extension épitopique intra- et intermoléculaire. En effet, le transfert de clones T
spécifiques du peptide X2MBP à des souris SJL/J déclenche une réponse lymphocytaire
T anti-X2MBP lors de la première phase de l’EAE, qui s’étend à des réponses
lymphocytaires T dirigées contre des épitopes immunodominants de l’isoforme majeure de
la MBP et de la PLP lors de la seconde phase de la maladie [Zhao, 1995].
Il serait intéressant de corroborer expérimentalement certaines de ces hypothèses.
Tout d’abord, afin de confirmer la circulation de l’isoforme tronquée de la Dsg1, sa
présence dans le sérum humain pourrait être recherchée à la fois chez des individus
sains et chez les malades de pemphigus. A cet égard, Lanza et al ont récemment mis en
évidence l'existence dans le sérum humain d'une isoforme tronquée de la Dsg3 d'environ
30 kDa [Lanza, 2006]. Ces auteurs ont détecté cette Dsg3 tronquée dans le sérum de
malades atteints de PV, de pemphigoïde bulleuse et d'individus sains par
immunoprécipitation à l'aide d'un Acm dirigé contre le peptide 49-60 du domaine EC1 de
la Dsg3. Cette Dsg3 soluble serait composée des domaines EC1 et EC2 de la forme
canonique de la Dsg3. Bien qu'aucune caractérisation du mécanisme à l'origine de la
production de cette Dsg3 tronquée et d'étude de son d'implication dans la réponse auto-
immune au cours des pemphigus n'ait été entreprise, cette observation s'avère malgré
tout très intéressante au regard des similitudes que l'on peut relever avec nos résultats de
l'étude de l'isoforme tronquée de la Dsg1.
En second lieu, l'analyse de la réactivité autoAc dirigée contre l'isoforme tronquée
de la Dsg1 pourrait être réalisée chez les malades atteints de pemphigus et chez des
sujets normaux par ELISA en utilisant comme Ag le peptide EC2/INT6 216-235. Un
modèle similaire a été décrit par Tanaka et al qui ont montré l'existence d'une forme
tronquée de la sous unité β (gp130) du récepteur à l'IL6 produite par un mécanisme
d'épissage alternatif et caractérisée par l'addition à son extrémité C-terminale d'un
pentapeptide spécifique de cette isoforme (NIASF) [Tanaka, 2000]. Cette isoforme soluble
et plus particulièrement la séquence C-terminale de 15 aminoacides générée par la
réunion entre un peptide de la gp130 et le peptide NIASF est reconnue par les autoAc
présents chez 75% des malades atteints de PR. Au commencement de nos travaux, les
résultats sur cette isoforme de la gp130 nous avaient tout d'abord suggéré d'analyser la
production d'IgG dirigées contre le peptide INT6 dans le sérum des patients atteints de
PF. Cependant, l'étude en ELISA avec ce peptide n'a pas permis de mettre en évidence
d'IgG anti-INT6 dans le sérum des malades testés (n=34). Malgré cela et à la lumière des
données obtenues sur la prolifération lymphocytaire T vis à vis du peptide EC2/INT6 216-
235, il serait désormais intéressant de vérifier la production d'IgG anti-EC2/INT6 216-
Discussion
- 176 -
235 chez les malades, en particulier chez ceux dont les PBMC prolifèrent en présence de
ce peptide et/ou qui expriment les molécules HLA de classe II capables de fixer ce
peptide.
Enfin dans une perspective à plus long terme, il est possible d'envisager la
production de clones lymphocytaires T spécifiques du peptide EC2/INT6 216-235 à partir
des PBMC qui prolifèrent en réponse à cet Ag et ainsi d'étudier leurs caractéristiques
phénotypiques et leurs propriétés fonctionnelles afin de mieux comprendre leur rôle dans
la physiopathologie de la maladie.
Un autre mécanisme est que l’expression thymique exclusive d’une isoforme
d'autoAg ne présentant pas certains épitopes portés par la forme canonique de l’autoAg
(uniquement exprimée à la périphérie), peut conduire à l’émergence de clones T
autoréactifs capables de réagir à la périphérie avec ces mêmes déterminants
antigéniques. Cette hypothèse est illustrée par un modèle murin d'EAE dans lequel
l'expression thymique restreinte à l'isoforme tronquée DM20 est corrélée à la présence de
cellules T autoréactives spécifiques de la forme complète de la PLP, exprimée dans le
système nerveux central mais exclue du thymus [Klein, 2000]. De même, un transcrit
alternatif de l'autoAg ICA512/IA-2, délété d'une séquence codant pour plusieurs épitopes
T et exclusivement exprimée dans le thymus, a été décrit et pourrait participer à la
rupture de la tolérance contre ICA512/IA-2 au cours du diabète de type 1 [Diez, 2001].
Nous avons transposé cette observation à notre modèle et commencé à étudier
l'expression thymique des transcrits normaux et alternatifs de la Dsg1 dans le thymus
humain. Nos résultats sur l'expression thymique des transcrits normaux de la Dsg1,
présentés sous la forme d'un article en préparation, sont discutés plus bas. L'analyse de
l'expression thymique des transcrits alternatifs DSG1 est en cours mais les résultats
préliminaires indiquent que tout comme les messagers DSG1, les transcrits codant pour
l'isoforme tronquée de la Dsg1 sont exprimés dans le thymus humain. Cependant, ces
observations ont été faites sur un faible effectif (n=10) et demandent à être confortées
chez un plus grand nombre de thymus.
Dans la seconde partie de ce travail de thèse, nous avons caractérisé par une
analyse protéomique ciblée, la réponse Ac anti-desmosome induite chez des souris
normales immunisées avec la région EC recombinante de la Dsg1 (rEC1/5-Dsg1). Afin de
contrôler la production d’IgG anti-Dsg1 dans le sérum des souris BALB/c et CD1
immunisées, nous avons mis au point un ELISA utilisant comme Ag la baculoprotéine
rEC1/5-Dsg1 purifiée. Les analyses par ELISA-rEC1/5-Dsg1 montrent que la totalité des
souris immunisées (n=20) produisent dans leur sérum des IgG réagissant avec la région
EC de la Dsg1. De plus, les sérums de ces animaux reconnaissent en immunoempreinte,
Discussion
- 177 -
la protéine rEC1/5-Dsg1 et la Dsg1 présente dans un extrait protéique d’épiderme
humain. Trois Acm, 1N5, 1D8 et 8C3, ont été dérivés des souris ayant développé une
réponse Ac anti-Dsg1 et sélectionnés sur leur capacité à réagir avec la protéine rEC1/5-
Dsg1 en ELISA. L’analyse en IFI sur coupe de peau humaine montre qu’ils se fixent aux
kératinocytes de l’épiderme avec un marquage fluorescent (de la SIC) identique à celui
obtenu avec un sérum de PF contenant des Ac anti-Dsg1. Les Acm 1N5 et 1D8
reconnaissent en immunoempreinte, la protéine rEC1/5-Dsg1 et la Dsg1 présente dans
un extrait protéique d’épiderme humain tandis que le 8C3 ne réagit pas avec la Dsg1 et
sa région EC recombinante dans les conditions dénaturantes du SDS-PAGE. Cette
observation suggère que ce dernier est dirigé contre un épitope conformationnel de la
Dsg1 puisque même avec une plus forte concentration en IgG dans le surnageant de
l’hybridome, la fixation du 8C3 à la Dsg1 n'est pas révélée en immunoempreinte. Par
ailleurs, nos résultats non publiés montrent que le 1N5 et le 1D8 réagissent avec des
épitopes localisés respectivement sur les domaines EC4-EC5 et EC1-EC2 de la Dsg1.
Ainsi, les propriétés immunologiques de ces 3 Acm reflètent celles des autoAc anti-Dsg1
produits chez les patients atteints de PF, qui ciblent divers épitopes des domaines EC de
la Dsg1 [Sekiguchi, 2001] à la fois conformationnels et non conformationnels [Kowalczyk,
1995 ; Hacker, 2002].
De façon tout à fait surprenante, 2 souris immunisées avec la région EC de la
Dsg1 réagissent en immunoempreinte sur un extrait d'épiderme humain avec la Dsg1 et
avec d'autres Ag de plus haut poids moléculaire. Plus précisément, le sérum d'une des
souris révèle une bande de 190 kDa et le sérum de la seconde un doublet protéique de
190-210 kDa. Nous avons dérivé des hybridomes à partir des splénocytes isolés de ces 2
souris puis sélectionné et cloné 2 d'entre eux, CK1 et 10A1, sur la capacité des Acm
sécrétés à donner en IFI un marquage fluorescent « en résille » (de la SIC) sur des coupes
de peau humaine et dans un second temps, un profil d'immunoempreinte sur un extrait
d'épiderme humain identique à celui observé avec les sérums des souris correspondantes.
En IFI, CK1 donne à la fois un marquage fluorescent « en résille » de l'épiderme et de la
membrane basale de la jonction dermo-épidermique sur des coupes de peau humaine et
d'œsophage de souris. CK1 reconnaît en immunoempreinte un doublet de protéines
épidermiques de 190 et 210 kDa, identique à celui reconnu par le sérum parental. 10A1
donne un marquage fluorescent de la SIC en IFI sur des coupes de peau humaine et
d'œsophage de souris et reconnaît en immunoempreinte une protéine épidermique de 190
kDa. Les analyses en immunoempreinte à fluorescence infrarouge montrent que le
doublet de 190-210 kDa et l'Ag de 190 kDa reconnus respectivement par le CK1 et le
10A1 sont aussi reconnus par les IgG présentes dans un sérum d'un malade atteint de
PPN. Grâce à l'immunoempreinte à fluorescence infrarouge, nous avons mis en évidence
Discussion
- 178 -
que les protéines ciblées par les Acm CK1 et 10A1 sont reconnues par les autoAc produits
au cours du PPN. La méthodologie mise au point utilisant cette technologie nous donc a
permis de comparer les spécificités des Ac observés chez les souris immunisés avec la
Dsg1 et chez les malades atteints de PPN.
La plupart des MAI sont caractérisées par une réponse auto-immune dirigée contre
plusieurs Ag de l'organe cible dont l'identification est cruciale pour une meilleure
compréhension des processus physiopathologiques qui concourent à leur développement
et/ou à celui de leurs modèles expérimentaux. Ainsi, des technologies qui permettent une
caractérisation globale des spécificités de la réponse auto-immune telle que la réponse
autoAc sont requises. L'analyse protéomique ciblée qui est fondée sur la triade
« électrophorèse bidimensionnelle/immunoempreinte/spectrométrie MALDI-ToF »,
constitue une approche puissante qui offre la possibilité de caractériser la diversité de la
réponse autoAc au cours des MAI. La faisabilité de cette stratégie a été démontrée à la fois
dans les MAI humaines [Stulik, 2003 ; Almeras, 2004] et expérimentales [Thébault,
2002]. A cet égard, nous avons précédemment démontré que l'analyse protéomique ciblée
est un outil efficace pour identifier les protéines ciblées par la réponse autoAc produite au
cours d’un modèle murin spontané de LED. En effet, nous avons défini
chronologiquement la spécificité des Ac présents dans le sérum des souris (NZW x
BXSB)F1 ou WB à différents âges de la vie et selon le sexe grâce à une approche d’analyse
protéomique ciblée. De la sorte, l’immunocriblage de carte protéique 2D de cellules HL60
avec les sérums des animaux nous a notamment permis de montrer que la réponse auto-
immune B observée chez les mâles WB se développe séquentiellement contre 6 protéines :
la vimentine, dans un premier temps, les protéines RAD23B, Hsp60 puis α-énolase et
hnRNP L et enfin, la nucléosphosmine [Thebault, 2002]. Afin d'identifier les protéines
cibles des Acm CK1 et 10A1, nous avons donc choisi comme stratégie, l'immunocriblage
de carte protéique 2D d'épiderme humain couplé à la spectrométrie de masse MALDI-ToF.
En premier lieu, nous avons réalisé une carte protéique 2D d’épiderme humain en
utilisant une insertion passive des protéines contenues dans l’extrait durant l’étape de
réhydratation du gel de première dimension (gel GPI, cf. matériels & méthodes). Cette
approche nous a permis de visualiser sur la carte protéique 2D colorée au bleu de
Coomassie, la protéine de 190 kDa reconnue par les Acm 10A1 et CK1. Cependant,
l’utilisation de cette méthode « classique » n’est pas adaptée à la séparation des protéines
de haut poids moléculaire dont l’entrée dans le gel GPI est limitée. L'utilisation de cette
méthode ne nous a pas permis d’identifier formellement la protéine de 190 kDa du fait de
sa trop faible quantité dans le gel 2D et de visualiser la protéine de 210 kDa dans le gel
2D coloré au bleu de Coomassie. En conséquence, pour augmenter l’entrée des protéines
de haut poids moléculaire dans le gel de première dimension, les protéines ont été
Discussion
- 179 -
insérées activement dans le gel grâce à l’action du courant durant l’étape d’IEF, en
chargeant l’extrait à l’extrémité basique (ou acide) du gel GPI. Cette seconde méthode
facilite l’entrée des protéines de haut poids moléculaire dans le gel de première dimension
et par la même, la densité des taches protéiques présentes dans la carte protéique 2D
d’épiderme humain. Cette approche méthodologique a de ce fait permis aux protéines de
190 et 210 kDa de pénétrer dans le gel 2D en quantité suffisante pour être visualisées,
excisées et identifiées par spectrométrie de masse après immunocriblage de cette nouvelle
carte 2D avec les Acm 10A1 et CK1. Ainsi, avons nous démontré que l’Ag cible de l’Acm
10A1 est l’envoplakine, et que le CK1 reconnaît à la fois l'envoplakine (ENV) et la
périplakine (PPL). Plus précisément, l'immunocriblage d'une banque d'expression d'ADNc
de kératinocytes humains (λgt11) avec le CK1 montre que celui-ci réagit avec une
séquence peptidique comprise dans le sous-domaine linker de l'ENV.
Ces Acm possèdent des propriétés intéressantes. Premièrement, l'analyse
protéomique des spécificités du 10A1 et du CK1 montre que tous 2 reconnaissent la PPL
mais que ceux-ci réagissent avec des épitopes différents de cette plakine étant donné que
le CK1 reconnaît aussi l'ENV. La démonstration par le criblage de la banque d'expression
λgt11, que le CK1 est dirigé contre un épitope du sous-domaine linker de l'ENV peut
expliquer sa réactivité contre le doublet de 190-210 kDa. En effet, une réactivité croisée
du CK1 vis-à-vis de ces 2 molécules est envisageable puisque la structure primaire du
sous-domaine linker de l'ENV partage une identité de 48% avec celle de la PER. De plus,
celui-ci partage une identité de 42% avec le sous-domaine linker de la plectine (PL) qui est
le seul membre de la famille des plakines à être exprimé dans les plaques desmosomales
et hémidesmosomales de l’épiderme. Ces dernières étant localisées au niveau de la
jonction dermoépidermique, une réactivité croisée du CK1 contre la PL pourrait rendre
compte du marquage fluorescent de la membrane basale de la peau humaine et de
l’œsophage de souris obtenu en IFI avec cet Acm. On peut donc supposer que cette
« polyréactivité » du CK1, dirigé à la fois contre l’ENV, la PER et probablement contre la
PL, soit la conséquence de la forte homologie qui existe entre les sous-domaines linker de
ces 3 molécules. De façon intéressante, le linker de l'ENV qui est une des cibles des
autoAc présents chez les malades de PPN [Nagata, 2001], représente un épitope majeur
de la réponse autoAc dirigée contre le doublet ENV-PER au cours de la maladie.
Effectivement, 92% des sérums de PPN ayant une réactivité anti-190-210 kDa
reconnaissent le linker de l’ENV et de la PPL. De plus, le peptide
LLDRKSGKQYSIEAALRCRR contenu dans cette région de l’ENV représente un épitope
immunodominant reconnu par 75% des sérums de malades [Zhang, 2006]. Nous avons
synthétisé sous forme recombinante le produit du clone de la banque λgt11 qui comprend
la majorité du linker de l’ENV (RecENV-L) et montré que 48.5% des sérums de PPN (n=33)
Discussion
- 180 -
et 62% des sérums de malades contenant des autoAc anti-190-210 kDa (n=21)
reconnaissent ce fragment protéique de l’ENV humaine en immunoempreinte. Bien que
ce dernier résultat diverge de celui obtenu par Zhang et al (62% vs 92%), il donne une
prévalence proche de celle établie dans l’étude princeps (comprise entre 58 et 69%)
[Nagata, 2001]. Afin de réaliser une étude de prévalence à plus large échelle, nous avons
mis au point un test de détection des Ac anti-RecENV-L en utilisant la technologie Bio-
Plex (Biorad) et étudions actuellement la présence d’IgG spécifiques dans le sérum des
patients atteints de PPN, de PV et PF.
A la lumière de ces résultats, on peut considérer que le sous-domaine linker de
l’ENV, cible du CK1, représente un épitope immunodominant de la réponse anti-plakines
observée au cours du PPN. Etant donné qu’aucune preuve de la pathogénicité des Ac
anti-ENV-PER n’a été fournie à ce jour, il serait très intéressant d’étudier le potentiel
pathogène de l’Acm CK1. Les premiers résultats obtenus par transfert passif à des
souriceaux nouveau-nés BALB/c indiquent que le CK1 a la capacité de se fixer in situ
dans l’épiderme des souris receveuses sans la formation de bulles. Il est important de
continuer ces investigations afin de confirmer ou d’infirmer le caractère pathogène d'un
Acm qui cible un épitope majeur des autoAg les plus spécifiques de la réponse auto-
immune du PPN. Il faut ici rappeler que le transfert passif d’IgG anti-DPI et anti-DPII,
purifiées à partir des sérums de malades atteints d’érythème multiforme, à des
souriceaux nouveau-nés induit une acantholyse associée à un détachement des filaments
intermédiaires de la plaque desmosomale dans l’épiderme des souris receveuses
[Foedinger, 1998].
Deuxièmement, les Acm 10A1 et CK1 ne se fixent pas uniquement à l'épiderme
humain mais aussi à l'épithélium de souris indiquant qu'ils réagissent contre des
épitopes B partagés par les molécules desmosomales de l'homme et de la souris. La
séquence aminoacide du linker de l'ENV humaine et de souris est hautement conservée
entre ces 2 espèces (88% d'identité) et la PER humaine partage une identité de 76% avec
son homologue murin. Une réactivité croisée pourrait rendre compte de la réactivités de
ces 2 Acm vis à vis des épithéliums humain et de souris.
L'observation majeure de cette étude est que l'immunisation de souris normales
avec un autoAg unique, la Dsg1, peut induire une réponse Ac contre cet Ag mais aussi
contre d'autres protéines desmosomales de la famille des plakines, mimant la diversité et
le chevauchement des spécificités des autoAc détectés au cours des pemphigus. Cette
observation étonnante permet de soulever quelques hypothèses afin d'expliquer la nature
du (des) phénomène(s) impliqué(s) dans cette diversification de la réponse immune B.
Premièrement, les Ac anti-Dsg1 pourraient se fixer à d'autres Ag desmosomiaux.
Cependant, la Dsg1 n'a aucune homologie de séquence avec l'ENV ou la PER et nos
Discussion
- 181 -
résultats montrent par ailleurs que les Acm 10A1 et CK1 ne réagissent pas avec la Dsg1
en ELISA ni en immunoempreinte sur un extrait d'épiderme humain. Par conséquent,
bien que la réactivité croisée entre Ag du soi peut rendre compte de la diversification de la
réponse auto-immune B au cours de certaines MAI [Elkon, 1986], nos données n'étayent
pas cette hypothèse. Une seconde hypothèse est que la production d'Ac anti-PER et anti-
ENV résulte d'un mécanisme d'extension épitopique. Il est défini comme la diversification
des réponses immunes à travers le temps et est caractérisé par une expansion
progressive du spectre des spécificités lymphocytaires T et B [Vanderlugt, 1996 ; James,
1998a ; Vanderlugt, 2000]. L'extension épitopique est un phénomène fréquemment
rencontré dans les MAI spécifiques d'organe dans lesquelles de multiples Ag de l'organe
cible sont généralement reconnus par les effecteurs de la réponse auto-immune. Ce
mécanisme implique que la réponse auto-immune puisse s'étendre non seulement à
différents épitopes d'une même molécule (extension intramoléculaire) mais aussi à des
épitopes portés soit par des molécules physiquement associées, soit par des molécules
cryptiques relarguées dans un contexte inflammatoire (extension intermoléculaire)
[Vanderlugt, 1996 ; James, 1998a ; Vanderlugt, 2000]. La démonstration qu'une
extension épitopique intramoléculaire se produit au cours des pemphigus a été
récemment fournie par l'analyse de la réponse anti-Dsg1 dans le fogo selvagem [Li, 2003]
et anti-Dsg3 dans le PV [Salato, 2005]. A côté de ce phénomène d'extension épitopique
désormais bien établi, plusieurs observations suggèrent que la diversification de la
réponse auto-immune B au cours des pemphigus est le fruit d'un mécanisme d'extension
intermoléculaire : (i) le passage d'une forme clinique et histologique de PV à une forme de
PF associée à un changement de la spécificité des autoAc (transition anti-Dsg3 à anti-
Dsg1) et inversement [Kawana, 1994 ; Ishii, 2000 ; Komaï, 2001] ; (ii) le passage de la
forme muqueuse de PV avec une production exclusive d'Ac anti-Dsg3 à la forme
cutanéomuqueuse de la maladie caractérisée par une nouvelle réactivité autoAc dirigée
contre la Dsg1 [Ding, 1997 ; Miyagawa, 1999a ; Salato, 2005] ; (iii) l'observation d'une
extension de la réponse auto-immune B chez un malade de PPN, initialement dirigée
contre la DPI et l'Ag de 170 kDa et se diversifiant vers les autres autoAg de la famille des
plakines (DPII, BPAG1, PER et ENV) [Bowen, 2000]. Enfin, dans le cas du pemphigus, il
faut rappeler que les 3 molécules considérées dans notre étude, la Dsg1, la PER et l'ENV,
font partie du complexe desmosomal et qu'elles peuvent être la cible de la réponse auto-
immune des patients atteints de pemphigus. En effet, les autoAc anti-Dsg1 sont présents
dans le sérum des malades de PPN dans 65% cas [Amagai, 1998], et plusieurs études ont
démontré l'existence d'IgG dirigées contre l'ENV et la PER dans le sérum des patients
atteints de PV et de PS [Kazerounian, 2000 ; Nagata, 2001 ; Abreu-Velez, 2003a].
Discussion
- 182 -
Toutefois, la réalité du phénomène d'extension épitopique intermoléculaire au cours des
pemphigus n'a pas encore été confirmée.
Notre observation que l'immunisation de souris normales avec la région EC de la
Dsg1 peut induire une réponse Ac contre des autoAg de la famille des plakines, e.g.
envoplakine et périplakine, procure le premier argument fort supportant le concept
d'extension épitopique intermoléculaire et pourrait ainsi expliquer la large rupture de la
tolérance B vis à vis des Ag épidermiques observée au cours du PPN. Puisque toutes les
protéines de la famille des plakines sont cytoplasmiques, elles sont probablement
inaccessibles au système immunitaire dans une cellule intacte. C'est pourquoi, il a été
postulé que : (i) les malades produisent initialement des autoAc dirigés contre les
protéines transmembranaires, Dsg1 et Dsg3, capables de provoquer la libération de
molécules associées aux Dsg ou d'Ag cryptiques. (ii) ces autoAg sont ensuite capturés,
apprêtés et présentés par des CPA aux cellules T spécifiques qui une fois activées,
activent à leur tour des cellules B spécifiques des plakines et in fine déclenchent la
synthèse d'autoAc anti-plakine [Hashimoto, 2003]. Une hypothèse séduisante qui
pourrait expliquer cette « désequestration » antigénique des plakines médiée par les
autoAc anti-Dsg est l'implication du processus d'apoptose kératinocytaire. En effet, il est
désormais bien établi que les Ac anti-Dsg présents chez les malades de pemphigus sont
capables d'induire une apoptose des kératinocytes et que ce mécanisme intervient très
certainement dans le processus acantholytique qui caractérise la maladie [Puviani, 2003;
Wang, 2004b; Pelacho, 2004]. Or, au cours de l'apoptose kératinocytaire, les caspases
clivent la majorité des protéines desmosomales les Dsg1 et Dsg3, la PG, la PKP-1, les DP,
la PL et la PER [Weiske, 2001 ; Aho, 2004 ; Dusek, 2006]. De la sorte, l'apoptose des
kératinocytes pourrait intervenir, via l'action des caspases, dans le(s) processus
lésionnel(s) en provoquant la dissociation des jonctions desmosomales et le relargage des
Ag desmosomiaux qui seraient alors susceptibles de rompre la tolérance au soi. En
accord avec cette hypothèse, on conçoit que les autoAc anti-Dsg1 pourraient conduire à
la production d'Ac anti-plakine en donnant lieu à la libération de ces Ag intracellulaires et
de ce fait, à leur transport de l'épiderme aux ganglions lymphatiques [Hemmi, 2001] et à
leur rencontre avec les cellules T spécifiques des plakines. Notre étude montrant que
l'immunisation avec la Dsg1 peut initier la production d'Ac anti-PER et anti-PPL conforte
ce modèle d'extension épitopique. La démonstration par IFI que les IgG anti-Dsg1, anti-
ENV et anti-PER produites chez les animaux immunisés se fixent aux Ag épidermiques de
souris est en accord avec cette cascade d'événements potentiels, à savoir l'activation de
lymphocytes B de souris spécifiques de la Dsg1 puis de l'ENV et de la PER.
Ce modèle est évocateur des réponses auto-immunes systémiques induites
expérimentalement chez les animaux immunisés avec certains autoAg associés au LED.
Discussion
- 183 -
En effet, différents modèles d'extension épitopique intermoléculaire de la réponse B ont
été développés impliquant plus particulièrement, les complexes du splicéosome et du
nucléosome qui comprennent tous 2 des Ag ciblés par la réponse autoAc au cours de la
maladie lupique. Plus précisément, les souris immunisées avec l'un de ces autoAg
recombinants, Ro60-kD, Ro52-kD ou La, produisent des Ac qui réagissent avec chacune
des autres molécules du complexe La/Ro RNP [Tseng, 1997]. Par ailleurs, une extension
de la réponse Ac contre les Ag Ro/La vers les molécules chaperonnes, calréticuline et
Grp78 (glucose-regulated protein 78), a été observée chez les souris immunisées avec la
protéine Ro52-kD et/ou Ro60-kD [Kinoshita, 1999]. De même, les souris immunisées
avec des peptides de l'autoAg Sm B/B' développent une réponse auto-immune anti-
splicéosome notamment, la production d'autoAc dirigés contre d'autres
ribonucléoprotéines et contre l'ADN [James, 1998b]. Enfin, les souris lupiques (SWR x
NZW)F1 immunisées avec des peptides antigéniques dérivés des histones H2B et H4
produisent de forts titres d'Ac anti-ADN double brin et anti-nucléosome [Madaio, 2000].
Enfin, la potentialité de l'induction d'une réponse Ac dirigée contre l'ENV et la PER
chez les souris normales immunisées avec la Dsg1 plaide en faveur de l'hypothèse auto-
immune de production des autoAc anti-plakines chez les malades atteints de PPN et
conteste par la même la position stricte affirmant que la production de ces populations
d'Ac est uniquement dépendante de la prolifération tumorale qui caractérise les patients
atteints de cette variété de pemphigus.
La phase finale de ce travail de thèse a eu pour but d'étudier l'expression de la
Dsg1 dans le thymus humain normal. Depuis une dizaine d'années, de nombreux
travaux ont en effet mis en évidence l'expression thymique d'ARNm codant pour des
protéines spécifiques de tissus dont plusieurs correspondent à des cibles de certaines
MAI comme par exemple, le diabète de type 1, la SEP ou la thyroïdite autoimmune
[Derbinsky, 2001; Sospedra, 1998]. Toutefois, aucune étude n'a fait état de l'expression
thymique de la Dsg1. En nous basant sur ces données, nous avons tout d'abord entrepris
d'étudier l'expression de la Dsg1 dans le thymus humain au niveau transcriptionnel. Les
analyses par PCR montrent que les transcrits normaux DSG1 sont présents dans 90,6%
des thymus des individus sains testés (n=32). Ces résulats évoquent l'expression
thymique d'autres autoAg ciblés par la réponse auto-immune B au cours de certaines
MAI tels que le récepteur à l'ACh dans la myasthénie [Wakkach, 1996], le récepteur à la
thyréostimuline ou TSH (thyroid-stimulating hormone) dans la maladie de Grave
[Murakami, 1996] et la chaîne α3 du collagène de type IV dans le syndrome de
Goodspature [Wong, 2001]. Plus étroitement, des travaux ont montré l'expression
thymique des ARNm de la Dsg3 [Schafer, 1994; Tsunoda, 2002] et nos analyses par PCR
Discussion
- 184 -
ont confirmés l'existence des transcrits DSG3 dans le thymus. Les données sur la Dsg4
sont plus controversées puisque les messagers DSG4 sont détectés dans le thymus
humain par des analyses de southern-blot [Kljuic, 2003], mais pas par celles réalisées par
PCR [Whittock, 2003].
La démonstration de la transcription du gène DSG1 dans le thymus suggére que
des peptides dérivés de la Dsg1 peuvent être présentés aux cellules T en maturation ce
qui pourrait conduire soit à une délétion clonale des cellules T autoréactives soit à une
sélection positive de cellules T régulatrices et spécifiques de la Dsg1. Toutefois, étant
donné que des lymphocytes T matures dirigés contre la Dsg1 sont présents non
seulement chez les malades atteints de PF mais aussi chez les sujets sains [Gebhard,
2005], l'expression thymique des transcrits DSG1 n'aboutit pas nécessairement à la
suppression des cellules T spécifiques de la Dsg1. Cette potentielle discordance entre
l'expression thymique d'un ARNm codant pour un autoAg et la tolérisation des cellules T
spécifiques de celui-ci est démontrée pour la sous-unité α de l'ATPase H+/K+ exprimée à
la membrane gastrique et qui constitue l'une des cibles majeures de la réponse
lymphocytaire T CD4+ au cours de la gastrite auto-immune [Allen, 2005].
Alternativement, une hypothèse intéressante est que l'expression des transcrits de la
Dsg1 dans le thymus induirait le développement de lymphocytes T régulateurs plutôt que
l'émimination des cellules T autoréactives vis à vis de la Dsg1. A cet égard, il est
intéressant de rappeler que des cellules régulatrices Tr1 spécifiques de la Dsg3 et
exprimant la molécule Foxp3 sont moins fréquemment détectés chez les malades atteints
de PV que chez les sujets sains [Veldman, 2004]. Ainsi, cette population de cellules Tr1
participerait-elle à la maintenance de la tolérance périphérique vis à vis de la Dsg3.
Nous avons ensuite sélectionnés 9 thymus au hasard, couvrant différents âges et
analysés par PCR quantitative l'expression relative de l'ARNm DSG1. De façon
supprenante, nos résultats indiquent que l'expression thymique des transcrits de la Dsg1
augmente avec l'âge. Ceux-ci sont d'autant plus étonant que des travaux similaires
réalisés sur d'autres autoAg ont montré soit une variation interindividuelle indépendante
de l'âge [Bruno, 2002], soit une diminution de l'expression des messagers codant ces
autoAg avec l'âge [Sospreda, 1998], et qu'il n'existe pas d'autre exemple de transcrit
d'autoAg dont l'expression thymique s'accroît avec l'âge. Par ailleurs, nos résultats
semblent en contradiction avec le fait que le nombre de cellules dans le thymus diminue
avec son involution âge-dépendante notamment, celui des CPA thymiques exprimant et
capables de présenter des peptides du soi. En effet, les réductions des espaces épithéliaux
(cortex et médullaire thymique) et du nombre de cellules dendritiques sont des
caractéristiques du thymus involutif [Bertho, 1997; Nakahama, 1990]. Bien que le
mécanisme à l'origine de cette augmentation des transcrits DSG1 dans le thymus ne soit
Discussion
- 185 -
pas encore élucidé, il est possible d'envisager certaines hypothèses pour rendre compte de
ce phénomène : (i) intrinséquement, les cellules exprimant ces messagers pourraient
réguler de manière positive la transcription du gène DSG1 avec l'âge. Malgré l’absence à
ce jour de la démonstration d’une augmentation de l'expression thymique d'un transcrit
codant pour un autoAg, il est essentiel de mentionner que le processus d'involution
thymique s'accompagne de changements importants dans l'expression génique. En effet,
une analyse comparative du transcriptome de thymus chez des souris âgées de 1, 6, 12 et
24 mois met en évidence des variations dans l'expression de 788 gènes avec l'âge des
animaux. A titre d'exemple, la comparaison entre les analyses transcriptomiques des
groupes de souris âgées de 1 et 24 mois montrent que l'expression de 418 gènes est
augmentée et que celle de 370 gènes est réprimée [Taub, 2005]. De plus, plusieurs
travaux menés chez l'homme ont démontré l'augmentation de la production des ARNm
codant pour certaines molécules telles que des cytokines impliquées dans la suppression
de la thymopoeïse [Sempowski, 2000] ou le récepteur TLR4 [Bernasconi, 2005] avec
l'involution thymique; (ii) le nombre de cellules exprimant les transcrits DSG1 pourraient
s'élever avec l'involution thymique. A cet égard, il est nécessaire de rappeler que plusieurs
travaux ont démontré une augmentation âge-dépendante du nombre de cellules B
présentes dans le thymus [Flores, 2001; Weerkamp, 2005].
Afin d'identifier la ou les population(s) de cellules thymiques exprimant
potentiellement la Dsg1 au niveau protéique, nous avons débuté des analyses de
comarquage par immunofluorescence indirecte sur des coupes de thymus humain avec
notre Acm anti-Dsg1 1N5. Les résultats préliminaires montrent que l'Acm 1N5 reconnaît
une population de cellules localisées principalement dans la médullaire et également
présentes dans les espaces périvasculaires du thymus humain. Les expériences de
comarquage indiquent que les cellules Dsg1-positives ne correspondent pas à des CET, ni
à des cellules dendritiques ou à des macrophages mais à des cellules exprimant les
molécules CD63 et CD19 donc, à une sous-population de lymphocytes B thymiques. Ces
résultats, encore fragiles, nécessitent d'être confirmés par des expériences
complémentaires utilisant d'autres sondes spécifiques des cellules B (un Acm anti-CD20
ou anti-CD21 par exemple) et de la Dsg1 (l'Acm anti-Dsg1 1D8 par exemple) afin contrôler
la spécificité des marquages que nous avons observés. Par ailleurs, une analyse de
comarquage avec des Acm anti-classe I et II du CMH avec un anti-Dsg1 permettrait de
vérifier si ces cellules ont la capacité de présenter des peptides du soi en l’occurrence,
ceux dérivés de la Dsg1. Dans l'affirmative, puisque le nombre de lymphocytes B présente
dans le thymus s'accroît avec son involution, l'expression de la Dsg1 par ces cellules
CD19+CD63+ pourrait en partie expliquer l'augmentation de l'expression thymique des
transcrits DSG1 en fonction de l'âge.
Discussion
- 186 -
Au regard des quelques travaux ayant démontré la restriction de l'expression
thymique d'un autoAg à son variant alternatif, nous avons tenté de déterminer si les
transcrits alternatifs de la Dsg1 sont aussi exprimés dans le thymus. Les résultats
obtenus à l'heure actuelle sur un faible effectif (n=10), comprenant des thymus âgés de 7
jours à 11 ans (moyenne de 2,15 ± 3,5 ans) révèle la présence des ARNm alternatifs DSG1
sur l’ensemble des fragments thymiques analysés (100%). Les analyses se poursuivront
par PCR classique sur l'ensemble des échantillons dont nous disposons (n=32) et par PCR
quantitative sur les 9 échantillons déjà selectionnés pour l'amplification de l'ADNc DSG1
afin d’éxaminer l’expression des messagers alternatifs de la Dsg1 en fonction de l’âge.
Conclusion
- 187 -
CONCLUSION
Bien que les pemphigus soient des maladies complexes, dites multifactorielles, qui
résultent de l'action conjointe de facteurs génétiques et environnementaux, ce travail de
thèse plaide en faveur de l'intervention d'un autoAg clé, la Dsg1, dans les mécanismes
physiopathologiques qui concourent au développement de certaines variétés de
pemphigus. Nos résultats fournissent en effet de solides arguments permettant de
soutenir le concept du rôle de la Dsg1 dans le processus auto-immun à la base de
maladie. En premier lieu, la démonstration d'une réponse lymphocytaire T dirigée contre
un épitope spécifique d'une isoforme soluble de la Dsg1 chez les malades de PF illustre la
possibilité que cet autoAg modifié par épissage alternatif, associé à une prédisposition
génétique liée notamment au locus HLA, puisse intervenir dans la rupture de la tolérance
au niveau du compartiment T et in fine, conduire à l'initiation d’une réponse auto-
immune B dirigée contre la Dsg1 via une extension épitopique intramoléculaire. Dans un
second temps et en accord avec notre modèle expérimental murin, la réponse B anti-Dsg1
pourrait s’étendre à d’autres protéines du desmosome en particulier, les plakines, selon
un mécanisme d’extension épitopique intermoléculaire et refléterait ainsi la diversité de la
réponse auto-immune B observée au cours du PPN. Enfin, puisque les transcrits DSG1
sont physiologiquement exprimés dans le thymus humain, une tolérance immune vis à
vis de la Dsg1 peut en principe s’établir, signifiant que l’absence de l’expression thymique
de cette autoAg ne constitue pas l’origine de la rupture de la tolérance qui concoure au
développement des PS.
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REFERENCES
Références
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ANNEXES
Annexes
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ANNEXES
I. CURSUS UNIVERSITAIRE
DEA de Biologie Cellulaire – Mécanismes régulateurs de la cellule eucaryote, Rouen (2001).
Mention B.
Maîtrise de Biochimie, option Microbiologie industrielle, Rouen (2000).
Licence de Biochimie, option Génétique bactérienne, Rouen (1999). Mention AB.
DEUG Sciences de la Vie, spécialité biochimie et physiologie, Rouen (1998).
Bac STL Biochimie Génie Biologique, lycée Galilée (1996). Mention AB.
II. ENSEIGNEMENTS
Enseignant vacataire en Immunologie à la Faculté des Sciences et Techniques de Rouen (2001-
2002).
Enseignant de la maîtrise d’Immunologie et Mécanismes Physiopathologiques à la Faculté Mixte de
Médecine et Pharmacie de Rouen (2003-2006).
III. PRESENTATIONS ORALES ET CONGRES
Conférences invitées
2° Congresso Nazionale Unificato di Dermatologia e Venereologia – Genoa, Italy (2005)
H. Mouquet, L. Drouot, M. Cerruti, C. Arnoult, F. Bonnet-Bayeux, P. Courville, P. Joly, F. Tron, D.
Gilbert. Immunization of Mice with the Extracellular Domain of Desmoglein 1, the Pemphigus
Foliaceus Autoantigen, Can Induce a B-Cell Tolerance Breakdown to Various Desmosome
Autoantigens.
Communications internationales
ESDR – Congress of the European Society of Dermatological Research – Tubïngen, Germany
(2005)
H. Mouquet, L. Drouot, M. Cerruti, C. Arnoult, F. Bonnet-Bayeux, P. Courville, P. Joly, F. Tron,
D. Gilbert. Immunization of Mice with the Extracellular Domain of Desmoglein 1, the
Pemphigus Foliaceus Autoantigen, Can Induce a B-Cell Tolerance Breakdown to Various
Desmosome Autoantigens.
Communications nationales
CARD – Congrés Annuel de la Recherche Dermatologique – Brest, France (2005)
P. Musette, H. Mouquet, S. Jacquot, D. Gilbert, F. Huetz, J.C. Roujeau, M. D’Incan, M.S.
Doutre, I. Gorin, F. Caux, C. Bedane, S. Oro, F. Tron, P. Joly. Study of the B- and T-
lymphocyte responses in pemphigus patients treated by anti-CD20 immunotherapy
(Rituximab).
CARD – Rouen, France (2003) & JDP – Journées Dermatologiques de Paris – Paris, France (2004)
H. Mouquet, L. Drouot, M. Cerruti, C. Arnoult, F. Bonnet-Bayeux, P. Courville, P. Joly, F. Tron,
D. Gilbert. Immunization of Mice with the Extracellular Domain of Desmoglein 1, the
Annexes
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Pemphigus Foliaceus Autoantigen, Can Induce a B-Cell Tolerance Breakdown to Various
Desmosome Autoantigens.
H. Mouquet, J. Leblond, L. Drouot, J. Leprince, P. Joly, F. Tron, D. Gilbert. Evidence for a
desmoglein 1 truncated isoform and study of its implication in pemphigus foliaceus.
IV. PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES
Articles de recherche
P. Musette, H. Mouquet, S. Jacquot, I. Dutot, D. Gilbert, M.L. Gougeon, J.C. Roujeau, M. D’Incan, C. Bedane, F. Tron, M. Hertl, P. Joly. Effects of anti-CD20 immunotherapy on humoral and cellular immune responses in pemphigus. (En préparation).
*P. Joly, H. Mouquet, J.C. Roujeau, D. Gilbert, M.L. Gougeon, M. D’Incan, C. Bedane, R. Muller, M. Hertl, P. Musette. Dramatic and long-lasting effect of anti-CD20 monoclonal antibody : rituximab on severe types of pemphigus. (En préparation).
**H. Mouquet, S. Berrih-Aknin, P. Joly, F. Tron, D. Gilbert. Transcript of desmoglein 1, the target autoantigen of pemphigus foliaceus, is expressed in human thymus. (En préparation)
**H. Mouquet, S. Farci, P. Joly, L. Drouot, J. Leblond, J. Leprince, M. C. Tonon, P. Loiseau, D. Charron, B. Maillère, F. Tron, D. Gilbert. 2006. A truncated alternative spliced isoform of human desmoglein 1 contains a specific T-cell epitope binding to the pemphigus foliaceus-associated HLA class II DRβ1*0102 molecule. J. Immunol. 177: 6517-6526. **H. Mouquet, L. Drouot, R. Charlionet, C. Arnoult, F. Bonnet-Bayeux, M. Thomas, J. Leprince, P. Joly, F. Tron, D. Gilbert. 2006. Proteomic analysis of the autoantibody response following immunization with a single autoantigen. Proteomics 6:4829-4837.
M. Kallel Sellami, M. Ben Ayed, H. Mouquet, L. Drouot, M. Zitouni, M. Mokni, M. Cerruti, H. Turki, B. Fezza, I. Mokhtar, A. Ben Osman, A. Zahaf, MR. Kamoun, P. Joly, H. Masmoudi, S. Makni, F. Tron , D. Gilbert. 2004. Anti-desmoglein 1 antibodies in healthy subjects : arguments for the role of environnemental factors in the occurrence of Tunisian pemphigus foliaceus. Clin. Exp. Immunol.
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Articles de revue
H. Mouquet, F. Tron. Alternative spliced autoantigens: Implications in autoimmune
diseases. (En préparation)
F. Tron, D. Gilbert, P. Joly, H. Mouquet, L. Drouot, M. Ben Ayed, M. Sellami, H. Masmoudi, S. Makni. 2006. Immunogenetics of pemphigus : An update. Autoimmunity
(Sous presse).
H. Mouquet, P. Joly. 2006. Ce qu’il faut retenir et comprendre des antigènes de la pemphigoïde bulleuse. Dermatologie Pratique
298: 8-10.
*F. Tron, D. Gilbert, H. Mouquet, P. Joly, L. Drouot, S. Makni, H. Masmoudi, D. Charron, M. Zitouni, P. Loiseau, M. Ben Ayed. 2005. Genetic factors in pemphigus. J. Autoimmun.
24:319-28.
*H. Mouquet, D. Gilbert, P. Musette, F.Tron, P. Joly. 2004. Molecular advances in pathogenesis of autoimmune blistering skin diseases. Ann. Dermatol. Venereol. 132:231-
42.
H. Mouquet, D. Gilbert, P. Joly, F. Tron. 2004. Aspects moléculaires des maladies autoimmunes cutanées bulleuses. Immunoanalyses et biologie spécialisée 19:31-
41.
Ouvrage
H. Mouquet, P. Musette. Les maladies bulleuses. In Immunité cutanée acquise. Immunologie cutanée. F. Bérard, J. Thivolet
J.F. Nicolas, eds (John Libbey Eurotext) Paris, 2004. p43-64.
* : ces articles sont présentés ci-dessous. ** : ces articles font l’objet de cette thèse.
1
Dramatic and long-lasting effect of anti-CD20 monoc lonal
antibody : rituximab on severe types of pemphigus.
Pascal JOLY M.D., Ph.D. (1), Hugo MOUQUET Ph.D. (2), Jean-Claude ROUJEAU
M.D. (3), Danièle GILBERT Ph.D. (2), Marie-Lise GOUGEON Ph.D. (4), Michel
D'INCAN M.D., Ph.D. (5), Christiophe BEDANE M.D., Ph.D. (6), Ralf MULLER
Ph.D.(7), Michael HERTL M.D., Ph.D (7), Philippe MUSETTE M.D., Ph.D. (2).
1 Department of Dermatology, Rouen University Hospital, Rouen, France. 2 INSERM U519, Rouen University Hospital, Rouen, France. 3 Department of Dermatology, Henri Mondor University Hospital, Créteil, France. 4 Antiviral Immunity, Biotherapy and vaccine Unit, Department of Molecular Medicine
Pasteur Institute, Paris, France. 5 Department of Dermatology, Clermont-Ferrand University Hospital, Clermont-
Ferrand, France. 6 Department of Dermatology, Limoges University Hospital, Limoges, France. 7 Department of Dermatology and Allergology, Faculty of Medicine Philipp University,
Marbug, Germany.
Financial supports :
- French Society of Dermatology, Paris, France
- Roche, France
Correspondance :
Prof. P.JOLY
Clinique Dermatologique – Hôpital Charles Nicolle
1 rue de Germont
F 76031 ROUEN cedex
France
Phone number : (33) 2 32 88 68 41
Fax number : (33) 2 32 88 88 55
e-mail : [email protected]
2
Pemphigus represents a paradigm of organ-specific autoimmunity (1). This
blistering disease affecting the skin and mucous membranes is mediated by
pathogenic autoantibodies directed against adhesion molecules of the epidermis :
desmoglein1 (Dsg1) and desmoglein3 (Dsg3) that are responsible for the cohesion
between keratinocytes in skin and mucosae, respectively (2-4). The condition is
severe, namely in patients with recalcitrant types of the disease or with relapses that
lead to severe adverse effects of corticosteroid (CS) and immunosuppressive drugs.
Rituximab, a humanized monoclonal antibody directed against the CD20
antigen of B-lymphocytes, has been demonstrated to be effective in various
autoimmune diseases and in occasional cases of life-threatening pemphigus (3). We
report on the first multicentre prospective series of patients with severe types of
pemphigus treated by rituximab, with a two-year follow-up and extensive
immunological evaluation.
The study was approved by the Seine Maritime ethics committee. Patients with
severe pemphigus vulgaris (PV), pemphigus foliaceus (PF) or paraneoplastic
pemphigus (PNP) were included if they either i) failed to respond to a 8-week
treatment with prednisone 1.5 mg/kg/day (group 1), or ii) experienced at least two
relapses despite a minimal prednisone dose of 20 mg/day (group 2), or iii) had
contraindications to CS due to severe associated conditions (group 3). These latter
patients were treated with rituximab alone without CS. Rituximab was administrated
intravenously at a dosage of 375 mg/m2 on days 1,8, 15 and 22. Patients were
evaluated both clinically and biologically every month during the first year of follow-up
and every other month during the second year. Primary endpoint was complete
remission (CR) 3 months after the last infusion of rituximab.
Twenty-two patients (15 males, 7 females ; 14 PV,7 PF, 1 PNP) were included
in the study. Their mean age was 52.8 ± 16.0 years-old. Main patients' clinical data at
baseline are indicated in Table 1. All patients from groups 1 and 2 were previously
treated with various immunosuppressive drugs and/or IV Ig without success. Severe
associated medical conditions or CS side-effects were present at baseline in 2 of 6, 7
of 11 and 5 of 5 patients from groups 1, 2 and 3, respectively.
Nineteen of 22 patients (86 %) experienced CR on day 90, including 5 of 6, 10
of 11 and 4 of 5 patients from group 1, 2 and 3, respectively. Two PV patients in
partial remission (PR) on day 90, had delayed CR on days 180 and 560, respectively.
3
A PF patient with erythroderma was considered as treatment failure. Mean delay to
achieve CR was 68.9 ± 22.8 days.
Seven of the 21 patients (33 %) who achieved CR, relapsed after a mean time
of 403 ± 186 days (1 of 6, 2 of 9 and 4 of 5 from groups 1, 2 and 3, respectively).
Three relapsing PV patients had mild oral erosions, and 3 PF and 1 PV patients had
limited cutaneous lesions involving 1 to 3 % of the body surface area. These relapses
were treated with only topical CS in two patients and by a moderate increase of oral
CS in three others. The last two relapsing patients were treated by a second course
of rituximab because of old age and severe diabetes mellitus, and had again a CR.
After a mean follow-up period of 23 months, 17 patients (77 %) were in CR. Mean
dose of prednisone of patients from group 1 and 2 decreased from 100.0±17.9
mg/day and 29.1±13.0 mg/day at baseline, to 7.8±6.2 mg/day and 5.9±3.8 mg/day at
the end of the study, (p=0.03 and p=0.001, respectively)(non-parametric test of
Wilcoxon). Two patients developed septicaemia, one of whom with a rheumatoid
arthritis concomitantly treated with anti-TNF, died.
Peripheral blood (PB) lymphocyte subpopulations and T-lymphocyte cytokine
production were evaluated by flow cytometry analysis using a large panel of
monoclonal antibodies : B-cells decreased dramatically from baseline : median
275.106/L (range 29-752.106/L) to day 21 : 0.106/L (range 0-1.106/L) and remained
undetectable until day 180 in all but 2 patients, one of whom relapsed on day 120.
Reappearance of B-cells began between day 180 and day 270. 90 % of them
expressed a CD19 + CD27 – naïve phenotype. Interestingly, 29 % had a CD19 +
CD30high CD24high transitional phenotype suggestive of B-cells migrating from the
bone marrow to the periphery. No major change in T-cell, NK-cell, nor T-cell cytokine
production were detected after rituximab treatment.
Using the immunoscope method (6), we followed the evolution of the repertoire
of IgG, IgA and IgM in blood B-lymphocytes of one patient. Before treatment, a weak
expanded peak was observed in the VH3b family of the variable portion of the heavy
chains, suggesting a specific immune response. Six months later, reappearing blood
B-cells had a normal Gaussian profile of the 3 VH families, similar to that found in
cord blood naïve B-cells, whereas the initially expanded B-cell population was no
more detectable.
4
Next, we evaluated patients autoantibody response using recombinant Dsg1
and Dsg3 ELISA tests (MBL, Nagano, Japan). A dramatic decrease of anti-Dsg1 and
anti-Dsg3 antibodies was observed after rituximab treatment, in the 6 PF and in 9 of
12 PV patients who experienced CR (Fig 1), whereas persistent high titres were
observed in the one PF patient with treatment failure and in the two PV patients in
PR. During the evolution, high titres of anti-Dsg1 and anti-Dsg3 antibodies were
observed in the four and three patients with cutaneous and mucosal relapse,
respectively. Surprisingly, 5 PV patients had persistent high titres or a re-increase of
anti-Dsg3 antibodies while still being in CR (Fig1C). To disentangle this discrepancy,
we tested these sera by an ELISA technique using recombinant proteins of the EC1-2-
3-4-5 domains of Dsg3 (7). Interestingly, antibodies reacting with epitopes of the EC1-2
domains which are considered as the main pathogenic antibodies, decreased
dramatically after rituximab treatment and remained undetectable until day 540
(Fig1D-E)). Plasma antibodies against recall antigens (pneumococcal capsule
polysaccharide and tetanus toxin) were not significantly altered on days 0, 21 and 90
(p=0.25;p=0.80 and p=0.16;p=0.9)respectively. Taken together, these findings
suggest some specificity of the effect of rituximab on autoantibody production.
Findings of this study show that rituximab is a very effective treatment of severe
types of pemphigus. Overall, it permitted both a major and prolonged clinical
improvement and a substantial decrease of CS doses. Despite the possibility of
severe side-effects, it may be considered as a first line treatment in patients with
severe contraindication to oral CS and in those with recalcitrant types of pemphigus.
The reappearance of naïve B-cells with a normal Gaussian repertoire suggests
the possibility of definitive healing of the disease in some patients.
5
Legend to Figure
Evolution of anti-desmoglein 1 and anti-desmoglein 3 IgG antibodies in
pemphigus patients treated with rituximab.
Anti-desmoglein1 antibody titres in PF, PV and PNP patients with persistent
complete remission (Panel A) or cutaneous relapses during the evolution (arrows)
(Panel B) ; anti-desmoglein 3 antibody titres in PV and PNP patients with persistent
CR (Panel C) or with mucosal relapses (arrows) (Panel D) ; anbibodies directed
against the recombinant proteins of the EC 1-2-3-4-5 domains of Dsg3 in a PV patient in
CR with persistent high titres of antibodies directed against the whole extracellular
domain of Dsg3 (�) (Panel E).
6
Patients
Group 1
(n = 6)
Group 2
(n = 11)
Group 3
(n = 5)
Sex M/F
3/3
7/4
5/0
Age �
52.8 ± 20.6
47.5 ± 13.1
64.6 ± 19.7
Type of pemphigus ��
PV
PF
PNP
4
1
1
7
4
-
3
2
-
Duration (months) of :
Mucosal lesions�
Cutaneous lesions�
21.8 ± 30.5
45.6 ± 66.0
81.0 ± 82.7
71.0 ± 75.0
12.5 ± 7.8
8.0 ± 6.9
Associated medical
conditions
- diabetes mellitus (n = 1)
- asthma (n = 1)
- myasthenia (n = 1)
- diabetes mellitus (n = 3)
- arterial hypertension (n = 3)
- hyperlipidemia (n = 3)
- rheumatoid arthritis (n=1) - myopathy (n = 1)
- depression (n = 2)
- bone fracture (n = 1)
- diabetes mellitus (n = 2)
- arterial hypertension (n = 2)
- hyperlipidemia (n = 2)
- blindness (n = 1)
- bacterial meningitis (n = 1)
- bone tuberculosis (n = 1)
- gram negative pneumonia (n= 1)
- osteonecrosis of the hip (n =1)
- cardiac insufficiency (n = 1)
Previous treatment failure
- IV Ig (n = 2)
- aziathioprine (n = 3)
- methotrexate (n = 2)
- IV Ig (n = 1)
- azathioprine (n = 3)
- methotrexate (n = 3)
- mycophenolate mofetil (n = 4)
- cyclosporine (n = 1)
Mean body surface area
involved
40 %
17 %
16 %
Mean prednisone dose
at time of rituximab
infusion (mg/day) �
100.0 ± 17.9
29.1 ± 13.0
0
� mean ± SD
�� PV : pemphigus vulgaris, PF : pemphigus foliaceus, PNP : paraneoplastic pemphigus.
7
Références :
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mediated diseases. J Clin Invest. 1989;83:1443-8.
2- Stanley JR. Cell adhesion molecules as targets of autoantibodies in pemphigus and
pemphigoid, bullous diseases due to defective epidermal cell adhesion. Adv Immunol
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the clinical and microscopic localization of lesions in pemphigus foliaceus and vulgaris. J Clin
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reactivity against non-conformational NH-terminal epitopes of the desmoglein 3 ectodomain
relates to clinical activity and phenotype of pemphigus vulgaris. Exp Dermatol 2006;15:606-14.
8
E
0 250 500 7500
50
100
150
200
250
Days
Ant
i-Dsg
1 A
b tit
er (
U/m
l)
0 250 500 7500
50
100
150
200
250
DaysA
nti-D
sg1
Ab
titer
(U
/ml)
0 250 500 7500
50
100
150
200
250
Days
Ant
i-Dsg
3 A
b tit
er (
U/m
l)
0 250 500 7500
50
100
150
200
250
300
350
Days
Ant
i-Dsg
3 A
b tit
er (
U/m
l)
A B
C D
0 100 200 300 400 500 6000.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Dsg3-EC
Dsg3-EC1
Dsg3-EC2
Dsg3-EC3
Dsg3-EC4
Dsg3-EC5
Days
Opt
ical
den
sity
(405
nm
)
231
Ann Dermatol Venereol2005;132:231-42Articles scientifiques
Revue générale
Avancées moléculaires dans la physiopathologie des maladies bulleuses autoimmunesH. MOUQUET (1), D. GILBERT (1), P. MUSETTE (1, 2), F. TRON (1), P. JOLY (1, 2)
Résumé
Les maladies bulleuses autoimmunes sont caractérisées par la
production d’autoanticorps dirigés contre les structures d’adhésion de la
peau. Ces maladies autoimmunes spécifiques d’organe se différencient
en deux groupes, les pemphigus dans lesquels les autoanticorps
reconnaissent des protéines du complexe desmosomal, et les maladies
autoimmunes sous-épidermiques, caractérisées par une réactivité des
autoanticorps contre des protéines de la jonction dermoépidermique. La
fixation des autoanticorps à leurs cibles provoque une altération des
molécules d’adhésion interkératinocytaire au cours des pemphigus ou de
la jonction dermoépidermique dans les maladies sous-épidermiques,
aboutissant à la formation de bulles intra ou sous épidermiques. Les
efforts de recherche réalisés depuis une vingtaine d’années ont permis,
l’identification des autoantigènes cibles et la caractérisation de leurs
fonctions adhésives, une meilleure compréhension des mécanismes
physiopathologiques et le développement de nouveaux outils
diagnostiques.
Summary
Autoimmune blistering skin diseases are characterized by the production
of autoantibodies directed against adhesive structures of the skin. These
organ specific autoimmune diseases included pemphigus in which
autoantibodies target proteins of the desmosomal complex, and
subepidermal autoimmune diseases characterized by autoantibodies
directed against structural proteins of the dermoepidermal junction.
Binding of autoantibodies to their targets induces a loss of adhesion
between keratinocytes in pemphigus and alterations of the
dermoepidermal junction in subepidermal autoimmune diseases.
Progresses during the last twenty years had allowed the identification of
target autoantigens and the characterization of their adhesive functions,
a better understanding of the pathogenesis of these diseases and the
development of new diagnostic tools.
es maladies bulleuses autoimmunes sont liées à la
production d’autoanticorps dirigés contre des protéi-
nes de structure de la peau. Ces autoanticorps sont res-
ponsables de la formation de bulles cutanées ou muqueuses
qui altèrent l’épiderme et son rôle de barrière physique vis-à-
vis de l’environnement. Ces maladies autoimmunes sont
classées sur des critères cliniques, histologiques et immuno-
logiques. Elles se divisent en 2 grands groupes, les pemphi-
gus et les maladies de la jonction dermoépidermique (JDE)
comprenant : la pemphigoïde bulleuse (PB) qui est la plus fré-
quente des maladies bulleuses autoimmunes, la dermatose
bulleuse à IgA linéaire (DBAL), la pemphigoïde cicatricielle
(PC), l’épidermolyse bulleuse acquise (EBA) et la dermatite
herpétiforme (DH). Les pemphigus et la PB représentent un
véritable paradigme de maladies autoimmunes spécifiques
d’organe médiées par les autoanticorps. Depuis une vingtaine
d’années, ces maladies ont fait l’objet d’un important effort de
recherche : les autoantigènes cibles ont été identifiés, leur
rôle dans l’adhésion des kératinocytes a été établi, les proprié-
tés des autoanticorps ont été précisées et de nouveaux tests
diagnostiques sont actuellement proposés.
Les autoantigènes cibles
Au cours des maladies autoimmunes cutanées bulleuses, les
autoanticorps sont dirigés contre des constituants protéiques
(tableau I) qui appartiennent soit aux desmosomes qui assu-
rent la jonction entre les kératinocytes (fig. 1), soit aux structu-
res responsables de l’adhésion de l’épiderme au derme. Ces
structures, constituant la JDE, sont, d’une part, le complexe
hémidesmosome/filaments d’ancrage qui fixe les kératinocy-
tes de la couche basale de l’épiderme à la membrane basale et,
d’autre part, les fibrilles d’ancrage qui amarrent la membrane
basale au derme (fig. 2). La localisation des autoantigènes re-
connus par ces autoanticorps a été précisée par des techniques
d’immunofluorescence et d’immunomicroscopie électroni-
Molecular advances in pathogenesis of autoimmune blistering skindiseases.H. MOUQUET, D. GILBERT, P. MUSETTE, F. TRON, P. JOLYAnn Dermatol Venereol 2005;132:231-42
The full text of this article is available in English, free of charge, on theWeb on: www.e2med.com/ad
(1) INSERM U519, Institut Fédératif de Recherche Multidisciplinaire sur les Peptides (IFRMP23), Faculté de Médecine et de Pharmacie, Rouen.(2) Clinique Dermatologique, CHU Charles Nicolle, Rouen.
Tirés à part : H. MOUQUET, INSERM U519, Faculté de Médecine et Pharmacie,
22, boulevard Gambetta, 76183 Rouen Cedex.
E-mail : [email protected]
L
232
H. MOUQUET, D. GILBERT, P. MUSETTE et al. Ann Dermatol Venereol2005;132:231-42
que. Les techniques d’immunoprécipitation et d’immunoem-
preinte ont permis de déterminer leur poids moléculaire
(fig. 3). Les techniques de biologie moléculaire notamment le
criblage de banques d’expression d’ADNc de kératinocytes à
l’aide de sérum de malades ont permis le clonage des gènes co-
dant pour ces autoantigènes, et la production des autoantigè-
nes sous forme recombinante. Ces protéines recombinantes
ont permis d’établir la cartographie des épitopes reconnus par
les lymphocytes T et B autoréactifs et sont actuellement utili-
sées dans les techniques de diagnostic par ELISA.
LES DESMOGLÉINES
Les desmogléines (Dsg) comme les desmocollines (Dsc) sont
des glycoprotéines transmembranaires, calcium-dépendan-
tes, qui appartiennent à la famille des cadhérines desmoso-
males. Il existe 4 isoformes de Dsg (Dsg1 à Dsg4) qui sont
composées d’une région extracellulaire organisée en 5 domai-
nes (EC1 à EC5), d’un segment transmembranaire et d’une ré-
gion intracytoplasmique (fig. 4). Ces protéines adhèrent
entre-elles dans l’espace interkératinocytaire ou desmoglie
par des interactions homotypiques (interactions entre protéi-
nes homologues) de leurs domaines extracellulaires (EC1 et
EC2). Elles sont liées aux filaments intermédiaires de cytoké-
ratine via les protéines de la plaque desmosomale (plakoglo-
bine et desmoplakine) [1]. L’expression de la Dsg2 et
vraisemblablement de la Dsg4 (nouvelle isoforme récem-
ment décrite) est ubiquitaire ; celle de la Dsg1 et la Dsg3 est
limitée à l’épiderme et aux muqueuses. La Dsg1 est exprimée
selon un gradient croissant des couches profondes vers les
couches les plus superficielles de l’épiderme alors que la Dsg3
et la Dsg4 présentent une expression restreinte aux kératino-
cytes des couches basales de l’épiderme [2, 3].
La Dsg1 (160 kDa) est l’autoantigène majeur des pemphi-
gus superficiels et la Dsg3 (130 kDa) l’autoantigène du pem-
phigus vulgaire. Cependant, cette dichotomie de la réponse
autoimmune au cours des pemphigus n’est pas aussi tran-
Tableau I. – Autoantigènes majeurs des maladies bulleuses autoimmunes.
Maladies bulleuses Autoantigène (poids moléculaire)
Pemphigus :
Pemphigus superficiel Desmogléine 1 (160 kDa)Pemphigus vulgaire Desmogléine 3 (130 kDa)
Desmogléine 1Pemphigus herpétiforme Desmogléine 1
Desmogléine 3 (occasionnellement)Pemphigus à IgA Desmocolline 1 (105-115 kDa)
Desmogléine 1Desmogléine 3 (occasionnellement)
Pemphigus paranéoplasique Complexe paranéoplasique :HD1-Plectine (500 kDa)Desmoplakine I (250 kDa)BPAG1 (230 kDa)Desmoplakine II (210 kDa)Envoplakine (210 kDa)Périplakine (190 kDa)Inconnu (170 kDa)Desmogléine 1Desmogléine 3
Dermatoses de la jonction dermoépidermique :
Pemphigoïde bulleuse BPAG1 (230 kDa)BPAG2 (180 kDa)
Pemphigoïde gestationis BPAG2Pemphigoïde cicatricielle BPAG2
BPAG1Laminine 5 et 6Collagène VII (chaîne a 1 de 290 kDa)Sous unité ß4 (200 kDa) intégrine a 6ß4
Dermatose à IgA linéaire BPAG2 et ses fragments protéolytiques LABD-1 (120 kDa) et LABD97 (97 kDa)
Epidermolyse bulleuse acquise Collagène VIIDermatite herpétiforme Transglutaminase épidermique (TGase 3)
233
Ann Dermatol Venereol2005;132:231-42Physiopathologie des maladies bulleuses autoimmunes
Dsg
Dsc
ENV
PPL
DPK
PG
Plaquedesmosomale
PL
Membraneskératinocytaires
Desmoglie
FIC
Fig. 1. Organisation moléculaire du desmosome. Le desmosome assure l’adhésion cellulaire entre deux kératinocytes adjacents. Il est constitué, d’une part, de glycoprotéines transmembranaires appartenant à la famille des cadhérines desmosomales (les desmogléines (Dsg) et les desmocollines (Dsc)) qui forment la desmoglie et, d’autre part, de protéines cytosoliques, les plakines (les desmoplakines (DP), la plectine (PL), l’envoplakine (ENV) et la périplakine (PPL)) et la plakoglobine (PG) qui forment la plaque desmosomale. Les cadhérines desmosomales interagissent : (i) entre-elles par leur extrémité N-terminale, (ii) avec la PG et les DP par leur domaine cytosolique. Les filaments intermédiaires de cytokératine (FIC) sont fixés à la plaque desmosomale via des interactions avec les DP et la PL.
Fig. 2. Organisation moléculaire de la jonction dermoépidermique. La jonction dermoépidermique constitue une zone d’adhésion entre l’épiderme et le derme. Cette adhésion est assurée par la triade ; hémidesmosomes, filaments d’ancrage et fibrilles d’ancrage. Les complexes hémidesmosomes/filaments d’ancrage permettent l’ancrage des kératinocytes basaux à la membrane basale composée de 2 lames ; la lamina lucida et la lamina densa. Les protéines intracellulaires BPAG1 et plectine (PL), sont localisées dans la plaque hémidesmosomale interne et interviennent dans la fixation du cytosquelette (filaments intermédiaires de cytokératine (FIC)) aux hémidesmosomes. La PL et BPAG1 interagissent avec l’intégrine α 6ß4 et avec la protéine BPAG2. Ces protéines transmembranaires ancrent les cellules basales au niveau de la plaque hémidesmosomale externe sur la membrane basale via leurs interactions avec la laminine 5, principale composante des filaments d’ancrage. Cette dernière interagit dans la lamina densa avec le collagène de type VII, constituant majeur des fibrilles d’ancrage, qui se projette dans une région dénommée sublamina densa, permettant ainsi la fixation de la membrane basale au derme sous-jacent. L’incubation de peau humaine avec une solution de NaCl 1 M provoque la séparation de l’épiderme du derme au niveau de la lamina lucida. FC : fibrilles de collagène.
arbme
Men elasab
nitaréK
oyc
etlasab
Lamina lucida NaCl1 M
Lamina densa
FIC
PL
BPAG2Laminine 5
Collagène VII
emredipE
emre
D
Intégrine α6β4
BPAG1
Hémidesmosome
FC
Sublamina densa
234
H. MOUQUET, D. GILBERT, P. MUSETTE et al. Ann Dermatol Venereol2005;132:231-42
chée. En effet, des autoanticorps anti-Dsg1 et anti-Dsg3 peu-
vent être détectés chez les malades atteints d’autres formes
de pemphigus [4].
LES PLAKINES
Les plakines ou protéines de la plaque desmosomale, l’HD1-
plectine, les desmoplakines 1 et 2, l’envoplakine et la péripla-
kine sont reconnues par les autoanticorps produits par les
malades atteints de pemphigus paranéoplasique. Toutefois,
des études récentes suggèrent que l’envoplakine et la péripla-
kine sont aussi la cible des autoanticorps dans les pemphigus
vulgaire et superficiel [5, 6].
Les plakines constituent une famille de protéines de structu-
re commune organisée en 3 domaines : un domaine N-termi-
nal globulaire permettant leur association à la plaque
desmosomale, un domaine central hélicoïdal assurant l’homo-
dimérisation des plakines et un domaine C-terminal globulai-
re qui participe à l’ancrage des filaments intermédiaires de
cytokératine aux desmosomes (fig. 5). Elles contribuent par
cette fonction d’ancrage, à l’intégrité structurale des kératino-
cytes. Les desmoplakines sont les plus abondants des compo-
sants desmosomaux. Les deux isoformes DPK1 (250 kDa) et
DPK2 (210 kDa) synthétisées par épissage alternatif, se lient
par leur domaine N-terminal à la région cytoplasmique des
cadhérines desmosomales directement ou par l’intermédiaire
de la plakoglobine. La plectine d’environ 500 kDa, coopère
avec les desmoplakines dans leur fonction de couplage des fi-
laments intermédiaires aux desmosomes. Cette phosphopro-
téine intracellulaire d’expression ubiquitaire, est aussi
présente dans la plaque interne des hémidesmosomes. L’envo-
plakine de 210 kDa et la périplakine de 190 kDa sont des cons-
tituants de l’enveloppe cornée de l’épiderme pouvant former
des homodimères ou des hétérodimères. Le rôle d’ancrage de
ces protéines est similaire à celui des autres plakines [7, 8].
BPAG1 ET BPAG2, LES ANTIGÈNES DE LA PEMPHIGOÏDE BULLEUSE
Les autoanticorps présents chez les malades atteints de PB
sont dirigés contre 2 protéines hémidesmosomales, BPAG1
et BPAG2. Les antigènes BPAG1 et BPAG2 sont aussi recon-
nus par les autoanticorps produits au cours d’autres maladies
bulleuses autoimmunes (tableau I).
La protéine BPAG1 (BP230) de 230 kDa, synthétisée par
les kératinocytes de la couche basale épidermique, appartient
à la famille des plakines décrite ci-dessus (fig. 5). Elle est lo-
calisée dans la plaque hémidesmosomale interne où elle con-
tribue à l’organisation du cytosquelette par la fonction de son
extrémité C-terminale qui assure l’ancrage des filaments in-
termédiaires de cytokératine à la plaque hémidesmosomale.
Une région N-terminale de BPAG1 interagit avec les domai-
nes intracytoplasmiques de l’intégrine α6ß4 et de BPAG2.
BPAG2 (BP180 ou collagène de type XVII) est une glyco-
protéine transmembranaire de type II de 180 kDa constituée
d’un domaine C-terminal extracellulaire de collagène, d’une
portion transmembranaire et d’un domaine N-terminal in-
tracellulaire (fig. 6). Sur le plan conformationnel, BPAG2
230 kDa
210 kDa
250 kDa
130 kDa
160 kDa
180 kDa
190 kDa
1 2 3 4 5
Fig. 3. Immunoempreintes sur extrait protéique d’épiderme humain permettant la caractérisation des autoantigènes par leur poids moléculaire. En immunoempreintesur un extrait d’épiderme humain, les sérums de malades atteints de pemphigus superficiel (1) et de pemphigus vulgaire (2) reconnaissent respectivement la desmogléine 1 (Dsg1) de 160 kDa et la desmogléine 3 (Dsg3) de 130 kDa. Les sérumsde pemphigus paranéoplasique réagissent le plus fréquemment avec un doublet protéique de : (i) 190-210 kDa correspondant à la périplakine (PPL) et à l’envoplakine (ENV) (3), (ii) 250-210 kDa correspondant aux desmoplakines I et II (DPK1 et DPK2) (4). Dans la pemphigoïde bulleuse, la réactivité anticorps présentedans le sérum des malades (5) est dirigée contre les 2 antigènes de la pemphigoïdebulleuse, BPAG1 (230 kDa) et BPAG2 (180 kDa).
Domaines extracellulaires Domaines intracellulaires
Dsg 1 S P EC1 EC2 EC3 EC4 AE TM AI SCI DL DUR DT
N C
N
Dsg 2 C
N
Dsg 3 C
N
Dsg 4 C
N
Dsc
b
aC
N
Cadhérine classiqueC
Fig. 4. Structure des cadhérines desmosomales. Les cadhérines sont des glycopro-téines transmembranaires synthétisées sous forme de précurseur inactif, possé-dant un peptide signal (S) et une proséquence (P) qui est clivée au cours de leur maturation. Les cadhérines sont composées de 4 domaines extracellulaires (EC), d’un domaine ancrage extracellulaire (AE), d’une région transmembranaire (TM), d’un domaine d’ancrage intracellulaire (AI) et d’un domaine très conservé dans la région cytosolique (SCI ; segment cadhérine intracellulaire). La région intracellulai-re des Dsg contient en plus, un domaine de liaison riche en prolines (DL), un do-maine d’unités répétées (DUR) de 29 ± 1 résidus, caractéristiques de ces protéines ainsi qu’un domaine C-terminal (DT). Chaque isotype de Dsc possèdent un domai-ne C-terminal spécifique a ou b, dérivé d’un épissage alternatif.
235
Ann Dermatol Venereol2005;132:231-42Physiopathologie des maladies bulleuses autoimmunes
possède une tête globulaire, une tige centrale proche de la
membrane correspondant à une séquence de 73 aminoacides
nommée NC16A et au domaine de collagène le plus large
(Coll. 15), et une queue flexible renfermant le reste des do-
maines de collagène (Coll. 1 à 14) interrompus par des sé-
quences non collagéniques. La région de BPAG2, proche de
la membrane du kératinocyte, interagit avec l’intégrine α6ß4
alors que l’extrémité C-terminale de la protéine traverse la la-
mina densa de la membrane basale et interagit avec la lami-
nine 5 [9, 10]. Des interactions supplémentaires entre
BPAG2 et les protéines de la plaque hémidesmosomale
(plectine et BPAG1) pourraient stabiliser davantage la JDE.
BPAG2 s’observe sous 2 formes : une forme complète trans-
membranaire et une forme soluble de 120 kDa appelée
LABD-1 (linear IgA bullous dermatosis antigen) ou
« ladinine » correspondant au domaine extracellulaire, clivé
par protéolyse de la surface cellulaire et intégré à la membra-
ne basale (fig. 6). Ce clivage de BPAG2 résulte de l’activité
enzymatique de métalloprotéases membranaires apparte-
nant à la famille des ADAM (A Disintegrin And Metallopro-
teinase). Un second fragment du domaine extracellulaire
d’un poids moléculaire 97 kDa (LABD97) peut être extrait de
l’épiderme et semble résulter d’une dégradation de l’antigè-
ne LABD-1 (fig. 6) [11].
L’INTÉGRINE α6ß4, LES LAMININES 5/6 ET LE COLLAGÈNE VII
A côté de la réactivité dirigée contre les antigènes de la PB, les
sérums des malades atteints de PC reconnaissent d’autres pro-
téines de la JDE comme l’intégrine α6ß4, les laminines 5/6 et
le collagène VII, autoantigène de l’épidermolyse bulleuse ac-
quise (EBA).
L’intégrine α6ß4 est un récepteur transmembranaire ex-
primé par les kératinocytes des assises basales de l’épiderme.
Cette glycoprotéine hémidesmosomale est un hétérodimère
composé des sous-unités α6 (120 kDa) et ß4 (200 kDa)
(fig. 7). Elle est connectée au réseau de filaments intermé-
diaires de cytokératine assurant ainsi la liaison entre ces fila-
ments et la matrice extracellulaire de la membrane basale.
L’intégrine α6ß4 interagit à la fois avec la plectine et la pro-
téine BPAG2. Dans la lamina lucida, elle est associée par sa
région extracellulaire à la laminine 5 qui joue le rôle de ligand
de cette intégrine.
Les laminines représentent une famille de glycoprotéines
assemblées en hétérotrimère de 3 chaînes polypeptidiques
reliées par des ponts disulfures, les sous-unités α, ß et γ(fig. 7). La laminine 5 (600 kDa) est constituée des sous-uni-
DPK1
Domaine globulaireN-terminal
Domainehélicoïdal
Dom aireaine globulC-terminal
CN B CA
DPK2
N CBA C
ENVCN C
PPLN C
PLN B BBBB C C
BPAG1N B C C
Fig. 5. Structure des plakines. Quatre plakines sont présentes au niveau de la plaquedesmosomale ; les desmoplakines (DP), l’envoplakine (ENV), la périplakine (PPL) et la plectine (PL). Cette dernière est aussi localisée au niveau de la plaque hémidesmosomale comme une autre plakine, l’antigène majeur de la pemphigoïdebulleuse (BPAG1). Les plakines partagent une structure commune faite de deux domaines globulaires N- et C- terminaux séparés par un domaine central hélicoïdal(rod domain). Le domaine N-terminal est constitué d’hélices a antiparallèles. Le domaine C-terminal est composé d’un nombre variable de domaines conservés ausein de la famille (A, B ou C) qui sont absents de la structure des PPL. Le domainecentral permet une homodimérisation par la formation d’une double hélice a.
BPAG2
1
Région intracellulaire Région extracellulaire
Coll. (14 – 1) 1497
Coll. 15 C
490NC16A
562
N
14??524LABD-1
12??531LABD97
Fig. 6. Stuctures de la protéine BPAG2 et de ses fragments protéolytiques (LABD-1 et LABD97). La protéine hémidesmosomale BPAG2 est une glycoprotéine transmembranaire de type II de 180 kD. Elle est constituée d’un domaine intracellulaire caractérisée par une structure globulaire à son extrémité N-terminale, d’une portion transmembranaire et d’un domaine C-terminal extracellulaire dont la conformation est arrangée en 15 domaines de type collagène (Coll. 1 à Coll. 15) interrompue par des séquences non collagéniques. Le domaine extracellulaire contient une séquence de 73 aminoacides, NC16A, localisée entre la région transmembranaire et le domaine Coll. 15 de BPAG2. Les protéines LABD-1 (120 kDa) et LABD97 (97 kDa) sont issues de la protéolyse de la région extracellulaire de BPAG2. Les extrémités C-terminales de ces fragments ne sont pas encore définies.
236
H. MOUQUET, D. GILBERT, P. MUSETTE et al. Ann Dermatol Venereol2005;132:231-42
tés α3 (200 kDa), ß3 (155 kDa) et γ2 (140 kDa) et est exprimée
spécifiquement au niveau de la JDE de la peau humaine
comme la laminine 6. La laminine 5 située à la jonction lami-na lucida — lamina densa, est synthétisée par les kératinocy-
tes et les fibroblastes dermiques. Elle constitue la
composante majeure des filaments d’ancrage qui assure la
fixation des hémidesmosomes à la membrane basale. Elle
peut s’associer par des liaisons covalentes à la laminine 6
(α3ß1γ1), avec laquelle elle possède des similarités structura-
les et immunologiques dont la sous-unité α3 commune à ces
2 isoformes. Ce complexe laminine 5/6 ancre les kératinocy-
tes basaux à la membrane basale en connectant les protéines
hémidesmosomales, intégrine α6ß4 et BPAG2, à certains
composants de la lamina densa tels que les collagènes de type
IV et VII.
Le collagène de type VII, protéine fibrillaire de 1 000 kDa
synthétisée par les kératinocytes et les fibroblastes dermiques,
constitue le composant majeur des fibrilles d’ancrage. Cette
protéine est un homotrimère composé de 3 chaînes hélicoïda-
les α1 (VII) identiques (d’environ 300 kDa chacune), torsadées
en une superhélice. Chaque chaîne est constituée d’un domai-
ne collagénique central flanqué d’un domaine globulaire N-
terminal de 145 kDa (NC1) et d’un domaine globulaire C-ter-
minal de 30 kDa (NC2) (fig. 7). Après sécrétion, les molécules
de collagène VII forment des dimères anti-parallèles (le do-
maine NC2 étant protéolysé) par l’intermédiaire de ponts di-
sulfures. Ces dimères s’agrégent ensuite latéralement pour
former les fibrilles d’ancrage associées en un réseau qui per-
met le pontage de la membrane basale (lamina densa) au der-
me sous-jacent. D’autres fibrilles de collagène VII renforcent
cet amarrage par leur interaction avec des fibres interstitielles
de collagène I et III présentes dans le derme [10].
Autoanticorps et physiopathologie des maladies bulleuses autoimmunes
Plusieurs arguments démontrent le rôle pathogène des auto-
anticorps dans ces maladies en particulier au cours du pem-
phigus : le parallélisme entre le taux d’anticorps circulants et
l’activité de la maladie ; la survenue de cas néonataux transi-
toires induits par le transfert transplacentaire des autoanti-
corps de la mère atteinte à l’enfant ; et la démonstration de la
pathogénicité des autoanticorps isolés des malades dans des
modèles in vitro et in vivo.
LES PEMPHIGUS
Les pemphigus touchent la peau et les muqueuses. Ils sont
caractérisés par la production d’anticorps pathogènes dirigés
contre des protéines du desmosome. La fixation de ces auto-
anticorps aux antigènes desmosomaux est responsable d’une
perte d’adhésion interkératinocytaire appelée acantholyse et
induit la formation de bulles intra-épidermiques. On distin-
gue trois entités immuno-anatomo-cliniques : le pemphigus
vulgaire (PV), le pemphigus superficiel (PS) et le pemphigus
paranéoplasique (PPN).
Réactivité autoanticorps
Au cours des pemphigus, l’examen en immunofluorescence
directe (IFD) d’une biopsie de peau périlésionnelle révèle des
dépôts d’immunoglobulines à la surface des kératinocytes
(anciennement appelée substance intercellulaire) donnant
l’aspect d’une fluorescence « en résille ». La présence d’un
marquage de la membrane basale oriente le diagnostic vers
un PPN mais a occasionnellement été décrit dans certaines
formes de PS (pemphigus de Senear Usher). Des dépôts in-
tercellulaires de C3 sont mis en évidence dans 50 p. 100 des
cas. Des dépôts intercellulaires d’IgA sont en principe carac-
téristiques du pemphigus à IgA. Des anticorps circulants sont
détectés chez les malades, par immunofluorescence indirecte
(IFI) sur coupe de peau humaine ou d’œsophage de singe et
par immunoempreinte sur extrait protéique d’épiderme ou
de kératinocytes humains (fig. 3). Les anticorps circulants et
les anticorps déposés sont essentiellement d’isotype IgG, en
particulier de sous-classe IgG1 et IgG4. Les 3 grands types de
pemphigus se distinguent en principe par la spécificité des
autoanticorps bien qu’un chevauchement des réponses auto-
anticorps ait été décrit entre les différentes formes. Au cours
des pemphigus superficiels, les autoanticorps sont dirigés
contre la Dsg1. Dans le PV avec atteinte muqueuse exclusive,
les autoanticorps sont dirigés contre la Dsg3 alors que les 2 ty-
pes d’autoanticorps (anticorps anti-Dsg1 et anti-Dsg3) sont re-
trouvés dans le sérum des patients atteints de PV avec atteinte
cutanée et muqueuse. De plus, une réactivité anti-Dsg4 a été
récemment observée chez quelques patients atteints de PV
[3]. Enfin, au cours du PPN, les autoanticorps reconnaissent
un complexe de protéines qui est principalement composé
des protéines de la famille des plakines (DPK1-2, périplakine,
envoplakine, BPAG1 et plectine), et de la famille des cadhéri-
nes (Dsg3 et Dsg1) [4].
Les autoanticorps anti-Dsg présents dans le sérum des ma-
lades reconnaissent des épitopes conformationnels, calcium-
dépendants, localisés principalement sur le domaine extra-
cellulaire de ces protéines [12, 13]. Bien que la réactivité anti-
Dsg soit indépendante de la glycosylation des épitopes, une
étude a récemment montré la possibilité d’inhiber la fixation
et l’action pathogène des anticorps anti-Dsg1 par l’utilisation
d’agglutinine de plante (lectine) ou de certaines glycosydases
[14]. L’étude de la cartographie épitopique de ces autoantigè-
nes montre que la majorité des autoanticorps des malades
(69,8 p. 100 des sérums de PS et 77,5 p. 100 des sérums de
PV) reconnaissent l’extrémité N-terminale, notamment le
domaine EC1 et une partie d’EC2 (position 1-161), précisé-
ment les épitopes formés des aminoacides 26-87 de la Dsg1
et 25-88 de la Dsg3 [15]. Cette réactivité pourrait résulter d’un
mécanisme de diversification progressive de la réponse au-
toimmune désignée sous le terme d’ « extension épitopique
intramoléculaire ». Ainsi, il a récemment été montré par
l’équipe de Diaz que les anticorps de patients atteints de
pemphigus endémique superficiel (fogo selvagem), réagissent
contre le domaine EC5 de la Dsg1 durant les phases de laten-
ce et/ou de rémission de la maladie, et contre le domaine
EC2 pendant la phase active [16].
237
Ann Dermatol Venereol2005;132:231-42Physiopathologie des maladies bulleuses autoimmunes
L’immunoempreinte a été longtemps utilisée pour détec-
ter les anticorps anti-Dsg. Sa sensibilité est limitée du fait de
la dénaturation des antigènes. Des tests ELISA utilisant les
Dsg1 et Dsg3 recombinantes ont donc été développés. Ils ont
une sensibilité et une spécificité de l’ordre de 95 p. 100
[17, 18], et permettent de suivre l’évolution de la maladie [19].
Les tests ELISA actuellement commercialisés (MBL, Medical
& Biological Laboratories) constituent un outil rapide de dé-
tection et de dosage des anticorps anti-Dsg.
Pathogénicité et modes d’action des autoanticorps
La pathogénicité des anticorps anti-Dsg retrouvés dans les 3 ty-
pes de pemphigus a été clairement établie dans des études réa-
lisées in vitro utilisant des cultures de peau humaine totale ou
de kératinocytes, et in vivo par transfert passif chez des souri-
ceaux nouveaux-nés d’IgG purifiées à partir de sérums de ma-
lades ou d’anticorps monoclonaux anti-Dsg [20-22].
L’expérience la plus concluante a été conduite par Amagaï et al.dans un modèle murin très élégant. Ce modèle de pathogéni-
cité est fondé sur la reconstitution de souris Rag2-/- avec les
splénocytes de souris invalidées pour la Dsg3 (Dsg3-/-) et im-
munisées avec de la Dsg3 recombinante murine. Les souris
Rag2-/- développent des lésions cutanées et muqueuses similai-
res à celles observées au cours du pemphigus vulgaire [23]. Les
caractéristiques immunologiques et histologiques des lésions
observées chez ces souris sont superposables à celles de la ma-
ladie humaine [24]. Par ailleurs, la production d’anticorps anti-
Dsg3 pathogènes et la survenue du pemphigus expérimental,
nécessitent la présence des populations lymphocytaires B et T
[25]. Enfin, ce groupe a montré récemment que la maladie
peut être induite par transfert passif chez les souris adultes
normales, d’un anticorps monoclonal anti-Dsg3 dérivé des
souris Rag2-/- receveuses des splénocytes des souris Dsg3-/- im-
munisées. Cet anticorps de sous-classe IgG1 est dirigé contre
un épitope conformationnel, calcium-dépendant de l’extrémi-
té N-terminale de la Dsg3 (1-63). Il reconnaît spécifiquement
4 résidus aminoacides (V3, K7, P8 et D59), supposés former
l’interface d’adhésion des Dsg entre-elles [26]. Ces résultats
confortent l’hypothèse d’une altération des fonctions adhési-
ves de la Dsg1 et de la Dsg3 par les autoanticorps produits dans
les différentes formes de pemphigus. En effet, la spécificité
des autoanticorps transférés (anti-Dsg3 et/ou anti-Dsg1) au
souriceau nouveau-né est corrélée au phénotype clinique et
histologique de la maladie développée par l’animal. La topo-
graphie dans l’épiderme des lésions cutanées est donc en ac-
cord avec la distribution relative de la Dsg1, fortement
exprimée au niveau des couches superficielles de la peau et
celle de la Dsg3 fortement exprimée au niveau des couches ba-
sales de l’épiderme. Ainsi, l’acantholyse profonde du PV est-
elle souvent la conséquence d’une action combinée d’anti-
corps dirigés contre la Dsg1 et contre la Dsg3. Les anticorps
anti-Dsg1 seuls n’entraînent en effet qu’une acantholyse su-
perficielle puisque la Dsg3, présente dans les couches basales,
compense la perte de la fonction d’adhésion de la Dsg1 induite
par les autoanticorps [27, 28]. Cette théorie de la
« compensation des desmogléines » rendrait compte de l’ab-
sence de PS néonatal à l’inverse du PV néonatal. En effet, con-
trairement à l’adulte, la Dsg3 serait coexprimée chez le
α6
β4
Intégrine α6β4TM
SRC
SRH
IVIIII IIN
N
C
CS
*
Laminine 5
G2
Domaine globulaireC-terminal
γ2 G5
G4
G3G1
SRF
α3
β3
Collagène VII
CN
Domaines collagéniques centraux
α1α1α1
Domaines NC1 Domaines NC2
Fig. 7. Structures de l’intégrine a6ß4, de la laminine 5 et du collagène VII. L’intégrine a6ß4, récepteur transmembranaire des hémidesmosomes, est un hétérodimère composé des sous-unités a6 (120 kDa) et ß4 (200 kDa). La sous-unité ß4 contient dans sa région intracytoplasmique, 2 paires de séquences répétées de fibronectine type III (SRF) séparées par des segments de connection et dans sa partie extracellulaire, 4 séquences répétées riche en cystéine (SRC). La sous-unité a6 de la protéine comporte une tête globulaire N-terminale comprenant des séquences répétées homologues (SRH). S : pont disulfure, TM : région transmembranaire.La laminine 5, constituant principal des filaments d’ancrage, est une protéine hétérotrimérique composée de 3 sous-unités (a3ß3g2) reliées par des ponts disulfures. Contrairement à la sous-unité ß3 (140 kDa), les sous-unités a3 (200 kDa) et g2 (155 kDa) existent à l’état de protéines processées, respectivement de 165 kDa et 105 kDa. La sous-unité a3 comporte à son extrémité C-terminale, un domaine globulaire (G) subdivisé en 5 sous-domaines (G1-G5) de 180 à 200 aminoacides.Le collagène VII, protéine fibrillaire d’environ 1 000 kDa, est le composant majeur des fibrilles d’ancrage. La molécule de collagène VII est constituée de 3 chaînes a1(VII) identique d’environ 300 kDa chacune, comportant 3 régions distinctes : un domaine collagénique central (145 kDa) flanqué d’un domaine globulaire N-terminal de 145 kDa (NC1) et d’un domaine globulaire C-terminal de 30 kDa (NC2).
238
H. MOUQUET, D. GILBERT, P. MUSETTE et al. Ann Dermatol Venereol2005;132:231-42
nouveau-né avec la Dsg1 dans les couches superficielles où elle
compenserait le défaut d’adhésion induit par les autoanticorps
ne rendant possible la survenue d’un pemphigus néonatal que
par la transmission transplacentaire d’anticorps anti-Dsg1 et
anti-Dsg3 [29].
Le dogme établi stipulant que, seules des IgG anti-Dsg1/Dsg3
ont la capacité d’induire un pemphigus chez la souris par
transfert passif a été récemment remis en cause par les travaux
de l’équipe de Grando. Ces auteurs montrent que 85 p. 100
des patients atteints de pemphigus, développent des autoanti-
corps pathogènes dirigés contre des antigènes kératinocytaires
différents des Dsg. Ces auteurs ont identifié 2 nouveaux auto-
antigènes reconnus par des IgG à activité potentiellement
acantholytique, le récepteur α9 à l’acétylcholine (Ach) (75 kDa)
et la pemphaxine (ou annexine 31) (50 kDa), qui peut égale-
ment se lier à l’Ach [30-33].
Les mécanismes d’action des autoanticorps au cours des
pemphigus ne sont pas tous élucidés. Deux hypothèses sont
couramment admises : (i) l’inhibition directe de la fonction ad-
hésive des Dsg, probablement due au simple masquage des si-
tes de leurs interactions par les autoanticorps [4, 26] ;
(ii) l’implication de la transduction de signaux cellulaires. En ef-
fet sur des kératinocytes en culture, les anticorps de pemphigus
induisent une activation du plasminogène via la transduction
de signaux cellulaires et ainsi, une production de plasmine dont
l’activité protéolytique conduirait à la digestion des glycoprotéi-
nes de la desmoglie [34]. Néanmoins, ces résultats demeurent
controversés, et la dégradation protéolytique pourrait résulter
d’un phénomène secondaire. Un autre mécanisme d’action a
été proposé : la fixation des anticorps de pemphigus vulgaire à
la surface des kératinocytes provoquerait la phosphorylation de
la Dsg3 aboutissant à la dissociation de cette protéine et de la
plakoglobine et in fine, à la perte d’adhésion interkératinocytaire
[35]. Une première étude du transcriptome sur des kératinocy-
tes en culture en présence d’IgG de pemphigus vulgaire mon-
tre que les anticorps diminuent la transcription de 198 gènes
notamment des protéines d’adhésion desmosomales (Dsg3, pé-
riplakine, desmoplakines) et augmentent la transcription de
31 gènes dont celui de la collagénase. De plus, ces travaux ont
confirmé la phosphorylation autoanticorps-dépendante de cer-
taines molécules d’adhésion particulièrement la Dsg3 (niveau
de phosphorylation augmentée de 300 p. 100) [36]. Conformé-
ment à l’hypothèse émise par Grando, l’acantholyse résulterait
des effets synergiques et cumulatifs des autoanticorps recon-
naissant différents antigènes de la membrane kératinocytaire
incluant à la fois des molécules intervenant dans l’adhésion cel-
lulaire (cadhérines desmosomales) et dans la régulation de cet-
te adhésion (récepteurs à l’Ach). Enfin, de récentes données
démontrent que la fixation des IgG anti-Dsg1/Dsg3 induit une
cascade moléculaire aboutissant à l’apoptose kératinocytaire et
in fine, au phénomène d’acantholyse [37, 38].
Les maladies autoimmunes sous-épidermiques
Les maladies autoimmunes sous-épidermiques constituent un
groupe hétérogène d’affections de la peau et/ou des muqueu-
ses. Elles sont caractérisées par la production d’autoanticorps
pour la plupart pathogènes, dirigés contre de nombreux com-
posants protéiques de la JDE. La fixation des anticorps à leur
cible entraîne une formation de bulles sous-épidermiques. La
plupart de ces maladies sont caractérisées histologiquement
par un infiltrat cellulaire dense composé principalement de
polynucléaires éosinophiles, neutrophiles et parfois de cellules
mononucléées.
Réactivité autoanticorps
L’analyse en IFD de la peau périlésionnelle de PB, PC et
d’EBA montre des dépôts linéaire d’IgG et de C3 le long de la
JDE. Un dépôt linéaire exclusif d’IgA est caractéristique de la
DBAL. Cet aspect de la fluorescence se distingue de celui ob-
servé au cours de la dermatite herpétiforme qui est caractéri-
sé par des dépôts granuleux d’IgA au sommet des papilles
dermiques. Les anticorps sériques de la PB, PC et d’EBA dé-
tectés par IFI sur coupe de peau humaine, se fixent le long de
la JDE et appartiennent aux sous classes IgG4 et IgG1. L’uti-
lisation de peau clivée par le NaCl 1M (qui induit la sépara-
tion de l’épiderme du derme au niveau de la lamina lucida)(fig. 2) permet de différencier la PB de l’EBA. En effet, la par-
tie épidermique du clivage (ou « toit ») contient les antigènes
hémidesmosomiaux (BPAG1, BPAG2, plectine et intégrine
α6ß4) et le plancher dermique, la laminine 5 et les collagè-
nes de type IV et VII. Les sérums de patients atteints de PB
reconnaissent habituellement le toit du décollement (épider-
me) (BPAG1 et BPAG2) tandis que les sérums de patients at-
teints d’EBA reconnaissent le plancher dermique du
décollement (collagène VII). Les sérums de patients atteints
de PC donnent habituellement une fluorescence mixte du
toit et du plancher du décollement. Les sérums de patients at-
teints de DBAL peuvent en fonction de la spécificité des an-
ticorps qu’ils contiennent, reconnaître soit exclusivement le
toit, soit exclusivement le plancher, soit les 2 versants du dé-
collement dermoépidermique. Les sérums de patients at-
teints de DH contiennent des IgA dirigées contre un tissu
connectif périmusculaire, l’endomysium [39]. Ces anticorps
anti-endomysium sont également présents chez les malades
atteints de maladie coeliaque et reconnaissent une enzyme,
la transglutaminase tissulaire [40].
Dans la PB, la majorité des autoanticorps reconnaît la par-
tie C-terminale des antigènes BPAG1 et BPAG2. Quatre épi-
topes immunodominants (MCW-0 à MCW-3), groupés sur
une séquence de 45 aminoacides, ont été localisés sur la por-
tion NC16A de BPAG2 [41]. La sensibilité des tests ELISA et
d’immunoempreinte utilisant comme antigène le domaine
NC16A recombinant est de 95 p. 100 pour la PB [42]. Le taux
des anticorps anti-NC16A semble être corrélé à l’activité de la
maladie [43]. Pour la détection rapide des autoanticorps, un
test ELISA utilisant l’antigène BP180-NC16A recombinant
est actuellement commercialisé (MBL Medical & Biological
Laboratories). Chez les malades atteints de pemphigoïde ges-
tationis, les autoanticorps anti-NC16A (principalement IgG3
et IgG1) semblent prédominants. 10 p. 100 d’entre eux re-
connaissent cependant un épitope distinct appelé MCW-5
[44]. Bien que certains sérums de PC et de DBAL réagissent
239
Ann Dermatol Venereol2005;132:231-42Physiopathologie des maladies bulleuses autoimmunes
avec la région NC16A, d’autres déterminants antigéniques
de la protéine peuvent également être reconnus [45, 46]. Le
fragment soluble de 120 kDa de BPAG2 sécrété par les kéra-
tinocytes décrit comme l’antigène LABD-1 et son fragment
protéolytique de 97 kDa (LABD97), représentent les cibles
majeures des autoanticorps de la DBAL. Au cours de cette
dermatose, les IgA réagissent préférentiellement avec le do-
maine Coll. 15 de la forme soluble LABD-1 [47]. Néanmoins,
la réponse autoanticorps est hétérogène, et peut selon les cas
être dirigée à la fois contre des antigènes dermiques et épi-
dermiques ce qui explique les différents aspects qui peuvent
être observés en immunomicroscopie électronique ou en im-
munofluorescence sur peau clivée par le NaCl [48]. Les don-
nées sur la cartographie épitopique de BPAG1 sont encore
parcellaires et montrent une reconnaissance de multiples dé-
terminants antigéniques localisés dans les sous domaines B
et C de l’extrémité C-terminale de BPAG1 par les sérums de
PB [49]. A côté des anticorps de sous classes IgG1 et IgG4,
des anticorps d’isotype IgE dirigés contre BPAG1 et BPAG2
ont également été décrits dans le sérum des malades atteints
de PB [50, 51]. Dans la PC, les anticorps anti-laminine 5 re-
connaissent de façon prédominante la sous unité α3 de la
protéine et réagissent par réactivité croisée avec la laminine
6 qui possède la même sous unité α3 [52]. L’étude de la car-
tographie épitopique de l’intégrine α6ß4 montre que les
autoanticorps de malades atteints de PC sont dirigés princi-
palement contre le domaine intracellulaire de la sous-unité
ß4 [53]. Au cours de l’EBA, 4 épitopes majeurs ont été locali-
sés sur le domaine NC1 du collagène VII [54]. La détection ra-
pide de ces autoanticorps a été réalisée par un test ELISA
utilisant comme antigène le domaine NC1 recombinant [55].
Pourtant, le spectre de réactivité autoanticorps contre le col-
lagène VII semble hétérogène puisque de récentes données
ont montré d’autres déterminants antigéniques reconnus
par les autoanticorps : (i) la triple hélice du domaine central
de la protéine est reconnue par un sous groupe de patients
[56], (ii) la région NC2/COL, impliquée dans le processus de
dimérisation des molécules de collagène VII [57]. Enfin, la
spécificité des anticorps de la DH a été récemment précisée
et correspondrait à la transglutaminase épidermique
(TGase 3) [58]. L’enzyme TGase 3 est exprimée de façon pré-
dominante dans les couches supérieures de l’épiderme. Elle
participe à la formation de l’enveloppe cornée durant la dif-
férenciation kératinocytaire en favorisant le pontage (intra-
moléculaire) de certaines protéines épidermiques [59].
Pathogénicité et modes d’action des autoanticorps
Plusieurs travaux réalisés in vitro et in vivo ont établi la patho-
génicité des autoanticorps anti-membrane basale. Les preuves
directes les plus probantes de la pathogénicité des anticorps di-
rigés contre l’autoantigène BPAG2 ont été fournies par Liu etal. dans un modèle expérimental murin de PB. Le transfert
passif d’anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la protéi-
ne BPAG2 humaine à des souris BALB/c nouveau-nées induit
des lésions cliniques, histologiques et immunologiques simi-
laires à celles de la PB humaine [60]. Dans ce modèle expéri-
mental, les autoanticorps pathogènes réagissent contre un
déterminant de BPAG2 murine homologue au domaine
NC16A de la protéine humaine [61]. L’activation du complé-
ment et le recrutement des polynucléaires neutrophiles à la
membrane basale sont nécessaires au déclenchement de la
maladie [62, 63]. De plus, les protéases sécrétées par les neu-
trophiles activités (élastase et gélatinase B), participent de fa-
çon critique aux lésions tissulaires initiées par la fixation des
anticorps anti-BPAG2 à leur cible [64, 65]. Dans ce modèle
expérimental murin de PB, des données récentes suggèrent
l’implication des mastocytes et des macrophages dans le re-
crutement des neutrophiles. La collaboration des macropha-
ges, des mastocytes et des neutrophiles semble nécessaire
pour l’induction de la maladie chez la souris [66, 67]. Par con-
tre, aucun travail n’a pu montrer le rôle pathogène des anti-
corps anti-BPAG1 dans la PB. Le rôle pathogène des IgA au
cours de la DBAL a été récemment montré dans un modèle
murin de transfert passif. En effet, l’injection d’IgA anti-
LABD97 à des souris SCID porteuses d’un greffon de peau
humaine aboutit dans un tiers des cas à une séparation de la
membrane basale accompagnée d’un infiltrat de neutrophiles
dans les papilles dermiques [68]. Au cours de la PC, la patho-
génicité des autoanticorps dirigés contre laminine 5 a été dé-
montrée, (i) par transfert passif d’anticorps anti-laminine 5 de
lapin purifiés à des souris BALB/c nouveaux-nés [69], (ii) par
transfert à des souris SCID adultes porteuses d’un greffon de
peau humaine, d’IgG purifiées de patients atteints de PC et di-
rigées contre la sous-unité α de la laminine 5 [70]. Dans ces
deux modèles, les souris receveuses présentent une maladie
similaire à la maladie humaine. Des arguments en faveur de
la pathogénicité des anticorps anti-intégrine α6ß4 ont été ap-
portés par des études in vitro, dans lesquelles l’incubation de
culture de conjonctive oculaire ou de muqueuse buccale avec
des IgG anti-intégrine α6ß4 purifiées à partir du sérum de
malades atteints de PC aboutit à une séparation de la membra-
ne basale [71, 72]. La pathogénicité des autoanticorps anti-col-
lagène VII n’est pas formellement démontrée cependant,
l’incubation de cryosections de peau humaine avec des leuco-
cytes de sujets sains et les sérums de patients atteints d’EBA
conduit à une séparation dermoépidermique dépendante de
l’activation des polynucléaires neutrophiles [73].
Les mécanismes d’action des anticorps anti-membrane ba-
sale ne sont pas élucidés. Différentes hypothèses ont été
évoquées : (i) interférence dans l’association des molécules
de la JDE due à la fixation des autoanticorps, (ii) activation du
complément, (ii) sécrétion par les éosinophiles de média-
teurs de l’inflammation via les anticorps IgE anti-BPAG1-2,
(iii) sécrétion par les polynucléaires neutrophiles, les macro-
phages ou les kératinocytes de protéases susceptibles de dé-
grader la matrice extracellulaire de la JDE [74].
Conclusion
Les maladies bulleuses autoimmunes doivent être considé-
rées comme résultant d’une rupture large de la tolérance vis-
240
H. MOUQUET, D. GILBERT, P. MUSETTE et al. Ann Dermatol Venereol2005;132:231-42
à-vis d’un ou de plusieurs antigènes desmosomaux ou de la
jonction dermoépidermique. Elles représentent des modèles
de maladies autoimmunes spécifiques d’organe médiées par
des autoanticorps pathogènes. La reconnaissance de leurs
mécanismes physiopathologiques au niveau moléculaire et
cellulaire a permis une meilleure compréhension des proces-
sus d’autoimmunisation, a largement contribué à la compré-
hension des fonctions adhésives de la peau et permet
d’espérer de nouvelles perspectives thérapeutiques.
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Question du praticien
La rubrique « Question du praticien » n’est plus annoncée dans chaque numéro des Annales de Dermatologie.
Le Comité de Rédaction et nos interlocuteurs du Comité de Lecture restent à votre disposition pour répondre à vos
questions. Celles d’intérêt général seront publiées dans notre revue.
Les « Questions » sont à adresser, en 2 exemplaires, sur papier libre ou papier à entête au Comité de Rédaction, Anna-
les de Dermatologie et de Vénéréologie, Masson, MediMedia France, 21, rue Camille Desmoulins, 92789 Issy-les-
Moulineaux Cedex 9.
Journal of Autoimmunity 24 (2005) 319e328
www.elsevier.com/locate/issn/08968411
Genetic factors in pemphigus
Francois Tron a,*, Daniele Gilbert a, Hugo Mouquet a, Pascal Joly a,Laurent Drouot a, Sondes Makni b, Hatem Masmoudi c, Dominique Charron d,e,
Mondher Zitouni b, Pascale Loiseau d, Mourad Ben Ayed c
a Unite INSERM 519 e IFRMP 23, Hopital Charles Nicolle, Faculte Mixte de Medecine et de Pharmacie,
22, Boulevard Gambetta, 76183 Rouen Cedex, Franceb Laboratoire d’Immunologie, CHU Habib Bourguiba, 3029 Sfax, Tunisie
c Laboratoire d’Immunologie, Hopital La Rabta, Jabbari e 1007 Tunis, Tunisied Service d’Immunologie, Hopital Saint-Louis, 1, avenue Claude Vellefaux, 75475 Paris Cedex 10
e INSERM, U396, IFR 58
Received 22 November 2004; revised 23 February 2005; accepted 15 March 2005
Abstract
Epidemiological studies performed in different ethnic populations and family studies, notably based on a partial phenotype of the
autoimmune process, indicate that genetic factors are involved in the occurrence of pemphigus. However, the precise heritabilityremains uncertain in the absence of twin concordance rate studies. Among the different strategies available to identify genetic factorsparticipating in autoimmune disease susceptibility, only population studies based on caseecontrol design have been performed inpemphigus. These studies consistently showed that MHC locus, in particular HLA class II alleles, are associated with pemphigus
vulgaris and pemphigus foliaceus. Other genes of the MHC locus may also participate in disease susceptibility as shown by studiesusing microsatellite markers across different regions of the MHC. It is likely that other non-MHC genes are involved in thepathogenesis of pemphigus. In particular, involvement of a polymorphic variant of desmoglein 1 gene was shown to be associated
with pemphigus foliaceus and to interact in an epistatic manner with MHC class II genes to contribute to the autoimmune process.Other candidate genes to which a role can be assigned in the disease pathogenesis should be considered to design caseecontrol orfamily-based association studies. Genome scan studies which require a large number of multiplex families to reach statistical power,
should also be considered in the endemic form of pemphigus foliaceus because of the high number of familial cases.� 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords: Pemphigus; HLA; Autoantigen; Desmoglein
1. Introduction
Pemphigus vulgaris (PV) and pemphigus foliaceus(PF) are rare but informative organ-specific autoim-
* Corresponding author. Tel.: C33 2 32 88 80 71; fax: C33 2 32 88
81 86.
E-mail address: [email protected] (F. Tron).
0896-8411/$ - see front matter � 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.jaut.2005.03.006
mune diseases. In most autoimmune diseases, severalfactors, genetic, environmental and stochastic, contrib-ute to their susceptibility. In pemphigus, a large body ofdata has accumulated which supports genetic predispo-sition as a contributor. This review will summarize datademonstrating the participation of genetic factors in theoccurrence of pemphigus and the strategies developedfor their identification. Some of these strategies arebased on what is known of the biology of pemphiguswhich, thus, will constitute the first part of this review.
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2. Biology of pemphigus
Pemphigus are characterized by the production ofautoantibodies directed against desmogleins (Dsg),Dsg3 in PV and Dsg1 in PF, that are keratinocytetransmembrane proteins localized in the desmosomeand members of CaC-dependent adhesion molecules,the cadherins [1]. The pathogenic property of anti-desmoglein autoantibodies can be directly demonstratedby passive transfer experiments: immunoglobulins G(IgG) purified from patient sera during the active phaseof the disease induce keratinocyte-cell membrane Igdeposit and blister formation when injected intra-peritoneally into normal mice [2,3]; newborns tomothers with PV may develop a transient form of thedisease due to the maternal IgG autoantibodies thatcross the placenta [4]. The interaction of anti-Dsgantibodies (Ab) with their target antigens (Ag) isresponsible for the loss of cell adhesion (acantholysis)and the formation of intra-epithelial blisters of the skinand mucous membranes. Immunochemical analysis ofautoantibodies directed against desmogleins indicatesthat they predominantly but not exclusively bind to theextracellular domains of the proteins [5,6] and exerttheir pathogenic effect through the inhibition of theiradhesive properties. Anti-Dsg antibodies belong to IgG1k, l and IgG4 k, l subclasses [7]. Interestingly, IgG4 areproduced during active phase of the disease, are absentin patients in remission [8], and are considered to displaymost of pathogenic properties. In contrast, no data areavailable about the structural characteristics of anti-DsgAb. The difficulty to derive pathogenic anti-Dsg Abproducing hybridomas or EBV-cell lines from peripheralblood lymphocytes (PBL) of pemphigus patients [9],likely due to technical limitation and/or the smallnumber of specific B-cell precursors in PBL, did notallow to study anti-Dsg1 or Dsg3 autoantibodies at theclonal level and, in particular, to analyze the repertoireof VH and VL genes they utilize. Therefore, it is stillquestionable whether anti-Dsg Ab use recurrent VH andVL gene segments, are encoded by germline or somat-ically-mutated genes, all questions that are directlyrelevant to the mechanisms of autoantibody productionand B-cell activation. Results from such analysis mightalso incite to study the contribution of Ig polymor-phism, in particular of Ig heavy chain (IGHV) and lightchain variable (IGLV) loci, to disease susceptibility if,for example, VH and/or VL genes of a given family ora particular V gene were shown to be used recurrently toconstruct an anti-Dsg Ab response.
T-cells intervene in the generation of the lesionalmechanisms indirectly. Indeed, the production of IgG4autoantibodies during active phase of pemphigussuggests the participation of mechanisms operating atnot only the B- (switch of Ig classes and subclasses) butalso the T-cell level such as the production of
interleukins 4 (IL-4) and 13 (IL-13) which promoteand are secreted by Th2-type T-cells. In addition, as inall organ-specific autoimmune diseases, the tolerancebreakage to target autoantigens are thought, althoughnot exclusively, to take place at the T-cell level, i.e., atthe immunological synapse involving human leucocyteantigens (HLA) class II molecules, the initiating auto-antigenic peptide(s) and T-cell receptors (TCR). Char-acterization of autoreactive T-cells and, moreparticularly, dissection of T-cell epitopes of Dsg3 andDsg1 are underway in several laboratories [10e17] aswell as the identification of HLA class II alleles thatrestrict Dsg-specific T-cell responses. Recent studieshave identified immunodominant T-cell epitopes andstarted characterizing the repertoire of Dsg3- or Dsg1-specific T-cells at the clonal level [16,18]. Therefore,the genes coding for the 3 major molecules of theimmunological synapse i.e., TCR, major histocompati-bility complex (MHC) and autoantigen should also beconsidered as candidate genes conferring susceptibility.
Other components of the desmosome can be targetedby the pemphigus autoimmune response. In PV and PF,proteins of the desmosome plaque such as desmoplakin[19] envoplakin and periplakin [20], can be bound byautoantibodies. In paraneoplastic pemphigus (PNP),a rare form of pemphigus associated with lymphopro-liferative disorders, the B-cell autoimmune response isdirected against various components of cell adhesionstructures [21], namely proteins of the plakin familyamong which envoplakin and periplakin are constantlybound by autoantibodies. Whether this type of pemphi-gus is triggered by genetic factor(s) similar to thoseidentified in PV and PF remains to be determined.
Animal models of autoimmune diseases are of majorinterest to study genetic mechanisms responsible forthe initiation and the development of autoimmuneresponses. Spontaneous models of organ-specific auto-immune diseases, such as the non-obese diabetic (NOD)mouse strain and the Biobreeding (BB) rat for humantype 1 diabetes and the obese strain (OS) of chicken forthyroiditis, have provided invaluable information aboutthe immunological and genetic factors contributing tothe occurrence and expression of the disease. However,although pemphigus has been described in certainanimal species such as dog and cat, there is no availablespontaneous model which could be a guidelight forthe human diseases. Experimental organ-specific auto-immune diseases induced by immunization with an‘‘heterologous autoantigen’’ also constitute useful mod-els of human diseases that were shown to be governed bygenetic factors [22]. Unfortunately, attempts to induceexperimental pemphigus diseases by immunizing normalmice with recombinant Dsg1 and Dsg3 have failed,apparently due to the inability to induce tolerancebreakage to these peripheral autoantigens. Recently, anelegant model of blistering autoimmune disease, based
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on the transfer to severe combined immune deficiency(SCID) mice of B- and T-cells derived from Dsg3 �/�
knock-out mice immunized with mouse Dsg3, may helpunveil cellular and molecular mechanisms at work inthis organ-specific autoimmune disease [23]. However,the characteristics of the model, i.e., immunization ofknock-out mice for the triggering ‘‘autoantigen’’, limitthe analysis of the initiating events and genetic factorsresponsible for the breakage of B- and T-cell tolerance.
Another feature, probably unique to certain forms ofpemphigus, is the role of environmental factors in theoccurrence of the disease. Indeed, while PV and non-endemic forms of PF occur sporadically throughout theworld, an endemic form of PF is observed in certaingeographical areas, namely Brazil [24], Colombia [25]and Tunisia [26]. In Brazil, epidemiological studiessuggest that PF (fogo selvagem) is triggered by envi-ronmental factors [27] and provides a unique opportu-nity to study the interplay between environmental andgenetic factors in the development of an organ-specificautoimmune disease. Drug-induced pemphigus alsoemphasizes the role of inducing or triggering exogenousagents in the development of the disease [28].
3. Genetic epidemiology
For a given autoimmune disease, clues to theunderlying genetic susceptibility should be provided byepidemiological studies, including differences in theautoimmune disease prevalence in different populations,familial aggregation and risks to specific type ofrelatives, twin and adoption studies, before undertakingidentification of the susceptibility genes. In pemphigus,several data are available from genetic epidemiologystudies indicating that susceptibility to the disease isinherited.
3.1. Population prevalence
The prevalence and incidence of pemphigus are low.The annual incidence of the disease has been calculatedin various populations and differs among ethnic groups.For example, the incidence is higher in Jewish popula-tion, in particular of Ashkenazi origin [29], in Japanese[30] and in Indian [31] as compared to the incidenceobserved in North America or Western Europe [32].However, those differences may be due to environmentalfactors, emphasizing the value of incidence or preva-lence studies performed in different ethnic groups livingin the same environment or in the same ethnic groupliving in different environments. An example of theformer is the difference in the annual incidence ofpemphigus, estimated in Hartford County (USA), from
1972 to 1977, between the overall adult population (4.2cases per 100,000) and the Jewish adults (32 cases per100,000) [33]. An example of the latter is the similarprevalence of PV in Indians living in South Africa and intheir land of origin [34].
Examination of epidemiological studies attempting toevaluate the incidence of pemphigus in various popula-tions strongly suggests that the incidence is higher in thelower latitudes and lower in the higher latitudes. Forexample, the annual incidence was 0.76 case per millioninhabitants in Finland [35], 1.7 cases in France [26], 3 inItaly [36] and 6.7 in Tunisia [26]. This NortheSouthgradient, if confirmed, is the opposite to that observedfor other 2 organ-specific autoimmune diseases, multiplesclerosis (MS) and type 1 diabetes whose prevalenceis higher in higher latitudes. This observation indeed,may be due to environmental factors, in particular,the socioeconomic status, but alternatively to geneticfactors. In this regard, it is interesting to consider thatMS and type 1 diabetes are thought to be Th1-dependentautoimmune diseases and pemphigus Th2-organ-specificautoimmune diseases occurring in different geographicalareas where the major selective pressure was exerted bydifferent pathogenic agents, mycobacterium tuberculosis(a Th1 pathogen) in the North of Europe and malaria(a Th2 pathogen) in the South of Europe and NorthAfrica.
3.2. Familial aggregation
Familial cases of pemphigus have been reported. InPV, they are very unusual and only sporadic casesinvolving first-degree relatives, mainly parentechildand/or siblingesibling have been described [37e40].However, 2 different observations speak for theinvolvement of genetic factors in PV susceptibility: (i)a significant increase in the prevalence of autoimmunediseases in the first-degree family members of PVpatients compared with relatives of healthy controls,which allows to suspect that genetic factors governingthe occurrence of general autoimmunity participate inPV susceptibility [41]; (ii) anti-Dsg3 antibodies, a partialphenotype of the autoimmune process, were frequentlydetected (O50%) in asymptomatic parents of PVpatients in a pattern consistent with a dominant in-heritance [42,43]. In PF, in particular the endemic formobserved in Brazil (FS), multiple cases of PF in familyunits have been reported and anti-Dsg1 Ab can bedetected at a high frequency in patient’s relatives [44].In contrast, familial cases of the endemic form of theTunisian PF seem to be rare. Whether anti-Dsg1autoAb are present in family members of patients withsporadic or endemic Tunisian PF remains to bedetermined and is currently under study.
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3.3. Twin and adoption studies
Twin studies allow to estimate and compare therisk for developing pemphigus in monozygotic anddizygotic twins when a member of a pair is involved bythe disease (concordance rates). Unfortunately, inpemphigus, neither twin nor adoption studies, whichrequired very large population-based ascertainment,have been reported due in part to the low prevalence ofpemphigus.
Finally, population prevalence and family studies, inparticular based on the anti-Dsg partial phenotype,allow to consider that genetic plays a role in theoccurrence of both PV and PF and suggest a dominantinheritance of the autoantibody response.
4. Strategy to identify genetic factors in pemphigus
Several approaches are available to identify the genesparticipating in autoimmune disease susceptibility. Thecandidate gene strategy aims at testing genes codingfor a molecule thought to play a role in immunedysregulation leading to the autoimmune process (targetantigens, antigen-processing or presenting molecules[45], B- and T-cell antigen receptors, cytokines andmolecules participating in BeT-cell cooperation [46])and may itself use different approaches. Populationstudies, in particular caseecontrol studies, allow to testan association between a given risk factor and a diseaseand is based on the comparison of affected andunaffected subjects. Family-based association studiesmay use gene linkage analysis which is based on theanalysis of the segregation of 2 traits, disease andsusceptibility genes, in families with multiple affectedindividuals [47]. A powerful family-based associationstudy is the transmission disequilibrium test (TDT)which requires the use of affected individuals and ofboth parents [48]. However, this method may be difficultto apply to pemphigus since, at least for PV and thesporadic form of PF, the disease mainly affectsindividuals O50 years and many patients will not haveboth parents alive. The aim of genomic-wide scans is toidentify cosegregation of polymorphic markers anddisease (or partial phenotype) to define chromosomalregions containing susceptibility loci. Genomic-widelinkage uses microsatellite markers and requires largemultiple families of affected individuals The problemsthat geneticists faced to map genes involved inautoimmune diseases illustrate the difficulty of thisapproach [49,50]. The rarity of familial cases in mosttypes of pemphigus may make genome-wide linkagestudy not applicable although the endemic form of PFoccurring in Brazil may constitute an appropriatepopulation.
5. Identification of genes involved in pemphigus
So far, the unique approach used to identify genesparticipating in pemphigus susceptibility has beenpopulation studies based on caseecontrol design thattested a few genes thought to play a role in the disease.This approach consistently demonstrated that the MHClocus is associated with both PV and PF. Recent studiesconducted in our laboratory also suggest that DSG1gene participates in PF susceptibility and interactswith MHC genes to increase the risk to develop thisautoimmune disorder. Other candidate gene studies,either gave negative or inconsistent results.
5.1. MHC genes
The MHC locus is an important susceptibility locusfor most autoimmune diseases as shown by associationstudies and, more recently, genome scan analysis in MS[51] and type 1 diabetes [52]. The association of PV withHLA class II alleles was revealed as early as 1980 andwas repeatedly demonstrated by serological, restrictionfragment length polymorphisms (RFLP) and genotypeanalyses. A compilation of various studies performed indifferent ethnic populations is presented in Table 1. Thedemonstration of the association of PF with HLA classII alleles was provided more recently and involved boththe endemic and non-endemic forms of the disease(Table 2). Several interesting observations can be madefrom these studies. PV was consistently found to beassociated with DR4 and DR14 and, more precisely,with DRB1*0402 and DRB1*1401 subtypes. Forexample, DRB1*0402 was found in 92% of AshkenaziJews [53], 85% of non-Jewish Iranians [66], 81% ofSardinians [58], 33% of Italians [57] while its prevalencein these different normal populations ranged from 2 to4%; HLA DRB1*1401 was found in 44.2% of Italian[57], 44% of Japanese [64], 37% in Pakistani [59] and28% of Spanish [60] patients. Thus, 2 different suscep-tibility alleles are associated with PV patients of differ-ent ethnic groups. Most DRB1*04 individuals areDQB1*0302 and most DRB1*14 are DQB1*0503 dueto linkage disequilibrium. Since DRb1 alleles other thanDRB1*0402 and DRB1*1401 and linked to DQB1*0302and 0503 are not increased in PV, one can hypothesizethat the primary association is with DRB1 genes. Thispresumption is supported by most functional studiesshowing that Dsg3-specific T-cell lines were restrictedto DR [67]. However, the association of PV withDQB1*0503 was reported to be primary in one study[68] and in vitro, monoclonal antibodies anti-HLA DRbut also anti-HLA DQ were shown to abolish anti-Dsg3antibody production by B-cells cocultured with CD4CT-cells obtained from patients with PV [69]. It is alsointeresting to note that DRB1*0402 which predisposes
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Table 1
MHC genes identified by association studies in PV
Populations n Alleles References
Controls Patients
Caucasians
Ashkenazi Jews 26 DR4, DQw8 [53]
French 106 37 DRB1*0402, 1401; DQB1*0302; 0503 [54]
Indians 89 37 DRB1*1404; DRB1*0202; DQA1*0101; DQB1*0503 [55]
Italians 128 61 DRB1*0402, DRB1*1401; DQB1*0503 [56,57]
Sardinians e 16 DRB1*0402; DQA1*0301; DQB1*0302 [58]
Pakistani e 19 DRB1*1404; DQA1*0101; DQB1*0503 [59]
Spanish 200 26 DRB1*0402, 1401; DQB1*0503, 0302 [60]
US 44 38 DR4 [61e63]
Mongoloids
Japanese 525 55 DRB1*0403, 0406; DRB1*1401, 1405, 1406 [64,65]
to idiopathic PV has been reported in patients affectedby the drug-triggered form of the disease [70].
Susceptibility to PF has been correlated with thepresence of DR4, DR14 and DR1 alleles (Table 2).However, in contrast to PV, no single DR4 or DR14allele was shown to be associated with the disease.Indeed, DRB1*0403, *0404, DRB1*0406 andDRB1*0402 in certain studies [54,64,72,76] andDRB1*1401, 1402, 1406 and DRB1*0102 subtypes wereincreased in PF patients. These studies also showed thatendemic and non-endemic forms of PF share similaralleles of susceptibility, an observation which, along thatmade in spontaneous and drug-triggered PV, indicatesthat different environmental factors interact withcommon genetic background to increase the risk todevelop these autoimmune blistering skin diseases.
Analysis of MHC class II molecules in autoimmunediseases such as type 1 diabetes, showed that certainalleles may confer protection [77]. Results obtained fromstudies performed in PV and PF also suggest that certainHLA protective alleles are present in the HLA class IIregions, such as DRB1*13 and DRB1*07 in Spanish [60]and Italian [57] PV patients, respectively. The recentstudy performed by the group of Petzl-Erler in large
populations of Brazilian patients with endemic PF andhealthy controls provided interesting observations aboutthe role of allelic interactions on disease susceptibility/resistance [71]. Previously reported positive associationswith HLA-DR antigens were confirmed (see Table 2)and several HLA-DR antigens (DRB1*0301,*0701,*0801, *1101, *1104 and *1402) were negativelyassociated with PF. Susceptible alleles were shown tobe semi-dominant over neutral alleles, and protectivealleles semi-dominant over susceptible and dominantover neutral. This study emphasizes the crucial role ofHLA-DRB1 gene in modulating susceptibility to andprotection against PF.
MHC class II locus was also found associated withthe third variety of pemphigus, PNP. Interestingly, inthe unique series that we reported, the MHC class IIalleles, DR4 and DR14, regularly found associated withPV and PF, were not increased in these patients, whilethe DR3 allele was significantly increased [78]. Thisobservation, if confirmed in larger series of patients withPNP, would indicate that PNP has a genetic basisdifferent from PV and PF.
MHC outside the HLA class II region may alsocontribute to disease susceptibility. In the study
Table 2
MHC genes identified by association studies in PF
Populations n Alleles References
Controls Patients
Sporadic PF
French 106 20 DRB1*0404 ; DRB1*0102 [54]
Italians 128 26 DRB1*04 ; DRB1*1404 ; DQB1*0503 [57]
Japanese 525 7 DRB1*04 ; DRB1*0403, *0406;
DRB1*14; DRB1*1401, *1405, *1406
[64]
Endemic PF
Brazilians 182 147 DRB1*0102, *0404, *0406 ; DRB1*1406, *1602 [71,72]
50 38 DRB1*0102 [73e75]
Tunisians 100 28 DR4 (UO)
UO: unpublished observation.
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performed in Spanish PV patients, HLA B38 was foundto be significantly increased with a frequency of 23%versus 7% in the general population [60]. More recently,microsatellite probes that span the entire MHC regionwere used to screen DNA samples from 38 Jewish PVpatients and 76 healthy controls. While some markerswere associated with MHC class II region, 4 probesmapped to MHC class I region [79]. Further analysis ofthese DNA samples with 26 single nucleotide poly-morphism markers spanning a chromosomal regionof 600,000 bp, indicated that 4 markers were foundinformative and all mapped to HLA-G. A deletion/insertion variant in exon 8 of the gene was foundassociated with the disease [80].
Although one cannot exclude that genes in stronglinkage disequilibrium with HLA class II genesparticipate in pemphigus susceptibility. The majormechanism proposed to explain the association be-tween MHC genes and autoimmune diseases is thatdisease-associated alleles can efficiently accommodatean autoantigen-derived peptide initiating the autoreac-tive T-cell response. The peptide binding groove of theHLA class II molecules contains pockets, five of themP1, P4, P6, P7 and P9 interact with amino acids of theside chains of the bound peptide. Polymorphism ofHLA class II molecules involves amino acid residuesthat contribute to the shape and charge of the pocket.PV-linked DRB1*0402 differs from other DR4 sub-types by the presence in the P4 pocket of 2 negatively-charged residues at position 70 (D) and 71(E) and,thus, could selectively present a Dsg3-derived peptide.Data obtained from Wuscherpfennig et al. [81] stronglysupport this model, since, based on the binding motif ofDRB1*0402 molecule, several candidate peptides ofDsg3 were selected, one of which induced consistentlyproliferation of T-cells from DRB1*0402 positive PVpatients. However, DRB1*0401 which is also associatedwith PV does not share the anionic amino acids of theDRB1*0402 molecule suggesting that different peptidesmay participate in the initiation of autoimmuneresponse or that other part(s) of the HLA-DRB1 chaincontribute to disease susceptibility. Similar conclusionwas reached in PF patients by Pavoni et al. [72] whocould not identify, among HLA-DRB1 alleles predis-posing to Brazilian endemic PF, any simple sharedpolypeptide motif at positions 67e74 although theclustering of DRB alleles in functional groups based onthe properties of polymorphic residues at position 70,71, 74 and 86, resulted in a better discriminationamong susceptibility and protective alleles. Furtherstudies are needed using different approaches such asT-cell proliferation assays, generation of T-cell linesand clones, binding experiments of candidate peptidesto purified HLA Class II molecules and identifica-tion of peptides eluted from these molecules toprecisely define immunodominant epitopes initiating
the autoimmune process, which may help design newtherapeutic strategies.
5.2. Autoantigen genes
It is actually firmly established that autoantigensinitiate and drive autoimmune responses both at the B-and T-cell level. Experimental models of autoimmunediseases induced by immunization with the autoantigenand the structural properties of autoreactive B- or T-cellreceptors derived from individuals with autoimmunediseases clearly speak for the crucial role of theautoantigen in the initiation of the autoimmuneresponse. One may thus wonder whether the geneencoding the putative initiating autoantigen is poly-morphic and if so, whether the polymorphism takes partin disease susceptibility. Involvement of autoantigengene polymorphism has been reported in two majorautoimmune diseases, type 1 diabetes (variable numberof tandem repeats (VNTR) polymorphism upstream ofthe insulin gene) [82] and myasthenia gravis (micro-satellite polymorphism in the first intron of muscleacetylcholine receptor alpha-subunit gene) [83].Although recent experiments, suggest that insulin VNTRalleles modulate insulin expression in human thymus andthus might control central tolerance, the significance ofthese associations still remains poorly understood.
These observations and the demonstration that theDSG1 gene is polymorphic in bovine [84] prompted usto ask whether DSG1 constitutes a candidate genepredisposing to PF. Two polymorphic markers wereidentified. The first is made of a variant haplotype of fivemis-sense mutations located on the part of the geneencoding the fourth and fifth extracellular domains ofthe protein and was not found to be associated with PF.The second marker consists of a single silent T to Ctransition at position 809 and was significantly morefrequent in French Caucasian PF patients than incontrols [85]. Interestingly, the increased frequency ofmutation 809 (C), notably at the homozygous state (809(C/C)) was also observed in PF patients recruited inTunisia where the epidemiology of the disease isdifferent, strengthening the observation made in France[86]. Thus, two different association studies performedin different epidemiological situations, indicate thatDSG1 is involved either in PF susceptibility or in theproduction of anti-Dsg1 antibodies. This question willbe addressed by studying DSG1 polymorphism in PVpatients producing anti-Dsg1 antibodies.
The role of a silent mutation of the coding sequenceof DSG1 in PF physiopathology remains questionable.An association with another polymorphism locatedelsewhere in the coding or regulatory sequences ofDSG1, is currently under investigation. The mutationcould also be involved in alternative splicing of Dsg1pre-mRNA transcripts leading to the synthesis of
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alternative transcripts of DSG1 and of untolerizedintron-encoded amino acid sequences responsible forT-cell tolerance breakage. Further analysis of FrenchCaucasian PF patients showed that a combination ofHLA DR4, the HLA-DRB1 allele significantly associ-ated with PF, and C/C (809) genotype conferreda stronger risk of PF development than either aloneand that the effect of both risk factors was more thanadditive [76]. This model is consistent with an epistasisbetween DR4 and C/C genotype in PF susceptibility andis reminiscent of results obtained in two other organ-specific autoimmune diseases, in which the interactiveeffect of two different loci was demonstrated: type 1diabetes with the insulin gene and the HLA region [87],and myasthenia gravis with acetylcholine receptoralpha-subunit gene (CHRNA) and two different HLAloci [88]. Thus, this observation underlines the complex-ity of genetic interactions in the development ofautoimmune diseases and constitutes a model to studyand further the understanding of epistasis between genesencoding presentation molecules and autoantigens.
5.3. IGH and IGL genes
The fundamental functions of B-cell receptor (BCR)in autoimmune responses which are now unambiguouslydemonstrated to be driven by antigens, allow to considerthe polymorphic IGH and IGL loci as candidate genes ofsusceptibility to autoimmune diseases. Both V and Csegments of the IGH and IGL loci are polymorphicand several autoimmune diseases were shown to beassociated with IGHC [89], IGHV [90] or IGKC [91,92]polymorphisms. Only few studies analyzed the role ofIG locus polymorphism in pemphigus susceptibility.One study was performed to determine whether IGHpolymorphism was associated with PV [93]. Whilesignificant differences in the distribution of IGHC allelicfrequencies were observed between 12 PV patients andcontrols, a significant difference was found for a VH3polymorphism. Although, the small size of the patientgroup could introduce bias and makes the significanceof the result questionable, this study invites to furtherstudy the IGH locus polymorphism in pemphigus ifa restricted usage of VH genes was demonstrated in theanti-Dsg1 or anti-Dsg3 antibody responses. Similarly,the observation that IgG4 constitutes the majorpathogenic IgG subclass [94,95] should invite to de-termine whether polymorphic variants of the switchgamma 4 sequence that were recently described [96], areassociated with PV or PF. Interestingly, anti-Dsg1 andanti-Dsg3 IgG4 antibodies preferentially if not exclu-sively, express kappa light chains. This observation andthe previous reports indicating that several autoimmunediseases are associated with IGKC polymorphismprompted us to determine whether PV or PF is as-sociated with allotypic markers of immunoglobulin
kappa. By using a PCR-digestion procedure, we showedthat both PV and PF in the sporadic and endemic formobserved respectively in France and Tunisia, were notassociated with a Km allotype [97].
5.4. Other candidate genes
Other genes of the MHC have been studied inpemphigus. Tumor necrosis factor (TNF) and lympho-toxin alpha (LTA) are cytokines with immunoregulatoryproperties whose genes are located in the class III regionof the humanMHCanddisplay polymorphism. In a studyperformed in a large series of patients with Brazilianendemic pemphigus and controls, no associations werefound between LTA/ or TNF/ single nucleotide poly-morphism (SNP) and PF indicating that genetic variabil-ity of these loci does not participate in susceptibility/resistance to the disease [98]. However, in an associationstudy involvinga limitednumberofPFpatients, apositiveassociation of TNFa promoter gene polymorphism withsporadic PF was observed [99]. Polymorphisms of TAP1andTAP2 genes that are located in theHLA class II locusand that encode for the transporters associated withantigen processing (TAP) molecules were recently ana-lyzed in Japanese pemphigus patients but no associationwas found with the disease [100]. Other candidate geneswere studied, particularly those that encode for cytokinesthat have been involved in pemphigus. In this regard,a recent study demonstrated that the SNP located atposition �174 of the IL6 gene is associated with FS.Indeed, the C/C genotype was shown to be protectivewhile the G allele predispose to FS, suggesting a role ofIL6 in the pathophysiology of pemphigus [101].
6. Conclusion
Finally, epidemiological and association studiesfirmly established that genetic factors are involved inthe occurrence of pemphigus and that HLA class IIgenes or genes in strong linkage disequilibrium partic-ipate in disease susceptibility. However, MHC haplo-type alone is insufficient for development of the diseaseand it is very likely, that pemphigus, like other auto-immune diseases, are complex and polygenic disordersin which many genes with various penetrance operateand interact to control the disease process. The positiveepistasis observed between the HLA and DSG1 lociillustrates this complexity and, thus, the difficulty toidentify genetic factors in pemphigus. Genome scanstudies require a large number of multiplex families thatmay be difficult to recruit at least in PV and sporadic PFand are often beyond financial resources of laboratories.These studies might be performed in Brazilian endemicpemphigus which frequently involves family membersallowing to recruit a large number of multiplex families
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and reach sufficient statistical power. However, thepower of association studies, in particular family-basedassociation when correctly designed, the recent identifi-cation of the patterns of genetic variation in the humangenome [102], and the better understanding of thepathophysiology of PV and PF should invite to useassociation studies to dissect the genetic basis of thedifferent varieties of pemphigus. Several non-MHCcandidate genes to which a role can be assigned in thedisease pathogenesis or an intermediate phenotype (anti-Dsg autoantibodies) could be selected and studiedinvolving large number of cases and controls. Amongthese candidate genes, those showing genetic conserva-tion across all populations [103] should be prioritized forminimizing heterogeneity of population and theirconfounding effects.
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RESUME
Les pemphigus sont des maladies auto-immunes spécifiques d'organe qui affectent la peau et les muqueuses. Ils sont caractérisés par la production d’autoanticorps pathogènes dirigés contre des protéines du desmosome, plus particulièrement, les desmogléines qui permettent l’adhésion entre eux des kératinocytes de l’épiderme. Au cours des pemphigus superficiels (PS), la réponse auto-immune est dirigée contre la desmogléine 1 (Dsg1). Chez les malades atteints de PS, des lymphocytes T autoréactifs vis à vis de la Dsg1 sont présents et interviennent dans la production d'autoanticorps anti-Dsg1. Cet autoantigène est aussi la cible de la réponse auto-immune au cours d'autres formes de pemphigus tels que les pemphigus vulgaire et paranéoplasique et par conséquent, semble jouer un rôle clé dans ces maladies.
Depuis plus d’une décennie, le rôle de l’autoantigène lui-même dans l’initiation, la propagation et la pérennisation de la réponse auto-immune a été conforté par de nombreux arguments expérimentaux. En nous appuyant sur ce concept, nous avons entrepris d’étudier l’intervention de la Dsg1 dans les mécanismes physiopathologiques qui concourent au développement des pemphigus.
Dans un premier temps, nous avons démontré l’expression dans l’épiderme humain,
d’une isoforme tronquée de la Dsg1 générée par épissage alternatif des transcrits DSG1. Cette Dsg1 soluble est porteuse d'une séquence peptidique spécifique qui se fixe avec une forte affinité à certaines molécules HLA de classe II de susceptibilité au PS en particulier, à la molécule DRB1*0102. Ce peptide est par ailleurs capable d'induire la prolifération de cellules mononuclées du sang périphérique chez 50% des malades atteints de la forme sporadique de PS. Ces patients expriment des allèles HLA de classe II associés à la maladie et deux d'entre eux sont porteurs de la molécule DRB1*0102. Ainsi, la modification de la Dsg1 par épissage alternatif pourrait-elle intervenir dans la rupture de la tolérance au niveau du compartiment T chez les individus prédisposés génétiquement par l'expression de certains allèles HLA de classe II et in fine, conduire à l'initiation d’une réponse auto-immune B dirigée contre la Dsg1.
En second lieu, nous avons observé une diversification de la réponse anticorps chez des souris normales immunisées avec la région extracellulaire recombinante de la Dsg1. Les animaux immunisés produisent non seulement des IgG dirigées contre la Dsg1 mais aussi, contre d'autres protéines de l'épiderme. Nous avons dérivé cinq anticorps monoclonaux à partir des splénocytes isolés de ces souris et montré que trois d'entre eux sont dirigés spécifiquement contre la Dsg1. Les deux autres, 10A1 et CK1, ne réagissent pas avec la Dsg1 mais reconnaissent des protéines épidermiques de plus haut poids moléculaire, compatible avec ceux des autoantigènes de la famille des plakines spécifiquement reconnus par les anticorps au cours du pemphigus paranéoplasique, e.g. l'envoplakine et la périplakine. Grâce à une analyse protéomique ciblée combinant l'immunocriblage d'une carte protéique 2D d'épiderme humain et la spectrométrie de masse MALDI-ToF, nous avons montré que la protéine cible du 10A1 est l’envoplakine, et que le CK1 reconnaît à la fois l'envoplakine et la périplakine. Ainsi, en accord ce modèle expérimental murin, la réponse B anti-Dsg1 pourrait-elle gouverner la réponse vis à vis d’autres protéines du desmosome en particulier, les plakines, mimant de ce fait la diversité de la réponse auto-immune B observée au cours du pemphigus paranéoplasique.
Enfin, nous démontrons par des analyses en PCR que l’ARNm de la Dsg1 est exprimé dans le thymus humain normal, que son expression augmente avec l’âge et de ce fait, que l’absence de l’expression thymique de cette autoantigène ne constitue pas l’origine de la rupture de la tolérance qui concoure au développement des PS.
Nos résultats mettent en exergue le rôle la Dsg1 dans le processus auto-immun au cours
des pemphigus, d'une part, à la phase d'initiation, avec l'intervention de cet autoantigène modifié par épissage alternatif dans la réponse lymphocytaire T et d'autre part, à la phase de propagation, avec la diversification de la réponse anticorps vis à vis d'autres antigènes desmosomiaux induite chez des souris normales immunisées avec cet autoantigène.
MOTS-CLEFS : Auto-immunité / Autoantigène / Desmogléine 1 / Desmosome / Epissage alternatif / Extension épitopique / HLA / Pemphigus / Plakine / Thymus.