أجهزة قياس حيوي

PCRتقانة الـ

http://aleppounibiotech.wordpress.com

المحاضرات على هذا الموقع http://aleppounibiotech.wordpress.com/

األجهزة المستخدمة في مخابر التقانات الحيوية جهاز نسخ قطع الشريط الوراثي والمعروف باسم

PCR األنواع المتوفرة ، طريقة العمل، وبرامجه المختلفة بعض التطبيقات المختلفة

أجهزة الرحالن الكهربائية: الرحالن عبر هالمة اآلغاروز الرحالن عبر هالمة البولي أكريالميد الرحالن عبر هالمات متخصصة بنظام األنبوب الشعري والمعروفة

Capillary باسم تحديد التسلسل النكليوتيدي جهازSequencer

PCRجهاز نسخ قطع الشريط الوراثي ثورة كبيرة في علم البيولوجيا الجزيئية حيث مكنت العلماء من PCRأحدثت تقنية الـ

في وقت قصير وبكفاءة عالية جداً ) مخبرياً ( DNAالحصول على نسخ كبيرة من الـ 1982في العام PCR أول من استخدم تقنية الـKary Mullis) ( يعتبر العالم كاري موليس

، ومنذ ذلك الحين وحتى اآلن التزال المجالت 1985وتم نشرها للمرة األولى في العام والدوريات العلمية تنشر الكثير من الطرق والتقنيات والتعديالت الجديدة والتي تعتمد في األصل على التقنية األم التي استخدمها كاري موليس ألول مرة وحاز بسببها على جائزة

1993نوبل عام DNAتقنية حساسة ويمكن أن تكون عالية التخصص في جزيء معين من الـ PCRالـ

PCRجهاز نسخ قطع الشريط الوراثي

The PCR process requires a repetitive series of the three fundamental steps that defines one PCR cycle: ◦ Double-stranded DNA template denaturation ◦ Annealing of two oligonucleotide primers to the single-

stranded template ◦ Enzymatic extension of the primers to produce copies

that can serve as templates in subsequent cycles

05_02.jpg

05_02_2.jpg

C B

B

B

C

A

A

05_02_3.jpg

PCR

Gel electrophoresis

1. Preparation of the gel

2. Loading the DNA

3. Separation

4. Staining

10 Pictures taken from: http://www.lfu.bayern.de

PCRجهاز نسخ قطع الشريط الوراثي PCR Achievements • speed the human genome discovery and for early

detection of viral diseases. • Single sperm cells to measure crossover frequencies

can be analyzed. • Trace forensic evidence of even mixed samples can

be analyzed. • PCR facilitates cloning and sequencing of DNA. • Generate large amounts of template for sequencing

reaction • PCR has been used to map chromosomes and to

analyze both large and small changes in chromosome structure.

: باختصار PCRما هو الـ

تعتمد الطريقة على استخدام األنزيم)DNA polymerase ( وعلى خاصية انفكاك .المضاعفة لدى تعريضها لدرجة حرارة مرتفعة DNAسلسلة الـ

تتألف مراحل الـPCR من المراحل التالية: التمسخ)Denaturation ( : وفيها يتم فصل السالسل المضاعفة عن بعضها البعض

C 94ويتم عادة في الدرجة مرحلة االلتحام)Annealing ( : درجة تقريباً ليسمح 50وفيها يبرد المزيج إلى الدرجة

.القالب DNA النوعية بااللتحام بالسالسل المفردة من الـ ) Primers(للبادئات مرحلة التطاول)elongation( : درجة مئوية 72وفيها يتم رفع درجة الحرارة إلى

) Mgcl2(والـ ) Buffer(إضافة إلى الـ ) DNA polymerase(تقريباً وبوجود األنزيم تبدأ عملية التضاعف ومع تكرار هذه العملية عدة مرات نحصل في كل مرة ) Mg+2(أي

.على عدد مضاعف من السالسل

Perkin-Elmer

Example: Program 102: 5,52,20,1 5: 95 C for 5 min 52: 95 C for 15 sec. 60 C for 15 sec., 72 C for 30 sec. Go to step one 35 times 20: 72 C for 7 min 1: 4 C hold

أرقام البرامج محدودة •واحد البد من حجز PCRإلنجاز برنامج •

عددة برامجوال يمكن إدخال أحرف إلى الجهاز، لذلك ال بد •

جدول مطبوع مرافق بأسامي من وجود بهم العاملين وأرقام البرامج الخاصة

وزمن االنتقال من درجة حرارة إلى أخرى •)Ramping ( طويل مقارنة باألجهزة

.الحديثة

eppendorf

Example: Program: Test (يمكن وضع أكثر من برنامج ضمن مجموعات وبأسامي مختلفة) 95 C for 5 min Cycle for 35: 95 C for 15 sec. 60 C for 15 sec., 72 C for 30 sec. 72 C for 7 min 4 C hold

0.2 ml

94 94 58

72

4 05:00 00:15

00:15 00:30

∞

PCR gradient هي آلية تمكن من التحكم بدرجة حرارة التحام البادئ لكل

مما يمكننا من تحديد أية PCRصف في نفس جهاز الـ DNAدرجة حرارة هي المناسبة الستنساخ قطع الـ

=

PCR Traditional PCR

Reverse Transcripatse PCR

Touchdown PCR

Nested, Hemi-nested PCR

Multiplex PCR

Colony PCR

Hot Start PCR

In-Situ PCR

Long PCR

Quantitative PCR

Competitive PCR

Fluorometric Real Time PCR

PCR في تقانة الـ عناصر التضاعفيجب أن تتوافر على األقل عناصر PCRلكي يتم تفاعل الـ :التفاعل التالية

قالب الـDNA ) وهو المراد تضخيمه ( البرايمرات (البادئات (primers محلول ملحيBuffer شاردة المغنيزيومMg+2 النيكليوتيداتdNTPs انزيم الـDNA polymerase

.وسوف نناقش كل عنصر من عناصر هذا التفاعل على حدة

DNAقالب الـ : أوالً

تعتمد دقة نتائج الـPCR إلى حد كبير جداً على مدى نقاوةالمستخلص من العينات DNAوجودة وسالمة قالب الـ

المدروسة فكلما كانت نقية وسليمة و كثيرة كانت النتائج أكثر دقة وجودة

وهناك طرق مختلفة وكثيرة جداً الستخالص الحمض النوويبكتيريا –نسخ –خاليا حيوانية (تتبع لطبيعة العينة المدروسة

.)الخ .... خاليا نباتية –فيروسات – يمكن حفظ الـDNA في محلولTE أو الماء على درجة

درجة مئوية أعوام 20-مئوية لمدة عام وعلى درجة 4حرارة متعددة دون أن تتأثر

DNAقالب الـ

العوامل من أهم DNAيعتبر تقطيع الـ الشريط الوراثي الـ ، المستخلص DNAجودة وسالمة قالب الـ التي تؤثر على

:DNAومن أهم العوامل التي تؤدي إلى تقطيع الـ العامل الفيزيائي الناتج عن جهل المخبريين في طريقة

االستخالص تجميد وإعادة حل الـDNA مرات متعددة قد تؤدي إلى

تقطيعه تلوث الـDNA باألنزيمات الهاضمة خاصة عند حفظه

على درجات حرارة المختبر لفترات طويلةالتعرض لألشعة فوق البنفسجية

DNAمصدر الـ

من أية خاليا تتمتع أو كانت DNAيمكن استخالص الـ تتمتع بنشاط حيوي سواء كانت من أحاديات أو

ومن الخاليا الشائعة االستخدام . حقيقيات النوى : على سبيل المثال ال الحصر DNAالستخالص الـ

البشرينسيج الدم البشري الخمائر خاليا النباتات الباكتيربوفاج

DNAكمية الـ

وفق PCRالالزمة لتفاعل الـ DNAتختلف كمية الـ فعلى سبيل المثال لنسخ قطعة . للتقانة المستخدمة

متخصصة من الشريط الوراثي كما هو في مؤشرات Simple sequenceالتتابع القواعد المتكررة البسيطة

repeats واختصارا ندعوها بـSSR نانو 10يكفيناإلنجاز التفاعل بشكل ناجح، بينما DNAغرام من الـ

.AFLPنحتاج إلى كمية أكبر للبدء بتقانة الـ تأخذ بعين DNAمعظم الطرق المتبعة في استخالص الـ

االعتبار كمية النسيج المستخلص وبالتالي تقدر كمية الـ DNA ميكرو غرام 100 – 10النهائية بـ

DNAتقدير كمية ونوعية الـ

50ng 100ng

50ng 100ng

)PCR ) :Buffersالمحاليل المستخدمة في الـ : ثانيا

وسط ذو قوة أيونية ثابتة أثناء عملية التضخيم المحلول الملحي يؤمن حيث ) Tris -Hcl(التقليدي هو PCRالمثالي المستعمل في الـ المحلول

تتراوح ) PH(وبدرجة ) mM 50 – 10(يستخدم بتركيز يتراوح بين من ) mM 50(بتركيز ) Kcl(كما يضاف للوسط ملح ) 8.8- 8.3(بين

DNAأجل تسهيل عملية التحام البرايمرات بالقالب في حاالت ) Buffers(يمكن أن نستخدم أنواع أخرى من المحاليل الدارئة

من أجل تأمين فصل جيد ) NaCl(نوعية فمثالً يمكن استخدام ملح كما C و Gللسالسل المضاعفة والحاوية على كميات كبيرة من الـ

من أجل ) Ammonium sulfate(يمكن استخدام كبريتات األمونيوم غير الكامل النسخ الناتجة عن ) artifacts(الحد من الشوائب

)incomplete amplicons (

يمكن إضافة الـDMSO ) وهي اختصار لـ :Di methyl suphoxide ( في حاالتMultiplex PCR ) الـPCR

يمكن DMSOلكن يجب األخذ بعين االعتبار أن الـ ) المتعدد السالسل .إذا استخدم بكميات كبيرة ) Tag polymerase(ان تثبط األنزيم

يمكن إضافة الجيالتين أو األلبومين البقري المصليBSA أو الفورماميد polymeraseمن أجل ثباتية األنزيم Triton X-100أو الـ

)PCR ) :Buffersالمحاليل المستخدمة في الـ

تركيزها في الحجم الهدف النهائي للتفاعل

المواد المضافة المساعدة

Secondary(يقلل من تشكل البنية الثنائية structure ( والتي تسبب عن المناطق الغنية

GCبـتكرارات الـ

1-1.7 M بيتائين

µg/ml BSA 100-10 وثباتيته يدعم عمل اإلنزيم

عمله مشابه للبيتائين، ويساعد على خفض درجة قد % 10، لكن زيادته عن تركيز Tmاالنصهار

Taqيثبط عمل اإلنزيم

2-10 % DMSO

فورماميد % 5-1 يساعد على زيادة التخصصية في االستنساخ

يساعد على ثباتية نشاط األنزيم وتحسين استنساخ GCالمناطق الغنية بـنكليوتيدات الـ

غليسيرول % 1-10

يساعد على ثباتية نشاط األنزيم ويمنع تشكل البنية الثنائية ولكنه قد يلعب دور سلبي في تخصصية

االستنساخ

X-100تريتون % 0.1-1

يزيد في تخصصية االستنساخ، وتقليل االخطاء )hybridization(وتحسين عملية التهجين

15-100 mM تتراميثيل كلوريد األمونيوم)TMAC(

يزيد في تخصصية االستنساخ، ويزيد كفاءة االستنساخ وزيادته

2 mM تتراميثيل أوكزاالت األمونيوم)TMA oxalate(

)PCR ) :Buffersالمحاليل المستخدمة في الـ

dNTPsالـ : ثالثاً

عادة ما يتم تحضير الـdNTP ميلي 10على شكل محاليل تركيزها ) pH=7عند درجة (مول لكل نوع من النكليوتيدات

يفضل أن يكون تركيز الـdNTPs 20(في التفاعالت العادية ما بين - ولتركيز , المراد تضخيمه DNAميكرومول وهذا يتبع لحجم الـ ) 200

dNTPsوعادة ما يكون هذا التركيز كافي لكي يؤمن Mg+2شوارد الـ خالل سير التفاعل وحتى األخير

ال يفضل زيادة تركيز الـdNTPs ألن الزيادة يمكن أن تؤدي لتشكل نواتج غيرنوعية

من المهم أن نستخدم الـdNTPs بنسب متساوية بين جميع النكليوتيدات Mis(وذلك لإلقالل من األخطاء الناجمة عن سوء االدخال

incorporation ( لتضخيم قطعة الـ رميكرومول 200عادة ما يكفي تركيزDNA القالب

دورة حرارية 30ولمدة ) Kbp 2(طولها

ركيز شوارد المغنيزيوم ت نزيمي كمساعد إيعمل المغنيزيوم)co-factor( لألنزيم

)DNA-polymerase ( وله تأثير هام للغاية على نوعية PCRالناجمة عن الـ القطع

تشكل شوارد المغنيزيوم معقدات ذوابة مع الـdNTPs ) polymerase(لكي يسهل التعرف عليها من قبل االنزيم

تصفيفها وفق ما يقابلها من كأساس فيويعاملها .نكليوتيدات مناسبة

0.5(عادة ما يتراوح تركيز شاردة المغنيزيوم ما بين – في التفاعالت التقليدية (واألكثر شيوعاً . رميلي مول) 2.5وذلك عندما يكون تركيز الـ ) رميلي مول 1.5هي

dNTPs )200 (رميكرومول .

ركيز شوارد المغنيزيوم ت الـ , الخضاب , يمكن أن يؤثر وجود كل من الهيبارينEDTA

ولذلك يفضل Mg+2أحياناً وعناصر أخرى سلباً على عمل الـ أن يتم جمع الدم على مضاد تخثر يحوي السترات أو كميات

)أن يتوفر السترات ( EDTAضئيلة من الـ : يمكن أن يؤثر تغيير تركيز شوارد المغنيزيوم على

.القالب DNAالتحام البرايمرات مع الـ ◦ درجة حرارة فصل السالسل المضاعفة ◦ PCRنوعية ناتج الـ ◦ Primer- dimerتشكل شوائب من الـ ◦وكفاءته في المقابلة الصحيحة polymeraseفعالية أنزيم الـ ◦

للنكليوتيدات

DNA polymerase: رابعاً Turnover rate : وهي عدد النكليوتيدات التي يمكن لالنزيم أن يضيفها

DNAللسلسلة الجديدة في الدقيقة الواحدة لكل جزئ من الـ polymerase

polymerization rate أوExtension rate : وهي مقدار النكليوتيدات .في الثانية الواحدة المستنسخة التي يضمها األنزيم إلى السلسلة

Processivity : وهي مقدار النكليوتيدات التي يستطيع األنزيم أن يضمها .قبل أن يفقد فعاليته ويتخرب DNAإلى سلسلة الـ

الـFidelity وهي قدرة األنزيم على إدخال النكليوتيدات : أي دقة الترجمة الصحيحة إلى السلسلة الجديدة وفق ما يقابلها في السلسلة القالب

حدة اتقدر فعالية األنزيم بالوUnit كمية األنزيم الالزمة : وهي بالتعريفدقيقة في 30في DNAإلى سلسلة الـ dNTPsنانومول من 10إلدخال C 74الدرجة

DNA polymerase على إضافة اإضافة إلى قدرتههنالك خصائص أخرى إلنزيمات البوليميرات

: ومنها DNAالنكليوتيدات على سالسل الـ Exonuclease activity : تقترن هذه ‘ 3 > ’5في االتجاه من

الوظيفة بعملية تصحيح القراءة والتثبيت منها خاصة الـExonuclease activity 3> ’5باالتجاه’ يعتبر هذا األنزيم من مجموعة الـ : من الناحية األنزيميةholoenzyme

Mg+2هو الـ cofactorعامل مساعدنظراً ألنه يحتاج إلى ًميكروليتر / وحدات 5(بتركيز عادة ما يكون هذا األنزيم متوفرا ( حجم من مزيج ليترميكر 100حدة لكل او) 2.5 – 1(عادة ما يكفي

حيث تضمن هذه الكمية إطالة دقيقة وصحيحة للسلسلة PCRتفاعل الـ وفي حال زادت كمية األنزيم يمكن أن يؤدي إلى نواتج غير . الجديدة

نوعية

PCRجهاز نسخ قطع الشريط الوراثي PCR Enzymes 1. AmpliTaq DNA Polymerase: Biophysical Properties: ◦ The enzyme is a 94-kDa protein ◦ 5'-3' polymerization activity ◦ Most efficient in the 70°–80°C range. ◦ Thermostable, with a half-life at 95°C of 35–40 min ◦ PCR products amplified using AmpliTaq DNA polymerase will often have

single base overhangs on the 3' ends of each polymerized strand, and this artifact can be successfully exploited for use with T/A cloning vectors.

◦ Extension Rate 75 nucleosides/s ◦ Source: Thermus aquaticus

Biochemical Reactions: ◦ DNA Polymerase requires magnesium ion

PCRجهاز نسخ قطع الشريط الوراثي AmpliTaq Gold AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) is chemically

modified AmpliTaq DNA polymerase. The reversible modification keeps the enzyme inactive at room temperature. High temperature and low pH promote the reversal, restoring the enzyme activity. These conditions occur in a Tris-buffered PCR at 92°–95°C (Tris-HCl formulated to pH 8.3 at 25°C drops below pH 7.0 above 90°C).

2. Pfu DNA Polymerase: ◦Source: Pyrococcus furiosus

◦Thermostable, with a half-life at 95°C more than 120 min

◦Extension Rate 75 nucleosides/s

3. Others such as Pwo (Pyrococcus woesei), Tfl (Thermas flavus), Tli (Thermus litoris) and Tma (Thermotoga maritima)

القسم العملي

:الجلسة األولىالتعرف على الماصات الدقيقة طريقة استخالص الـDNA من النباتات طريقة استخالص الـDNA من الدم طريقة استخالص الـDNA من األنسجة