ReaLyse Lysing Solution10X Concentrate

Catalog No. 25237­ 00

1. INTENDED USE

The ReaLyse solution is an erythrolytic reagent intended for lysing red blood   cells   to   enable   a   lyse­no   wash   protocol   in   applications   that   involve immunofluorescent staining of human peripheral blood leucocytes.

The ReaLyse solution is recommended for use in lysis and fixation of cell  preparations  stained  with ReaMetrix   reagents  such as  Dry  Tri  T­STAT CD3/CD4/CD8 and CD3/CD4/CD45, ReaPan 34845, ReaPan B27, and ReaPan S34 which are to be analyzed by flow cytometry.

2. BACKGROUND 

The   quality   of   immunophenotypic   analysis   of   cell   preparations   is evaluated on the basis of a high signal to noise ratio. The noise quotient of a cell preparation is predominantly caused by the large percentage of red blood cells (erythrocytes) relative to the fraction of white blood cells (leucocytes) in the same. The removal of erythrocytes by lysis greatly reduces the background noise, thus allowing for easier analysis of the target cell populations which have been stained by fluorophore tagged antibodies.  

Use of  ReaLyse solution  in   the  processing steps   for  analysis  of   the sample   preparations   to   be   analyzed   using   the   above­mentioned   reagents (Section 1)  is highly recommended. This ensures the sufficient  lysis of  Red Blood Cells (RBCs) and fixing of the immuno stained population thus allowing for samples to be analyzed in a lyse­no­wash protocol. 

3. PRINCIPLE OF LYSIS 

When whole blood is added to the monoclonal antibody reagent,  the fluorochrome­labeled antibodies in the reagent bind specifically to leucocyte surface antigens.  The  stained  samples  are   then  treated with ReaLyse  lysing solution which  results   in  simultaneous  lysis  of   red blood cells  under  gentle hypotonic  conditions  and  fixation of   the   leucocytes   resulting  in  a   leucocyte suspension substantially free of red blood cells and suitable for flow cytometric analysis.

4. REAGENT 

The ReaLyse lysing solution is formulated as a buffered solution and contains Formaldehyde and Diethylene glycol. 

It is provided as a 10X concentrate. A working solution of 1X dilution of this concentrate is to be used for the lysis of cell preparations before analysis by flow cytometry.  To obtain the working solution,   the dilution of  the 10X concentrate   is   performed   in  deionized  water   at   room  temperature   (20°C  to 25°C) using reference table­1.

Precautions1. The ReaLyse lysing solution contains Diethylene glycol and Formaldehyde. 

Formaldehyde is a potential carcinogen and causes irritation to the eyes and skin. Ingestion of Diethylene glycol can be fatal. Wear suitable protective clothing. If swallowed, seek medical attention immediately.

2. All blood specimens are considered biohazards. Handle them as if they are capable of transmitting infection and dispose off with proper precautions in accordance with governmental regulations.

3. The addition of  the  precise volume of  deionized water   is  critical   to obtain correct  concentration of the 1X working solution.  Use a calibrated pipette and operate according to the manufacturer’s instructions.

4. The use of  temperatures,   incubation and vortexing times other  than those specified in the corresponding product inserts may give erroneous results.

Dilution Instructions

Dilute   the   10X   concentrate   1:10   with   the   deionized   water   at   room temperature (20° to 25°C) to prepare 1X working lysing solution according to Table 1. Mix well.

Table 1: Dilution Instructions for Preparation of 1X ReaLyse Lysing (Working)  

solution

Required Volume of 1X Working solution (mL) 5 10 15 20 25Volume of 10X Concentrate (mL) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5Volume of Deionized Water (mL) 4.5 9.0 13.5 18.0 22.5

Storage and Handling

Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use the reagent after the expiry date on the label. 

Do not freeze the ReaLyse Lysing solution. Follow the instructions given on the container label to ensure good shelf life. 

The diluted working solution is stable for one month when stored in a glass container  at   room  temperature.  Do  not  use   this   reagent   if  discoloration occurs or a precipitate forms.

The   ReaLyse   lysing   solution   contains   Formaldehyde   which   is   highly volatile. Do not leave the lid in a loose or open position. The lid should be tightly sealed after use.

Note ­ Follow appropriate instructions as given in the respective product inserts for information on instruments, sample collection and sample processing.

5. PERFORMANCE CHARACTERISTICS

Representative   Acquisition   Plots   of   ReaLyse   Lysing   Solution   with ReaMetrix Reagents 

Depicted  below are  acquisition  plots  of  peripheral  blood samples   incubated with Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent (Figure 1) and Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD8 reagent (Figure 2); processed with ReaLyse lysing solution and analyzed on a FACScan flow cytometer.

         Figure 1. SSC vs. CD45 dot plot; CD3 vs. CD4 dot plot obtained with Dry­Tri  T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent.

        Figure 2. SSC vs. CD3 dot plot; CD8 vs. CD4 dot plot obtained with Dry­Tri  T­STAT CD3/CD4/CD8 reagent/

The   dual­parameter   light   scatter   plots   (SSC   versus   FSC,   Figure   3) illustrates   the   expected   leucocyte   spatial   distribution   of   a   normal   K3EDTA anticoagulated blood sample lysed with ReaLyse lysing solution using lyse no wash   procedure.   Acquisition   and   analysis   are   with   a   BD   FACScan   flow cytometer equipped with Cell Quest Pro software.

Figure 3. SSC vs. FSC dot plot

The  following plots  depict  peripheral  blood sample  immuno stained with ReaPan 34845 reagent and treated with ReaLyse lysing solution prior to analysis on a FACS Calibur flow cytometer (Figure 4).

         

        Figure 4. SSC vs. CD45 dot plot; SSC vs. CD3 dot plot; CD3 vs. CD4 dot plot;  

CD3 vs. CD8 dot plot obtained with ReaPan 34845 reagent

Performance Data

The   following   performance   data   for   lysing   solution   were   generated   by performing clinical validation on Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent.

AccuracyThe absolute counts for CD45+, CD3+ and CD4+CD3+ T­cells were 

determined using Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent.  Aliquots of  the same blood samples were stained and lysed with the ReaLyse lysis solution and a commercially available lysis solution. The samples were analyzed using a BD FACScan™ flow cytometer. The plots in the figure 5, 6, 7, 8 indicate that the results from both the lysis solutions are equivalent.

Figure 5.  Correlation of  Absolute Lymphocyte Counts (CD45+) determined  using the Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent lysed with ReaLyse lysis  solution compared to a commercially available lysis solution. (n=30)

Figure 6.  Correlation of  Absolute Lymphocyte Counts (CD45+) determined  using the Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent lysed with ReaLyse lysis  solution   compared   to   Absolute   Lymphocyte   Counts   determined   using  Hematology Analyzer. (n=26)

Figure 7. Correlation of Absolute CD3+ cell Counts determined using the Dry­Tri  T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent  stained and lysed with ReaLyse  lysing solution compared to a commercially available lysing solution. (n=30)

Figure 8. Correlation of Absolute CD4+ CD3+ cell Counts determined using  the Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent stained and lysed with ReaLyse  lysing solution compared to a commercially available lysing solution. (n=30)

PrecisionThe blood of 3 healthy donors was stained five times each with Dry­Tri 

T­STAT   CD3/CD4/CD45   reagent.   The   lyse   no­wash   staining   and   lysis procedure was used and run on FACScan flow cytometer. The observed CV was <5%. The results obtained are summarized in the following table. 

6. LIMITATIONS

1. ReaLyse lysing solution is specifically formulated for use with ReaMetrix reagents.

2. Retain   samples   in   VACUTAINER   blood   collection   tubes   at   room temperature (20° to 25°C) prior to staining and lysing. Refer to the reagent package insert for maximum storage times after collection.

3. Samples with nucleated red blood cells may show incomplete lysis of red blood cells. This may also occur when assaying blood samples from patients with certain hematologic disorders in which red cells are difficult to lyse, as in sickle­cell anaemia, thalassemia, spherocytosis, etc.

4. Reagents should be used before the expiration date printed on the reagent bottle.

5. Results obtained with flow cytometry may be erroneous if the instrument is misaligned,  compensation spillovers  are not  correctly  compensated or   the gate is improperly set.

6. Reproducible results will  be obtained as long as the procedure used is in accordance   with   this   package   insert   and   with   good   laboratory   practice guidelines.

7. REFERENCES

1. Mandy FF,  Nicholson JK,  McDougal  JS.  Guidelines   for  performing single­platform absolute CD4+ T­cell determinations with CD45 gating for persons infected with human immunodeficiency virus. Centre for Disease   Control   and   Prevention.   MMWR   Recomm   Rep 2003   Jan 31;52(RR­2):1­13.

2. Mandy FF,  Brando B.  Enumeration  of  Absolute  Cell  Counts  Using Immunophenotypic Techniques. Current Protocols in Cytometry (2000) 6.8.1­6.8.26.

3. Bossuyt  X,  Marti  GE,  Fleisher  TA:  Comparative  analysis  of  whole blood lysis methods for flow cytometry. Cytometry 30:124–133, 1997.

4. Tamul KR, Schmitz KK, Folds JD: Comparison of the effects of Ficoll­Hypaque   separation   and   whole   blood   lysis   on   results   of   immuno­ phenotypic analysis of blood and bone marrow samples from patients with hematologic malignancies. Clin Diagn Lab Immunol 2:337–342, 1995.

5. Carter PH, Resto­Ruiz S, Washington GC, Ethridge S, Paline A, Vogt R,  Waxdal  M, Fleisher T,  Noguchi  PD,  Marti  GE:  Flow cytometric analysis   of   whole   blood   lysis,   three   anticoagulants,   and   five   cell preparations. Cytometry 13:66–74, 1992.

6. Vuorte, J., Jansson, S­E., Repo, H., "Evaluation of red blood cell lysing solutions   in   the   study   of   neutrophil   oxidative   burst   by   the   DCFH assay", 2001, Cytometry, 43, 290­296.

7. Tiirikainen MI.  Evaluation of red blood cell   lysing solutions for  the detection   of   intracellular   antigens   by   flow   cytometry.   Cytometry 1995;20:341–348.

8. WARRANTY

The product is warranted only to conform to the quantity and contents stated   on   the   label   at   the   time   of   delivery   to   the   customer.   There   are   no warranties,  expressed  or   implied,   that  extend beyond  the description  on  the label of the product. ReaMetrix’ sole liability is limited to replacement of the products.   ReaMetrix   is   not   liable   for   property   damage,   personal   injury,   or economic loss caused by the product.

Note:   FACScan,   FACSCalibur   are   all   registered   trade   names   of  Becton­Dickinson; EPICS XL is registered trade name of Beckman­Coulter.

CUSTOMER SUPPORT INFORMATION

ReaMetrix India Pvt. Ltd.50­B, II Phase, Peenya Industrial AreaPeenya, Bangalore­560058, IndiaPh: 91­80­28378693/5,Fax: 91­80­41172451E­mail: info@reametrix.comwww.reametrix.com

Rev No. 2.0,  15­Apr­09