¿podemos diseñar sistemas de expresión que respondan a señales ambientales predeterminadas?
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¿Podemos diseñar sistemas de expresión que respondan a señales ambientales predeterminadas? Reguladores a la carta. The transcriptional regulator XylR. B interdomain. 211. 233. D HTH. NH 2. C (activation). COOH. A (receptor). ATP binding. Recognition and binding - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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¿Podemos diseñar sistemas de expresión que respondan a
señales ambientales predeterminadas?
Reguladores a la carta
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The transcriptional regulator XylR
A (receptor)
B interdomain
ATP binding
C (activation) D HTH
DNA binding in Pu y Ps
COOHNH2
211 233
Recognition and binding of aromatic effectors
ATP hydrolysisMultimerizationContacts with 54
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R
R
XylR active
B
D
A
C
XylR inactive
Intramolecular repressionSpecific A-C interactions
Binding to A domainRelease of repression
Activation of XylR in response to inducers
R
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B
D
A
C
Regulators á la carte: can we change at will the effector specificity of XylR?
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The B domain of XylR: a coiled coil?
A C D
B/Q linker
1 211 472233 514 554
CN
566
208 236
(XylR16-1) DP HHHR (XylR3H)
IVDE RYELQTQ VANLRNR LKQYDGQ YYGIG
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Native inducer
XylR
BA
C
OH4
phenolF
CH3
7
4-FBA
CH3
Cl
8
4-ClBA
CH3
11
1-methyl
13
biphenyl
CH3-(CH2)6-CH3
14
octane
CH3
CH3
m-xileno
2
5
benzene
NH2
6
aniline
CH3
NO2
9
4-NT
10
naphthalene
CH3
12
2-methyl
CH3
Cl
3-Cl tol
3
Suboptimal inducers
Non-inducers
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0
5
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
BC
MAD16-1, XylR16-1
Inducer compounds
0
5
10MAD1, XylR
BA
cti
vity
Pu
(-
Ga
l, x
10
3)
Effects of 16-1 mutation in the B domain of XylR
A
A
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B
D
A
C
Can we change the effectorspecificity of XylR?
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R
R
Non naturalinducers
XylRactive
Generation of regulators á la carte
D
AB
C
XylRinactive
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Structural prediction
The A domain of XylR
Genetic approach: generation of diversity
1 211
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CH3
NO2
D
AB
C
XylR
CH3
NO2
CH3
NO2
toluene m-xylene
2-NT 3-NT 4-NT biphenyl
p-xylene
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3
Native inducers
New inducers
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Reshaping the effector pocket of the A domain
A
CH3
CH3
generation
of diversity
R
R
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1. Preparation of target DNA2. Digestion DNase I (30-300 bp)
3. PCR without oligonucleotides
4. PCR with oligonucleotides
Generation of diversity through mutation-prone shuffling of homologous A domains
XylR A domainDmpR A domain TbuT A domain
Family of similarDNA sequences
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Genetic screening
Elimination ofNon productivecombinations
Selection ofnew activecombinations
Shuffled A domains
Pool of A domainvariants
Shuffling of A domains of XylR-like activators
XylR A domainDmpR A domain TbuT A domain
Family of similarDNA sequences
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The genetic tricks
• Positive selection
• Negative selection
• Visual screening
• Phenotypical characterisation
Po npt (km)
Po sacB
Po luxAB
Pu lacZ
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Cloning vector
pCon918
A C DPr
NdeI SnaBI
ligation E. coli XL1 colony poolP. putida KT2440
Po-Km/Po-sacB
Growthon plates
Conjugation
M9 succ Km + new effector
A domain Shuffling libraryNdeI/SnaBI
Sucrose
Plasmid extraction
P. putida KT2440 Po-luxAB Light emission
Genetic screening/selection
No Km
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3-nt decanal test assayLB+3NT
LB+3NT
no inducer
no inducer
C-
C-
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XylR 1
XylR 2
XylR 3
XylR 4
XylR 5
XylRwt
no inducer m-xylene phenol benzene
XylR 1
XylR 2
XylR 3
XylR 4
XylR 5
XylRwt
2-nt 3-nt 4-nt biphenyl
Visualization of effector-specificity changes
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Sequence analysis of hybrid regulators
XylR1
XylR5
XylR DmpR
1 V124A 161-166 220
XylR2
F65L
XylR3
46-50
XylR4
L184I
161-166
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In vivo activity of hybrid regulators m
-xile
nobe
ncen
o0
2
4
6
8
2 3 4 5 6 7 8 91XylR wt
no in
d-
feno
l
2-N
T3-
NT
4-N
Tbi
feni
lo 0
2
4
6
8
XylR12 3 4 5 6 7 8 91
no in
d-
feno
l
2-N
T3-
NT
4-N
Tbi
feni
lo 0
2
4
6
8
XylR22 3 4 5 6 7 8 91
no in
d-m
-xil
feno
lbe
nc2-
NT
3-N
T4-
NT
bife
nilo
0
2
4
6
8
XylR32 3 4 5 6 7 8 91
no in
d-m
-xil
feno
lbe
nc2-
NT
3-N
T4-
NT
bife
nilo
no in
d-m
-xil
feno
lbe
nc2-
NT
3-N
T4-
NT
bife
nilo0
2
4
6
8
XylR42 3 4 5 6 7 8 91
0
2
4
6
8
XylR52 3 4 5 6 7 8 91
no in
d-m
-xil
feno
lbe
nc2-
NT
3-N
T4-
NT
bife
nilo
m-x
ilbe
nc
m-x
ilbe
nc
Pro
mote
r act
ivit
yr
Pu
(b
-Gal, x
10
3)
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(Apparent) affinity assays
0
2
4
6
8
110-4 10-3 10-2 10-1
XylR wt
XylR2XylR1
0
2
4
6
8
XylR2XylR1
3-MBA (mM) 3-NT (mM)
Pro
mote
r act
ivit
y P
u (
b-G
al, x
10
3)
XylR wt
110-4 10-3 10-2 10-1
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Inhibition by 3-NT
0
1
2
3
4
5
6
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
3-NT (mM)
3-MBA 1 mM
XylR wt
Pro
mote
r act
ivit
y P
u (
b-G
al, x
10
3)
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Structural prediction for the A domain of XylR
Grupo de Diseño de Proteínas-CNB
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Contact surfaces protein/effector
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Mapping structural changes in the model
XylR2
F65L
XylR3
46-50
XylR5
161-166
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XylR2
F65L
XylR3
46-50
XylR5
161-166
Mapping structural changes in the model
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XylR2
F65L
XylR3
46-50
XylR5
161-166
Mapping structural changes in the model
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XylR1
XylR4
V124A
L184I
Mapping structural changes in the model
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XylR1
XylR4
V124A
L184I
Mapping structural changes in the model
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XylR wt
XylR5XylR4
XylR1
XylR3
XylR2
![Page 31: ¿Podemos diseñar sistemas de expresión que respondan a señales ambientales predeterminadas?](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022062309/568148d7550346895db5f0cb/html5/thumbnails/31.jpg)
Loops involved in the effector pocket
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Conclusions
• Mutants XylR1 to XylR5 bear changes that unlock the ability of XylR to respond to many non-natural effectors
• The changes involve not only the shape of the effector pocket, but also the structural transmission caused by inducer binding
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![Page 36: ¿Podemos diseñar sistemas de expresión que respondan a señales ambientales predeterminadas?](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022062309/568148d7550346895db5f0cb/html5/thumbnails/36.jpg)
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