procédure analyses bactériologique 2009
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Comment procder pour raliser une analyse en Bactriologie?Pr DOSSO Mireille 2009
LA MICROBIOLOGIE
Etude des microorganismes :visibles au microscope De la taille du m (10-6 m)
Gnralits: Rappel
LA MICROBIOLOGIELES DIFFERENTS MICROORGANISMES
Bactries Champignons Virus Parasites
BACTERIOLOGIE MYCOLOGIE VIROLOGIE PARASITOLOGIE
LES MICROORGANISMESEXEMPLES DE PATHOLOGIE :
Bactries :
Infections urinaires, Diarrhes Tuberculose, Diphtrie, Ttanos Mycoses, Teignes Sida, Hpatite C, Rubole Toxoplasmose, Paludisme, Tnia (ver solitaire)
Champignons : Virus : Parasites :
LES MICROORGANISMES
Les Champignons :
Champignons filamenteux (dermatophytes, moisissures) Ex : Penicillium, Aspergillus Levures Ex : Levure de bire, levure de boulanger Ex : Candida, Cryptococcus Taille : 10 m
LES MICROORGANISMES Les Virus : Taille < 0.1 m ADN ou ARN Pas denzymes : besoin dune cellule hte Reproduction par replication
Les Bactries : Taille : 1 m ADN et ARN Enzymes : biosynthses Reproduction par scissiparit
ETUDE DE LA BACTERIE
SON HABITAT
Dans lenvironnement :
Chez lhomme :
Saprophyte
Flore normale = Flore commensale
SON HABITATDANS NOTRE ENVIRONNEMENT :
Dans le sol Dans lair Dans leau Dans les aliments
SON HABITATCHEZ LHOMME EN BONNE SANT
OUI Bouche Oreilles Voies respiratoires Intestins Voies gnitales Peau ....
NON
Sang Liquide cphalocphalorachidien (LCR) Urine
Flore normale : en contact avec lextrieur
Toujours strile : cavits fermes
SA PATHOGENICITELHOMME MALADE :
La bactrie pathogne stricte :
Multiplication et dissmination dans lorganisme Rsistance au systme immunitaire Scrtion denzymes : lsions des tissus Parfois secrtions de toxines
SA PATHOGENICITELes bactries toxigniquesLa bactrie ne quitte pas le lieu de l'infection et la toxine seule provoque la maladie en diffusant dans l'organisme Ex : - Clostridium tetani (ttanos) - Corynebacterium diphteriae (diphtrie)
Intoxinations alimentaires :- Staphylococcus aureus - Clostridium botulinumBotulisme : ingestion d'aliments dans lesquels C. botulinum a labor sa toxine (non dtruite dans le tube digestif) paralysies par atteinte neuro-musculaire
SA PATHOGENICITELa bactrie pathogne par opportunisme :Quelle bactrie ? Une bactrie saprophyte ou de la flore normale dont la prsence ne provoque habituellement pas de maladie Quand ? Lors dune dficience immunitaire de l'hte Lors dune rupture de la barrire naturelle
Ex : E. coli , prsent dans la flore normale et occasionnellement mis en cause dans des infections urinaires, des septicmies...
SA PATHOGENICITE : EXEMPLESFLORE NORMALE BACTERIES PATHOGENESCAVITE ORO-PHARINGEE : ORO Streptocoque
Streptocoques, Entrocoques Neisseria Corynebactries Anarobies...
A Pneumocoque Corynebacterium diptheriae Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae
TUBE DIGESTIF :
Entrobactries Entrocoques Levures Anarobies...
Salmonella, Shigella E. coli, Yersinia, Campylobacter Vibrio cholerae Toxine : Clostridium, S. aureus
SA PATHOGENICITE : EXEMPLESFLORE NORMALEPEAU :
BACTERIES PATHOGENES
Staphylococcus epidermidis Corynebactries Propionibacterium acnes...
Staphylococcus aureus Streptococcus A Pasteurella Bacillus...
CAVITE GENITALE :
Lactobacillus Mycoplasmes Anarobies Flore dorigine cutane...
Gonocoque Streptocoque B Gardnerella vaginalis Treponema pallidum Haemophilus, Chlamydia...
SA FORME
COQUES
BACILLE
COCCO-BACILLE
SON MODE DE GROUPEMENTCOQUES
diplocoque
amas
chainettes
BACILLES
diplobacille
coccobacille
SA STRUCTUREmembrane cytoplasmique capsule (facultatif)
paroi
ribosomes
cytoplasme
flagelle (facultatif)
pili ou adhsine
ADN
SA MOBILITE1- Pas de flagelle : Bactrie immobile 2- Un flagelle : Bactrie mobile Dplacement : 3- Plusieurs flagelles : Bactrie mobile Dplacement :
SON ALIMENTATION Besoins lmentairesPour synthtiser les lments constitutifs de la bactrie C, N, O, H, sels minraux, ...
Besoins en sucrePour les dpenses nergtiques de la bactrie glucose , lactose
Besoins en facteurs de croissancePour la croissance des bactries difficiles vitamines, acides amins ...
SA RESPIRATION
Besoin doxygne
Bactrie arobie
Besoin de moins doxygne Bactrie microarophile Absence doxygne Besoin de CO2 Bactrie anarobie Bactrie capnophile
SA MULTIPLICATIONDivision toutes les 20 mn
SA MULTIPLICATIONLa vitesse de multiplication dpend de la temprature : Vitesse
Temprature 4C 37C 65C
LE LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE MEDICALE
SON ROLE
Trouver le bon traitement pour le patient
?
COMMENT ?
Isoler la bactrie responsable de l'infection Identifier cette bactrie Tester sa rsistance envers diffrents antibiotiques
LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE
Prlvement Examen microscopique Culture Identification Antibiogramme
LE PRELEVEMENT
LE PRELEVEMENTPRELEVEMENT Urine MODE DE PRELEVEMENT PATHOLOGIES Infections urinaires
Selles
Infections intestinales, Intoxications alimentaires Ecouvillon Vaginite, cervicite, prostatite, urthrite, MST... Abcs, Liquide pritonal , plaie superficielle
Prlvement gnital
Suppuration
Ecouvillon ou seringue
LE PRELEVEMENTPRELEVEMENT Prlvement de gorge Expectorations MODE DE PRELEVEMENT Ecouvillon PATHOLOGIES Infections ORL, angines.. Infections pulmonaires, pneumonies ... Septicmie
Crachat ou aspiration bronchique Prise de sang
Sang
LCR
Ponction lombaire
Mningite
LCR = Liquide Cphalo-rachidien
LE PRELEVEMENT
Prlvements pluri-microbiens : pluriPrlvements : cutans
Flore normale + Agent pathogne
digestifs vaginaux, urtraux des voies respiratoires ... On observe plusieurs bactries
Prlvements mono-microbiens : monoPrlvements :
LCR, sang, urine
Agent pathogne seul
On observe une seule bactrie
LE PRELEVEMENT
Conditions de prlvementMatriel de prlvement strile. Dsinfecter autour de la zone de prlvement avant de prlever
(ex : toilette locale lors du recueil d'urine)
LE TRANSPORT DU PRELEVEMENTEnsemencer immdiatement le prlvement ou Utiliser un milieu de transport POURQUOI ?
Ce sont des organimes vivants ! il faut : 1- les garder vivants 2- viter leur multiplication QUAND ? labo loign du site de prlvement :
prlvement domicile, au lit du malade .
LE TRANSPORT DU PRELEVEMENTSi le prlvement doit attendre avant inoculation sur milieu de culture, Conditions de conservation :4C Urine, selles37 37C et/ou Milieu de transport
Prlvements gnitaux, LCR, sang, pus
?Pas de multiplication bactrienne souhaite Possibilit de germes fragiles Possibilit de germes anarobies
Le milieu de transport a lavantage dviter la dessication
LEXAMEN MICROSCOPIQUE
Procdures opratoires utiliser au Laboratoire de microscopie.
Procdures opratoires identifiables dans un Laboratoire de microscopie- Accueil et rception des chantillons - Tri et enregistrement des chantillons - Traitement des chantillons - Stockage des chantillons et conservation des frottis.
Phase pr-analytique: pr-analytique:Accueil et rception des chantillons - rception tous les jours ouvrables - noter date et heure darrive - vrifier la fiche de demande danalyse - vrifier la concordance: nom / chantillon - procder lenregistrement des chantillons
Poste de Tri des chantillons - vrifier la concordance: nom / chantillon - vrifier la quantit et la qualit - rtention ou rejet de lchantillon - si rejet: rdaction de la fiche de non conformit - remise dun exemplaire au demandeur avant son dpart
Enregistrement des chantillons
- attribuer un numro de srie chaque chantillon - procder lenregistrement:
* dabord physique * puis magntique (si possible)
- indiquer la conformit ou la non-conformit non-
Attention: Ne pas jeter systmatiquement les chantillons difficiles obtenir!!!
Phase analytique:Traitement des chantillons
- ranger les chantillons dans lordre croissant - ralisation des frottis - fixer les frottis - colorer les frottis - procder la lecture des lames - rendre les rsultats
Phase post-analytique postStockage des chantillons et conservation des lames - stockage jusquau rendu des rsultats - conservation * +4C ou temprature ambiante +4 * 80C (biopsies) 80 * les frottis positif * 1/10 frottis ngatif
LEXAMEN MICROSCOPIQUE :Premire tape
1 - L'examen direct (ou tat frais)
1 goutte entre lame et lamelle : Obj. x 40, sec.
INTERET :
Prsence et abondance des bactries Morphologie et mode de groupement Mobilit Cytologie : observation des cellules ex : Leucocytes (tmoins de linfection)
LEXAMEN MICROSCOPIQUE :2 - LE GRAMColoration la plus utilise en bactriologie Permet de faire une classification des bactries
Gram + Gram -
Violet Rose
LEXAMEN MICROSCOPIQUE :Coloration de Gram : PrincipeRepose sur la diffrence de permabilit de la paroi bactrienne
1 - Violet de Gentiane ou Crystal - Violettraversent la paroi et colorent toute la bactrie
2 - Solution d'iode ou Lugolfavorise la fixation du colorant
3 - Dcoloration l'Alcool - ActoneLes bactries dites Gram (-) se dcolorent Les bactries dites Gram (+) restent violettes
4 - La fuchsine ou la safranineColoration des bactries Gram (-) en rose
lecture objectif x 100 immersion (huile)
L EXAMEN MICROSCOPIQUE :3 - Autres Colorations Coloration au bleu de mthylne pour visualiser les bactries intra-leucocytaires ex : gonocoques Coloration de Giemsa pour les parasites sanguins et intra-cellulaires Coloration de Ziehl - Neelsen pour les Mycobactries Acridine orange Fluorescence pour les prlvements faible concentration bactrienne
LA CULTURE
LA CULTUREPour obtenir une croissance bactrienne, il faut : Rpondre aux exigences de la bactrie :
Milieu nutritif Atmosphre adapte Temprature adapte
LA CULTURE
Choisir le bon milieu de culture :
en fonction de la bactrie recherche en fonction du prlvement
?Milieu de base ?
Milieu chromogne ?
Milieu riche ?
Milieu slectif ?
LA CULTURE
Les diffrents types de milieux de culture milieu enrichi : milieu de base + sang, facteurs decroissance...
milieu de base : lments nutritifs minimum
milieu slectif : addition d'antibiotiques ou autres milieu chromogne : addition de substratschromognes qui donnent des colonies colores
Les milieux peuvent tre la fois slectifs et enrichis, ou slectifs et chromognes ...
LA CULTURE : Exemples
Urine :CPS ID 2 Glose sang
Selles :Selenite Hektoen BCP Yersinia CIN Campylosel
Prlvement gnital :
Chocolat
Sang ANC
Candida ID
Mac Conkey
LA CULTURE
Choisir la bonne temprature : Bactries : 37C Champignons : 30C
Etuve ? 30C 37C
LA CULTURE
Les differents types respiratoires1 2 3 4
LA CULTURE1 - Bactries arobies strictesNe peuvent vivre qu'en prsence d'oxygne tirent leur nergie en utilisant l'oxygne de l'air : C'est la respiration (mtabolisme oxydatif) ex : Pseudomonas, Mycobactries
2 - Aro-anarobies facultatives AroSe dveloppent avec ou sans air, mais la majorit de l'nergie produite provient de la fermentation ex : Entrobactries
LA CULTURE3 - Anarobies strictesNe se dveloppent qu'en l'absence d'air. L'oxygne leur est toxique. La totalit de l'nergie est produite par fermentation (mtabolisme fermentatif). ex : Fusobacterium, Eubacterium
4 - MicroarophilesPrfrent une pression partielle d'O2 infrieure celle de l'air. ex : Campylobacter, Mycoplasmes
5 - Bactries capnophilesCertains germes prfrent une atmosphre enrichie en CO2,elle est indispensable d'autres. ex : Neisseria gonorrhoeae
LA CULTURE Choisir la bonne atmosphre : Bactrie arobie Bactrie aro-anarobie Bactrie -arophile Bactrie anarobie Bactrie capnophilePas de gnrateur Jarre
Gnrateur microaer
Gnrateur anaer Gnrateur CO2
LA CULTURE Croissance en milieu solide :Sur boite de Ptri Une bactrie dpose la surface d'une glose nutritive, se multiplie et forme 1 amas visible l'oeil nu : la colonie = 1 million de bactries = 20 gnrations
POUR LISOLEMENT
LA CULTURE
Croissance en milieu liquide :En bouillon Une bactrie introduit dans un bouillon nutritif se multiplie, et cre un trouble visible l'oeil nu. Une culture en bouillon ne permet pas de diffrencier une pousse polymicrobienne d'une pousse monomicrobienne.POUR LENRICHISSEMENT
Ex : bouillon C ur-cervelle,Trypcase-soja ...
LA CULTURE Courbe de croissance
bactrienneQuantit de bactries
3 2
4
1 Temps 24H 48H
LA CULTURE
Courbe de croissance bactrienne
1 - Phase de latence Mtabolisme rduit : adaptation de la population bactrienne aux nouvelles conditions de culture. 2 - Phase de croissance exponentielle Multiplication bactrienne trs active. 3 - Phase de ralentissement et phase stationnaire Epuisement des lments nutritifs, accumulation de produits toxiques dans le milieu. 4 - Phase de dclin Mortalit par autolyse des bactries
LIDENTIFICATION
L IDENTIFICATION BACTERIENNE La condition : Obtenir une culture pure (si prlvement polymicrobien)
Premire tape : L'ISOLEMENTEtalement du prlvement sur une glose nutritive
1 bactrie
1 colonie
L IDENTIFICATION BACTERIENNEL'isolement1 2
3 4
L IDENTIFICATION BACTERIENNE L'isolement1 2
3 4
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Deuxime tape : L'IDENTIFICATION
Les bactries sont classes par : Famille Genre Espce exemple : Micrococcaceae Staphylococcus aureus exemple : Enterobacteriaceae Escherichia coli
S. aureus
E. coli
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Lexamen microscopique : Coques ou bacilles Mode de groupement Gram + ou Gram Observation des colonies sur botes de Ptri :Taille, couleur, aspect, odeur (!) Prsence d'une hmolyse sur milieu au sang (Streptocoques... )
L IDENTIFICATION BACTERIENNELHEMOLYSE Hmolyse E : hmolyse partielle (halo verdtre sous la colonie) Ex : Pneumocoque Hmolyse F : hmolyse totale (halo clair sous la colonie) Ex : Streptocoque groupe A, B ... Hmolyse H : pas d'hmolyse Ex : Enterococcus faecalis, faecium
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Tests d'orientation :recherche des enzymes "respiratoires"2 H2O2catalase
Catalase : Dgradation de leau oxygne2 H2O + O2
Oxydase :TMPDincolore oxydase
TMPD oxydrose carmin
(TMPD = N Tetra methyl - para - phnylne - diamine)
L IDENTIFICATION BACTERIENNELes rsultats des tests d'orientation : - Morphologie : Gram Catalase, oxydase permettent de dfinir la famille ou le genre, et donc de choisir les tests ou galeries d'identification Exemples : Cocci, Gram +, Catalase + Staphylocoques Cocci, Gram +, Catalase Streptocoques Bacilles, Gram -, Oxydase Entrobactries
L IDENTIFICATION BACTERIENNE Etude des caractres biochimiques :Etude du mtabolisme de la bactrie (enzymes...) Exemple :Glucose Enzyme Glucose ferment Production dacide pH
Virage de lindicateur color
TEST (+)
Pas denzyme
TEST (-)
4 - IDENTIFICATION BACTERIENNELES TESTS BIOCHIMIQUES
Mtabolisme glucidique :oxydation ou fermentation dun sucre : glucose , lactose, saccharose, arabinose...
Mtabolisme protiqueProtines : glatine, lait, sang ... protases, urase, dsaminases, dcarboxylases
Mtabolisme lipidiquelipase, lcithinase ...
L IDENTIFICATION BACTERIENNE Applications
Milieux d'identification en tubes
Galeries d'identification26 27 28 29 30 21 22 23 24 25 16 17 18 19 20 11 12 13 14 15 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5
ex :
Galeries API, VITEK
ID 32,
cartes
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Etude des caractres antigniquesRaction immunologique : antigne - anticorps Anticorps fixs sur des particules de latex Agglutination sur lame en prsence de lantigne correspondant (bactrie...)AGGLUTINATION latex avec anticorps bactrie
- partir de colonies isoles - ou directement partir des prlvements. Avantage : rapidit ( raction immdiate)
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Identification sur milieux chromognes : Permet didentifier la bactrie la couleur de sa colonie sur la boite Pour
les prlvements frquents Et pour les bactries les plus frquemment rencontres Ex : CPS ID 2 Urine (E.coli, Proteus, Strepto. D) Intrt : gain de temps et dargent
L IDENTIFICATION BACTERIENNE Identification par biologie molculaire :Permet didentifier la bactrie par un fragment spcifique de son ADN A partir des colonies Ou directement partir du prlvement
Ex : Gen Probe
Mycobactries, Gonocoque, Chlamydia...
Intrt : Spcificit, gain de temps
L ANTIBIOGRAMME
L ANTIBIOGRAMME
Gurir rapidementBUT :Trouver un traitement efficace pour le malade
L ANTIBIOGRAMMEEtudier in vitro l'activit des antibiotiques sur la bactrie isoleA raliser uniquement sur l'agent pathogne (pas sur la flore normale)
Interprter l'activit de l'antibiotique in vivo : Risques potentiels de succs ou d'chec pour le traitement
L ANTIBIOGRAMMELES ANTIBIOTIQUESagents antibactriens
1928 : Fleming dcouvre la Pnicilline
L ANTIBIOGRAMMELES ANTIBIOTIQUES Origine :- biologique : labors par des micro-organismes : champignons, bactries - chimique : produits par synthse
Action : variable selon la famille d'antibiotiques- inhibition de la synthse de la paroi bactrienne - altration de la membrane cytoplasmique - action sur la synthse d'enzymes - inhibition de la synthse des acides nucliques
L ANTIBIOGRAMME
Les rsultats sont rendus au mdecin en :
S R I
Sensible Rsistant Intermdiaire
LANTIBIOGRAMMELES RESULTATS
Bactrie sensible : S
La bactrie ne pousse pas en prsence de lantibiotique Le traitement avec cet antibiotique sera un succs
Bactrie rsistante : R
La bactrie pousse en prsence de lantibiotique Le traitement avec cet antibiotique sera un chec
Bactrie intermdiaire : I
Rsultat intermdiare
L ANTIBIOGRAMMERsistance bactrienne
Naturelle :
Rsistance toujours retrouve chez une mme bactrie : Cest un comportement normal et connuEx : Proteus mirabilis rsistant la Ttracycline
Acquise :
Rsistance nouvelle acquise par mutation gntique : Cest un comportement anormal Cette rsistance peut apparatre puis disparatre
A cause des rsistances acquises (donc surprises), il faut faire un antibiogramme pour chaque bactrie identifie
L ANTIBIOGRAMME
Etude de la CMI :CONCENTRATION MINIMALE INHIBITRICE Plus faible concentration d'antibiotique capable d'inhiber toute croissance visible de la souche tudie. Mthode de dilution en milieu liquideEx : CMI = 1g/ml
Concentration dantibiotique (g/ml)
0
0,5
1
2
4
8
L ANTIBIOGRAMMELES DIFFERENTES TECHNIQUES
Diffusion en glose (disques) Galeries ATB Cartes Vitek
L ANTIBIOGRAMME
Mthode de diffusion en gloseUtilisation d'un disque de papier filtre sur lequel un antibiotique a t incorpor et sch.
inoculation de toute la surface de la glose avec la suspension bactrienne. les disques sont placs sur la surface de la bote. les antibiotiques vont alors diffuser dans la glose.
Aprs 20 heures d'incubation, une zone d'inhibition apparat autour du disque. La taille de la zone est proportionnelle la valeur de la CMI.
L ANTIBIOGRAMMEB
A
Mesure du diamtre
dinhibition pour chaque antibiotiqueC
G
Ce diamtre
H
correspond la CMI report en S, R, I en fonction des diamtres officiels donns par les comits dexperts
Ce diamtre estF E D
L ANTIBIOGRAMME
Pour tre fiable la mthode doit tre standardise STANDARDISATION :- de l'inoculum : quantit de bactries - de la glose Mueller-Hinton : composition du Muellermilieu - de l'paisseur de la glose : diffusion de l'antibiotique - de la charge dantibiotique du disque
L ANTIBIOGRAMME
Galeries ATB :On teste chaque antibiotique (A,B,C,D...) 2 concentrations diffrentes (c et C)= Pas de croissance bactrienne = Croissance bactrienne
c 0 A B C D
CTmoin de croissance
S R I S
L ANTIBIOGRAMMELes concentrations critiquesPour chaque antibiotique, les diffrents comits de l'antibiogramme fixent un intervalle critique permettant de savoir si l'antibiotique sera efficace in vivo (aux doses thrapeutiques) C : concentration critique suprieure c : concentration critique infrieure Concentrations dtermines en fonction de la pharmacocintique : - fixation sur les protines,- pntration dans certains sites, - absorption, mtabolisme et excrtion.
L ANTIBIOGRAMME Souche sensible : CMI < cL'antibiotique test est actif sur la souche bactrienne.
Souche intermdiaire : c < CMI < CNe rpondra pas un traitement doses usuelles, mais peut-tre un traitement par voie gnrale haute dose ou par voie locale. C'est l'intervalle de risque.
Souche rsistante : CMI > CLa souche rsiste aux plus fortes concentrations. L'antibiotique ne sera pas actif in vivo.
L ANTIBIOGRAMME Mthodes automatises :Etude de la croissance bactrienne dans un milieu liquide ou semi-liquide en prsence d'une ou plusieurs concentrations d'antibiotiques - ATB Expression - mini API
26 27 28 29 30
21 22 23 24 25
16 17 18 19 20
11 12 13 14 15
6 7 8 9 10
1 2
- VITEK
3 4 5
EN RESUME1- PRELEVEMENT2 - EXAMEN MICROSCOPIQUE Etat frais Gram 3 - CULTURE 4 - TESTS D'ORIENTATION Catalase Oxydase 5 - IDENTIFICATION Manuelle : Galerie API Semi-automate : ATB Expression - mini API Semi Automate complet : VITEK 6 - ANTIBIOGRAMME Diffusion en milieu glos (disques) Milieu semi-glos (galeries ATB) semi Milieu liquide (cartes VITEK)