uvod problematika i cilj istraživanja hipoteza metode istraživanja rezultati pilot studije znanstveni doprinos

PREUZETO IZ:Thesleff I, Nieminen P. Tooth morphogenesis and cell differentiation. Curr Opin Cell Biol, 1996. 8(6): p. 844-50.

Ektoderm prvog

ždrijelnog luka

Zubna osnova

Ektomezenhim neuralnog

grebena

Caklinski organ

Zubna papila

Zubni vrećica (folikul)

Vratna petlja

Vanjski caklinski

epitel

Caklinska mrežica

Intermedijarni (središnji)

slojUnutrašnji caklinski

epitelCaklinski

čvorić

Hertwig-ova korjenska ovojnica

Oblik korijena

Ameloblasti Caklina

Reducirani zubni epitel

Osteoblasti

Fibroblasti

Cementoblasti

Cement

Parodontni ligament

Alveolarna kost

Odontoblasti

Nediferencirane

mezenhimne stanice

Fibroblasti

Dentin

Pulpa

Primarni epitelni

pričvrstak

Uzorak krune

PORIJEKLO DIJELOVI ZUBNEOSNOVE

STANICE ZUBNE OSNOVE

PROIZVODI

Nakupina stanica u sredini unutarnjeg caklinskog epitela

Proizvodi niz signalnih molekula (FGF, BMP, Shh, Wnt) koje utječu na rast epitela i ektomezenhima, oblikovanje zuba, prostorni raspored, broj i oblik kvržica

Primarni caklinski čvorić nastaje na vršku zubnog pupoljka, a odstranjuje se apoptozom

Sekundarni caklinski čvorići nastaju na vrhovima budućih kvržica molara te reguliraju njihov položaj i oblik

Caklinski čvorić

PREUZETO IZ:Koyama, E., et al., Polarizing activity, Sonic hedgehog, and tooth development in embryonic and postnatal mouse. Dev Dyn, 1996. 206(1): p. 59-72.Vaahtokari, A., et al., The enamel knot as a signaling center in the developing mouse tooth. Mech Dev, 1996. 54(1): p. 39-43.

Nedostatak istraživanja o ranim stadijima razvoja zuba u čovjeka

Istraživanja na pokusnim životinjama pokazala su značajne razlike u prostorno-vremenskom izražaju proliferacijskih, pro-apoptotskih i anti-apoptotskih čimbenika tijekom razvoja zuba

Poremećaji proliferacije, apoptoze i diferencijacije tijekom razvoja zuba i čeljusti dovode do pojave raznih patoloških promjena (često u sklopu sindroma):

› Anomalije oblika, broja, veličine, građe, vremena nicanja i položaja zuba u čeljusti

› Razvojnih cista i tumora

PROLIFERACIJSKI ČIMBENICI

PRO-APOPTOTSKIČIMBENICI

ANTI-APOPTOTSKIČIMBENICI

ČIMBENICIDIFERENCIJACIJACIJE

Ki-67Bcl-2

Bax

Sindekan-1

Hsp-70

Kaspaza-3

p53

Ki-67

p53

Bax

Kaspaza-3

Stanična smrt

Bcl-2

Preživljenje

Sindekan-1

Hsp 70

Stanična specijalizaci

ja

Stanica

Istražiti pojavu, raspodjelu i promjenu proliferacijske aktivnosti stanica primjenom Ki-67 biljega tijekom različitih stadija ranog razvoja zuba

Istražiti prisustvo, prostorni i vremenski slijed pojavljivanja pro-apoptotskih čimbenika kaspaze-3 i p53 u različitim dijelovima zuba tijekom razvoja

Utvrditi prostorni i vremenski slijed pojavljivanja anti-apoptotske bjelančevine Bcl-2, sindekana-1 i Hsp-70 kao mogućih poticatelja proliferacije i diferencijacije

Dvostrukim bojenjem dokazati moguću istovremenu prisutnost različitih čimbenika u istoj stanici: › Bax i Bcl-2› Ki-67 i sindekan-1› Ki-67 i Bcl-2

Imunohistokemijsko istraživanje ranih faza u razvoju ljudskog zuba ukazati će na moguću ulogu istraživanih čimbenika u normalnom razvoju i diferencijaciji specifičnih dijelova zuba

Promjene u izražaju i prostornom rasporedu svih navedenih čimbenika analizirat će se tijekom ranog razvoja zuba (5.-10. tjedan):

› Ki-67 biljeg očekujemo u svim dijelovima zuba, očekuje se promjena u njegovoj zastupljenosti i prostornom rasporedu paralelno s rastom i diferencijacijom zuba

› Pojava Bcl-2 biljega očekuje se u epitelnoj osnovi zubnog pupoljka i nešto slabiji izražaj u okolnom mezenhimu

› U ranijim razvojnim fazama zuba očekuje se manja uloga kaspaze-3 i veća uloga p53 apoptotskog čimbenika

› Porast izražaja Hsp-70 očekuje se tijekom ranog razvoja i diferencijacije zuba i nešto manji izražaj u okolnom ektomezenhimu

› Pojavu sindekana-1 očekujemo u specifičnim područjima osnove zuba te naročito u pripadajućem zubnom ektomezenhimu tijekom kasnijih razvojnih faza

Interakcije istraživanih čimbenika mijenjati će se tijekom razvoja zuba te omogućavati rast i diferencijaciju zubne osnove i razvoj specifičnih staničnih linija:

› Prevladavanje proliferacijskih i anti-apoptotskih čimbenika u ranijim razdobljima

› U kasnijim razdobljima oblikovanja osnove zuba, veći izražaj apoptotskih čimbenika i čimbenika diferencijacije

Sakupljanje tkiva i određivanje starosti zametaka

› Tkivo normalnih ljudski zametaka starosti 5-10 tjedana (iz postojeće arhivske zbirke Zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju te tkivo sakupljeno u Kliničkom zavodu za patologiju, sudsku medicinu i citologiju KBC Split, a uz suglasnost Etičkog povjerenstva za biomedicinska istraživanja MF u Splitu)

› Kriteriji očuvanosti tkiva: bez vanjskih znakova maceracije, promjene boje i anomalija

› Određivanje starosti: na temelju podataka o ovulacijskoj dobi, mjerenjem (CRL) te uspoređivanjem sa stadijima Carnegie instituta

Vođenje, uklapanje i rezanje tkiva:

› Mikrosekcija (odvajanje tkiva koje sadrži zubne zametke)

› Fiksacija u 4% formaldehidu, ispiranje u PBS-u, dehidracija, ksilol, uklapanje u parafinu

› Rezanje na sagitalne, frontalne ili transverzalne rezove debljine 5-7 µm

› Lijepljenje na predmetna stakla, orijentacijsko bojenje svakog desetog stakla H&E (razina reza, očuvanost tkiva)

Imunohistokemijsko bojanje rezova

› Primarna protutijela: Ki-67 Bax Bcl-2 p53 kaspaza-3 sindekan-1 Hsp-70

› Sekundarna detekcija primarnih protutijela: Bojanje DAB-om Imunofluorescencija (TRITC i FITC)

Kvantifikacijska analiza Ki-67, sindekan-1 i Hsp-70 pozitivnih stanica i statistički postupci:

› Brojenje pozitivnih stanica (smeđe obojenje stanice DAB-om) i računanje njihovog udjela u ukupnom broju stanica

› Određivanje moguće statistički značajne razlike u postotku pozitivnih stanica: Među razvojnim tjednima Među različitim dijelovima zuba

› Mann-Whitney test: neparametrijski test za dva nezavisna uzorka (dolaze li dva nezavisna uzorka iz iste distribucije)

› Kruskal-Wallis test: neparametrijski, proširenje MW testa za tri i više grupa

› Razina značajnosti je 0.05

Semi-kvantifikacijska analiza: određivanja intenziteta i prostorne raspodjele pojedinih čimbenika u raznim dijelovima zubne osnove tijekom razvoja (označeno kao odsustvo, slaba ili jaka izraženost)

Kolokalizacijska analiza: određivanje prisustva dvaju čimbenika u istoj stanici primjenom dvostruke imunofluorescencije te određivanje stanica koje pokazuju dvostruki izražaj

Imunohistokemijsko bojenje DAB-om › Ki-67› Bcl-2› kaspaza-3› p53› sindekan-1› Hsp-70

Imunofluorescentno bojenje (dvostruko bojenje) › Bax i Bcl-2 › Ki-67 i Bcl-2 › sindekan-1 i Hsp-70

Kalibović Govorko D, Bečić T, Vukojević K, Mardesic-Brakus S, Biočina-Lukenda D, Saraga-Babić M, Spatial and temporal distribution of Ki-67 proliferation marker, Bcl-2 and Bax proteins in the developing human tooth. Arch Oral Biol (2010)

Mardešić-Brakus S, Kalibović Govorko D, Vukojević K, Alujević Jakus I, Carev D, Petričević J, Saraga-Babić M, Apoptotic and antiapoptotic factors in early human mandible development. Eur J Oral Sci (2010)

Ki-67

Bcl-2

Bcl-2

Ki-67

merge

merge

BaxBcl-2

Syndecan-1/Hsp-70 merge

Dobivanje novih saznanja o ranom razvoju zuba u čovjeka o kojima ne postoje literaturni podaci te o raspodjeli, vremenu i mjestu pojavljivanja pojedinih razvojnih čimbenika

Određivanje % pozitivnih stanica za pojedini istraženi čimbenik (tijekom 5.-10. razvojnog tjedna) ukazat će na slijed razvojnih zbivanja koji su uvjet normalnog razvoja zuba

Pokazati će se da je fina regulacija izražaja genskih proizvoda u stanicama osnove budućeg zuba ključna za normalni razvoj zuba

Istraživanje procesa normalnog oblikovanja i diferencijacije zuba i susjednih struktura od velike je važnosti za razumijevanje nastanka razvojnih anomalija, cista i tumora

Poremećaji stanične proliferacije, diferencijacije i apoptoze, odnosno perzistencije embrionalnih tvorbi dovode do patoloških promjena

Istraživanje mehanizama nastanka patoloških promjena ima kliničku primjenu u području dentalne medicine:

› Oralna kirurgija: razvojne ciste i tumori› Ortodoncija: anomalije broja, oblika, položaja zuba i

čeljusti (od preko 5000 poznatih genetskih sindroma, u više od 700 postoje dentalne/oralne/kranio-facijalne anomalije)

Hvala djelatnicima Zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju studija Medicina i Dentalna medicina Medicinskog fakulteta Sveučilišta u

Splitu