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Poster n° 1

Cross-talk between Tetanus neurotoxin-Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein-mediated transport and L1-mediated adhesion Philipp Alberts1, Rachel Rudge1, Ina Hinners2, Aude Muzerelle3, Sonia Martinez-Arca1, Theano Irinopoulou1, Véronique Marthiens4, Sharon Tooze2, Fritz Rathjen5, Patricia Gaspar3, and Thierry Galli1§ 1Membrane Traffic and Neuronal Plasticity, INSERM U536, F-75005 Paris, France 2Secretory Pathways Laboratory, Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK 3INSERM U106, Hôpital Salpêtrière, F-75651, Paris cedex 13, France 4INSERM U440, F-75005 Paris, France 5Max-Delbrueck-Centrum fuer Molekulare Medizin, D-13092 Berlin, Germany

T

he membrane trafficking pathway mediated by Tetanus neurotoxin-Insensitive Vesicle Associated Membrane Protein (TI-VAMP) in neurons is still unknown. Here we show

that knock down of TI-VAMP by RNA interference blocked neurite outgrowth in PC12 cells and hippocampal neurons and that TI-VAMP bound to the target SNAREs syntaxin 1, SNAP-25, and syntaxin 7 in vivo indicating an important function in exocytosis and endocytosis. TI-VAMP colocalized with L1 in the developing brain, neurons in culture, and PC12 cells. Plasma membrane L1 was internalized into the TI-VAMP-containing compartment in growing axons and PC12 cells. Using the extracellular domain of L1 and N-Cadherin immobilized on beads, we found that the knockdown of TI-VAMP led to impaired L1- but not N-Cadherin-mediated adhesion and that TI-VAMP-containing vesicles accumulated at the site of L1 bead-cell junction. We conclude that TI-VAMP mediates the intracellular transport of L1 and that L1-mediated adhesion controls this membrane trafficking pathway.

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Poster n° 2

Détection par Ultramicroélectrodes de Carbone de l’Emission d’Adrénaline par les Cellules Chromaffines : Modèle Physico-Chimique de la Dynamique de l’Exocytose.

Christian Amatore, Stéphane Arbault, Imelda Bonifas, Yann Bouret et Marie Erard

UMR CNRS-ENS-UPMC 8640 « PASTEUR » Ecole Normale Supérieure, Département de Chimie, 24 rue Lhomond, 75231 Paris Cedex 05, France. e-mail : Stephane.Arbault@ens.fr

es techniques électrochimiques conjuguées aux propriétés spécifiques des ultramicroélectrodes de carbone ont été mises à profit depuis plus d’une décennie

pour étudier l’émission de neurotransmetteurs par des cellules sécrétrices (neurones, cellules pancréatiques, PC12, cellules chromaffines,…).[1] L’actuelle résolution de nos mesures ampérométriques des flux de catécholamines libérés par une cellule, i.e., de l’ordre de 1000 molécules/ms, offre la possibilité de caractériser la dynamique et le rôle des principaux paramètres physico-chimiques gouvernant la libération d’adrénaline par exocytose chez les cellules chromaffines.

L

Nous avons montré que chaque pic ampérométrique correspondant à l’exocytose d’une vésicule peut être déconvolué en fonction des cinétiques de démasquage de la matrice vésiculaire au cours de la fusion des membranes (full-fusion) et de diffusion de l’adrénaline hors de la matrice. Le modèle développé au laboratoire[2] a établi que le gonflement de la matrice suivant l’échange des cations catécholamines avec les cations extracellulaires, induit une tension de la membrane vésiculaire. L’énergie créée par cette tension « s’accumule » au niveau du pore de fusion et va conduire à la rupture de son édifice puis à la fusion des membranes. La dissipation visqueuse de cette énergie rend parfaitement compte des cinétiques des pics expérimentaux, démontrant l’importance des paramètres physico-chimiques dans le processus d’exocytose.[2] Plusieurs séries d’expériences ont été réalisées afin de tester sélectivement chaque hypothèse du modèle.[3] Nous avons tout d’abord cherché à perturber l’échange des cations catécholamines contenus dans la matrice vésiculaire avec les cations extracellulaires. L’utilisation d’ions lanthanide (La3+ 0.1-3 mM) conduit à l’avortement ou à la suppression des événements exocytotiques, probablement via une forte complexation (ions trivalents) de la matrice et donc à un ralentissement de son gonflement. Ensuite, nous avons induit des variations de tension mécanique ou de viscosité de la membrane cellulaire d’une part, en appliquant des variations transitoires de pression osmotique sur la cellule et d’autre part, en modifiant son contenu en cholesterol. Les premiers résultats obtenus au cours de ces études sont en accord avec les prédictions du modèle et offrent une nouvelle voie de compréhension des processus déterminant la cinétique de sécrétion des catécholamines par exocytose. Références :

[1] C. Amatore, C. R. Acad. Sci. Paris, 323, 757-771, (1996). [2] C. Amatore, Y. Bouret, E. R. Travis, R. M. Wightman, Biochimie, 82, 481-496, (2000). [3] C. Amatore, S. Arbault, I. Bonifas, Y. Bouret, M. Erard, M. Guille, ChemPhysChem, 4, 147-154 (2003).

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Poster n° 3

Redox modulation of the lysosomal cystine transporter Cystinosin Gian Carlo BellenchI1, Vassiliki Kalatzis2, Corinne Antignac2, Bruno Gasnier1

1- CNRS UPR 1929, Institut de Biologie Physico-Chimique, 13 rue P. et M. Curie, 75005 Paris 2- INSERM U423, Université René Descartes, Hôpital Necker-Enfants Malades, 149 rue de Sèvres, 75015 Paris

ysosomal degradation products are exported to the cytosol by membrane transporters driven by a V-type H+-ATPase. In the case of the disulfide amino acid cystine, this

efflux is ensured by the product of the nephropathic cystinosis gene, cystinosin. Cystine is eventually reduced to cysteine by cytosolic glutathione.

L In order to get better access to the transport activity of cystinosin, we designed a functional assay based on the relocalisation of the transporter to the plasma membrane and the artificial imposition of a transmembrane pH gradient. Using this assay, we observed that treating cells with the permeant thiol oxidant diamide induced a 5-fold inhibition of cystinosin. This inhibition was assigned to the oxidation of an intracellular thiol since the alkylating reagent N-ethylmaleimide (NEM) induced a similar inhibition and transport was protected from NEM by the reversible action of diamide. However, mutation of the five cysteine residues of cystinosin to alanine did not prevent inhibition by diamide or NEM, implying that a distinct oxidizable factor controls the activity of cystinosin. After irreversible inhibition by NEM, transport could be restored by a permeant precursor of glutathione, suggesting that cystinosin is regulated by glutathione or a related metabolite. Several lines of evidence have shown that lysosomes are able to reduce protein disulfide bridges in their lumen. Since the export and subsequent reduction of cystine may contribute to the import of reducing equivalents into lysosomes, the regulation of cystinosin by glutathione, as well as the known redox control of the V-type H+-ATPase, might represent homeostatic mechanisms that reduce the lysosomal use of cytosolic reducing power in case of oxidative stress.

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Poster n° 4

Interactions moléculaires de la protéine Csp lors de la sécrétion de l’insuline

Frédéric Boal1, Hui Zhang2, Pier Scotti1, Jochen Lang1

1Institut Européen de Chimie et Biologie, Bat B8, Avenue des Facultés, 33405 TALENCE Cedex, France; 2Dept. Cell Biology & Physiology, University of Pittsburgh

otre étude porte sur une protéine nécessaire à la sécrétion de l’insuline par exocytose dans les cellules β-pancréatiques: la protéine Csp (Cysteine-string protein). Cette

protéine co-chaperonne est présente à la surface des vésicules larges à corps dense contenant l’insuline et deux variants d’épissage sont identifiés (Csp1 et Csp2), différents seulement par leur partie C-terminale.

N

L’expression transitoire des différentes formes tronquées dans les cellules insulino-sécrétrices (HIT-T15) montre un effet important de la région « linker » et du C-terminus. Des immunoprécipitations ont mis en évidence une interaction entre Csp et la protéine SNARE VAMP-2 (Vesicle-associated membrane protein) lors de la stimulation de l’exocytose par le calcium. L’étude des interactions entre protéines recombinantes et traduites in-vitro suggère que la partie C-terminale de Csp joue un rôle lors de cette interaction. Afin de mieux étudier les partenaires potentiels de Csp nous avons employé la réticulation qui permet de figer des interactions transitoires. A ces fins des cellules préalablement perméabilisées à l’aide de la Streptolysine-O ont été exposées à différents taux de calcium. Nous avons pu montrer par cette technique que la Csp forme des dimères et que cette dimérisation est favorisée par l’augmentation du calcium dans le cas de Csp1. De plus, l’absence du domaine C-terminal dans l’isoforme Csp2 favorise la dimérisation de la protéine, ce qui indique un rôle de ce domaine dans ce processus. Nos résultats suggèrent que la Csp interagit avec une protéine SNARE lors de l’exocytose et que cette interaction peut être régulée par l’homodimérisation de la Csp.

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Poster n° 5

Les toxines létales de Clostridium sordelli modifient la perméabilité de la barrière cellulaire et les jonctions intercellulaires

Boehm Catherine et Michel R. Popoff Toxines Microbiennes, Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux, 75015 Paris.

es toxines létales (LT) sont les principaux facteurs de virulence de Clostridium sordellii qui est une bactérie responsable de gangrène et d’entérite hémorragique chez l’animal

et parfois chez l’homme. Les toxines LT font partie des toxines de grande taille (270 kDa). Il en existe deux variants (LT82 et LT9048) produits par des souches distinctes de Clostridium sordellii. Ces toxines possèdent une activité monoglucosyltransférase en N-terminal. Elles clivent l’UDP-glucose et transfèrent le résidu glucose sur les protéines régulatrices des familles Rho et Ras. Les protéines Rho glucosylées ne peuvent plus se lier à leurs effecteurs et la signalisation en aval est inhibée ce qui aboutit à la dépolymérisation des filaments d’actine et à l’arrondissement des cellules.

L

Les effets des toxines LT ont été étudiés dans un modèle expérimental de barrière cellulaire constitué de cellules rénales de souris (CCD) cultivées sur filtre de façon à obtenir une monocouche de cellules polarisées avec des jonctions intercellulaires étanches. Que les toxines soient incubées du côté apical ou basolatéral, elles induisent une augmentation de la perméabilité de la monocouche qui se traduit par une baisse de la résistance électrique transépithéliale (TER) et le passage de dextrans fluorescents, essentiellement de petite taille (4400 Da). Ceci indique une ouverture des jonctions intercellulaires et une rupture de l’intégrité de la voie paracellulaire. Les molécules des jonctions intercellulaires ont été analysées en immunofluorescence. Les toxines LT affectent principalement l’actine basolatérale et la distribution des molécules de E-cadhérine. Le complexe E-cadhérine-caténines, essentiel à l’établissement des jonctions intermédiaires, se dissocie et la cadhérine s’accumule dans le cytoplasme. Par contre, les marqueurs des jonctions serrées (ZO-1, occludine) montrent peu de modification.

Ces travaux permettent d’apporter quelques premiers éléments de conclusion : les toxines LT agissent préférentiellement sur l’actine basolatérale ainsi que sur les jonctions à E-cadhérine et à moindre degré sur les jonctions serrées. La cible préférentielle serait Rac qui contrôlerait le pool d’actine basolatéral et l’établissement des jonctions intermédiaires.

Des expériences d’immunoprécipitation sont en cours qui permettront de mettre en

évidence, avec plus de précison, les événements qui touchent le complexe E-cadhérine-caténines.

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Poster n° 6

Recyclage chez S. cerevisiae Amandine Bungicourt, Rosine Haguenauer-Tsapis et Jean-Marc Galan.

ontrairement à l’exocytose et l’endocytose, les voies et les acteurs du recyclage restent largement méconnus chez S.cerevisiae. La v-SNARE Snc1p est une des rares

protéines dont le recyclage a été démontré dans cet organisme. Snc1p cycle entre TGN, membrane plasmique et endosomes précoces (Lewis, 2000; Galan, 2001).

C En utilisant l’uracile perméase Fur4p comme cargo empruntant la voie d’endocytose, nous avons pu démontrer que la protéine est stabilisée à la membrane plasmique dans des mutants déficients pour la machinerie ESCRT requise pour l’invagination des cargos ubiquitinilés dans les MVB. Cette stabilisation apparente peut être due à un défaut d’internalisation de Fur4p ou à un recyclage rapide de la protéine à partir du compartiment endosomal tardif. Pour trancher entre ces deux possibilités, nous avons mis au point un protocole permettant de découpler efficacement l’internalisation de Fur4p de son recyclage à la membrane plasmique. Dans une souche sauvage, après son internalisation, Fur4p est intégrée dans les vésicules internes des MVB puis dégradée dans la vacuole (lysosome). En revanche, nous observons recyclage actif de Fur4p vers la membrane plasmique à partir des endosomes tardifs dans des souches déficientes pour la machinerie ESCRT. Ainsi la stabilisation apparente de Fur4p à la membrane plasmique dans des cellules déficientes pour la machinerie ESCRT est probablement due à une internalisation suivie d’un recyclage rapide de la protéine à la membrane plasmique. Nous cherchons actuellement à caractériser la machinerie et les mécanismes moléculaires nécessaires au recyclage de Fur4p à partir des endosomes tardifs. Des données préliminaires indiquent que la voie de recyclage suivie par Fur4p diffère de celle empruntée par Snc1p. Lewis MJ, Nichols BJ, Prescianotto-Baschong C, Riezman H, Pelham HR. (2000) Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 2000 Jan;11(1):23-38. Galan JM, Wiederkehr A, Seol JH, Haguenauer-Tsapis R, Deshaies RJ, Riezman H, Peter M. (2001) Skp1p and the F-box protein Rcy1p form a non-SCF complex involved in recycling of the SNARE Snc1p in yeast. Mol Cell Biol. 2001 May;21(9):3105-17.

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Poster n° 7

Effect of fibrillar prion peptide on immunoreceptor signaling in microglia J. Ciesielski-Treska, G. Ulrich, N.J. Grant, S. Chasserot-Golaz and M-F. Bader CNRS UPR2356 Neurotransmission et Sécrétion Neuroendocrine, 5 rue Blaise Pascal 67084 Strasbourg Cedex France.

PHAGOCYTOSIS, the process by which cells internalize particles larger than 0.5 µm in diameter, is central to immunity. As the resident phagocytes of the central nervous

system, the microglia are critical for the clearance of amyloid deposits associated with prion diseases. Here opsonized, latex beads were used as a model to study the effect of a synthetic peptide (human prion peptide, PrP 106-126) which can form amyloid fibrils, on the phagocytic activity of microglia isolated from neonatal rat brain cultures. The fibrillar form of PrP markedly altered Fc-mediated phagocytosis by microglia. This effect was not due to decreased binding of particles, but rather to an altered particle engulfment suggesting that prion fibrils may interfere with the immunoreceptor signaling. Initiation of phagocytosis in untreated microglia induced the redistribution of Rac-1 and actin filaments that accumulated on the phagosomal membrane and disappeared after closure of phagosomal cups. Althought prion fibrils had no apperant effect on the recruitment of Rac-1 and actin, their accumulation on phagosomal membrane was prolonged for several hours and most of beads remained surrounded by unclosed pseudopod at the cell surface. Similarly, in the presence of prion fibrils, the accumulation of p85 subunit of type I PI 3-kinase on phagosomal membrane was prolonged. This suggest that fibrillar prion peptide does not impair with initial actin-driven events leading to pseudopod extension and formation of phagocytic cups, but more likely, it is linked with PI 3-kinase-depending process involving membrane fusion and phagosomal closure. Thus the pathogenic form of prion protein may hamper phagocytic function of resident microglia that is crucial in the clearance of amyloid deposits and in the development of prion diseases.

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Poster n° 8

Post-Tetanic Potentiation: insights gained from analyzing fluctuations in amplitude of postsynaptic responses Frédéric Doussau1, Elodie Fourcaudot 1, Yann Humeau2 and Bernard Poulain1 1, Neurotransmission et Sécrétion Neuroendocrine, UPR2356 du CNRS, IFR37, Strasbourg, France and, 2, Friedrich Meischer Institute, Basel, Switzerland

ost-tetanic potentiation (PTP) is a form of synaptic plasticity that is characterized by a transient increase in neurotransmitter release that lasts for several to tens of minutes.

PTP is induced by an accumulation of Ca2+ during tetanic stimulation that is thought to trigger recruitment of synapsin-controlled reserve synaptic vesicles (SV) (Greengard et al., 1993; Zucker 1999; Humeau at al., 2001).

P

According to binomial models for quantal neurotransmission, amplitude of post-synaptic responses can be described by combining three parameters, n, the number of active release sites, p, the average release probability (0<p<1) and, q, the amplitude of miniature postsynaptic responses: Imean = n*p*q (Eqn.1). The variance of the fluctuations in amplitude of the responses is Var = n*p*[1 -p]*q2 (Eqn.2). p is compound parameter that refers both to the probability that a release site is loaded with a release ready SV and the probability that this release ready SV fuses with plasma membrane upon stimulation (Brown et al., 1976; Zucker, 1989; Quastel, 1997; Scheuss and Neher, 2001; Humeau et al., 2002). If PTP involves the recruitment of reserve SV, the number of release site loaded with release ready SV should be transiently enhanced during PTP and this should manifest as transient increase in p. To verify this hypothesis we analyzed the Var = f(Imean) relationship obtained from analyzing the fluctuations in amplitude of postsynaptic responses recorded during the expression of PTPs at identified Aplysia synapses. The corresponding Var = f(Imean) plots were well fitted by equation Var = q*Imean – (1/n)*Imean

2 (Eqn.3) indicating that PTPs were due to transient increase in release probability p. Accordingly, when the resting p was increased by changing extracellular [Ca2+/Mg2+] ratio before induction of PTP, PTP amplitude was occluded. Therefore, our results validate the notion that PTP results from enhanced supply of release sites with release ready SV. Above model does not fully apply at synapses that had undergone synaptic depression in response to high frequency synaptic activity. Indeed, the Var = f(Imean) plots from PTPs elicited at depressed synapses were better fitted by a combination of Eqn.3 and equation Var = q*Imean – (1/n)*Imean

2 (Eqn 4) which is the graphical indication of a change in n, the number of active release sites (Humeau et al., 2002). Moreover, the PTPs expressed during synaptic depression did not occlude when resting p was raised at high values. These data suggest that PTP is dual and contributed both by an increase in SV availability at active release sites (conventional hypothesis) and transient "waken up" of silent sites, with the respective weight of these two phenomena depending on the physiological conditions. Supported by AFM to FD and DGA (to BP).

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Poster n° 9

Relation structure/fonction/activité des protéines Rho et de leur partenaire GDI : le modèle RhoG - rhoGDI3 Estelle Dransart, Jacqueline Cherfils, Birgitta Olofsson. LEBS, UPR9063 CNRS, 1 Avenue de la Terrasse, 91198 Gif sur Yvette

e maintien de l’intégrité d’une cellule repose notamment sur sa capacité d’adaptation aux différents stimuli extra et intra-cellulaires émis. Un stimulus correspond à un signal

qui est propagé dans la cellule via des molécules messagères intra-cellulaires qui vont être activées de manière à apporter la réponse adaptée à ce signal. Parmi ces nombreux messagers, on trouve les petites protéines G de la famille Rho (Ras Homologous). Ces protéines sont impliquées dans le déclenchement de divers processus cellulaires, dont le réarrangement du cytosquelette d’actine, la différenciation cellulaire et le trafic vésiculaire. Elles cycle entre une conformation inactive (liée au GDP) et active (liée au GTP) par l’action des facteurs d’échange (GEF) et « GTPase Activating Proteins » (GAP). Elle cycle également entre une forme cytosolique et une forme associée aux membranes par l’action des protéines rhoGDI.

L

Ces facteurs modulent donc l'activité des petites protéines G en contrôlant leur état nucléotidique (cycle GDP/GTP) et leur distribution dans la cellule. Une grande question de la biologie cellulaire est de comprendre comment les petites protéines G et leurs multiples régulateurs co-ordonnent et combinent leurs interactions pour mettre en place une réponse cellulaire spécifique. Dans le but de déterminer les mécanismes généraux de fonctionnement des GDIs vis-à-vis des protéines Rho, nous avons développé une stratégie de mutagenèse dirigée de ces différentes protéines. Nous avons choisi un des systèmes le plus simple et le plus spécifique connu actuellement : le régulateur non conventionnel rhoGDI-3 dont la spécificité d'inhibition pour la protéine RhoG vient d'être montrée au laboratoire1. Notre projet est d'étudier l'orchestration dynamique de la régulation de RhoG, et plus particulièrement de comprendre les mécanismes moléculaires responsables de l'étape d'articulation entre l'inhibition par rhoGDI-3 et l'activation par le facteur d'échange TrioGEF1. Afin de faire un choix rationnel de mutations, nous avons modélisé les structures de GDI-3 et RhoG ainsi que celle de leur complexe. Cette approche nous a permis de définir des mutants affectant des domaines stratégiques de GDI-3 et RhoG, impliqués dans la fonctionnalité et /ou l’interaction entre ces deux protéines. Les premières études effectuées sur ces mutants ont été réalisées in vivo par immunofluorescence dans les cellules de mammifère (HeLa), afin de déterminer l’influence de ces mutations sur la localisation cellulaire de GDI-3 et RhoG, ainsi que sur la capacité de GDI-3 à inhiber RhoG. Des expériences d’immunoprécipitation menées en parallèle ont permis de déterminer si ces mutations affectaient également les potentialités de GDI-3 et RhoG à interagir entre eux. D’autre part, les mutants de RhoG sont également étudiés du point de vue de leur capacité à interagir et/ou à être activés par le facteur d’échange (GEF) Trio. Cette partie des travaux est réalisée en collaboration avec le laboratoire CRBM du CNRS de Montpellier. Brunet, N., Morin, A. and Olofsson, B. (2002) RhoGDI-3 regulates RhoG and targets this protein to the Golgi complex through its unique N-terminal domain. Traffic 3, 342-358.

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Poster n° 10

Interaction of Synaptophysin with the AP-1 Adaptor Protein γ−adaptin

Oussama El Far1, Hiroshi P. M. Horikawa2, Matthias Kneussel3, and Heinrich Betz Department of Neurochemistry, Max-Planck-Institute for Brain Research, Deutschordenstrasse 46, 60528 Frankfurt, Germany 1-present address: INSERM U464, Faculté de médecine nord, Bd Pierre Dramard 13916 Marseille cedex 20 2-present address: Department of Molecular Neuroscience, Medical Research Institute, Tokyo Medical and Dental University, Yushima, 1-5-45 Bunkyo-ku, Tokyo, Japan 3-present address: Center for Molecular Neurobiology, University of Hamburg, Falkenried 94, D-20251 Hamburg, Germany

ynaptophysin is one of the most abundant proteins of the synaptic vesicle membrane. Here, we selected the cytoplasmic carboxyterminal region of synaptophysin to search

for interacting proteins by using the yeast two hybrid system. This identified γ-adaptin, a component of the AP-1 adaptor complex, as a synaptophysin binding protein. An anti-synaptophysin antibody coimmunoprecipitated γ-adaptin from brain extracts, and immunocytochemistry disclosed a partial colocalization of synaptophysin and γ-adaptin in the perinuclear region of cultured hippocampal neurons. Our results are consistent with synaptophysin serving as a docking site for AP-1 during clathrin-dependent vesicle budding and/or kinesin-based transport reactions.

S

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Poster n° 11

Implication de l’endocytose dans la compartimentation de protéines au segment initial de l’axone. Marie-Pierre Fache, Pierre Giraud, Juan José Garrido, Anissa Moussif, Bénédicte Dargent INSERM U464, Institut Jean Roche, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine Secteur-Nord, Boulevard Pierre Dramard, 13916 Marseille cedex 20, France

a compartimentation des protéines membranaires dans les neurones, cellules polarisées suivant un axe dendrito-somato-axonal, implique des mécanismes

moléculaires complexes encore mal définis. Le segment initial de l’axone (AIS), domaine particulièrement important dans la physiologie du neurone, contient à haute densité, l’une de ces protéines, le canal sodium voltage-dépendant, Nav1.2. Des résultats récents de Garrido et al. (soumis) montrent par expression de protéines chimériques, que la compartimentation de Nav1.2 à l’AIS est contrôlée par un motif de 26 acides aminés localisé dans la région intracytoplasmique II-III du canal (CD4-Nav1.2-II-III). L’étude présente a pour but de rechercher par quelles voies du trafic intracellulaire, la protéine néosynthétisée CD4-Nav1.2-II-III, est adressée à l’AIS et quels sont les mécanismes mis en jeu dans la rétention et la concentration dans ce domaine particulier de l’axone. CD4-Nav1.2-II-III est reconnue par une voie d’endocytose aussi bien dans les cellules Cos-7 que dans les neurones et colocalise avec un marqueur des endosomes précoces (EEA1). Dans les neurones, l’endocytose est importante dans le domaine somato-dendritique. Elle n’est pas observée dans l’AIS bien que présente dans le reste de l’axone. La construction de mutants de délétion permet de délimiter un motif de 20 acides aminés distinct du motif de concentration à l’AIS. L’abrogation du motif d’endocytose affecte significativement la distribution de CD4-Nav1.2-II-III à l’état stationnaire, provoque la perte de l’endocytose somato-dendritique, mais maintient toujours l’ancrage de la protéine à l’AIS. Sur ces observations, nous postulons que la régulation de l’expression membranaire de CD4-Nav1.2-II-III se ferait par un processus d’endocytose. Une élimination de la protéine interviendrait dans le domaine somatodendritique et axonal alors que sa concentration au niveau de l’AIS serait consécutive à un phénomène de rétention dont le mécanisme reste à définir (ancrage à des protéines partenaires, absence d’endocytose …). Des expériences préliminaires permettent d’envisager que l’ankyrine G, protéine spécifique de l’AIS, jouerait un rôle privilégié dans la rétention du domaine intracytoplasmique II-III de Nav1.2 et que le phénomène pourrait être endocytose-dépendant.

L

J.J.Garrido, P.Giraud, E. Carlier, F. Fernandes, M.P. Fache, D. Debanne and B. Dargent. A targeting motif that determines sodium channel clustering at the axonal initial segment. Article soumis.

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Poster n° 12

Analyse moléculaire de l’endocytose du récepteur de l’interféron gamma Alexandre Fradagrada, Marie-Noëlle Monier, Ludger Johannes et Christophe Lamaze. Insitut Curie (Paris), UMR144 – Laboratoire Trafic et Signalisation

l apparaît évident aujourd’hui que l’endocytose joue un rôle majeur dans le contrôle de la signalisation des récepteurs de cytokines et de facteurs de croissance. Par ailleurs, ces

dernières années ont vu l’identification de nouvelles voies d’endocytose distinctes de la voie classiquement étudiée, dépendante de la clathrine. Nous avons mis au point de nouveaux systèmes d’étude pour suivre qualitativement et quantitativement l’endocytose du récepteur de l’interféron γ (IFNγ), un processus mal connu. Nous avons utilisé des inhibiteurs sélectifs des différentes voies d’endocytose (Eps15, RNAi clathrine,....) afin de définir la contribution exacte de ces voies dans l’endocytose de l’IFNγ. Nos premiers résultats montrent que le récepteur est internalisé, au moins en partie, par une voie indépendante de la clathrine. Nous avons étudié, par ailleurs, le devenir intracellulaire du récepteur de l’IFNγ suite à l’inhibition de l’une ou l’autre de ses voies d’endocytose. Le rôle des microdomaines dans l’endocytose du récepteur a également été analysé. Ces études ouvrent la voie à une meilleure compréhension des liens moléculaires existant entre le trafic intracellulaire et la signalisation, un domaine d’investigation totalement inexploré pour les interférons.

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Poster n° 13

Ent3p a Novel PtdIns(3,5)P2 Effector Required for Protein Sorting in the Multivesicular Body Sylvie Friant, Eve Pécheur, Anne Eugster and François Letourneur Institut de Biologie et de Chimie des Protéines, UMR 5086 CNRS, 7 passage du Vercors, 69367 Lyon. E-mail: s.friant@ibcp.fr

hosphatidylinositol 3,5-bisphosphate (PtdIns(3,5)P2) is required for cargo-selective sorting to the vacuolar lumen via the multivesicular body (MVB), but the PtdIns(3,5)P2

binding protein that mediates this sorting has not been characterized so far. We have identified Ent3p a yeast epsin N-terminal homology (ENTH) domain containing protein, that is a specific PtdIns(3,5)P2 effector and is localized to the endosomal compartment. The ENTH domain of Ent3p is required for its PtdIns(3,5)P2 binding activity and for its membrane interaction in vitro and in vivo. An ent3-1 mutant is defective in protein sorting into the MVB and shows a delay in transport of vacuolar hydrolases, whereas endocytosis and protein secretion are unaffected. Interestingly, Ent3p is associated with clathrin and is required for actin cytoskeleton organization. Our results show that Ent3p is required for protein sorting into intralumenal vesicles of the MVB trough PtdIns(3,5)P2 binding via its ENTH domain.

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Poster n° 14

Internalisation et désensibilisation rapide du récepteur Y1 du neuropeptide Y

Hervé Gicquiaux, Sandra Lecat‡, Mireille Gaire, Alain Dieterlen¶, Yves Mély, Kenneth Takeda, Jean-Luc Galzi‡ & Bernard Bucher Pharmacologie et Physicochimie des Interactions Cellulaires et Moléculaires, UMR CNRS 7034, Faculté de Pharmacie, 74 route du Rhin, 67401 Illkirch, ‡Département Récepteurs et Protéines Membranaires, UPR CNRS 9050, Boulevard Sébastien Brant, 67401 Illkirch, ¶Laboratoire MIPS-Groupe LABEL, 61 rue Albert Camus, 68093 Mulhouse

es récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent un ensemble important de cibles thérapeutiques. L’étude de leurs mécanismes d’activation et de régulation est

d’une importance fondamentale pour la compréhension de leur rôle physiologique et leur implication pathologique.

L Le neuropeptide Y (NPY) tout comme le peptide YY (PYY) et le polypeptide pancréatique (PP) sont des peptides endogènes de 36 acides aminés. Ils génèrent leurs activités biologiques en agissant sur une même famille de RCPG. A ce jour, cinq sous types de récepteurs ont été clonés (Y1, Y2, Y4, Y5, y6). Parmi ces sous types, le plus étudié est le récepteur Y1. La transfection des cellules HEK 293 contenant un ADNc codant successivement pour un peptide signal, la GFP puis le récepteur Y1 a conduit à l’expression de fluorescence à la surface des cellules. Des mesures de Ca2+i et d’inhibition de l’activité de l’adénylyl cyclase stimulée par la forskoline ont permis de montrer que la fusion de la GFP sur le récepteur Y1 n’altère pas les propriétés fonctionnelles de ce dernier. Nous avons observé que le couple récepteur Y1-GFP s’internalisait de manière très rapide à 37°C après stimulation par le NPY. La corrélation de ce signal d'internalisation avec la cinétique de désensibilisation de la réponse calcique et de celui de l’AMP cyclique induite après activation des récepteurs Y1 suggère fortement que ce phénomène participe directement au processus de régulation de l'activité des récepteurs Y1. Un tel signal n'est pas observé pour les récepteurs Y2, Y4 et Y5 fusionnés à l'EGFP, suggérant une différence importante de régulation de ces récepteurs.

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Poster n° 15

Microglia ingest Fibrillar Prion Peptide N.J. Grant, J. Ciesielski-Treska, G. Ulrich, G. Toutirais, S. Chasserot-Golaz, M-F. Bader & Y. Bailly CNRS UPR 2356, 5 rue Blaise Pascal, 67084 Strasbourg Cedex, France E-mail: ngrant@neurochem.u-strasbg.fr

P

rion diseases are characterized by extracellular amyloid deposits and neuronal cell death. Although an acute inflammatory response is not typically observed in animal

and culture models, the morphology and abundance of microglia in these plaques in vivo is consistent with microglial activation. It still remains unclear whether microglia aid in the elimination of extracellular amyloid plaques, thereby protecting neurons from degeneration or fail to clear prion fibrils leading to the formation of larger plaques and thus aggravate the pathology. Here, the response of rat microglia in primary culture to amyloid fibrils of the synthetic prion peptide (human PrP106-126) was examined using confocal and electron microscopy. Phagocytotic capacity was assayed by measuring the uptake of 1 µm latex beads. Prion fibrillar material was immunodetected close to the cell surfaces, and within numerous cytoplasmic endosomes of treated cells. These organelles followed a classical phagolysosome maturation process, providing evidence that the microglia are capable to some extent of internalizing and processing fibrillar PrP peptide. On the other hand, the prion peptide dramatically reduced the ingestion of beads, suggesting that it interfered with phagocytosis. The inability of microglia to completely eliminate prion fibrils may contribute to plaque formation and neurodegeneration in transmissible spongiform encephalopathies.

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Poster n° 16

Réversion rapide du blocage de l’exocytose par la toxine LT de Clostridium sordellii Yann Humeau1,3

, Frédéric Doussau1

, Michel R. Popoff2, Bernard Poulain1

1UPR 2356 du CNRS, IFR 37 des Neurosciences, 5 rue Blaise Pascal, F-67084 Strasbourg cedex. Tél. : 03 88 45 66 77. Fax : 03 88 60 16 64. E-mail : poulain@neurochem.u-strasbg.fr 2Toxines microbiennes, Institut Pasteur, F-75724 Paris cedex 15 3adresse actuelle: Friedrich Miescher Institute, Basel, Switzerland

a toxine létale (LT) de C. sordellii utilise l’UDP-glucose cytosolique comme donneur de glucose et glucosylent une thréonine très conservée de la boucle effectrice de certaines

GTPases monomériques des familles Rho et Ras empêchant ainsi l’activation de leurs protéines effectrices. La LT inactive ainsi les actions biologiques de Rac, Ras, Rap, Ral, mais jamais Rho. Nous avons montré précédemment que la glucosylation de Rac entraîne un blocage de la libération de transmetteur par diminution du nombre des sites d’exocytose fonctionnels (Humeau et al., 2002). Rac est Vésiculaire (Doussau et al., 2000). Lors de l’arrimage des vésicules synaptiques au site de fusion Rac stimulerait un effecteur (la PLD1) essentiel à la fusion.

L

L’application de stimulations itératives aux terminaisons nerveuses empoisonnées par la LT produit une très forte augmentation, transitoire, de la libération de transmetteur (Doussau et al., 2000). Nous caractérisons ici ce phénomène. Il est distinct de la potentialisation post-tétanique (PPT) : son amplitude est plus forte (>400 % versus ~50% pour la PPT) et sa durée est plus courte (τoff <1 min versus ~10 min pour la PPT). De plus, alors que les PTP sont dues à des augmentations temporaires de la probabilité de libération, nous avons déterminé qu’il y a une augmentation temporaire du nombre des sites de fusion fonctionnels. Cette action est donc l’opposé du blocage induit par la LT. L’induction de la réversion de l’inhibition causée par la LT par des stimulations itératives dépend très fortement de leur fréquence (seuil ~ 10 Hz). La répétition des stimulations à forte fréquence provoque une accumulation d’ions Ca2+. Ce n’est pourtant pas là l’origine de la réversion de l’action de la LT : en effet, l’amplitude relative et la durée de la réversion de la LT sont indépendantes du gradient calcique. L’amplitude de la facilitation synaptique (une forme de plasticité synaptique très dépendante de l’accumulation cytosolique de Ca2+) n’est pas modifiée au cours de la phase de réversion. L’application d’agents pharmacologiques modifiant l’efficacité du stockage intracellulaire des ions Ca2+ n’a pas eu d’effet sur l’amplitude et la durée de la réversion de la LT. Ces données suggèrent que l’amplitude et la durée de la réversion de la LT ne sont pas associées à une augmentation transitoire de la [Ca2+]i. La durée de la phase de réversion de la LT dépend très fortement de la fréquence des stimulations appliquées pendant la phase de réversion : plus la fréquence est élevée (tout en restant en deçà de la fréquence seuil de 10 Hz), plus courte est la réversion de la LT. En fait, quelque soit la fréquence de stimulation utilisée, le nombre de stimulations nécessaire pour « épuiser » la levée du blocage est constante. Chaque site de libération empoisonné ne re-fonctionne qu’un nombre de fois déterminé. Plusieurs questions restent ouvertes : Est-ce que la levée transitoire du blocage induit par la LT est provoquée par la mise en jeu de voies qui court-circuitent Rac et permettent d’activer directement l’un de ses effecteurs (comme la PLD1)? Est-ce qu’un métabolite est produit au cours des stimulations itératives et s’accumule localement plus vite qu’il n’est consommé/métabolisé permettant, par diffusion latérale, le re-fonctionnement des sites de fusion adjacents ? Ce travail a bénéficié d’un soutien par l’AFM (F.D.), le PRFMMIP2000 et la DGA (M.R.P et B.P.)

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Poster n° 17

Presynaptic induction and expression of associative heterosynaptic LTP in the central nervous system Yann Humeau1 & Andreas Lüthi1 Department of Pharmacology/Neurobiology, Biozentrum, University of Basel, Klingelbergstrasse 70, CH-4056 Basel, Switzerland 1Present address: Friedrich Miescher Institute, Maulbeerstrasse 66, CH-4058 Basel, Switzerland.

he induction of associative synaptic plasticity in the mammalian central nervous system classically depends on coincident pre- and postsynaptic activity. According to

this rule, associative long-term potentiation (LTP) of excitatory synaptic transmission can only be induced if synaptic release occurs during postsynaptic depolarization. Here, we describe a novel mechanism underlying the induction of associative LTP in the lateral amygdala (LA). Simultaneous activation of converging cortical and thalamic afferents specifically induced associative, N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor-dependent LTP at cortical, but not at thalamic inputs. Surprisingly, the induction of associative LTP at cortical inputs was completely independent of postsynaptic activity including depolarization, postsynaptic NMDA receptor activation, or calcium influx, thus representing a form of heterosynaptic, though input-specific, plasticity. Depending on the activity of cortical afferents, thalamic afferent stimulation resulted in a transient or persistent increase in the probability of release at cortical inputs. Thus, our study demonstrates the presynaptic induction and expression of heterosynaptic, associative synaptic plasticity upon simultaneous activity of converging afferents, and indicates that input-specificity of associative LTP can be determined by presynaptic properties.

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Poster n° 18

Clostridium sordellii lethal toxin blocks neuro-exocytosis by disabling Rc-dependent PLD-mediated priming of exocytotic sites Y. Humeau,1 M.R. Popoff,2 F. Doussau,1 N.Vitale,1 M.-F. Bader,1 M.A. Frohman,3 and B. Poulain,1

CNRS, UPR2356, F-67084 Strasbourg, France, 2 Toxines microbiennes, Institut Pasteur, F-75724 Paris Cedex 15, France, 3Dept. of Pharmacol., Univ. Med. Cent., Stony Brook, NY 11794-5140

ethal toxin produced by Clostridium sordellii strain IP82 (LT82) is a large monoglucosyltranferase that utilizes UDP-glucose as a cofactor and glucosylates Rac,

Ras, Ral and Rap. Intraneuronal application of LT82 rapidly inhibits evoked acetylcholine release as monitored electrophysiologically at identified synapses of Aplysia. Certain evidence suggests that glucosylation of Rac, which is associated with the synaptic vesicle membrane is responsible for the inhibitory action of LT on ACh release. Analysis of postsynaptic response fluctuations permit an estimation of quantal release parameters indicated that this indicated inactivation of Rac reduces the number of active release sites. The intracellular pathways controlled by Rac were examined. Phospholipase D was one possible candidate. Injection of purified, catalyticaly inactive PLD recombinant proteins into neurons also blocked ACh release. This indicates that PLD activity is essential for neuroexocytosis. Fluctuation analysis revealed that inactivation of PLD caused a loss of active release sites, similar to that produced by LT. Upon synaptic vesicle docking, the Rac-PLD interaction may modify the lipid composition of the fusion sites thereby permitting SNARE-mediated vesicle fusion to occur. The inhibitory action of LT on neuroexocytosis is proposed to result from disruption of this priming process.

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Poster n° 19

Role of the GAP Gyp1p in recycling of internalized material in yeast. Céline Lafourcade

1, Jean-Marc Galan

1,2, Rosine Haguenauer-Tsapis2 and Matthias

Peter1,*

1Institute of Biochemistry, ETH Hoenggerberg, 8093 Zürich, Switzerland

2Institut Jacques Monod-CNRS, 2 place Jussieu, 75251 PARIS Cedex 05, France

he Rab/Ypt-GTPases are key regulators of membrane trafficking and together with SNAREs proteins mediate selective fusion of vesicles with target compartments. They

cycle between GDP- and GTP-bound forms, and accessory proteins that regulate this cycling are thought to be critical for Ypt/Rab function. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) stimulate both GDP loss and GTP uptake, while GTPase activating enzyme (GAPs) catalyze GTP hydrolysis. A family of related proteins termed Gyp’s has been discovered and shown to exhibit GAP activity towards several Ypt/Rab GTPases in vitro. However little is known about the role of GEFs and GAPs proteins in vivo.

T

We tested cells defective for each of these GAPs for recycling of Snc1p and the membrane dye FM4-64. We found that cells deleted for GYP1 exhibit a strong recycling defect. Our results suggest that Gyp1p acts as a GAP for Ypt-Rab GTPases that are directly or indirectly involved in recycling. We are currently trying to understand the molecular basis for their role in recycling.

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Poster n° 20

The myotubularin phosphatase family : from genetic diseases to phosphoinositides metabolism and membrane trafficking. Laporte Jocelyn, Blondeau François, Tronchère Hélène, Liaubet Laurence, Bedez Florence, Buj-Bello Anna, Payrastre Bernard, Mandel Jean-Louis. IGBMC, Illkirch and U326, Toulouse.

yotubularins define a large family of proteins conserved from yeast to human, where 14 members have been described so far. Three of the human genes are found

mutated in three human genetic diseases, a congenital myopathy and two forms of demyelinating Charcot-Marie-Tooth neuropathy. We are studying the function of the founding member, myotubularin (MTM1), mutated in myotubular myopathy.

M

Myotubularin and homologues dephosphorylate phosphatidylinositol 3-phosphate (PI3P) and phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate (PI3,5P2), both in vitro and in yeast. PI3P is implicated in the regulation of endocytosis through its interaction with FYVE and PX domain containing proteins. Cells overexpressing myotubularin show a decreased PI3P labeling when a 2XFYVE is used as a probe, and extended filopodias. However myotubularins do not localize onto early endosomes but as a dense cytoplasmic network and overexpression of MTM1 does not seem to inhibit recycling of transferrin. Patients cells lacking myotubularin show a normal localization of PI3P and EEA1 onto early endosomes. On the other hand, overexpression of human myotubularin in yeast induce a vacuolar phenotype similar to the loss of VPS34, the kinase producing PI3P. This phenotype is dependent on the catalytic activity and is also induced by myotubularin homologues. Although its function is unknown, myotubularin and homologues contain a GRAM domain also found in regulators of Rab GTPases. We observed that constitutive activation of Rac induces recruitment of wild-type myotubularin and homologues to plasma membrane ruffles. Morevover, a myotubularin mutant lacking a residue essential for the release of the substrate localizes specifically to plasma membrane extensions. Taken together, our results suggest that myotubularin proteins are a large family of new phosphoinositides phosphatases which might regulate endocytosis and membrane trafficking. Misregulation of these processes could be the primary cause of myotubular myopathy and type 4B Charcot-Marie-Tooth neuropathies.

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Poster n° 21

Biochemical and functional characterization of Rab27a mutations occurring in Griscelli syndrome patients Gaël Menasché

1, Jérôme Feldmann

1, Anne Houdusse

2, Catherine Desaymard

3, Alain

Fischer1, Bruno Goud

3, Geneviève de Saint Basile

1.

1 Unité de Recherche sur le Développement Normal et Pathologique du Système Immunitaire INSERM U429, Hôpital Necker-Enfants Malades, 75743 Paris, France,2 équipe Motilité structurale and 3 équipe Mécanismes moléculaires du transport intracellulaire, Unité Mixte de Recherche, Institut Curie/Centre National de la Recherche Scientifique 144, Institut Curie, 75248 Paris, France.

R

ab27a is a member of the Rab family of small GTPase protein, the first member of this protein family so far associated with a human disease, i.e. the Griscelli syndrome type

2. Mutations in Rab27a gene cause pigment as well as cytotoxic granule transport defects accounting for the partial albinism and severe immune disorder characteristic of this disorder. So far, three Rab27a missense mutations have been identified. They open a unique opportunity to designate critical structural and functional residues of Rab proteins. We show here that the introduction of a proline residue in the α4 (A152P) or β5 (L130P) loop observed in two of these spontaneous mutants, dramatically affects both GTP and GDP nucleotide binding activity of Rab27a, probably by disrupting protein folding. The third mutant, W73G, is located within an invariant hydrophobic triad at the switch interface, previously shown in active Rab3A to mediate Rabphilin3A effector interaction. W73G is shown to display the same nucleotide binding and GTPase characteristics as the constitutively active mutant Q78L. However, in contrast to Q78L, W73G mutant construct neither interacts with the Rab27a effector melanophilin nor modifies melanosome distribution and cytotoxic granule exocytosis. Substitutions introduced at the 73 position, including the L residue present in Ras, did not restore Rab27a protein functions. Taken together, our results characterize new critical residues of Rab proteins, and identify the W73 residue of Rab27a as a key position for interaction with the specific effectors of Rab27a, both in melanocytes and cytotoxic cells.

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Poster n° 22

Altération de la voie d’endocytose par Nef-VIH-1 provoque une inhibition du recyclage du TfR à la membrane plasmique Ricardo Madrid

1, Katy Janvier

1, Douglas Hitchin

2, Heather Craig

2, Louis Renault

4,

Jacqueline Cherfils4, Dan Cassel5, Bernard Hoflack

4, John Guatelli

2,3 and Serge

Benichou1,*.

1Institut Cochin, Department of Infectious Diseases, INSERM U567, CNRS UMR8104, Université Paris 5, Paris, France; 2the San Diego Veterans Affairs Healthcare System; 3the Department of Medicine, University of California, La Jolla, USA; 4 LEBS. CNRS, 91198 Gif/Yvette. 5 Institut Curie, UMR144, 26 rue d’Ulm. 75248 Paris.;6Max Planck Institute, Dresden, Germany.

a protéine Nef du VIH joue un rôle primordial dans la réplication virale et l’induction du SIDA. In vitro, Nef module l’expression à la surface de nombreuses protéines

membranaires telles que CD4, CMH-I et II, CD28, DC-SIGN et des cytokines TNF et LIGHT. Ces perturbations du trafic des protéines résultent de la capacité de Nef à interagir avec les complexes AP-1, AP-2, AP-3 et COP-I, constituants de la machinerie impliquée dans le transport vésiculaire des protéines au sein de la via d’endocytose.

L

Dans une première partie de notre étude (1), nous montrons que Nef provoque une concentration des complexes AP-1, AP-3, mais pas AP-2, dans une région périnucleaire, et qu’impliquent le motif 160EXXXLL165 contenu dans la boucle flexible carboxypeptidase de la protéine. Des traitements qui altèrent l’état d’activation d’ARF1 (BFA, la sur-expression du mutant ARF1-T31N et ARF1-GAP) demeurent sans effet l’association des APs induite par l’expression de Nef. In vitro, Nef ne présente pas une activité intrinsèque sur la machinerie régulant le cycle d’activation-inactivation d’ARF1. L’ensemble de ces données suggère que Nef permettre l’association et la stabilisation des complexes AP-1 et AP-3 indépendant de la machinerie ARF1 et indique que les perturbations du trafic intracellulaire par Nef soient plus générales. Ainsi, dans une deuxième partie du travail (résultats pas publiés), nous avons étudié l’effet de Nef sur la distribution de marqueurs du compartiment endosomial précoce. En effet, nos résultats montrent que Nef provoque une altération importante de protéines cyclant entre la membrane plasmique et les endosomes, et nettement sur le transport du récepteur à la transferrine (TfR), du récepteur au mannose –6-phosphate (CI-MPR). Au contraire, Nef n’altère pas l’adressage du récepteur à l’EGF (EGFR) vers les compartiments de dégradation. L’analyse des cinétiques de transport du TfR indique que Nef provoque un ralentissement important du recyclage des endosomes précoces vers la membrane plasmique, sans altérer son internalisation à partir de la surface cellulaire. Cette altération se traduit par une réduction tres significative d’expression du TfR à la surface des cellules expriment Nef, et sa séquestration dans le compartiment endosomal perinucleaire. Dès que les perturbations du trafic du TfR dépendent aussi du motif di-leucine (160EXXXLL165), nous proposons que Nef puisse altérer de façon spécifique la physiologie du compartiment précoce et de recyclage par la stabilisation constitutive des complexes adaptateurs AP-1 et AP-3 aux membranes endosomiaux. (1) Janvier K, Craig H, Hitchin D, Madrid R, Sol-Foulon N, Renault L, Cherfils J, Cassel D, Benichou S, Guatelli J. (2002). HIV-1-Nef Stabilizes the Association of Adaptor Protein Complexes type 1 and 3 with Membranes. J. Biol. Chem. (accepté 16 dec 2002).

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Poster n° 23

Ectopic expression of syntaxin 1 in the ER redirects TI-VAMP and cellubrevin-containing vesicles Sonia Martinez-Arca1, Véronique Proux-Gillardeaux1, Philipp Alberts1, Daniel Louvard2, and Thierry Galli1* 1Membrane Traffic and Neuronal Plasticity, INSERM U536, Institut du Fer-à-Moulin, 75005, Paris, France. 2Morphogenesis and Cell Signaling, CNRS UMR 144, Institut Curie, 75005, Paris, France.

NARE proteins are key mediators of membrane fusion. Their function in ensuring compartmental specificity of membrane fusion has been suggested by in vitro studies

but not demonstrated in vivo. We show here that the ectopic expression of the plasma membrane t-SNARE heavy chain syntaxin 1 in the endoplasmic reticulum induces the redistribution of its cognate vesicular SNAREs, TI-VAMP and cellubrevin, and its light chain t-SNARE SNAP-23. These effects were prevented by co-expressing nSec1. Expression of syntaxin 1 alone impaired the cell surface expression of TI-VAMP and cellubrevin but not the recycling of transferrin receptor. TI-VAMP, cellubrevin and SNAP-23 associated in vivo with exogenous syntaxin 1. Redistribution of TI-VAMP in the ER of syntaxin 1-expressing cells was microtubule-dependent and impaired the trafficking of CD63, a cargo of TI-VAMP containing vesicles. We conclude that the destination of v-SNAREs is driven by their specific interaction with cognate t-SNAREs. Our in vivo data provide strong support for the highly specific v-SNARE/t-SNARE interaction-mediated compartmental specificity of membrane fusion.

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Poster n° 24

Détection d’auto-anticorps dans le syndrome de Lambert-Eaton : une maladie auto-immune résultant d’un défaut de l’exocytose Nicole Martin-Moutot, Raquel Gouvea Dos Santos, Catherine Van Renterghem, Michael Seagar INSERM U464, Institut Jean Roche, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine Secteur Nord, Marseille

e syndrome myasthénique de Lambert-Eaton (LEMS) est une maladie neurologique dysimmunitaire avec production d’auto-anticorps. On observe au niveau des

terminaisons des motoneurones un défaut de la libération d’acétylcholine se traduisant par une faiblesse musculaire. Dans 70% des cas, il s’agit d’un syndrome paranéoplasique dans lequel un carcinome pulmonaire à petites cellules (SCLC), une tumeur d’origine neuroendocrine, induit la réponse immunitaire. Le transfert passif d’IgG LEMS a des souris cause une perturbation et une diminution des particules de la zone active au niveau de la jonction neuromusculaire. De plus, une série de données électrophysiologiques et biochimiques soutient l’hypothèse que les auto-anticorps pathogènes perturbent le fonctionnement des canaux calcium présynaptiques. La cible de ces auto-anticorps n’est que partiellement déterminée au niveau moléculaire. Des travaux faits dans différents laboratoires ont abouti à la conclusion que les antigènes LEMS sont très hétérogènes. Certains anticorps sont dirigés contre la synaptotagmine, une protéine liée au canaux calcium et impliquée dans l’exocytose, d’autres réagissent avec les canaux Ca++ de type N (Cav2.2) ou P/Q (Cav2.1), par le biais des sous-unités β3 et β4 ou bien directement avec une boucle extracellulaire de la sous-unité α1A des canaux P/Q.

L

Nous avons mis au point et utilisons un test diagnostic sérologique basé sur l’immunoprécipitation des canaux calcium N ou P/Q de cerveau de rat, marqués par l’125I-ωconotoxine GVIA (ωGVIA) ou par 125I-ωconotoxine MVIIC (ωMVIIC). Les résultats obtenus se recoupent en grande partie, mais pas complètement, ce qui impose de faire les deux tests. Nous avons récemment purifié une toxine d’araignée sud-américaine : l’-ω Phonetoxine IIA (ωPtxIIA) et caractérisé au niveau électrophysiologique et pharmacologique son mode d’action (Dos Santos et al. 2002). Cette toxine se fixe aussi bien sur les canaux Cav2.1 et Cav2.2, qui sont les sous-types de canaux majoritairement impliqués dans la libération des neurotransmetteurs. Elle pourrait donc être un outil intéressant pour le dosage des auto-anticorps LEMS. Nous avons mis au point un test sérologique utilisant l’125I-ωPtxIIA. Les résultats ont été évalués et comparés à ceux obtenus avec l’125I-ωGVIA et l’125I-ωMVIIC, toxines spécifiques d’un sous-type de canal calcium. Dos Santos RG, Van Renterghem C, Martin-Moutot N, Mansuelle P, Cordeiro MN, Diniz CR, Mori Y, DeLima ME, Seagar M, J Biol Chem, 2002, 277(16) 13856-62.

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Poster n° 25

Caractérisation de nouvelles isoformes du CD23 : endocytose régulée par le domaine extracellulaire

Guillaume Montagnac1, Linda Yu2, Mary Perdue2, Alexandre Benmerah1

1Dpts Maladies Infectieuses, Institut Cochin, Batiment G. Roussy, 27 rue du Faubourg St Jacques, Paris. 2Intestinal Disease Research Programme, McMaster University, Hamilton, ON, Canada.

L

e récepteur de faible affinité aux IgE (CD23) est impliqué dans des phénomènes allergiques au niveau de l’épithélium intestinal en assurant un transport spécifique,

dépendant des IgE, des allergènes de la lumière intestinale au pôle basal des entérocytes. A fin de préciser la fonction du CD23 au sein de ce transport, nous avons caractérisé ses propriétés d'internalisation. Comme il existe deux isoformes du CD23, nous avons montré que seule l’isoforme b du CD23 est exprimée par l'épithélium intestinal. Nous nous sommes ensuite attaché à caractériser les propriétés d’internalisation du CD23, l'internalisation des complexes IgE/CD23 représentant la toute première étape du transport transépithélial. Nos résultats indiquent qu’il existe dans la portion cytoplasmique de CD23b un signal positif d’internalisation mais que celui-ci est inhibé par la présence d’un signal négatif dans la portion spécifique de l’isoforme b. Enfin, nous avons mis en évidence par RT-PCR l’existence de nouvelles isoformes du CD23b présentant un épissage alternatif dans la région extracellulaire impliquée dans l’oligomérisation du récepteur. Bien que pourvues du signal inhibiteur, ces nouvelles isoformes sont toutes internalisées de façon constitutive. L'ensemble de ces données suggérent ainsi un mécanisme original de contrôle de l'internalisation du CD23b qui serait donc régulée par sa région extracellulaire.

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Poster n° 26

Le senseur calcique de l’exocytose dans les cellules insulino-sécrétrices : quelle synaptotagmine ?

C. Monterrat, C.Tessier, F. Gasset, J.Lang.

Institut Européen de Chimie et Biologie, Av Pey Berland, 33406 Pessac Cedex.

L’ altération précoce de la sécrétion d’insuline par les cellules β-pancréatiques est un facteur important de la pathologie du diabète de type II. Parmi les mécanismes

moléculaires de la sécrétion d’insuline, l’augmentation du calcium intracellulaire liée au métabolisme du glucose constitue l’élément déclencheur principal de la fusion des vésicules larges à corps dense (VLDC) avec la membrane plasmique. Les synaptotagmines (Syt), une famille de protéines comprenant au moins 13 isoformes sont, aujourd’hui, les meilleurs candidats au rôle de senseur calcique de l’exocytose. Nous avons précédemment montré, dans un modèle de cellules clonales dérivées des cellules β-pancréatiques, l’implication fonctionnelle de Syt I et II dans l’exocytose. Cependant, ces deux isoformes ne sont pas exprimées dans les cellules primaires, une autre isoforme jouant le rôle de senseur calcique. Notre étude a donc pour objectif la localisation sous-cellulaire systématique des isoformes qui pourraient être impliquées dans l’exocytose (VII à XIII) des cellules insulino-sécrétrices, un prérequis indispensable aux études fonctionnelles. Des anticorps dirigés contre une séquence peptidique spécifique de chaque isoforme ont été produits. Leur caractérisation sur les protéines recombinantes Syt I à XIII n’ont révélé aucune réactivité croisée. Nous avons confirmé la présence de Syt VII et VIII sur les fractions contenant les VLDC en gradient continu de sucrose, cependant nous ne retrouvons pas de colocalisation significative en immunofluorescence. Nous examinons actuellement la distribution des isoformes IX à XIII. En conclusion, cette étude permet de montrer la présence de Syt VII et VIII sur un compartiment de même densité que les VLDC et suggère que le rôle de senseur calcique de l’exocytose des cellules β-pancréatiques est assuré par une autre isoforme.

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Poster n° 27

Intervention de l'ubiquitine ligase Rsp5p dans le trafic des hydrolases vacuolaires chez S. cerevisiae. J. Morvan, R. Haguenauer-Tsapis et D. Urban-Grimal Institut Jacques Monod- CNRS, Université Paris6 and Paris7-Denis Diderot, 2 place Jussieu, 75251-Paris-cedex 05

L

es endosomes de levure, ou de cellules animales, invaginent leurs membranes pour former des vésicules internes. Ils sont alors nommés "multi-vesicular bodies" (MVBs).

Les MVBs fusionnent ensuite avec la vacuole et y délivrent leurs vésicules internes pour dégradation. Il a été montré, en particulier chez la levure, que beaucoup de protéines membranaires qui intègrent ces structures vésiculaires y sont dirigées après ubiquitylation. Parmi celles-ci, se trouvent les précurseurs de deux hydrolases vacuolaires, la carboxypeptidase S, Cps1p et la polyphosphate endophosphatase, Phm5p qui sont libérées dans le lumen de la vacuole après maturation. L'ubiquitine isopeptidase Doa4p est impliquée dans la déubiquitylation de ces protéines membranaires au moment de leur incorporation dans les vésicules internes des MVBs. Dans un contexte mutant doa4, où les cellules ne possèdent qu'un faible taux d'ubiquitine libre, ces protéines ne sont pas ubiquitylées et sont délocalisées à la membrane vacuolaire. Nous montrons ici que l'ubiquitine ligase, Rsp5p, déjà impliquée dans l'endocytose ubiquitine-dépendante des protéines de la membrane plasmique, participe à l'ubiquitylation de ces protéines au cours de leur trajet biosynthétique entre le Golgi et les MVBs.

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Poster n° 28

Identification of a novel presynaptic membrane compartment containing Tetanus Neurotoxin-Insensitive Vesicle Associated Membrane Protein in the rat brain Aude Muzerelle

1, Philipp Alberts

2, Sonia Martinez-Arca

2, Odile Jeannequin

3, Pierre

Lafaye3, Jean-Claude Mazié3, Thierry Galli2*, and Patricia Gaspar1*

1 INSERM U106, Hôpital Salpêtrière, F-75651, Paris cedex 13, France 2 Membrane Traffic and Neuronal Plasticity, INSERM U536, F-75005 Paris, France 3 Laboratoire d'Ingénierie des Anticorps, Institut Pasteur, 75724 Paris Cedex 15, France

etanus neurotoxin-Insensitive Vesicle Associated Membrane Protein (TI-VAMP) is a SNARE implicated in neurite outgrowth. We produced a monoclonal antibody Cl158.2

that specifically recognizes TI-VAMP. Using Cl158.2 in the neonatal and adult brain of the rat, we confirmed the presence of TI-VAMP in the somatodendritic compartment of most neurons of the adult brain and spinal cord. We found a pronounced labeling of dendrites during the early postnatal period, coinciding with the peak of dendritogenesis. At P15 and thereafter, an unexpected localization of TI-VAMP was identified in a subset of axon terminals : 1) the hippocampal mossy-fiber terminals in the dentate gyrus and in CA3 , 2) the peridendritic terminal plexuses in the globus pallidus (GP), substantia nigra pars reticulata (SNr), and amygdala, and 3) the dorsal horn of the spinal cord. The presynaptic localization of TI-VAMP was demonstrated by co-localization with synaptophysin, and by ultrastructural studies. Terminals that contained TI-VAMP were glutamatergic in the hippocampus, GABAergic in the SNr and GP, and met-enkephalinergic in the amygdala and dorsal horn of the spinal cord. The existence of a presynaptic pool of TI-VAMP in a subset of neurons suggests that exocytosis in these cells may depend, at least in part, on a different molecular machinery than in most synapses of the brain. The presence of TI-VAMP in the mossy fibers may correspond to the high degree of plasticity that characterizes this pathway throughout adult life.

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* T. Galli and P. Gaspar were principal investigators

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Poster n° 29

Calcium-independent phospholipase A2 is involved in both the retrograde and anterograde traffic in mammary epithelial cells C.Péchoux-Longin*, R. Boisgard**, E. Chanat* and F. Lavialle* * Laboratoire de Génomique et physiologie de la lactation, Inra Jouy-en-Josas. ** Laboratoire d’imagerie moléculaire expérimentale, CEA Orsay.

uring lactation, mammary epithelial cells synthesize a huge amount of caseins that travel from the rough endoplasmic reticulum towards the Golgi/trans-Golgi stacks

where they undergo post-translational modifications (phosphorylation, glycosylation) and are packaged into secretory vesicles. After fusion of the secretory vesicles with the apical membrane domain, casein micelles are released in the lumen of the acinus. A pivotal role of phospholipases in the lipid-based mechanisms that couple membrane dynamics and intracellular trafficking has been recently proposed. To explore the possible participation of the calcium-independent phospholipase A2 (i-PLA2) in the vesicular transport of caseins, fragments of mammary tissue of lactating animals were treated with BEL -a suicide substrate that interferes with i-PLA2 activity.

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Analysis of the secretion of [35S]methionine/cysteine pulse-labelled milk proteins indicates that BEL decreases the amount of secreted caseins by 30%. Interestingly, casein secretion decreases to a similar extent when BEL is added after accumulation of pulse-labelled proteins into the trans-Golgi-network by incubation at 20°C. Morphological studies carried out by electron microscopy indicate that when mammary fragments are incubated with BEL, secretory vesicles containing casein micelles accumulate in a juxtanuclear Golgi region. Analysis of the casein maturation was performed in the absence or the presence of BEL by 2D-PAGE. It brings evidence that the inhibitor delays the casein transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. Immunochemical observations using antibodies directed against p58 show that BEL perturbs the membrane organization of the endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment (ERGIC) but also prevents the effect of brefeldin A. Measurements of PLA2 activities, achieved by an in vitro assay using cytosolic extracts of mammary tissue, indicated that BEL slightly (10%) but readily decreases the release of arachidonic acid from synthetic lipid micelles. Taken together, these data support the hypothesis that i-PLA2 is involved in both the retrograde and anterograde membrane traffic in mammary epithelial cells.

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Poster n° 30

La myosine1b contribue au transfert des molécules vers les vésicules internes des endosomes multivésiculaires. Laura Salas-Cortés, Fei Ye, Graça Raposo, Danielle Tenza, Daniel Louvard, Evelyne Coudrier. Morphogenèse et signalisation cellulaire. UMR 144. Institut Curie.

a myosine 1b (Myo1b), une myosine associée aux endosomes et aux lysosomes, contrôle le transport des molécules internalisées vers les lysosomes et contribue avec

l’actine au mouvement des lysosomes sur les microtubules. Pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire par lequel Myo1b participe au trafic intracellulaire des molécules le long de la voie d’endocytose, nous avons choisi le mélanocyte (cellules MNT-1, lignée cellulaire dérivée des mélanocytes humains) comme modèle cellulaire. Les mécanismes moléculaires fondés sur l’interaction entre l’actine et les myosines jouent en effet un rôle essentiel pour le transport intracellulaire de ce type cellulaire spécialisé dans la synthèse de mélanine.

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Nos résultats montrent que la sur expression de GFP-Myo1b ou d’une protéine mutée dans les cellules MNT-1 affecte la distribution intracellulaire des pigments et des protéines associées aux endosomes et aux mélanosomes et perturbe la structure et la taille des compartiments (endosomes) EEA1 positifs. La biogenèse des mélanosomes, organites apparentés aux lysosomes sécrétoires au sein desquels, la mélanine est synthétisée dépend de la ségrégation des protéines spécifiques des mélanosomes comme Pmel17, au niveau d’endosomes multivésiculaires. Nous avons observé que la sur expression de Myo1b ralentit la maturation de Pmel17. De plus Myo1b co-immunoprécipite avec Pmel17 et ces deux protéines co-localisent sur la membrane externe des endosomes multivésiculaires. En exerçant une tension entre les filaments d’actine et la membrane des endosomes, via de protéines comme Pmel17, Myo1b pourrait faciliter la formation des vésicules internes des endosomes multivésiculaires et contribuer au transport des protéines vers les vésicules internes.

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Poster n° 31

L’observation du mouvement des vésicules de sécrétion par microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente Tran SV., Huet S., Fanget I., Cribier S., Henry J.-P. CNRS UPR 1929, Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris, France jphenry@ibpc.fr

a microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente permet d’observer les mouvements d’une vésicule de sécrétion unique au voisinage de la membrane

plasmique de la cellule ainsi que l’éventuelle fusion de cette vésicule avec la membrane. En effet, l’onde évanescente n’excite que la fluorescence des molécules situées au voisinage de l’interface verre/cellule. Dans notre montage, l’épaisseur de la région excitée (quelques centaines de nanomètres) peut être ajustée expérimentalement en faisant varier l’angle d’incidence du faisceau d’excitation (laser à argon accordé à 488 nm).

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Les observations sont réalisées sur trois types cellulaires différents : des cellules PC12, des cellules BON et des cellules chromaffines d’origine bovine. Les vésicules de sécrétion sont marquées par des colorants encapsulés (ex. l’acridine orange) ou des protéines fluorescentes incorporées à leur contenu (ex. la NPY-GFP). Grâce aux séquences d’images obtenues, il est possible de déterminer la trajectoire des vésicules. L’analyse de ces trajectoires a permis de mettre en évidence l’existence de trois catégories de vésicules : une première regroupant des vésicules peu mobiles dont le déplacement est quasi brownien, une seconde pour laquelle les mouvements sont importants et dirigés et enfin une troisième qui est intermédiaire entre les deux catégories précédentes. L’observation de la répartition des vésicules dans ces différentes classes dépendant de la profondeur de pénétration de l’onde évanescente utilisée, nous pouvons en déduire que les vésicules les moins mobiles sont concentrées au voisinage de la membrane et que leur mobilité croît lorsque l’on s’éloigne de cette dernière. Nous avons aussi observé une modification de la mobilité lors de la stimulation des cellules par les ions K+ ou Ba2+. Nous avons enfin étudié l’évolution temporelle de la fluorescence lorsqu’une vésicule fusionne avec la membrane, ces événements de fusion ayant été obtenus par perméabilisation des membranes par la digitonine en présence de Ca2+ extra-cellulaire.

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Poster n° 32

Observation des modifications de la mobilité vésiculaire induites par Rab27A et son effecteur MyRIP par microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente Tran SV., Huet S., Fanget I., Cribier S., Henry J.-P. CNRS UPR 1929, Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris, France jphenry@ibpc.fr

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l a récemment été montré que la protéine Rab27A était présente sur les granules de sécrétion. De plus, une interaction entre la myosine VII A et Rab27A par l’intermédiaire

de MyRIP (Myosin VII A and Rab Interacting Protein) a été mise en évidence. Ces résultats suggèrent l’existence d’un lien entre les vésicules et le cytosquelette d’actine. Afin de comprendre la nature de ce lien, nous avons étudié le mouvement des granules situés au voisinage de la membrane plasmique. Pour cela, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente qui permet de suivre la trajectoire des vésicules situées à une distance de la membrane inférieure à quelques centaines de nanomètres. D’après de précédentes études, cette zone d’observation englobe l’anneau sous-cortical d’actine. Ces observations ont été effectuées sur des cellules PC12 co-transfectées par NPY-GFP, un marqueur du contenu des vésicules, et par le mutant GTPase déficient de Rab27A (Rab27A-Q78L) ou différentes constructions impliquant MyRIP. A partir des trajectoires, la mobilité des vésicules a été caractérisée en calculant leur coefficient de diffusion en 2 dimensions. Il a alors été possible de réaliser des histogrammes de répartition des coefficients de diffusion pour les différentes conditions de transfection. Ainsi, nous avons mis en évidence le fait que la sur-expression de Rab27A-Q78L ou de la protéine MyRIP sauvage induit une nette diminution de la mobilité des vésicules. Réciproquement, dans des cellules transfectées par le domaine de MyRIP se liant à Rab27A, la mobilité est augmentée. Ces résultats suggèrent que le couple Rab27/Myrip permet un accrochage des vésicules sur le cytosquelette d’actine via une myosine.

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Poster n° 33 Adhésion et internalisation de colloïdes multilamellaires

Damien van Effenterre, Cécile Poirier, Brigitte Delord, Laurence Navailles, Didier Roux. Centre de Recherche Paul Pascal, 33600 Pessac. Pascale Jolimaître, Line Bourel. Institut de Biologie de Lille (UMR 8525)

otre laboratoire est un laboratoire de physico-chimie dont certaines équipes se tournent vers des problématiques de biologie. En particulier, dans le cadre d’une

étude sur la vectorisation d’ADN, notre équipe cherche à étudier l’interaction entre des particules colloïdales et des cellules en culture.

NAu sein de l’équipe, ont été développés des vecteurs particuliers qui sont des

sphères multilamellaires jusqu’au centre, obtenues après cisaillement contrôlé d’une phase lamellaire et dispersion dans un excès d’eau. La spécificité de ces vecteurs est leur mise en œuvre facile par rapport aux autres types de vecteurs (liposomes, nanosphères polymériques, virions…) ainsi que leur grande versatilité : du fait de leur structure lamellaire, ils sont capables d’encapsuler en grande quantité des molécules aussi bien hydrophiles qu’hydrophobes, y compris de l’ADN [1]. De plus, l’équipe a mis au point des méthodes pour contrôler leur état de surface, notamment en les fonctionnalisant avec des ligands peptidiques ou protéiques [2].

L’étape que nous essayons de comprendre maintenant est leur adhésion. Nous étudions à la fois par fluorescence et par cytométrie de flux l’adhésion de ces colloïdes sur des cellules épithéliales HeLa, en ayant choisi une séquence peptidique ciblant spécifiquement les intégrines. Nous essayons de comprendre les effets des paramètres physico-chimiques de l’objet sur son adhésion dans un premier temps, avec le souhait d’étudier son internalisation dans un deuxième temps.

Parallèlement, nous avons construit un modèle théorique simple pour rendre compte de l’adhésion collective de colloïdes en compétition pour un nombre fini de récepteurs mobiles[3]. Nous montrons que l’accrochage de l’objet et son temps de capture sur la membrane dépendent fortement de la concentration en volume et ceci pourrait avoir une influence sur les possibilités d’internalisation.

L’objet de notre venue dans le Club endocytose est donc vraiment pour nous de nous informer au sein d’une communauté que nous ne connaissons pas, pour apprendre efficacement les bases nous permettant d’aborder des pistes où nous sommes incompétents, et bien sûr pour entamer des collaborations …

[2] « The spherulite : a promising way for oligonucleotide delivery »

N. Mignet, A. Bup, C. Degert, B. Delord, D. Roux, C. Helene, J.C. Francois, R. Laversanne Nucleic Acid Research 28, 16, 3134 (2000) [1] « RGD-functionnalized spherulites™ as targeted vectors captured by adherent cultured cells » P. Chenevier, B. Delord, J. Amedee, R. Bareille, F. Ichas And D. Roux Biochemica et Biophysica Acta, 1573, 17-27 (2002) [3] “Adhesion of colloids on a cell surface in competition for mobile receptors”. D. van Effenterre and D. Roux, submitted (2003)

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Poster n° 34

Calcium-regulated exocytosis of dense core vesicles requires the activation of ARF6 by ARNO at the plasma membrane Vitale N., Chasserot-Golaz S. & Bader M.F. CNRS UPR-2356 Neurotransmission et Sécrétion Neuroendocrine, 5 rue Blaise Pascal, 67084 Strasbourg

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he ADP-ribosylation factor (ARF) GTP-binding proteins are believed to mediate cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking along the secretory pathway. Here we

show that ARF6 is specifically associated with dense-core secretory granules in neuroendocrine PC12 cells. Stimulation with a secretagogue triggers the recruitement of ARF6 and the secretory granules to the cell periphery and ARF6’s concomitant activation. We demonstrate that the guanine nucleotide exchange factor that activates ARF6 is the plasma membrane-associated ARNO. Expression of the constitutively inactive ARF6(T27N) mutant inhibits secretagogue-dependent exocytosis without affecting the depolymerization of the cortical actin barrier required for dense-core granule secretion. Using a mutant of ARF6 specifically impaired for PLD1 stimulation, we find that ARF6 is functionally linked to PLD1 in the exocytotic machinery. Finally, we show that ARNO, ARF6 and PLD1 co-localize at sites of exocytosis in stimulated cells. Together, these results provide the first direct evidence that ARF6 plays a role in calcium-regulated exocytosis in neuroendocrine cells. ARF6-stimulated PLD1 activation at the plasma membrane and consequent changes in membrane phospholipid composition may be critical for formation of the exocytotic fusion pore.

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Poster n° 35

Interaction of NCS-1 and PI4K-β in living nerve cells during stimulation. Nicolas Vitale1, Jean Luc Dupont1,Odile Procksch1, Andreas Jeromin2 and Jean de Barry1

1-Neurotransmission et Secretion Neuroendocrine, CNRS, 67084 Strasbourg, France 2- Samuel Lunefeld Research Institute, Mont Sinai Hospital,Toronto M5G 1X5 Canada

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umerous studies have shown that exocytosis in nerve cells and neuroendocrine cells is regulated by the neuronal calcium sensor (NCS-1) and by phosphoinositol-4-kinase-

β (PI4K-β). These proteins are found on the membrane of secretory vesicles and the aim of our study was to describe their interaction during stimulation in living cells and to decipher the role of this interaction in the secretory process. In PC12 cells overexpressing either NCS-1-EYFP or PI4K-β-EGFP we observed a stimulation-induced translocation of each protein from the cytoplasm toward the plasma membrane. Using FRET between PI4K-β-ECFP and NCS-1-EYFP we show that both proteins are interacting in resting cells and that this interaction increases with stimulation. Its appears that the membrane insertion of NCS-1 is necessary for the interaction with PI4K-β since the overexpression of NCS-1 mutated on its myristoylation site, which triggers its membrane insertion, does not allow interaction between PI4K-β and the mutated protein. Moreover the overexpression of mutated NCS-1 inhibits stimulated secretion suggesting that the interaction of the two proteins on the membrane of secretory granules is necessary for the secretory function.