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8/4/2019 Pencil Lin

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J O U R N A L OF B A C T E R I O L O G Y , J a n . 1 9 8 1 , p . 3 9 8 4 0 30 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 1 / 0 1 0 3 9 8 - 0 6 $ 0 2 . 0 0 / 0

V o l . 1 4 5 , N o . 1

P u r i f i c a t i o n o f P e n i c i l l i n - B i n d i n g P r o t e i n 2 o f E s c h e r i c h i a c o l i

SUSAN J . CURTISt AND JACK L . STR OMINGER*T h e B i o l o g i c a l L a b o r a t o r i e s , H a r v a r d U n i v e r s i t y , C a m b r i d g e , M a s s a c h u s e t t s 0 2 1 3 8

P e n i c i l l i n - b i n d i n g p r o t e i n 2 ( P B P - 2 ) o f E s c h e r i c h i a c o l i K - 1 2 w a s p u r i f i e d b y

c o v a l e n t a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y u s i n g 6 - a m i n o p e n i c i l l a n i c a c i d c o v a l e n t l y c o u -

p l e d t o c a r b o x y m e t h y l - S e p h a r o s e ( 6 - A P A - C M - S e p h a r o s e ) . P u r i f i c a t i o n o f PBP-

2 w a s a c c o m p l i s h e d b y p r e b i n d i n g t h e m e t h o x y c e p h a l o s p o r i n , c e f o x i t i n , t o t h e

T r i t o n X - 1 0 0 - s o l u b i l i z e d PBPs o f E . c o l i a n d t h e n i n c u b a t i n g t h e PBPs w i t h 6 -A P A - C M - S e p h a r o s e . C e f o x i t i n r e a d i l y b i n d s t o a l l t h e E . c o l i PBPs e x c e p t PBP-

2 a n d , t h u s , i n t h e p r e s e n c e o f c e f o x i t i n , o n l y P B P - 2 c o u l d b i n d t o t h e 6 - A P A -

C M - S e p h a r o s e . T h e p u r i f i c a t i o n o f a m i x t u r e o f a l l o f t h e PBPs o f E . c o l i b y

a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y i s a l s o d e s c r i b e d .

P e n i c i l l i n a n d o t h e r , B - l a c t a m a n t i b i o t i c s k i l lb a c t e r i a b y i n h i b i t i n g s y n t h e s i s o f t h e b a c t e r i a lc e l l w a l l ( 1 , 4 , 2 9 ) . D i f f e r e n t a p p r o a c h e s h a v e

b e e n u s e d t o d e t e r m i n e w h i c h s t e p s o f c e l l w a l ls y n t h e s i s a r e i n h i b i t e d . F o r e x a m p l e , i n E s c h e -

r i c h i a c o l i a n d B a c i l l u s s u b t i l i s p e n i c i l l i n - s e n -s i t i v e e n z y m e s t h a t may b e i n v o l v e d i n t h e s y n -

t h e s i s o f t h e p e p t i d o g l y c a n l a y e r o f t h e c e l l w a l lh a v e b e e n s t u d i e d ( 3 - 5 , 1 2 , 1 3 , 3 4 ) . T h e s e e n -z y m e s h a v e b e e n i d e n t i f i e d a s p e p t i d o g l y c a n

t r a n s p e p t i d a s e s a n d D - a l a n i n e c a r b o x y p e p t i -

d a s e s , b o t h o f w h i c h a r e p e n i c i l l i n s e n s i t i v e i nv i t r o . Two p e n i c i l l i n - s e n s i t i v e c a r b o x y p e p t i d a s e

a c t i v i t i e s p u r i f i e d f r o m E . c o l i ( c a r b o x y p e p t i -d a s e s I A a n d I B , C ) ( 3 4 ) a r e p r o b a b l y n o t r e -q u i r e d f o r n o r m a l c e l l g r o w t h ( 1 1 , 1 9 , 2 0 ) . T h em a j o r c a r b o x y p e p t i d a s e o f B . s u b t i l i s i s o n l y

i n h i b i t e d b y c o n c e n t r a t i o n s o f c e p h a l o t h i n muchg r e a t e r t h a n t h o s e r e q u i r e d t o k i l l t h e c e l l , a n di t i s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y c o n c e n t r a t i o n s o f 6 -a m i n o p e n i c i l l a n i c a c i d ( 6 - A P A ) w h i c h h a v e n o

e f f e c t o n t h e g r o w t h o f B . s u b t i l i s ( 2 ) .M e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n s o f B . s u b t i l i s a n d

E . c o l i w h i c h b i n d p e n i c i l l i n c o v a l e n t l y h a v e a l s ob e e n i n v e s t i g a t e d a s p o s s i b l e t a r g e t s o f p e n i c i l l i na c t i o n ( 2 5 , 2 7 , 3 0 , 3 1 ) . I n t h e c a s e o f E . c o l i ,t h e s e p e n i c i l l i n - b i n d i n g p r o t e i n s ( P B P s ) w e r es o l u b i l i z e d w i t h t h e i o n i c d e t e r g e n t S a r k o s y l

N I - 9 7 a n d t h e n s e p a r a t e d b y s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s( S l ) S - P A G E ) ( 2 5 , 2 7 ) . S e v e n E . c o l i PBPs h a v eb e e n i d e n t i f i e d b y t h i s m e t h o d . G e n e t i c a n db i o c h e m i c a l s t u d i e s o f t h e PBPs f r o m E . c o l ih a v e i n d i c a t e d t h a t : ( i ) P B P - 1 i s i n v o l v e d i n t h e

e l o n g a t i o n o f t h e c e l l w a l l d u r i n g t h e c e l l d i v i s i o nc y c l e : ( i i ) P B P - 2 h a s s o m e f u n c t i o n i n t h e m a i n -t e n a n c e o f p r o d u c t i o n o f t h e r o d m o r p h o l o g y o fE . c o l i c e l l s ; a n d ( i i i ) P B P - 3 i s i n v o l v e d i n t h e

t P r e e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , C o l l e g e o f

M e d i c i n e , H o w a r d U n i v e r s i t y , W a s h i n g t o n , DC 2 0 0 6 9 .

f o r m a t i o n o f t h e s e p t u m d u r i n g c e l l d i v i s i o n ( 2 5 ,3 2 , 3 3 ) . P B P - 1 i n c l u d e s t w o p r o t e i n c o m p o n e n t st e r m e d PBP-1A a n d P B P - l B s , a n d P B P - l B smay b e a t r a n s p e p t i d a s e ( 2 6 , 3 3 ) . P B P - 4 , - 5 , a n d- 6 h a v e t r a n s p e p t i d a s e a n d c a r b o x y p e p t i d a s e a c -t i v i t y i n v i t r o ( 1 1 , 2 0 , 2 8 , 3 4 ) . P B P - 4 i s i d e n t i c a lt o c a r b o x y p e p t i d a s e I B o f E . c o l i , a n d P B P - 5a n d P B P - 6 a r e t h e p o l y p e p t i d e s c o m p o s i n g c a r -b o x y p e p t i d a s e I A ( 1 1 , 1 9 , 2 0 , 2 8 , 3 4 ) . M u t a n t s

l a c k i n g P B P - 4 ( d a c B ) g r o w n o r m a l l y ( 1 1 , 2 0 ) , a s

d o t h o s e l a c k i n g t h e m a j o r a c t i v i t y o f D - a l a n i n e

c a r b o x y p e p t i d a s e I A ( d a c A ) ( 1 9 ) . The d o u b l em u t a n t d a c A d a c B i s a l s o a p p a r e n t l y n o r m a l

( 1 9 ) . H o w e v e r , t h e d a c A m u t a t i o n h a s b e e n

s h o w n t o b e a m u t a t i o n o f P B P - 5 a n d , t h u s , t h i sd o u b l e m u t a n t s t i l l h a s a b o u t 1 0 % o f t h e w i l d -t y p e c a r b o x y p e p t i d a s e a c t i v i t y , d u e t o t h e p r e s -e n c e o f a n u n a l t e r e d P B P - 6 ( 2 1 ) . T h u s , t h e

q u e s t i o n o f w h e t h e r some D - a l a n i n e c a r b o x y p e p -t i d a s e a c t i v i t y i s e s s e n t i a l f o r n o r m a l g r o w t h i s

s t i l l u n a n s w e r e d . P B P - 4 h a s a l r e a d y b e e n p u r i -f i e d ( 3 4 ) . A m i x t u r e o f P B P - 5 a n d - 6 was o b -t a i n e d p r e v i o u s l y ( 3 4 ) , a n d t h e s e two PBPs were

r e c e n t l y s e p a r a t e d ( H . A m a n u m a , m a n u s c r i p t i np r e p a r a t i o n ) . S t u d i e s o f t h e f u n c t i o n s o f E . c o l iP B P - 1 , - 2 , a n d - 3 i n c e l l w a l l s y n t h e s i s w o u l d b e

g r e a t l y f a c i l i t a t e d b y p u r i f i c a t i o n o f t h e s e p r o -

t e i n s a s w e l l .M e c i l l i n a m ( 6 - / i - a m i d i n o p e n i c i l l a n i c a c i d )

( s e e F i g . 1 ) h a s a u n i q u e e f f e c t on E . c o l i c e l l s .A t c o n c e n t r a t i o n s o f t h e a n t i b i o t i c o f 0 . 1 , u g p e r

m l o r l e s s , E . c o l i c e l l s b e c o m e s p h e r i c a l , a n d

t h e n t h e y e v e n t u a l l y l y s e ( 1 7 , 2 2 ) . A r o u n d m o r -

p h o l o g y o c c u r s w i t h a h i g h f r e q u e n c y amongm e c i l l i n a m - r e s i s t a n t m u t a n t s ( 1 0 , 1 8 ) . P B P - 2

h a s a v e r y h i g h s p e c i f i c i t y f o r b i n d i n g m e c i l l i n a m

( 2 4 , 2 5 ) . The c o n c e n t r a t i o n o f m e c i l l i n a m a t

w h i c h P B P - 2 i s 5 0 % s a t u r a t e d i s 0 . 0 2 i L g p e r m l

p e r 1 0 m i n a t 3 0 0 C . The o t h e r PBPs o f E . c o l id o n o t b i n d m e c i l l i n a m a t t h i s c o n c e n t r a t i o n

( 2 5 ) . A m u t a n t l a c k i n g P B P - 2 h a s b e e n i s o l a t e d

3 9 8

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PURIFICATION O F E . COLI P B P - 2 399

( 2 4 - 2 6 ) . The m u t a n t i s a t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v em u t a n t o f E . c o l i w h i c h i s r e s i s t a n t t o m e c i l l i -nam a t 3 0 0 C . C e l l s o f t h i s m u t a n t , S P 6 , h a v e a

r o u n d m o r p h o l o g y i n s t e a d o f a r o d m o r p h o l o g y

a t 3 0 0 C a n d d o n o t g r o w a t 4 2 0 C . G e n e t i c a n a l -y s i s o f SP 6 a n d o f a s e c o n d t e m p e r a t u r e - s e n s i -t i v e m u t a n t w h i c h i s r o d - s h a p e d a t 3 0 0 C b u t

g r o w s a s a s p h e r e a t 4 2 0 C i n d i c a t e s t h a t t h e

r o d A g e n e i s e i t h e r t h e s t r u c t u r a l g e n e f o r P B P -

2 o r i s v e r y c l o s e l y l i n k e d t o t h a t g e n e ( 9 ) . Ther o d A g e n e , a g e n e m a i n t a i n i n g t h e r o d s h a p e o f

t h e c e l l , a n d t h e g e n e s f o r PBP-2 a n d m e c i l l i n a mr e s i s t a n c e a r e a l l c o t r a n s d u c i b l e w i t h t h e l i pg e n e a t t h e same f r e q u e n c y ( 9 ) . T h e s e r e s u l t sl e d t o t h e c o n c l u s i o n t h a t PBP-2 h a s a f u n c t i o n

i n m a i n t a i n i n g o r p r o d u c i n g t h e n o r m a l r o d m o r -

p h o l o g y o f E . c o l i . P u r i f i c a t i o n o f PBP-2 i s ap r e r e q u i s i t e t o f u r t h e r b i o c h e m i c a l s t u d i e s o f

t h e f u n c t i o n s w h i c h i t may p e r f o r m i n c e l l w a l l

b i o s y n t h e s i s . T h i s p a p e r d e s c r i b e s t h e p u r i f i c a -t i o n o f E . c o l i P B P - 2 , a s w e l l a s t h a t o f a m i x t u r eo f a l l o f t h e PBPs o f E . c o l i b y c o v a l e n t p e n i c i l l i na f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y ( 3 ) .

MATERIALS AND METHODS

P r e p a r a t i o n s o f m e m b r a n e s . C e l l s o f E . c o l i K -1 2 s t r a i n H 2 1 4 3 , g r o w n t o l o g p h a s e i n a m e d i u md e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 3 4 ) , w e r e u s e d t o p r e p a r e E . c o l im e m b r a n e s . C e l l s ( 3 0 0 g ) w e r e s u s p e n d e d i n 3 0 0 m l o f

0 . 0 2 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) , a n d t h ec e l l s w e r e t h e n g r o u n d w i t h 3 0 0 m l o f g l a s s b e a d s( P o t t e r s I n d u s t r i e s ) i n a G i f f o r d Wood m a x i - m i l l f o r3 0 m i n a t 5 ° C . T h e g r o u n d c e l l s w e r e t h e n c e n t i f u g e df o r 2 0 m i n a t 5 , 0 0 0 r p m i n a S o r v a l l c e n t i f u g e t or e m o v e w h o l e c e l l s a n d d e b r i s . T h e s u p e r n a t a n t w a st h e n c e n t r i f u g e d a t 3 8 , 0 0 0 rpm i n a m o d e l B 6 0 u l t r a -c e n t r i f u g e ( I n t e r n a t i o n a l E q u i p m e n t C o . , N e e d h a mH e i g h t s , M a s s . ) , u s i n g a n A 1 7 0 r o t o r f o r 4 0 m i n . T h em e m b r a n e p e l l e t o b t a i n e d w a s t h e n s u s p e n d e d i n 5 0 0m l o f 0 . 0 2 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) a n dc e n t r i f u g e d a g a i n a t 3 8 , 0 0 0 rpm f o r 4 0 m i n . T h e p e l l e tw a s w a s h e d a g a i n i n t h i s m a n n e r w i t h 5 0 0 m l o f t h es a m e

b u f f e r . T h e w a s h e d m e m b r a n e s w e r e s u s p e n d e di n 0 . 0 2 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) t o ap r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f 2 0 mg p e r m l ,

P r e p a r a t i o n o f 6 - A P A - C M - S e p h a r o s e o r a m i -n o p r o p y l m e c i f l i n a m - S e p h a r o s e . U s i n g t h em e t h o d o f C u a t r e c a s a s a n d P a r i k h ( 7 ) , c a r b o m e t h y l( C M ) - S e p h a r o s e - C L - 6 B ( P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a l s ,I n c . , P i s c a t a w a y , N . J . ) w a s r e a c t e d w i t h N - h y d r o x y -s u c c i n i m i d e t o f o r m t h e N - h y d r o x y s u c c i n i m i d e e s t e ro f t h e c a r b o x y m e t h y l g r o u p s o f t h e C M - S e p h a r o s e . 6 -AP A o r a m i n o p r o p y l m e c i l l i n a m ( F i g . 1 ) c o u l d b ec o u p l e d t o t h e C M - S e p h a r o s e b y t h e r e a c t i o n o f t h e i rp r i m a r y a m i n o g r o u p s w i t h t h e N - h y d r o x y s u c c i n i m i d ee s t e r .

A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f t h e P B P s . T h e E .c o l i PBPs w e r e s o l u b i l i z e d f r o m m e m b r a n e s o f s t r a i nH 2 1 4 3 ( 5 0 0 mg o f p r o t e i n ) b y a d d i n g t o t h e m a n e q u a lv o l u m e o f b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 1 M p o t a s s i u m p h o s -p h a t e ( p H 7 . 0 ) , 2% T r i t o n X - 1 0 0 , 1 M N a C l , 0 . 0 6 MM g C l 2 a n d i n c u b a t i n g a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 0 m i n .

N H 2 S C H 31 CH3

o N-'-'COOH

6 - A m i n o p e n i c i l l o n i c A c i d

0I I HjCH2-CN SCH3

ONC C O O H

B e n z y l p e n i c i l l i n( P e n i c i l l i n G )

C H 2 - C H 2 I C H 2 > N C N J . L CH3CH2-CHp-CH2 H > QCOH

O COOH

M e c i l l i n o m

CHa-HpCHICHI ,.

I _ I C H 2 - C H 2 ~ - C H 2 > N 1 HA O

H 3N H ? - C 2 -

A m i n o p r o p y l m e c i l l i n o m

F I G . 1 . C h e m i c a l s t r u c t u r e s o f j 8 - l a c t a m a n t i b i o t -i c s u s e d .

The m e m b r a n e s w e r e s t i r r e d d u r i n g t h i s i n c u b a t i o np e r i o d . T h e m e m b r a n e m i x t u r e w a s t h e n c e n t r i f u g e d

a t 3 8 , 0 0 0 r p m f o r 3 0 m i n w i t h a n I E C m o d e l B 6 0u l t r a c e n t r i f u g e . The s u p e r n a t a n t c o n t a i n e d t h e c r u d es o l u b i l i z e d P B P s . I n t h e c a s e w h e r e P B P - 2 a l o n e w a st o b e i s o l a t e d , c e f o x i t i n o r c e p h r a d i n e w a s a d d e d t ot h e s o l u b i l i z e d P B P s , a n d t h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e da t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 0 m i n . I f a l l t h e PBPs w e r et o b e i s o l a t e d , t h i s s t e p w a s e l i m i n a t e d . An e q u a lv o l u m e o f 0 . 0 2 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 )w a s a d d e d t o t h e P B P s , a n d t h e n t h e PBPs w e r ei n c u b a t e d w i t h 1 0 m l o f 6 - A P A - C M - S e p h a r o s e f o r 3 0m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e 6 - A P A - C M - S e p h a r o s ew a s t h e n f i l t e r e d i n a s i n t e r e d g l a s s f i l t e r a n d w a s h e ds u c c e s s i v e l y w i t h 3 0 0 m l o f b u f f e r c o m p o s e d o f 0 . 0 5 M

p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) , 0 . 1 % T r i t o n X -1 0 0 , 1 mM 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , 3 0 0 m l o f t h e s a m eb u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 1 M N a C l , a n d 3 0 0 m l o f t h e b u f f e rc o n t a i n i n g 2 M N a C l . T h i s e x t e n s i v e w a s h i n g w a sn e c e s s a r y t o r e m o v e p r o t e i n s w h i c h h a d b o u n d t o t h e6 - A P A - C M - S e p h a r o s e n o n - s p e c i f i c a l l y t h r o u g h , f o re x a m p l e , h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s ( 2 3 ) .

T h e w a s h e d 6 - A P A - C M - S e p h a r o s e w a s t h e np o u r e d i n t o a 2 0 - m l g l a s s c o l u m n . To e l u t e t h e PBPsf r o m t h e 6 - A P A - C M - S e p h a r o s e , a t r o o m t e m p e r a t u r e1 0 m l o f a b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 0 5 M p o t a s s i u m p h o s -p h a t e ( p H 7 . 0 ) , 1 % T r i t o n X - 1 0 0 , a n d 0 . 4 M NH20Hw a s p a s s e d t h r o u g h t h e c o l u m n a n d c o l l e c t e d . A f t e r3 0 m i n h a d e l a p s e d , a n a d d i t i o n a l 1 0 m l o f t h e b u f f e r

w a s p a s s e d t h r o u g h t h e c o l u m n a n d c o l l e c t e d , a n da f t e r t h e f o l l o w i n g 3 0 - m i n p e r i o d , a f i n a l 1 0 - m l f r a c t i o no f t h e b u f f e r w a s c o l l e c t e d f r o m t h e c o l u m n .

T h e t h r e e f r a c t i o n s o f b u f f e r c o n t a i n i n g t h e e l u t e dPBPs w e r e c o m b i n e d a n d d i a l y z e d o v e r n i g h t a g a i n s t1 0 l i t e r s o f 0 . 0 1 M T r i s - h y d r o c h l o r i d e b u f f e r ( p H 7 . 5 )

V O L . 1 4 5 , 1 9 8 1

8/4/2019 Pencil Lin


400 CURTIS AND STROMINGER

c o n t a i n i n g 0 . 1 % T r i t o n X - 1 0 0 a n d 1 mM 2 - m e r c a p t o -

e t h a n o l a t 5 0 C . T h i s d i a l y s i s r e m o v e d t h e NH20Hf r o m t h e P B P p r e p a r a t i o n . T h e PBPs w e r e t h e n c o n -c e n t r a t e d o n a 0 . 2 - m l c o l u m n o f D E AE - c e l l u l o s e ( D E -5 2 , W h a t m a n ) a n d e l u t e d f r o m t h e D E - 5 2 w i t h t h r e ec o l u m n v o l u m e s o f a b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 0 5 M T r i s -h y d r o c h l o r i d e ( p H 7 . 5 ) , 1 % T r i t o n X - 1 0 0 , a n d 0 . 5 MN a C l .

P B a s s a y s a n d SDS-PAGE o f t h e P B P s . To 1 0 0

p l o f t h e P B P p r e p a r a t i o n i s o l a t e d , 1 0 p 1 o f [ " C ] p e n i -c i l l i n G ( 5 4 p C i / p m o l ) o r 2 p 1 o f [ " C l m e c i l l i n a m ( 6 4, u C i / , u m o l ) w a s a d d e d . The f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f[ I 4 C ] p e n i c i l l i n G w a s 6 8 p g p e r m l , a n d t h e f i n a l c o n -

c e n t r a t i o n o f m e c i l l i n a m w a s 3 p g p e r m l . T h e P B Ps a m p l e s a s s a y e d u s u a l l y c o n t a i n e d 2 t o 5 p g o f p r o t e i n .T h e a s s a y s w e r e i n c u b a t e d f o r 1 0 m i n a t 2 5 0 C , a n dt h e n 4 0 0 i 1 o f c o l d a c e t o n e w a s a d d e d t o t e r m i n a t e t h e

a s s a y a n d p r e c i p i t a t e t h e P B P s . T h e m i x t u r e w a s

c e n t r i f u g e d a t 7 , 0 0 0 r p m i n a S o r v a l l c e n t r i f u g e . T h e nt h e p r o t e i n p e l l e t o b t a i n e d w a s s u s p e n d e d i n 5 0 p l o fb u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 6 2 5 M T r i s - h y d r o c h l o r i d e ( p H 6 . 8 ) ,1 0 % g l y c e r o l , 5% 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , a n d 3% S D S , a n dt h e s a m p l e s w e r e b o i l e d f o r 5 m i n .

The PBPs w e r e t h e n s u b j e c t e d t o SDS-PAGE b yt h e m e t h o d o f L a e m m l i a n d F a v r e ( 1 5 ) . SDS w a s

p r e s e n t a t a c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 % i n t h e g e l . T h eu p p e r s t a c k i n g g e l c o n t a i n e d 6 % a c r y l a m i d e , a n d t h e

l o w e r s e p a r a t i n g g e l c o n t a i n e d 1 0 % a c r y l a m i d e . R a d i o -

a c t i v e p r o t e i n b a n d s i n t h e g e l w e r e d e t e c t e d b y f l u o -r o g r a p h y b y t h e m e t h o d o f B o n n e r a n d L a s k e y ( 6 ) .K o d a k X R - 5 X - r a y f i l m w a s u s e d i n t h e f l u o r o g r a p h yp r o c e d u r e . T h e f i l m w a s e x p o s e d t o t h e g e l f o r 2 w e e k s

f o r t h e d e t e c t i o n o f a l l PBPs i s o l a t e d .P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y t h e

m e t h o d o f L o w r y e t a l . ( 1 6 ) .C h e m i c a l s . [ 4 C ] p e n i c i l l i n G ( 5 4 , C i / , u m o l ) w a s

o b t a i n e d f r o m A m e r s h a m C o r p . , A r l i n g t o n H e i g h t s ,I l l . [ " C l m e c i l l i n a m ( 6 4 p C i / p m o l ) w a s a g i f t f r o m L e oP h a r m a c e u t i c a l C o . , a s w e r e n o n r a d i o a c t i v e m e c i l l i -nam a n d a m i n o p r o p y l m e c i l l i n a m . C e p h r a d i n e a n d

c e f o x i t i n w e r e k i n d l y p r o v i d e d b y t h e M e r c k C o m -p a n y .

RESULTS

I s o l a t i o n o f E .c o l i

PBPsb y a f f i n i t y

c h r o -

m a t o g r a p h y . The PBPs o f B . s u b t i l i s a n d

S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s h a v e b e e n p u r i f i e d w i t h

S e p h a r o s e 4 B - 2 0 0 ( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t .L o u i s , M o . ) c o n t a i n i n g t h e s p a c e r a r m 6 - a m i n o -

h e x a n o i c a c i d t o w h i c h 6-APA h a d b e e n c o u p l e d( 6 - A P A - A H - S e p h a r o s e 4 B - 2 0 0 ) . T h e s e p u r i f i c a -t i o n s i n v o l v e s o l u b i l i z a t i o n o f b a c t e r i a l m e m -

b r a n e s w i t h T r i t o n X - 1 0 0 a n d i n c u b a t i o n o f t h e

d e t e r g e n t e x t r a c t w i t h S e p h a r o s e c o v a l e n t l ys u b s t i t u t e d w i t h a p e n i c i l l i n o r c e p h a l o s p o r i n ,f o l l o w e d b y e l u t i o n o f t h e P B Ps w i t h h y d r o x y l -a m i n e ( 3 , 1 4 ) . A s i m i l a r t e c h n i q u e w a s u s e d t o

p u r i f y t h e E . c o l i P B P s . I n i t i a l a t t e m p t s t o p u -r i f y t h e E . c o l i PBPs y i e l d e d p r e p a r a t i o n s o f

PBPs w h i c h w e r e b a d l y c o n t a m i n a t e d w i t h

o t h e r p r o t e i n s w h i c h b o u n d t o t h e 6 - A P A - A H -

S e p h a r o s e 4 B - 2 0 0 n o n - s p e c i f i c a l l y . I t i s l i k e l y

t h a t t h e n o n s p e c i f i c b i n d i n g r e s u l t e d f r o m h y -

d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e membranep r o t e i n s a n d t h e h e x a m e t h y l e n e s p a c e r a r m o f

t h e 6 - A P A - A H - S e p h a r o s e 4 B - 2 0 0 ( 2 3 ) .

T h e e x t e n t o f n o n s p e c i f i c b i n d i n g t o t h e a f f i n -i t y c h r o m a t o g r a p h y r e s i n w a s s i g n i f i c a n t l y r e -d u c e d b y t h e u s e o f a r e s i n w i t h a s h o r t e r s p a c e r( 6 - A P A - C M - S e p h a r o s e ) , w h i c h w a s f o r n e d b yc o u p l i n g 6-APA t o C M - S e p h a r o s e ( P h a r n a c i a )u s i n g t h e m e t h o d o f C u a t r e c a s a s a n d P a r i k h ( 7 ) .I t h a d p r e v i o u s l y b e e n s h o w n t h a t t h i s p e n i c i l l i na f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y r e s i n c o u l d b e u s e d t op u r i f y t h e D - a l a n i n e c a r b o x y p e p t i d a s e o f B a c i l -

l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s ( 3 5 ) .I n a d d i t i o n t o t h e E . c o l i PBPs p r e v i o u s l y

i d e n t i f i e d b y S p r a t t a n d P a r d e e ( 2 7 ) , f o u r o t h e r

p r o t e i n s w h i c hb i n d

[ " C ] p e n i c i l l i na r e p r e s e n t

i n t h e P B P p r e p a r a t i o n o b t a i n e d b y a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y u s i n g 6 - A P A - C M - S e p h a r o s e( F i g . 2 ) . T h e s e a r e t h e t w o b a n d s p r e s e n t b e -

t w e e n P B P - 3 a n d PBP4, c a l e d PBP-3A a n dP B P - 3 B , a n d t h e t w o b a n d s b e l o w P B P - 6 , c a l e dP B P - 7 a n d - 8 . V e r y l i t t l e P B P - 5 i s p r e s e n t i n t h eP B P p r e p a r a t i o n c o m p a r e d t o t h e a m o u n t o f

A

PBP

.-M.W~ - I

..

. 1 % . . . . . . ' . ,_'A

- 2- 3} - 3 a , 3 b- 4

5. - . 7

- 8

- d y e

a b f r o n t

B

PBP

-8 - I

___-2- 3

a3a,3b- 4

m _7 6

i 0 " W -8

a b

F I G . 2 . PAGE o f E . c o l i P B P s p u r i f i e d b y a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y .

( A )C o o m a s s i e b l u e - s t a i n e d

p o l y -a c r y l a m i d e g e l : l a n e s a and b a r e d u p l i c a t e s a m p l e so f t h e P B P p r e p a r a t i o n . ( B ) F l u o r o g r a m o f t h e p o l y -a c r y l a m i d e s l a b g e l : l a n e a , b i n d i n g o f / ' C J p e n i c i l l i nG t o t h e P B P s ; l a n e b , b i n d i n g o f " 4 C J m e c i l l i n a m t o

t h e P B P s . S e e t h e t e x t f o r d e t a i l s .

J . B A C T r E R I O L .

8/4/2019 Pencil Lin


V O L . 1 4 5 , 1 9 8 1

P B P - 6 . H o w e v e r , when t h e s e p r o t e i n s a r e p u r i -f i e d b y t h e m e t h o d o f Tamura e t a l . ( 3 4 ) , t h e ya r e p r e s e n t i n a p p r o x i m a t e l y e q u a l a m o u n t s .The s m a l l amount o f P B P - 5 i n t h e P B P p r e p a -

r a t i o n i s d u et o t h e

f a c t t h a tP B P - 5 d o e s n o t

b i n d t o 6 - A P A - C M - S e p h a r o s e , a l t h o u g h i t w i l lb i n d t o s i m i l a r a f f i n i t y c o l u m n s w i t h l o n g e rs p a c e r a r m s ( H . A m a n u m a , m a n u s c r i p t i n p r e p -

a r a t i o n ) .I n F i g . 2 B , l a n e b , t h e b i n d i n g o f [ " 4 C ] m e c i l l i -

nam t o t h e PBPs i s s h o w n . A t t h e c o n c e n t r a t i o n

o f m e c i l l i n a m u s e d i n t h e a s s a y s , o n l y P B P - 2s h o u l d b i n d m e c i l l i n a m ( 2 5 ) . T h u s , t h e m a j o rp r o t e i n b a n d b i n d i n g m e c i l l i n a m i s P B P - 2 . The

r e s u l t s i n d i c a t e a l s o t h a t a v e r y s m a l l amount o f[ 1 4 C ] m e c i l l i n a m b i n d s t o PBP-3A a n d P B P - 4 .

A l l t h e p r o t e i n b a n d s i n t h e P B P p r e p a r a t i o nc o r r e s p o n d t o P B P s , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h r e e

v e r y m i n o r p r o t e i n b a n d s . T h e s e p r o t e i n s mayb e p r e s e n t d u e t o r e s i d u a l n o n s p e c i f i c b i n d i n g t o

t h e 6 - A P A - C M - S e p h a r o s e . No a t t e m p t h a s b e e nm a d e t h u s f a r t o f u r t h e r c h a r a c t e r i z e P B P - 3 A ,- 3 B , - 7 , a n d - 8 . H o w e v e r , t h e s e PBPs a p p e a r

c o n s i s t e n t l y i n t h e P B P p r e p a r a t i o n s p r e p a r e db y t h e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y p r o c e d u r e d e -s c r i b e d h e r e .

P u r i f i c a t i o n o f P B P - 2 . S i n c e P B P - 2 s e l e c -t i v e l y b i n d s m e c i l l i n a m , i t w a s t h o u g h t t h a t i tw o u l d b e p o s s i b l e t o p u r i f y P B P - 2 b y a f f i n i t y

c h r o m a t o g r a p h y u s i n g S e p h a r o s e t o w h i c h ad e r i v a t i v e o f m e c i l l i n a m , a m i n o p r o p y l m e c i l l i -n a m , h a d b e e n c o u p l e d ( F i g . 1 ) . H o w e v e r , t h i sp r o c e d u r e w a s u n s u c c e s s f u l b e c a u s e i t w a s n o t

p o s s i b l e t o c o u p l e t h e a m i n o p r o p y l m e c i l l i n a mt o t h e S e p h a r o s e s o t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o fm e c i l l i n a m p e r m i l l i l i t e r o f S e p h a r o s e w a s l o we n o u g h t o p r e v e n t b i n d i n g o f PBPs o t h e r t h a nP B P - 2 .

A n o t h e r p o s s i b l e m e t h o d o f i s o l a t i n g P B P - 2w o u l d b e t o a d d t o t h e s o l u b i l i z e d P B P m i x t u r ea p e n i c i l l i n o r c e p h a l o s p o r i n w h i c h b o u n d t o a l l

t h e PBPs e x c e p t P B P - 2 a n d t h e n i n c u b a t e t h ePBPs w i t h 6 - A P A - C M - S e p h a r o s e . U n d e r t h e s e

c o n d i t i o n s o n l y P B P - 2 s h o u l d b i n d t o t h e 6 -A P A - C M - S e p h a r o s e . C e p h r a d i n e a n d c e f o x i t i nw e r e u s e d s i n c e t h e s e c e p h a l o s p o r i n s b i n d t oP B P - 2 o n l y a t v e r y h i g h c o n c e n t r a t i o n s c o m -p a r e d t o t h e c o n c e n t r a t i o n s a t w h i c h t h e y c a nb i n d t o t h e o t h e r PBPs ( 2 5 ) .

T h e E . c o l i PBPs w e r e s o l u b i l i z e d w i t h ab u f f e r c o n t a i n i n g T r i t o n X - 1 0 0 a n d 0 . 5 M N a C la s d e s c r i b e d . T h e n , e i t h e r 6 0 0 , u g o f c e f o x i t i n p e rm l o r 4 0 0 l A g o f c e p h r a d i n e p e r m l w a s a d d e d t ot h e

s o l u b i l i z e d p r o t e i n s ,a n d t h e m i x t u r e w a s

i n c u b a t e d f o r 2 0 m i n a t 2 5 0 C . The P B P s w e r et h e n i n c u b a t e d w i t h 6 - A P A - C M - S e p h a r o s e , t h e

S e p h a r o s e w a s w a s h e d , a n d t h e P B P s w e r ee l u t e d w i t h a b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 4 M NH20H.

PURIFICATION OF E . COLI P B P - 2 4 0 1

A B

PBP

1 -

P B P

w oo - 1

2 -- __ _ - 2- 3 a-4

-67 - C4 - 7

8- * A _ -8

ab ab c dF I G . 3 . PAGE o f PBPs p u r i f i e d w h e n c e p h r a d i n e

o r c e f o x i t i n w a s p r e b o u n d t o t h e P B Ps b e f o r e a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y . ( A ) C o o m a s s i e b l u e - s t a i n e d p o l y -a c r y l a m i d e s l a b g e l : l a n e a , c e p h r a d i n e ( 4 0 0 p g / m l )w a s p r e b o u n d t o t h e P B P s ; l a n e b , c e f o x i t i n ( 6 0 0 p g /m l ) w a s p r e b o u n d t o t h e P B P s . ( B ) F l u o r o g r a m o f

t h e g e l s h o w i n g b i n d i n g o f [ ' 4 C ] p e n i c i l l i n G a n d[ ' 4 C J m e c i l l i n a m t o t h e P B P p r e p a r a t i o n s : l a n e a ,b i n d i n g o f p e n i c i l l i n G t o t h e c e f o x i t i n - p r e t r e a t e dP B P p r e p a r a t i o n ; l a n e b , b i n d i n g o f m e c i l l i n a m t ot h e c e f o x i t i n - p r e t r e a t e d P B P p r e p a r a t i o n ; l a n e c ,b i n d i n g o f p e n i c i l l i n G t o t h e c e p h r a d i n e - p r e t r e a t e d

P B P p r e p a r a t i on ; l a n e d , b i n d i n g o f m e c i l l i n a m t ot h e c e p h r a d i n e - p r e t r e a t e d P B P p r e p a r a t i o n .

The r e s u l t s a r e s h o w n i n F i g . 3 .F i g u r e 3A s h o w s t h e C o o m a s s i e b l u e - s t a i n e d

g e l c o n t a i n i n g s a m p l e s o f t h e p r e p a r a t i o n o b -t a i n e d , a n d F i g . 3 B s h o w s a f l u o r o g r a m i n d i c a t -i n g t h e r e s u l t s o f a s s a y s f o r t h e b i n d i n g o f [ ' 4 C ] -m e c i l l i n a m a n d [ " 4 C ] p e n i c i l l i n G t o t h e P B Pp r e p a r a t i o n s . T h e p r e p a r a t i o n o b t a i n e d b y b i n d -i n g c e f o x i t i n t o t h e s o l u b i l i z e d PBPs b e f o r e a f -f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y h a s o n l y o n e m a j o r p r o -

t e i n b a n d i n i t ( F i g . 3 A, l a n e b ) . T h i s b a n d

c o r r e s p o n d s t o t h e m a j o r p r o t e i n b a n d b i n d i n gb o t h p e n i c i l l i n G a n d m e c i l l i n a m i n t h e p r e p a -r a t i o n a n d i s a t a p o s i t i o n i n t h e g e l c o r r e s p o n d -i n g t o P B P - 2 ( F i g . 3 B , l a n e s a a n d b ) . T h e r e i sa l s o a m i n o r p r o t e i n b a n d i n t h i s p r e p a r a t i o nw h i c h b i n d s p e n i c i l l i n G a n d m e c i l l i n a m . I t sp o s i t i o n i n t h e g e l i n d i c a t e s t h a t i t i s P B P - 3 A .T h e P B P p r e p a r a t i o n o b t a i n e d b y i n c u b a t i n gt h e s o l u b i l i z e d P B P s w i t h c e p h r a d i n e b e f o r ea f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y c o n t a i n s s i g n i f i c a n ta m o u n t s o f t h e o t h e r P B P s i n a d d i t i o n t o PBP-2 ( F i g . 3 A , l a n e a a n d F i g . 3 B , l a n e c ) . H o w e v e r ,

more P B P - 2 w a s p r e s e n t i n t h i s p r e p a r t i o n t h a ni n t h e p r e p a r a t i o n t r e a t e d w i t h c e f o x i t i n .M o d i f i c a t i o n o f t h e p r o c e d u r e f o r p u r i f i c a t i o n

o f PBP-2 b y ( i ) p r e i n c u b a t i o n o f t h e T r i t o n -

s o l u b i l i z e d membrane p r o t e i n s w i t h b o t h 2 0 0 , A g

8/4/2019 Pencil Lin


4 0 2 CURTIS AND STROMINGER

o f c e f o x i t i n p e r m l a n d 4 0 0 , u g o f c e p h r a d i n e p e r

m l , f o l l o w e d b y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y u s i n g

6 - A P A - C M - S e p h a r o s e ; o r ( i i ) p r e i n c u b a t i o n

w i t h 6 0 0 M g o f c e f o x i t i n p e r m l , f o l l o w e d b ya f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y u s i n g a m i n o p r o p y l m e -

c i l f i n a m - S e p h a r o s e ( s e e a b o v e ) d i d n o t r e s u l t i na n i m p r o v e d y i e l d o f P B P - 2 ( d a t a n o t s h o w n ) .

The p u r i f i e d P B P - 2 h a d p r o p e r t i e s s i n i l a r t ot h o s e d e t e r m i n e d p r e v i o u s l y ( 2 5 ) . I t b o u n d m e -c i l l i n a m a t l o w c o n c e n t r a t i o n s ( 3 u g / m l ) a n d h a do n l y a v e r y l o w a f f i n i t y f o r c e f o x i t i n . P u r i f i e dP B P - 2 h a s a n e s t i m a t e d m o l e c u l a r w e i g h t o f

6 7 , 0 0 0 b a s e d o n i t s m o b i l i t y d u r i n g SDS-PAGE,w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h t h e p r e v i o u s l y r e p o r t e d

v a l u e o f 6 6 , 0 0 0 ( 2 5 ) .

DISCUSSION

T h e p r o c e d u r e f o r p u r i f i c a t i o n o f P B P - 2 d e -s c r i b e d h e r e s u c c e s s f u l l y s e p a r a t e s P B P - 2 f r o m

E . c o l i m e m b r a n e s a n d t h e r e s t o f t h e E . c o l iPBPs ( e x c e p t f o r a v e r y s m a l l a m o u n t o f PBP-3 A ) . A m a j o r p r o b l e m o f t h e p u r i f i c a t i o n o fP B P - 2 i s t h e s m a l l a m o u n t o f t h e p r o t e i n p r e s e n t

i n t h e E . c o l i c e l l m e m b r a n e . S p r a t t e s t i m a t e dt h a t t h e r e a r e o n l y 2 0 m o l e c u l e s o f P B P - 2 p r e s -e n t p e r c e l l , a n d t h e p r o t e i n b i n d s o n l y 0 . 7 % o f

t h e t o t a l [ ' 4 C ] p e n i c i l l i n G w h i c h c a n b i n d t om e m b r a n e s o f E . c o l i ( 2 5 ) . T h e r e s u l t s o f o u rp u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e i n d i c a t e d t h a t f r o m 3 0 0 g

o f m e m b r a n e p r o t e i n , p o s s i b l y a s much a s 5 0 t o1 0 0 M g o f P B P - 2 c o u l d b e i s o l a t e d . P u r i f i c a t i o no f P B P - 2 f r o m a m u t a n t c o n t a i n i n g e l e v a t e dl e v e l s o f P B P - 2 w o u l d p r o v i d e b e t t e r y i e l d s o f

P B P - 2 . C l o n i n g o f t h e P B P - 2 g e n e i s a n o t h e r

a p p r o a c h t o o b t a i n i n g l a r g e r a m o u n t s o f t h i sp r o t e i n .

The p r e p a r a t i o n o f a l l t h e E . c o l i PBPs p u r i -f i e d b y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y c o n s i s t e n t l yc o n t a i n e d f o u r PBPs n o t p r e v i o u s l y i d e n t i f i e d ,P B P - 3 A , - 3 B , - 7 , a n d - 8 . T h e s e PBPs d o n o t

c o r r e s p o n d t o a n y o f t h e s e v e n S a r k o s y l - s o l u b i -

l i z e d PBPs w h i c h h a v e b e e n c o n s i s t e n t l y d e -t e c t e d b y t h e m e t h o d o f S p r a t t a n d P a r d e e ( 2 7 ) .H o w e v e r , P B P - 7 may b e s i m i l a r t o a n e i g h t hP B P w h i c h a p p e a r s o c c a s i o n a l l y i n t h e S a r k o s y l -s o l u b i l i z e d p r e p a r a t i o n s . The r e a s o n P B P - 3 A ,- 3 B , - 7 , a n d - 8 a p p e a r o n l y i n t h e p u r i f i e d E . c o l iP B P p r e p a r a t i o n may b e t h a t : ( i ) t h e s e PBPs d on o t b i n d [ " 4 C ] p e n i c i l h i n G when t h e p e n i c i l l i n i si n c u b a t e d w i t h t h e i n t a c t membrane a s i n t h e

p r o c e d u r e o f S p r a t t a n d P a r d e e ( 2 7 ) ( t h e y mayb e i n a c c e s s i b l e t o p e n i c i l l i n i n t h e m e m b r a n e ) ;( i i ) s e p a r a t i o n o f t h e c r u d e S a r k o s y l - s o l u b i l i z e dPBPs b y s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s i s n o t s e n s i t i v ee n o u g h t o d e t e c t P B P - 3 A , - 3 B , - 7 , a n d - 8 u n d e rt h e c o n d i t i o n s o f e l e c t r o p h o r e s i s e m p l o y e d ; ( i i i )P B P - 3 A , - 3 B , - 7 , a n d - 8 m i g h t b e p r o t e o l y t i cd i g e s t i o n p r o d u c t s o f t h e o t h e r E . c o l i P B P s

J . B A C T E R I O L .

w h i c h a r e p r o d u c e d d u r i n g t h e p u r i f i c a t i o n p r o -c e d u r e . The l a t t e r p o s s i b i l i t y may b e u n l i k e l y ,h o w e v e r , s i n c e P B P - 3 A , - 3 B , - 7 , a n d - 8 a p p e a r

c o n s i s t e n t l y a n d i n t h e s a m e r e l a t i v e a m o u n t s i nt h e p u r i f i e d P B P p r e p a r a t i o n s .

F u r t h e r c h a r a c t e r i z a t i o n o f p u r i f i e d P B P - 2s h o u l d c o n t r i b u t e t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e

e x a c t r o l e o f t h e p r o t e i n i n t h e m a i n t e n a n c e o r

p r o d u c t i o n o f t h e r o d m o r p h o l o g y o f E . c o l ic e l l s . T h u s f a r , s t u d i e s o f P B P - 2 h a v e e n c o m -p a s s e d o n l y t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e s p e c i f i c i t yo f t h e p r o t e i n f o r d i f f e r e n t p e n i c i l l i n s a n d c e p h -

a l o s p o r i n s ( 2 5 ) . T h e s e s t u d i e s w e r e p e r f o r m e db y b i n d i n g t h e a n t i b i o t i c s t o E . c o l i m e m b r a n e s ,s o l u b i l i z i n g t h e PBPs w i t h S a r k o s y l , a n d t h e ns e p a r a t i n g t h e m b y SDS-PAGE. The e f f e c t s o fNH20H a n d 2 - m e r c a p t o e t h a n o l o n t h e r e l e a s e

o f p e n i c i l l i n f r o m P B P - 2 w e r e a l s o i n v e s t i g a t e d .I t i s i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e w h e t h e r P B P - 2 h a s

a n y D - a l a n i n e c a r b o x y p e p t i d a s e o r t r a n s p e p t i -d a s e a c t i v i t y a n d w h e t h e r t h e r e i s a n y o t h e r

e n z y m e a c t i v i t y i n v o l v e d i n c e l l w a l l s y n t h e s i s .H o w e v e r , n o p e p t i d o g l y c a n t r a n s p e p t i d a s e o r

D - a l a n i n e c a r b o x y p e p t i d a s e a c t i v i t y h a s b e e n d e -t e c t e d i n t h e p u r i f i e d P B P - 2 p r e p a r a t i o n s u n d e rt h e a s s a y c o n d i t i o n s e m p l o y e d b y T a m u r a e t a l .( 3 4 ) f o r t h e s e a c t i v i t i e s ( d a t a n o t s h o w n ) . I t i sp o s s i b l e t h a t u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s e n z y m ea c t i v i t y m i g h t b e d e t e c t e d . F o r e x a m p l e , T r i t o n

X - 1 0 0 w a s p r e s e n t i n t h e a s s a y s p e r f o r m e d .S o m e o t h e r d e t e r g e n t , s u c h a s a S p a n o r P e g o -s p e r s e d e t e r g e n t ( 8 ) , may s t i m u l a t e t h e e n z y m ea c t i v i t y o f t h e p u r i f i e d P B P - 2 t o a g r e a t e r e x t e n t

t h a n T r i t o n X - 1 0 0 . A l t e r n a t i v e l y , i t may b e n e c -

e s s a r y t o i n c o r p o r a t e P B P - 2 i n t o l i p i d v e s i c l e sm a d e f r o m E . c o l i l i p i d s t o r e c o n s t i t u t e i t s e n -

z y m a t i c a c t i v i t y . T h i s h a s b e e n p o s s i b l e w i t h t h e

B . s t e a r o t h e n n o p h i l u s D - a l a n i n e c a r b o x y p e p t i -d a s e ( 3 4 ) . I t i s l i k e l y t h a t t h e a c t u a l s u b s t r a t e o fP B P - 2 i s a m a c r o m o l e c u l a r p r e c u r s o r o f t h e

c o m p l e t e d p e p t i d o g l y c a n s t r u c t u r e r a t h e r t h a n

t h e l o w e r - m o l e c u l a r - w e i g h t s u b s t r a t e s u s e d i nt h e a s s a y s f o r P B P - 2 ( 3 4 ) . A l t e r n a t i v e l y , t h e

s u b s t r a t e may b e l i n k e d t o t h e l i p i d c a r r i e r , C 5 -i s o p r e n o l . A w i d e v a r i e t y o f s u c h p r e c u r s o r s

must b e i s o l a t e d a n d t e s t e d t o d e t e r m i n e w h i c ho f t h e m i s t h e a c t u a l s u b s t r a t e o f P B P - 2 .

ACKNOWLEDGMENTS

T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y P u b l i c H e a l t h S e r v i c e r e s e a r c h

g r a n t A I 0 9 1 5 2 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a i t h .

LITERATURE CITED

1 . B l u m b e r g , P . M. 1 9 7 4 . P e n i c i l l i n - b i n d i n g c o m p o n e n t s o f

b a c t e r i a l c e l l s a n d t h e i rr e l a t i o n s h i p

t o t h e m e c h a n i s m

o f p e n i c i l l i n a c t i o n . A n n . N . Y . A c a d . S c i 2 3 5 : 3 1 0 - 3 2 5 .

2 . B l u m b e r g , P . M . , and J . L S t r o m i n g e r . 1 9 7 1 . I n a c t i -v a t i o n o f D - a l a n i n e c a r b o X y p e p t i d a s e b y p e n i c i l l i n s a n d

c e p h a l o s p o r i n s i s n o t l e t h a l i n B a c i l l u s s u b t i l i s . P r o c .

N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 6 8 : 2 8 1 4 - 2 8 1 7 .

8/4/2019 Pencil Lin


PURIFICATION O F E . COLI P B P - 2 403

3 . B l u m b e r g , P . K, and J . L S t r o m i n g e r . 1 9 7 2 . I s o l a t i o nb y c o v a l e n t a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f t h e p e n i c i l l i nb i n d i n g c o m p o n e n t s from m e m b r a n e s o f B a c i U u s s u b -t i l i s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 6 9 : 3 7 5 1 - 3 7 5 5 .

4 . B l u m b e r g , P . M . , and J . L S t r o m i n g e r . 1 9 7 4 . I n t e r a c -t i o n o f p e n i c i l l i n w i t h t h e b a c t e r i a l c e l l : p e n i c i l l i n - b i n d -ing p r o t e i n s a n d p e n i c i l l i n - s e n s i t i v e enzymes. B a c t e r i o l .R e v . 3 8 : 2 9 1 - 3 3 5 .

5 . B l u m b e r g , P . M . , R . R K Yocum, E . W i l l o u g h b y , andJ . L S t r o m i n g e r . 1 9 7 4 . B i n d i n g o f ( ' 4 C ) p e n i c i l l i n G t o

t h e m e m b r a n e - b o u n d a n d t h e p u r i f i e d D - a l a n i n e c a r -

b o x y p e p t i d a s e s f r o m B a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s an d

B a c i l l u s s u b t i l i s a n d i t s r e l e a s e . J . B i o l . C h e m . 2 4 9 :

6 8 2 8 - 6 8 3 5 .

6 . B o n n e r , W. K, and R . i L a s k e y . 1 9 7 4 . A f i l m d e t e c t i o n

m e t h o d f o r t r i t i u m - l a b e l l e d p r o t e i n s a n d n u cl e i c a c i d s

i n p o l y a c r y l a m i d e g e l s . E u r . J . B i o c h e m . 4 6 : 8 3 - 8 .

7 . C u a t r e c a s a s , P . , and I . P a r l k h . 1 9 7 2 . A d s o r b e n t s f o ra f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . Us e o f h y d r o x y s u c c i n i m i d ee s t e r s o f a g a r o s e . B i o c h e m i s t r y 1 1 : 2 2 9 1 - 2 2 9 8 .

8 . G e n n i s , R . B . , and J . L. S t r o m i n g e r . 1 9 7 6 . A c t i v a t i o n

o f C 6 6 - i s o p r e n o i d a l c o h o l p h o s p h o k i n a s e f r o m S t a p h y -l o c o c c u s a u r e u s I J I . A c t i v a t i o n b y d e t e r g e n t s . J . B i o l .C h e m . 2 5 1 : 1 2 7 7 - 1 2 8 2 .

9 . I w a y a , M . , R . G o l d m a n , D . J . Tipper, B . F e i n g o l d ,and J . L . S t r o m i n g e r . 1 9 7 9 . M o r p h o l o g y o f an E s c h -

e r i c h i a c o l i m u t a n t w i t h a t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n tr o u n d c e l l s h a p e . J . B a c t e r i o l . 1 3 6 : 1 1 4 3 - 1 1 5 8 .

1 0 . I w a y a , M . , C . W. J o n e s , J . K h o r a n a , and J . L . S t r o m -

i n g e r . 1 9 7 8 . M a p p i n g o f t h e m e c l l i n a m - r e s i s t a n t ,r o u n d m o r p h o l o g i c a l m u t a n t s o f E s c h e r i c h i a c o l i . J .B a c t e r i o l . 1 3 3 : 1 9 6 - 2 0 2 .

1 1 . I w a y a , K,and J . L S t r o m i n g e r . 1 9 7 7 . S i m u l t a n e o u s

d e l e t i o n o f D - a l a n i n e c a r b o x y p e p t i d a s e E B - C a n d p e n i -c i l l i n - b i n d i n g c o m p o n e n t I V i n a m u t a n t o f E s c h e r i c h i a

c o l i K 1 2 . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U.SA 7 4 : 2 9 8 0 - 2 9 8 4 .

1 2 . I z a k l , K . ,M. M a t e u h a s h i , and J .

L S t r o m i n g e r . 1 9 6 6 .G l y c o p e p t i d e t r a n s p e p t i d a s e a n d D - a l a n i n e c a r b o X y p e p -t i d a s e : p e n i c i l l i n - s e n s i t i v e e n z y m a t i c r e a c t i o n s . P r o c .

N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 5 5 : 6 5 6 - 6 6 3 .

1 3 . I z a k l , K . , and J . L . S t r o m i n g e r . 1 9 6 8 . B i o s y n t h e s i s o f

t h e p e p t i d o g l y c a n o f b a c t e r i a l c e l l w a l l s . X I V . P u r i f i -c a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f t w o D - a l a n i n e c a r b o x y p e p t i -d a s e s f r o m E s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m . 2 4 3 : 3 1 9 3 -3 2 0 1 .

1 4 . K o z a r i c h , J . W . , and J . L . S t r o m i n g e r . 1 9 7 8 . A mem-

b r a n e e n z y m e f r o m S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s w h i c h c a t -a l y z e s t r a n s p e p t i d a s e , c a r b o x y p e p t i d a s e , a n d p e n i c i l l i n -ase a c t i v i t i e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 3 : 1 2 7 2 - 1 2 7 8 .

1 5 . Laemmnl, U . K . , and M . F a v r e . 1 9 7 3 . M a t u r a t i o n o f t h eh e a d o f b a c t e r i o p h a g e T 4 . I . DNA p a c k a g i n g events. J .M o l . B i o l . 8 0 : 5 7 5 - 5 9 9 .

1 6 . L o w r y , O. H, N . J . R o s e b r o u g h , A.L F a r r , and R . J .

RandalL 1 9 5 1 . P r o t e i n measurment w i t h t h e F o l i n

p h e n o l r e a g e n t . J . B i o l . C h e m . 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .1 7 . L u n d , F . , andLy b r i n g . 1 9 7 2 . 6 - f - A m i d i n o p e n i c i l l a n i c

a c i d s - a new g roup o f a n t i b i o t i c s . N a t u r e ( L o n d o n )Ne w B i o l . 2 3 6 : 1 3 5 - 1 3 7 .

1 8 . M a t s u h a s h i , S. , T . K a m i r y o , P . K L B l u m b e r g , P . Ln-n e t t , and J . L S t r o m n n g e r . 1 9 7 4 . M e c h a n i s m o f ac -

t i o n a n d d e v e l o p m e n t o f r e s i s t a n c e t o a new a m i d i n op e n i c i l l i n . J . B a c t e r i o l . 1 1 7 : 5 7 8 - 8 7 .

1 9 . M a t s u h s h i , K . , L N . Maruyama, Y . Takagaki, S .

Tamai, Y . N i s h i m u r a , and Y . H i r o t a . 1 9 7 8 . I s o l a -t i o n o f a m u t a n t o f E s c h e r i c h i a c o l i l a c k i n g p e n i c i l l i n -s e n s i t i v e D - a l a n i n e c a r b o y p e p t i d a s e I A . P r o c . N a t l .A c a d . S c i . U . S . A . 7 5 : 2 6 3 1 - 2 6 3 5 .

2 0 . M a t s u h a s h i , M, Y . T a k a g a k i , L . N . Maruyama, S .T a m a k i , Y . N i s h i m u r a , F L S u z u k i , U . O g i n o , andY . H i r o t a 1 9 7 7 . M u t a n t s o f E s c h e r i c h i a c o l i l a c k i n gi n h i g h l y p e n i c i l l i n - s e n s i t i v e D - a l a n i n e c a r b o x y p e p t i -d a s e a c t i v i t y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 4 : 2 9 7 6 -2 9 7 9 .

2 1 . M a t 8 u h s h i , M . , S . T a m a k i , S . J . C u r t i s , and J . L .S t r o m i n g e r . 1 9 7 9 . M u t a t i o n a l e v i d e n c e f o r i d e n t i t y o fp e n i c i l l i n - b i n d i n g p r o t e i n 5 i n E s c h e r i c h i a c o l i w i t h t h e

m a j o r D - a l a n i n e c a r b o x y p e p t i d a s e I A a c t i v i t y . J . B a c -t e r i o l . 1 3 7 : 6 4 4 - 6 4 7 .

2 2 . M e l c h i o r , N . H I , J . B l o m , L T y b r i n g , and A . B r i c h -A n d e r s e n . 1 9 7 3 . L i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y o f t h e

e a r l y r e s p o n s e o f E s c h e r i c h i a c o l i t o a 6 B - a m i d i n o p e n -i c i l l a n i c a c i d ( F L 1 0 6 0 ) . A c t a P a t h o l . M i c r o b i o l . S c a n d .

S e c t . B 8 1 : 3 9 3 - 4 0 7 .2 3 . O ' C a r r a , P . , S . B a r r y , and T . G r i f f i n 1 9 7 4 . S p a c e r a r m s

i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y : u s e o f h y d r o p h i l i c a r m s t oc o n t r o l o r e l i m i n a t e n o n - b i o s p e c i f i c a d s o r p t i o n e f f e c t s .FEBS L e t t . 4 3 : 1 6 9 - 1 7 5 .

2 4 . S p r a t t , B . G . 1 9 7 5 . D i s t i n c t p e n i c i l l i n - b i n d i n g p r o t e i n s

i n v o l v e d i n t h e d i v i s i o n , e l o n g a t i o n a n d s h a p e o f E s c h -e r i c h i a c o l i K 1 2 . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 2 : 2 9 9 9 -3 0 0 3 .

2 5 . S p r a t t , B . G . 1 9 7 7 . P r o p e r t i e s o f t h e p e n i c i l l i n - b i n d i n gp r o t e i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 . E u r . J . B i o c h e m . 7 2 :3 4 1 - 3 5 2 .

2 6 . S p r a t t , B . G . , V . J o b a n p u t r a , a n d U . S c h w a r z . 1 9 7 7 .M u t a n t s o f E s c h e r i c h i a c o l i w h i c h l a c k a c o m p o n e n t o f

p e n i c i l l i n - b i n d i n g p r o t e i n 1 a r e v i a b l e . FEBS L e t t . 7 9 :3 7 4 - 3 7 8 .

2 7 . S p r a t t , B . G . , a n d A . B . P a r d e e . 1 9 7 5 . P e n i c i l l i n - b i n d i n gp r o t e i n s a n d c e l l s h a p e i n E . c o l i . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 5 4 :5 1 6 - 5 1 7 .

2 8 . S p r a t t , B . G . , and J . L . S t r o m i n g e r . 1 9 7 6 . I d e n t i f i c a t i o no f t h e m a j o r p e n i c i l l i n - b i n d i n g p r o t e i n s o f E s c h e r i c h i ac o l i a s

D - a l a n i n e c a r b o x y p e p t i d a s e I A .J .

B a c t e r i o l . 1 2 7 :6 6 0 - 6 6 3 .

2 9 . S t r o m i n g e r , J . L 1 9 7 7 . How p e n i c i l l i n k i l l s b a c t e r i a : as h o r t h i s t o r y , p . 1 7 7 - 1 8 1 . I n D . S c h l e s s i n g e r ( e d . ) , M i -c r o b i o l o g y - 1 9 7 7 . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y ,W a s h i n g t o n , D . C .

3 0 . S t r o m i n g e r , J . L , E . W i l l o u g h b y , T . K a m i r y o , P . M.

B l u m b e r g , a n d R . R . Y o c u m . 1 9 7 4 . P e n i c i l l i n - s e n s i -t i v e e n z y m e s a n d p e n i c i l l i n - b i n d i n g c o m p o n e n t s i n b a c -t e r i a l c e l l s . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 2 3 5 : 2 1 0 - 2 2 4 .

3 1 . S u g d n a a , H . , P . K L B l u m b e r g , and J . L S t r o m i n g e r .1 9 7 2 . M u l t i p l e p e n i c i l l i n - b i n d i n g c o m p o n e n t s i n B a c i l -l u s s u b t i l i s , B a c i l l u s c e r e u s , S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ,a n d E s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m . 2 4 7 : 5 2 7 9 - 5 2 8 8 .

3 2 . S u z u k i , H . , Y . N i s h i m u r a , a n d Y . H i r o t a . 1 9 7 8 . On t h ep r o c e s s o f c e l l u l a r d i v i s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i : a s e r i e so f m u t a n t s o f E . c o l i a l t e r e d i n t h e p e n i c i l l i n - b i n d i n gp r o t e i n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 5 : 6 6 4 - 6 6 8 .

3 3 . T a m a k d , S . , S . N a k a j i m a , a n d K L M a t u h a s h i . 1 9 7 7 .T h e r m o s e n s i t i v e m u t a t i o n i n E s c h e r i c h i a c o i l s i m u l -t a n e o u s l y c a u s i n g d e f e c t s i n p e n i c i l l i n b i n d i n g p r o t e i n -l B s a n d i n e n z y m e a c t i v i t y f o r p e p t i d o g l y c a n s y n t h e s i si n v i t r o . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 4 : 5 4 7 2 - 5 4 7 6 .

3 4 . T a m u r a , T . , Y . I m a e , a n d J . L S t r o m i n g e r . 1 9 7 6 .P u r i f i c a t i o n t o h o m o g e n e i t y a n d p r o p e r t i e s o f t w o D -a l a n i n e c a r b o s y p e p t i d a s e s I f r o m E s c h e r i c h i a c o l i . J .B i o l . C h e m . 2 5 1 : 4 1 4 - 4 2 3 .

3 5 . Waxman, D . J . , and J . L . S t r o m i n g e r . 1 9 7 9 . C l e a v a g eo f a C O O H - t e r m i n a l h y d r o p h o b i c r e g i o n f r o m D - a l a n i n ec a r b o x y p e p t i d a s e , a p e n i c i l l i n - s e n s i t i v e b a c t e r i a l mem-b r a n e e n z y m e . J . B i o l . C h e m . 2 5 4 : 4 8 6 3 4 8 7 5 .

V O L . 1 4 5 , 1 9 8 1

pencil lin

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