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Principles of Biochemistry Third Edition

International Student Edition

Chapter 12 Enzyme Kinetics, Inhibition, and Control

Copyright © 2008 by John Wiley & Sons, Inc.

Donald Voet • Judith G. Voet • Charlotte W. Pratt

Chapter 12 Opener

Cinetique de Catalyse Rappel de notions de cinétique

Réaction simple, irréversible • 1/ la vitesse d’une réaction est proportionnelle à la concentration x constante de vitesse:

• Pour A -> P v= k(A) réaction de 1er ordre

• Pour A+B -> P v=k(A)(B) réaction de 2ème ordre (1er ordre pour A et 1er ordre pour B)

• Pour 2A -> P v=k(A)2 réaction de 2ème ordre

Réaction réversible:

• A+B <=> P v=k1(A)(B) - k-1(P)

Réaction catalysée:

• A+cat <=> A-cat <=> P-cat <=> P + cat

k1

k-1

k

k

k

k1

k-1

Figure 12-1

Diagramme de vitesse de 1er ordre dA/A = dlnA = -kdt A = A0e-kt

Box 12-1a

Marquage isotopique

Box 12-1b

Figure 12-2

Etat stationnaire

Figure 12-3

Cinétique de Michaelis

Vmax * S vo = _________________

KM + S

k2 + k3 KM= __________

k1

k1

k2

k3

Table 12-1

Figure 12-4

Diagramme de Lineweaver-Burk

k2 + k3 KM= __________

k1

k1

k2

k3

k1[E][S] = k-1[ES] + k2[ES]

KM = (k-1 + k2)/ k1 • KM mesure la tendance de ES à se dissocier dans chaque direction en fonction de la tendance à se former. • donc un KM élevé signifie - rapide formation du produit (grand k2)

OU - rapide dissociation du complexe (grand k-1).

E + S ES E + Pk1

k- 1

k2

Que signifie KM? Cinétique

si v = 1/2 Vmax = Vmax [S] KM + [S]

Vmax 2

=>: 2[S] = KM + [S] [S] = KM

Que signifie KM?

KM

Vmax

Initialrate, V

Substrate concentration, [S]

Vmax/2

Plot of rate (V) against substrate concentration ([S])

E + S ES E + Pk1

k- 1

k2

=>:

=>: v = Vmax [S] KM + [S]

Cinétique

• Pour toute réaction selon Michaelis-Menten:

KM = [S] => v=Vmax/2

• donc, KM est une mesure de [S] requise pour une catalyse effective

• Plus KM est grand, plus [S] est élevée pour réaliser une certaine vitesse de réaction.

NB: la valeur KM ne donne pas la force de liaison du substrat à l’enzyme (sauf cas limite où k2 << k-1) ni la specificité ou l’efficacité de l’enzyme.

Ceci est fourni par kcat/KM.

E + S ES E + Pk1

k- 1

k2

Que signifie KM? Cinétique

Turn Over Number, kcat

vo = Vmax [S] Km + [S]

(vo) E + S ES E + P

k2

k1 k3

Si [substrat] en excès , k3 = kcat, turn over number (t.o.n)

Si [substrat] faible

= k3 [E][S] Km + [S]

= Km

k3 [E][S]

[substrat] négligeable specificité de Substrat Equation de Michaelis-Menten

2ème ordre (IV)

Juang RH (2004) BCbasics

Turn Over Numbers d’Enzymes

Catalase H2O2

Carbonic anhydrase HCO3-

Acetylcholinesterase Acetylcholine

40,000,000

400,000

140,000

b-Lactamase Benzylpenicillin 2,000

Fumarase Fumarate 800

RecA protein (ATPase) ATP 0.4

Enzymes Substrat kcat (s-1)

Le nombre de molécules de produit transformées par mol. de substrate par une molecule d’enzyme en une seconde Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263

kcat

• kcat est une mesure directe de la production catalytique du produit sous conditions saturantes de substrat.

• L’unité de kcat est s-1. • kcat mesure le nombre molecules de substrat

transformées par molecule d’enzyme par seconde (turn-over).

E + S ES E + Pk1

k- 1

k2

Cinétique

kcat/KM • kcat/KM est une mesure directe de l’efficience et de la

specificité de l’ enzyme.

• indique ce que l’enzyme peut accomplir si un nombre abondant de sites sur l’enzyme sont accessibles.

• kcat/KM permet une comparison directe de la spécificité d’un enzyme pour un substrate.

• L’efficience maximum possible serait si toutes les collisions moleculaires resultent en une reaction. Selon la theorie de diffusion, cette valeur serait ca. 108 –109 (mol/L)-1 s-1.

E + S ES E + Pk1

k- 1

k2

Cinétique

Chymotrypsine a des kcat / Km distinct pour Different Substrats

O R O H3C–C–N–C–C–O–CH3

H H

= – = – –

–H Glycine

kcat / Km

1.3 ╳ 10-1

–CH2–CH2–CH3 Norvaline 3.6 ╳ 102

–CH2–CH2–CH2–CH3 Norleucine 3.0 ╳ 103

–CH2– Phenylalanine 1.0 ╳ 105

(M-1 s-1)

R =

Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379

Determiner kcat/KM • Effectuer une série de mesures, avec même [E]t mais en

variant [S]0 et mesurer l’augmentation de [P] ou la diminution de [S] à divers moments.

• Vitesses initiales, V0 est linéaire = [S]/t

[S]

time 3 6 9 15 30

[S]01

[S]02

[S]03

Cinétique

kcat/KM On peut estimer KM et Vmax par le diagramme v vs. [S]. 1.Estimer Vmax (asymptote).

2.Calculer Vmax/2

3.lire KM du graphique.

Vmax difficile à determiner sur le diagramme v/S (hyperbole). Difficile d’extrapole [S] infini et Vmax.

E + S ES E + Pk1

k- 1

k2

Cinétique

L’étude d’état stationnaire n’est pas univoque (notion de Black Box)

Cinétique à plusieurs substrats

États de l’enzyme

A, B, C, D…. = substrats P, Q, R, S… = produits

A B C P Q R

E EA EAB EABC<=>EPQR EQR ER E Mécanisme séquentiel ter, ter

Selon nombre de réactants: uni, bi, ter, quad, etc

Cinétique à 2 Substrats

Figure 12-5

Cinétique à 2 Substrats: exemples

Cinétique à 2 Substrats: Mécanismes

1. Mécanisme ordonné bi-bi

2. Mécanisme aléatoire bi-bi


3. Mécanisme séquentiel bi-bi


Inhibition Enzymatique

Exemple : inhibiteur compétitif

Inhibition Enzymatique

Exemple : inhibiteur d’état de transistion

Inhibition Enzymatique Compétitive

Le degré d’inhibition compétitive varie avec le taux d’enzyme qui lie l’inhibiteur

Vmax * S vo = ______________

αKM + S

Figure 12-6



Figure 12-7



Inhibition Enzymatique Incompétitive

L’inhibiteur incompétitf se lie sur le complexe enzyme-substrat, mais pas sur l’enzyme libre

Figure 12-8

Inhibition Enzymatique Incompétitive

L’inhibiteur incompétitf se lie sur le complexe enzyme-substrat, mais pas sur l’enzyme libre

Inhibition Enzymatique Mixte

L’inhibiteur mixte se lie aussi bien sur le complexe enzyme-substrat, que sur l’enzyme libre

Figure 12-9

Inhibition Enzymatique Mixte

L’inhibiteur mixte se lie aussi bien sur le complexe enzyme-substrat, que sur l’enzyme libre

Km

Diagrammes d’inhibition

Competitive Non-competitive Uncompetitive D

irect

Plo

ts

Dou

ble

Rec

ipro

cal

Vmax Vmax

Km Km’ [S], mM

vo

[S], mM

vo

Km [S], mM

Vmax

Km’

Vmax’ Vmax’

Vmax unchanged Km increased

Vmax decreased Km unchanged Both Vmax & Km decreased

1/[S] 1/Km

1/vo

1/ Vmax

Two parallel lines

Intersect at X axis

1/vo

1/ Vmax

1/[S] 1/Km 1/[S] 1/Km

1/ Vmax

1/vo

Intersect at Y axis

= Km’

Juang RH (2004) BCbasics

Table 12-2

Effets des Inhibiteurs

Box 12-4b

Exemples d’inhibiteurs: - inhibiteurs de RT: AZT - inhibiteurs de protéase: ritonavir

Box 12-4c

Exemples d’inhibiteurs: - inhibiteurs de RT: AZT - inhibiteurs de protéase: ritonavir

Figure 12-11

Régulation enzymatique : Allostérie

Exemple: Asp Transcarbamoylase

Figure 12-10



Figure 12-12


C6r6 : 6 ss-unités catalytiques + 6 ss-unités régulatrices


PALA est un analogue bi-substrat qui mime l’intermediaire de reaction formant le carbamoyl aspartate

Il se lie au site active de la sous-unité catalytique



Figure 12-13



Propriétés Générales des Enzymes Allosteriques 1. L’activité est modifiée par des inhibiteurs ou activateurs

(modulateurs)

2. Les modulateurs allosteriques se lient de manière non-covalente à l’enzyme

3. Les enzymes ont une structure quaternaire

4. Les enzymes présentent une courbe sigmoidale vo versus [S] (cooperativité positive de sites multiples de liaison du substrat)

5. Il y a transition rapide entre la conformation active (R) et la conformation inactive (T)

6. Substrats et activateurs ne peuvent se lier que dans la configuration R et les inhibiteurs seulement dans la configuration T.

Régulation Allosterique

Transition rapide entre états R et T • L’addition de S: augmente la concentration de l’état R • L’addition de I: augmente la concentration de l’état T • L’activateur se lie de preference à R, donc augmente le rapport R/T

Role de la cooperativité de liaison sur la régulation:

• L’addition de l’agent allostérique modifie l’activité de l’enzyme

• L’activateur peut diminuer Km, l’inhibiteur peut augmenter Km


Deux Theories de Régulation allosterique

Modèle Concerté Monod-Wyman-Changeux (theorie basée sur la symmetrie)

• Il n’existe que 2 conformations: R et T

• la symmetrie est maintenue lors de la transition entre l’état R et l’état T)

• Les sous-unités sont toutes soit R soit T

• R = forte affinité pour S T = faible affinité pour S

• La liaison de S déplace l’équilibre vers l’état R

• La liaison de I déplace l’équilibre vers l’état T


Deux Theories de Régulation allosterique

• un ligand peut induire un changement de la structure de la sous-unité sur laquelle il se lie

• Le changement conformationel d’une sous-unité affecte la conformation de la sous-unité voisine

• Un mélange des deux formes de sous-unité R (haute affinité pour S) et T (faible affinité pour S) peut exister

=> la symmetrie ne doit pas nécessairement être conservée

Modèle Sequentiel (theorie d’induction par le ligand)


(b) Modèle séquentiel : Mélange possible de

sous-unités T et de sous-unités R. Liaison

de S convertit seulement la sous-unité concernée de T vers R

(a) Modèle concerté Monod-Wyman-Changeux: sous-unités toutes à l’état T

ou toutes à l’état R


Modèle séquentiel: Exemple de l’Hémoglobine Changement conformationel

lors de la liaison de O2 sur l’hémoglobine

• Oxygène se lie à Hb

• correspond en partie au modèle sequentiel et en partie au modèle concerté


Régulation Enzymatique: phosphorylation

Figure 12-14a

Régulation Enzymatique: phosphorylation Exemple: Glycogène phosphorylase

Figure 12-14b


Figure 12-15


Figure 12-16


Figure 12-17

Drug Design

Détoxification: rôle du Cytochrome P450 (une mono-oxygénase)

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