purification and vaccine potential of klebsiella capsular

7/27/2019 Purification and Vaccine Potential of Klebsiella Capsular

1/7

1985, 50(1):225.Infect. Immun.S J Cryz Jr, E Frer and R Germaniercapsular polysaccharides.Purification and vaccine potential of Klebsiella

http://iai.asm.org/content/50/1/225Updated information and services can be found at:

These include:

CONTENT ALERTS

morecite this article),

Receive: RSS Feeds, eTOCs, free email alerts (when new articles

http://journals.asm.org/site/misc/reprints.xhtmlInformation about commercial reprint orders:http://journals.asm.org/site/subscriptions/To subscribe to to another ASM Journal go to:
http://iai.asm.org/cgi/alertshttp://iai.asm.org/cgi/alertshttp://iai.asm.org/cgi/alerts


2/7

I N F E C T I O N AND I M M U N I T Y , O c t . 1 9 8 5 , p . 2 2 5 - 2 3 00 0 1 9 - 9 5 6 7 / 8 5 / 1 0 0 2 2 5 - 0 6 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 3 1 9 8 5 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

P u r i f i c a t i o n a n d V a c c i n e P o t e n t i a l o f K l e b s i e l l a C a p s u l a rP o l y s a c c h a r i d e sS . J . CRYZ, J R . , * E . FURER, AND R . GERMANIER

S w i s s Serum a n d V a c c i n e I n s t i t u t e , 3 0 0 1 B e r n e , S w i t z e r l a n dR e c e i v e d 1 7 A p r i l 1 9 8 5 / A c c e p t e d 1 J u l y 1 9 8 5

C a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e ( C P S ) f r o m 1 8 K l e b s i e l l a s t r a i n s o f d i f f e r e n t c a p s u l a r t y p e s wa s i s o l a t e d andc h a r a c t e r i z e d . P u r i f i e d CPSs were c o m p o s e d p r i m a r i l y o f c a r b o h y d r a t e w i t h t r a c e q u a n t i t i e s o f p r o t e i n , n u c l e i ca c i d s , a n d l i p o p o l y s a c c h a r i d e . A l l CPSs we r e o f a h i g h m o l e c u l a r w e ig h t , p o s s es s i n g a Kd o f 0 . 0 1 t o 0 . 1 1 asd e t e r m i n e d b y g e l f i l t r a t i o n over S e p h a r o s e C L - 4 B . Low l e v e l s o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e p r e s e n t i n a l l p r e p a r a t i o n sw e r e r e s p o n s i b l e f o r t h e h ig h l y p y r o g e n i c n a t u r e o f o n e - h a l f o f t h e CP S p r e p a r a t i o n s . T r e a t m e n t o f c a p s u l a rm a t e r i a l w i t h d i l u t e NaOH i n 95% e t h a n o l m a r k e d l y r e d u c e d t h e p y r o g e n i c i t y o f a l l p r e p a r a t i o n s an d h ad an e g l i g i b l e e f f e c t on t h e i r m o l e c u l a r w e i g h t . The i m m u n o g e n i c i t y o f t h e v a r i o u s n a t i v e CPSs f o r m i c e v a r i e dc o n s i d e r a b l y f r o m s e r o t y p e t o s e r o t y p e , b u t a l l e v o k e d an a n t i c a p s u l a r i m m u n o g l o b u l i n G r e s p o n s e . F i v e o f 1 8N a O H - t r e a t e d p o l y s a c c h a r i d e s we r e s i g n i f i c a n t l y ( P < 0 . 0 5 ) l e s s i m m u n o g e n i c t h a n t h e i r n a t i v e c o u n t e r p a r t s .Human i m m u n o g l o b u l i n G p r e p a r e d f r o m v o l u n t e e r s i m m u n i z e d w i t h e i t h e r n a t i v e or N a O H - t r e a t e d K P 1 - 0c a p s ul a r p o l y s a cc h a ri d e was e q u a l l y e f f e c t i v e a t p r e ve n t i n g e x p e r i m e n t a l f a t a l K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e b u r nwound s e p s i s i n m i c e .

I n f e c t i o n s d u e t o K l e b s i e l l a spp. i n c o m p r o m i s e d p a t i e n tp o p u l a t i o n s ar e a w e l l - r e c o g n i z e d p r o b l e m ( 1 , 2 4 , 3 3 ) . I n t h e5 - y e a r p e r i o d f r o m 1 9 7 6 t o 1 9 8 0 , K l e b s i e l l a s p p . were f o u n dt o b e t h e s e c o n d most f r e q u e n t l y i s o l a t e d g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a i n cases o f p r i m a r y b a c t e r e m i a ( 3 ) . K l e b s i e l l a b a c -t e r e m i a a n d p n e u m o n i a carry an a t t e n d a n t m o r t a l i t y r a t ew h i c h c an a p p r o a c h , or e x c e e d , 50 % ( 1 , 1 5 , 2 3 , 3 3 ) . A l s o ,K l e b s i e l l a spp. can o f t e n b e t h e cause o f u r i n a r y t r a c t ,w o u n d , s o f t - t i s s u e , a n d r e s p i r a t o r y t r a c t i n f e c t i o n s ( 3 , 9 ) .R e c e n t l y , we h a v e d e s c r i b e d t h e i s o l a t i o n , p u r i f i c a t i o n ,a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f c a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e ( C P S ) d e -r i v e d f r o m K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e K P 1 - 0 ( 6 , 6 a ) . A n t i - C P Sa n t i b o d y a d m i n i s t e r e d p a s s i v e l y ( 6 ) or e l i c i t e d i n response t oi m m u n i z a t i o n w i t h p u r i f i e d a n t i g e n ( 6 a ) was f o u n d t o p r o v i d ea h i g h d e g r e e o f p ro t ec t i o n a g a i n s t f a t a l K . p n e u m o n i a eK P 1 - 0 b u r n wound s e p s i s . F u r t h e r m o r e , t h i s c a p s u l a r a n t i -ge n was f o u n d t o b e s a f e a n d i m m u n o g e n i c i n humanv o l u n t e e r s ( 8 ) . H o w e v e r , t h e a b o v e s t u d i e s were l i m i t e d t oo n l y a s i n g l e c a p s u l a r s e r o t y p e .W h i l e t h e r e h a v e b e e n n u m e r o u s i n v e s t i g a t i o n s on t h eb i o c h e m i s t r y o f K l e b s i e l l a CP S r e l a t i n g t o m o n o s a c c h a r i d ec o m p o s i t i o n a n d p r i m a r y s t r u c t u r e ( 1 8 , 2 5 ) , l i t t l e i s knownr e g a r d i n g t h e v a ri o u s b i o l o g i c a l a n d c h e m i c a l p a r a m e t e r sr e l e v a n t t o t h e i r u se as vaccine components ( 4 ) . I n t h ep r e s e n t s t u d y , we h a v e i s o l a t e d a n d p u r i f i e d 1 8 s e r o t y p e s o fK l e b s i e l l a C P S s . T h e s e s e r o t y p e s were s e l e c t e d d u e t o t h e i rp r e v a l e n c e among K l e b s i e l l a b a c t e r e m i c i s o l a t e s a n d ac-c o u n t f o r a p p r o x i m a t e l y 70% o f s u c h s t r a i n s ( 2 1 , 2 4 ; P . M.M o r t i m e r a n d S . J . C r y z , J r . , s u b m i t t e d f o r p u b l i c a t i o n ) . Thev a r i o u s a n t i g e n p r e p a r a t i o n s were a n a l y z e d r e g a r d i n g p u r i t y ,m o l e c u l a r w e i g h t , p y r o g e n ic i t y , a n d i m m u n o g e n i c i t y i n m i c et o d e t e r m i n e t h e i r p o t e n t i a l as human v a c c i n e c a n d i d a t e s .

MATERIALS AND METHODSB a c t e r i a l s t r a i n s a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . K l e b s i e l l a s t r a i n s o fknown c a p s u l a r a n d l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) s e r o t y p e ( 2 8 )

were k i n d l y p r o v i d e d b y I . 0 r s k o v , S t a t e n s S e r u m i n s t i t u t ,* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

C o p e n h a g e n , D e n m a r k . C u l t u r e s were s t o r e d a t - 2 0 C i n a10% s k i m m i l k s o l u t i o n . HYEM medium ( c o n t a i n i n g 2%H y c a s e - S F [ H u m k o - S h e f f i e l d , M e m p h i s , T e n n . ] , 0.3% y e a s te x t r a c t [ D i f co L a b o r at o r i e s , D e t r o i t , M i c h . ] , a n d 2% m a l t o s e )was u s e d f o r r o u t i n e c u l t i v a t i o n . C u l t u r e s ( 5 0 0 m l o f mediumi n a 2 - l i t e r E r l e n m e y e r f l a s k ) were grown a t 3 7 C w i t h s h a k i n g( 1 0 0 r p m ) f o r 1 6 h . K . p n e u m o n i a e K P 1 - 0 was t h e g i f t o f D .S t r a u s , T e x a s Tech H e a l t h S c i e n c e C e n t e r , L u b b o c k .P u r i f i c a t i o n o f C P S . CP S was p u r i f i e d b y a s l i g h t m o d i f i -c a t i o n o f a p r e v i o u s l y p u b l i s h e d t e c h n i q u e ( 1 3 ) . B a c t e r i awere r e m o v e d f r o m c u l t u r e s b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 x gf o r 3 0 m i n . Th e s u p e r n a t a n t was t h e n p a s s e d t h r o u g h a0 . 4 5 - , u m f i l t e r t o remove t h e r e m a i n i n g c e l l s . C e t a v l o n ( N -c e t y l - N , N , N - t r i m e t h y l a m m o n i u m b r o m i d e ; E . Merck AG ,D a r m s t a d t , F e d e r a l R e p u b l i c o f G e r m a n y ) , as a 10% ( w t / v o l )s t o c k , was a d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0.5% ( w t / v o l ) .A f t e r s t i r r i n g f o r 3 0 m i n a t room t e m p e r a t u r e , t h e p r e c i p i t a t ewas c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n . The m a t e r i a l was d i s s o l v e di n 1 M C a C l 2 ( 1 0 0 t o 2 5 0 m l ) a n d e t h a n o l was a d d e d t o e q u a l25% ( v o l / v o l ) . A f t e r s t i r r i n g f o r 3 0 t o 6 0 m i n a t room t e m -p e r a t u r e , t h e p r e c i p i t a t e d n u c l e i c a c i d s were removed b yc e n t r i f u g a t i o n . Th e CP S was p r e c i p i t a t e d f r o m t h e r e s u l t i n gs u p e r n a t a n t b y i n c r e a s i n g t h e e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n t o 80%( v o l / v o l ) . The CP S was d i s s o l v e d i n d i s t i l l e d water ( 5 0 t o 1 0 0m l ) a n d e x t r a c t e d a t l e a s t t h r e e t i m e s w i t h an e q u a l v o l u m eo f c h l o r o f o r m - b u t a n o l ( 5 : 1 ) . The p o o l e d water p h a s e s weree x t e n s i v e l y d i a l y z e d a g a i n s t d i s t i l l e d water a t 4 C a n d t h e nc e n t r i f u g e d a t 1 0 0 , 0 0 0 x g f o r a minimum o f 1 6 h t o removet h e m a j o r i t y o f LPS. CP S was p r e c i p i t a t e d f r o m t h e super-n a t a n t b y e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n ( 8 0 % , v o l / v o l ) , c o l l e c t e d b yc e n t r i f u g a t i o n , d i s s o l v e d i n d i s t i l l e d w a t e r , a n d l y o p h i l i z e d .P u r i f i c a t i o n o f L P S . LP S was p u r i f i e d f r o m c e l l w a l lf r a g m e n t s o f s t a t i o n a r y - p h a s e c u l t u r e s o f K . pneumoniaeKP1-0 as p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 7 ) .M o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n a t i o n . The CP S p r e p a r a t i o n sw e r e s i z e d b y g e l f i l t r a t i o n ove r a S e p h a r o s e CL-4B c o l u m n( 9 2 b y 1 . 5 c m ; P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a l s , U p p s a l a , S w e -d e n ) . The c o l u m n was e q u i l i b r a t e d i n p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ( P B S ; p H 7 . 4 ) a n d c a l i b r a t e d , u s i n g b l u e d e x t r a n 2 0 0 0( P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a l s ) t o d e f i ne t h e v o i d v o l u m e ( V O )

2 2 5

V o l . 5 0 , N o . 1


3/7

2 2 6 CRYZ ET A L .a n d [ ' 4 C ] s o d i u m a c e t a t e (New E n g l a n d N u c l e a r , Z u r i c h ,S w i t z e r l a n d ) t o d e f i n e t h e t o t a l b e d v o l u m e ( V s ) . T h e d i s t r i -b u t i o n c o n s t a n t ( K d ) w a s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o t h em e t h o d o f Wong e t a l . ( 3 2 ) . CP S ( 5 mg i n 3 m l ) w a s a p p l i e dt o t h e c o l u m n , a n d f r a c t i o n s w e r e m o n i t o r e d f o r t o t a l c a r -b o h y d r a t e b y t h e p h e n o l - s u l f u r i c a c i d m e t h o d ( 1 1 ) .Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s . P r o t e i n w a s m e a s u r e d b y t h em e t h o d o f L o w r y e t a l . ( 1 9 ) , u s i n g b o v i n e s e r u m a l b u m i n a sa s t a n d a r d . N u c l e i c a c i d s w e r e q u a n t i t a t e d b y d e t e r m i n i n gt h e A 2 6 0 o f a 1 - m g / m l CP S s o l u t i o n ( i n w a t e r ) i n a 1 - c mc u v e t t e . T h e c o n v e r s i o n f o r m u l a u s e d w a s t h a t 5 0 , u g o fn u c l e i c a c i d s p e r m l y i e l d s a n A 2 6 0 o f 1 i n a 1 - c m c u v e t t e ( 3 2 ) .R e s i d u a l m o i s t u r e w a s d e t e r m i n e d b y u s e o f a t yp e 2 6 - 3 2 1 Am o i s t u r e a n a l y z e r ( D u p o n t I n s t r u m e n t s , M o n r o v i a , C a l i f . ) .A k n o w n a m o u n t o f CP S ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 m g ) w a s p l a c e do n t o a n i c k e l w e i g h i n g b o a t a n d i n s e r t e d i n t o t h e o v e n( 1 0 5 C ) f o r 2 0 m i n i n t h e p r e s e n c e o f d r y N 2 ( c o n d i t i o n ss h o w n t o r e s u l t i n a m a x i m a l w a t e r l o s s f r o m C P S s ) . T h ea m o u n t o f w a t e r d r i v e n o u t o f t h e s a m p l e w a s q u a n t i t a t e d b ya n e l e c t r o l y s i s c e l l a n d d i g i t a l l y d i s p l a y e d . To c o r r e c t f o ra t m o s p h e r i c m o i s t u r e , a b l a n k o f j u s t a n e m p t y w e i g h i n gb o a t w a s u s e d . T h e c o r r e c t e d w a t e r l o s s v a l u e w a s d i v i d e db y t h e i n i t i a l w e i g h t o f t h e CP S t o y i e l d p e r c e n t r e s i d u a lm o i s t u r e . 2 - K e t o - 3 - d e o x y o c t o n a t e w a s m e a s u r e d b y t h et h i o b a r b i t u r i c a c i d m e t h o d ( 2 9 ) . T o t a l c a r b o h y d r a t e w a sd e t e r m i n e d b y t h e p h e n o l - s u l f u r i c a c i d m e t h o d , u s i n g d e x -t r a n 5 0 0 ( P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a l s ) a s a s t a n d a r d ( 1 1 ) .D e t o x i f i c a t i o n o f L P S . LP S p r e s e n t i n CP S p r e p a r a t i o n sw a s d e t o x i f i e d v i a d e a c y l a t i o n b y t h e m e t h o d o f S e i d a n dS a d o f f ( 3 1 ) . CP S ( 5 m g ) w a s s u s p e n d e d i n 2 m l o f a 0 . 1 NNaOH s o l u t i o n i n 95% e t h a n o l f o r 3 0 m i n a t 3 7 C . T h es o l u t i o n w a s n e u t r a l i z e d b y t h e a d d i t i o n o f 2 N a c e t i c a c i d .T h e l i q u i d w a s t h e n r e m o v e d w i t h a P a s t e u r p i p e t t e . T h eCP S w a s d i s s o l v e d i n d i s t i l l e d w a t e r , e x t e n s i v e l y d i a l y z e da g a i n s t d i s t i l l e d w a t e r , a n d l y o p h i l i z e d .P y r o g e n i c i t y a s s a y s . T h e p y r o g e n i c i t y o f CP S w a s e v a l u -a t e d i n 1 . 8 - t o 2 . 2 - k g Ne w Z e a l a n d w h i t e r a b b i t s . CP S w a sd i s s o l v e d i n p h y s i o l o g i c a l s a l i n e . R a b b i t s ( a m i n i m u m o f t w op e r c a p s u l a r a n t i g e n ) e a c h r e c e i v e d 1 m l o f CP S s o l u t i o n p e rk g o f b o d y w e i g h t i n t r a v e n o u s l y . T e m p e r a t u r e r e s p o n s e wasm e a s u r e d a t 0 . 5 - h i n t e r v a l s f o r 4 h . An i n c r e a s e o f 0 . 3 C a ta n y o n e t i m e p o i n t w a s c o n s i d e r e d t o b e a p y r o g e n i cr e s p o n s e .E L I S A . E n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y s ( E L I S A )f o r t h e d e t e c t i o n o f a n t i - C P S i m m u n o g l o b u l i n G ( I g G ) w e r ep e r f o r m e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 6 ) . An ELISA f o r d e t e c -t i o n o f a n t i - L P S a n t i b o d y w a s p e r f o r m e d i n a s i m i l a r m a n -n e r , u s i n g m i c r o t i t e r p l a t e s c o a t e d w i t h 2 0 0 , u l o f a 2 0 - , u g / m ls o l u t i o n o f LP S i n P B S , pH 7 . 4 , p e r w e l l . E a c h p l a t ec o n t a i n e d e i g h t c o n t r o l w e l l s w h i c h w e r e r ea ct ed w i t h a l lr e a g e n t s e x c e p t s e r u m .I m m u n i z a t i o n o f m i c e . F e m a l e NMRI m i c e ( 1 8 t o 2 0 g )w e r e u s e d . G r o u p s o f 1 0 m i c e w e r e i m m u n i z e d i n t r a m u s c u -l a r l y w i t h 1 , u g o f CP S i n 1 0 0 p . l o f PBS o n d a y s 0 a n d 1 4 .B l o o d w a s t a k e n f r o m e a c h mouse o n d a y 2 8 , a n d t h e serumw a s c o l l e c t e d a n d s t o r e d a t - 2 0 C .A n t i s e r a . H e a l t h y a d u l t v o l u n t e e r s w e r e i m m u n i z e d s u b -c u t a n e o u s l y w i t h 2 5 o r 5 0 p . g o f n a t i v e o r N a O H - t r e a t e d K .p n e u m o n i a e K P 1 - 0 CP S ( 8 ) . S e r a w e r e o b t a i n e d a t t h e t i m eo f v a c c i n a t i o n a n d 4 w e e k s p o s t v a c c i n a t i o n f r o m s e v e nv o l u n t e e r s p e r g r o u p a n d p o o l e d . I g G was i s o l a t e d f r o m t h ec r u d e s e r a b y p u b l i s h e d m e t h o d s ( 2 6 ) . I g G ELISA t i t e r sw e r e d e t e r m i n e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 6 , 6 a ) . T h e s e r aw e r e d i l u t e d w i t h s t e r i l e p h y s i o l o g i c a l s a l i n e s o a s t o g i v ee q u a l t i t e r s f o r e a c h p r e p a r a t i o n . T r h e I g G t i t e r s were 9 8 a n d8 5 f o r s e r u m p o o l s d e r i v e d f r o m v o l u n t e e r s i m m u n i z e d w i t h

TABLE 1 . C o m p o s i t i o n o f K l e b s i e l l a C P S sC a p - C o m p o n e n t ( % d r y w t ) as u l a rsero- d r a t e P r o t e i n N u c l e i c K D o b R e s i d u a lt y p e drateacdmitr

2 7 7 . 6 1 . 0 3 1 . 3 2 0 . 0 4 9 . 53 7 3 . 7 0 . 7 3 0 . 8 8 0 . 1 0 8 . 57 8 6 . 8 0 . 9 1 0 . 5 1 0 . 1 0 9 . 99 7 8 . 1 2 . 0 5 1 . 2 4 0 . 0 5 1 0 . 61 0 7 8 . 9 1 . 1 1 0 . 7 0 0 . 1 6 1 3 . 62 0 5 7 . 4 0 . 2 8 0 . 2 1 0 . 0 6 8 . 02 1 7 0 . 7 1 . 5 7 0 . 9 7 0 . 0 6 9 . 52 4 7 9 . 8 0 . 1 6 0 . 3 6 0 . 0 5 9 . 02 5 7 6 . 2 0 . 5 0 . 6 9 0 . 0 2 7 . 43 0 7 0 . 1 2 . 4 4 0 . 5 5 0 . 1 6 1 1 . 53 5 7 9 . 0 1 . 0 2 . 4 5 0 . 1 2 8 . 64 3 7 1 . 8 1 . 3 3 0 . 5 4 0 . 1 1 1 2 . 34 7 6 9 . 4 0 . 4 4 0 . 4 4 0 . 1 5 9 . 95 4 6 2 . 9 1 . 7 4 1 . 3 3 0 . 1 0 9 . 45 5 6 3 . 2 0 . 7 1 0 . 3 6 0 . 0 4 9 . 25 6 7 4 . 3 2 . 5 0 1 . 1 0 0 . 1 8 9 . 36 0 8 6 . 3 1 . 2 0 1 . 4 0 0 . 2 0 7 . 16 1 6 9 . 2 1 . 1 7 0 . 6 1 0 . 1 3 6 . 7

Mean 7 3 . 6 1 . 1 5 0 . 8 6 0 . 1 0 1 9 . 4 4a S e e t e x t f o r a n a l y t i c a l m e t h o d s .b KDO, 2 - K e t o - 3 - d e o x y o c t o n a t e .

n a t i v e K P 1 - 0 CP S o r N a O H - t r e a t e d K P 1 - 0 C P S , r e s p e c -t i v e l y .P r o t e c t i o n s t u d i e s . M i c e ( f e m a l e NMRI w e i g h i n g 1 8 t o 2 0g ) e a c h r e c e i v e d human I g G ( 5 . 6 m g o f p r o t e i n p e r m o u s e ) o rhuman a l b u m i n ( 1 6 . 5 m g p e r m o u s e ; A l b u m a n , S w i s s S e r u ma n d V a c c i n e I n s t i t u t e , B e r n e , S w i t z e r l a n d ) i n t r a v e n o u s l y i n0 . 3 m l o f s a l i n e . A p p r o x i m a t e l y 2 4 h l a t e r m i c e were b u r n e da n d c h a l l e n g e d w i t h a p p r o x i m a t e l y 7 0 CFU o f K . p n e u m o -n i a e K P 1 - 0 a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 5 , 6 ) . M o r t a l i t y wasr e c o r d e d f o r 1 0 d a y s p o s t c h a l l e n g e . F o r a c t i v e v a c c i n a t i o ns t u d i e s m i c e were i m m u n i z e d on d a y s 0 a n d 7 w i t h 1 0 p . g o fK P 1 - 0 CP S o r p r o n a s e - t r e a t e d K P 1 - 0 CP S i n 1 0 0 p . i n t r a -m u s c u l a r l y . K P 1 - 0 CP S was t r e a t e d w i t h p r o n a s e i n t h ef o l l o w i n g manner. To 5 0 0 p . g o f CP S i n 1 m l o f P B S , p r o n a s e( B o e h r i n g e r G m b H , M a n n h e i m , F e d e r a l R e p u b l i c o f G e r -m a n y ) was a d d e d t o e q u a l 5 0 , u g / m l . T h e s o l u t i o n wasi n c u b a t e d f o r 2 4 h a t 3 7 C .S t a t i s t i c a l a n a l y s i s . F o r c h a l l e n g e s t u d i e s , s i g n i f i c a n c e wasd e t e r m i n e d b y t h e c h i - s q u a r e m e t h o d . F o r a n t i b o d y r e -s p o n s e s t u d i e s , S t u d e n t ' s t t e s t was u s e d .

RESULTSC P S s were i s o l a t e d f r o m 1 8 s t r a i n s o f K l e b s i e l l a s p p .w h i c h d i f f e r e d i n s e r o t y p e . C a p s u l a r m a t e r i a l c o u l d r e a d i l yb e p u r i f i e d f r o m a l l s t r a i n s b y u s i n g a s c h e m e w h i c h e n t a i l e d( i ) c o p r e c i p i t a t i o n f r o m c u l t u r e s u p e r n a t a n t s w i t h a q u a t e r -n a r y ammonium d e t e r g e n t ( C e t a v l o n ) , ( i i ) r e m o v a l o f n u c l e i ca c i d s b y e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n , ( i i i ) e x t r a c t i o n w i t h o r g a n i cs o l v e n t s t o r e move l i p i d s a n d p r o t e i n , a n d ( i v ) r e m o v a l o fLP S b y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n . Y i e l d s o f c a p s u l a r a n t i g e n sv a r i e d f r o m 7 0 t o 7 5 0 m g / l i t e r f o r t h e v a r i o u s s t r a i n s .CP S p r e p a r a t i o n s were c o m p o s e d p r i m a r i l y o f c a r b o h y -d r a t e ( T a b l e 1 ) . R e s i d u a l p r o t e i n l e v e l s we r e i n t h e r a n g e o f0 . 5 t o 2 . 5 % , w i t h an a v e r a g e v a l u e o f 1 . 1 5 % . T h e n u c l e i ca c i d c o n t e n t was c o m p a r a b l y l o w , w i t h a l l b u t on e p r e p a r a -t i o n ( K 3 5 ) c o n t a i n i n g . 2% a n d an a v e r a g e v a l u e o f 0 . 8 6 % .T r a c e q u a n t i t i e s o f 2 - k e t o - 3 - d e o x y o c t o n a t e we r e d e t e c t e d i na l l p r e p a r a t i o n s , i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f L P S . T h e a b o v e

I N F E C T . IMMUN.


4/7

KLEBSIELLA CP S 2 2 7TABLE 2 . P y r o g e n i c p o t e n t i a l o f n a t i v e a n d N a O H - t r e a t e dK l e b s i e l l a C P S s

MPD ( , u g o f a n t i g e n / m l p e r k g o f F o l d r e -C a p s u l a r r a b b i t b o d y w t ) ' d u c t i o ns e r o t y p e NaOH i n p y r o g e -N a t i v e t r e a t e d n i c i t y

2 < 0 . 1 b >10 > 1 0 03 0 . 5 >10 2 07 < 0 . 1 > 10 > 1 0 09 2 > 5 0 > 2 51 0 < 0 . 2 >10 >502 0 0 . 5 > 10 >202 1 0 . 5 >10 >202 4 1 0 5 0 52 5 1 0 >50 >53 0 1 >50 >503 5 0 . 5 >10 > 2 04 3 < 0 . 1 5 >504 7 < 0 . 1 >10 > 1 0 05 4 < 0 . 1 >10 > 1 0 05 5 1 >50 >505 6 < 0 . 1 >10 > 1 0 06 0 < 0 . 1 >10 > 1 0 06 1 < 0 . 1 >10 > 1 0 0

a A p y r o g e n i c r e s p o n s e w a s t e r m e d a n i n c r e a s e o f - 0 . 3 a C .b L o w e s t d o s e t e s t e d .c H i g h e s t d o s e t e s t e d .

r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t CPSs c o u l d b e o b t a i n e d i n g o o dy i e l d s f r o m a l l s t r a i n s o f K l e b s i e l l a spp. t e s t e d a n d c o u l ds u b s e q u e n t l y b e p u r i f i e d t o a h i g h d e g r e e .T h e p y r o g e n i c p o t e n t i a l o f b a c t e r i a l CP S f o r r a b b i t s h a sp r e v i o u s l y b e e n s h o w n t o b e a f a i r l y a c c u r a t e i n d i c a t o rr e g a r d i n g t h e a c c e p t a b i l i t y o f s u c h a n t i g e n s i n h u m a n s ( 1 6 ,3 2 ) . O n e - h a l f ( 9 o f 1 8 ) o f t h e n a t i v e p r e p a r a t i o n s w e r e f o u n dt o b e h i g h l y pyrogenic, w i t h a m i n i m a l p y r o g e n i c d o s e( M P D ) o f s 0 . 2 , u g / m l pe r k g - ( T a b l e 2 ) . F o u r p r e p a r a t i o n s( K 3 , K 2 0 , K 2 1 , a n d K 3 5 ) were t e r m e d m o d e r a t e l y p y r o g e n i c( M P D = 0 . 5 , u g / m l pe r k g ) , w h i l e f i v e ( K 9 , K 2 4 , K 2 5 , K 3 0 ,a n d K 5 5 ) were c o m p a r a t i v e l y n o n p y r o g e n i c ( M P D -2 , u g / m lpe r k g ) .W e h a v e p r e v i o u s l y n o t e d t h a t t r e a t m e n t o f K l CP S i n as o l u t i o n o f 95% e t h a n o l c o n t a in i n g 0 . 1 N NaOH m a r k e d l yr e d u c e d i t s p y r o g e n i c i t y b y d e t o x i f y i n g t h e c o n t a m i n a t i n gLP S v i a d e a c y l a t i o n o f t h e l i p i d A m o i e t y ( 8 ) . T h e r e f o r e , t h ev ar i o u s c a ps u l a r a n t i g e n s were t r e a t e d i n a s i m i l a r manner,a n d t h e i r M P D s we r e d e t e r m i n e d ( T a b l e 2 ) . N a O H - t r e a t e dc a p s u l a r m a t e r i a l was i n a l l cases f o u n d t o b e l e s s p y r o g e n i ct h a n t h e c o r r e s p o n d i n g n a t i v e m a t e r i a l . F o r 1 1 o f 1 8 c a p s u l a rp r e p a r a t i o n s w h i c h were i n i t i a l l y h i g h l y or m o d e r a t e l yp y r o g e n i c , t h i s t r e a t m e n t r e d u c e d t h e p y r o g e n i c i t y b y moret h a n 5 0 - f o l d . A l e s s d r a m a t i c e f f e c t was o b s e r v e d when t h en a t i v e CP S was c o m p a r a t i v e l y n o n p y r o g e n i c ( s e r o t y p e s 2 4a n d 2 5 ) .T h e i m m u n o g e n i c i t y o f b a c t e r i a l CPSs i s a c c e p t e d t o b ed e p e n d e n t upon t h e i r m o l e c u l a r w e i g h t ( 1 4 , 3 2 ) . T h e m o l e c -u l a r s i z e o f t h e v ar i o u s c a ps u l a r a n t i g e n s was d e t e r m i n e d b yg e l f i l t r a t i o n ov e r S e p h a r o s e CL-4B b e f o r e ( n a t i v e ) a n d a f t e rNaOH t r e a t m e n t ( T a b l e 3 ) . NaOH t r e a t m e n t h a d a n e g l i g i b l ee f f e c t on t h e e l u t i o n p r o f i l e s o b s e r v e d . A l l p o l y s a c c h a r i d e se l u t e d a t or near t h e v o i d v o l u m e ( K d = 0 . 0 1 t o 0 . 1 6 ) ,i n d i c a t i n g an av e rag e m o l e c u l a r w e i g h t o f > 1 0 6 . F u r t h e r -m o r e , >97% o f t h e t o t a l c a r b o h y d r a t e present i n a l l p r e p a -r a t i o n s e l u t e d w i t h a K d o f . 0 . 5 . An e x a m p l e o f t h e r e s u l t so b t a i n e d i s s h o w n i n F i g . 1 ( n a t i v e K 7 C P S ) .

W e e l e c t e d t o s t u d y t h e I g G r e s p o n s e t o v a c c i n a t i o n w i t hK l e b s i e l l a C P S s s i n c e t h i s c l a s s o f a n t i - C P S a n t i b o d y h a sb e e n s h o w n t o a f f o r d g o o d p r o t e c t i o n a g a i n s t e x p e r i m e n t a lK l e b s i e l l a i n f e c t i o n s ( 6 ) . T h e i m m u n o g e n i c i t y o f n a t i v e a n dN a O H - t r e a t e d C P S s w a s e v a l u a t e d i n m i c e . T h e I g G a n t i -b o d y r e s p o n s e f o l l o w i n g i m m u n i z a t i o n w i t h n a t i v e c a p s u l a ra n t i g e n s w a s f o u n d t o v a r y s u b s t a n t i a l l y among t h es e r o t y p e s ( T a b l e 4 ) . P o l y s a c c h a r i d e s d e r i v e d f r o m c a p s u l a rt y p e s 7 , 1 0 , 2 0 , 2 4 , 5 6 , a n d 6 0 w e r e h i g h l y i m m u n o g e n i c( m e a n I g G ELISA t i t e r s , . 1 5 0 ) . M a t e r i a l d e r i v e d f r o m t y p e s4 3 a n d 6 1 w a s w e a k l y i m m u n o g e n i c ( m e a n I g G ELISA t i t e r s ,s 2 0 ) . I n m o s t c a s e s , NaOH t r e a t m e n t w a s f o u n d t o h a v el i t t l e , i f a n y , e f f e c t o n t h e i m m u n o g e n i c i t y . H o w e v e r , t h ea n t i b o d y r e s p o n s e t o f i v e p r e p a r a t i o n s ( K 1 0 , K 3 0 , K 5 4 , K 5 5 ,a n d K 6 1 ) w a s f o u n d t o b e s i g n i f i c a n t l y ( P . 0 . 0 5 ) d e c r e a s e da f t e r NaOH t r e a t m e n t .T h e p r o t e c t i v e c a p a c i t y o f human I g G a n t i b o d y e l i c i t e d i nr e s p o n s e t o i m m u n i z a t i o n w i t h n a t i v e CP S o r N a O H - t r e a t e dCP S w a s e v a l u a t e d i n a m u r i n e b u r n wound s e p s i s m o d e l( T a b l e 5 ) . P a s s i v e l y t r a n s f e r r e d a n t i - n a t i v e CP S o r a n t i -N a O H - t r e a t e d CP S c o n f e r r e d a c o m p a r a b l e , a n d s i g n i f i c a n t( P < 0 . 0 1 ) , d e g r e e o f p r o t e c t i o n a g a i n s t i n f e c t i o n w i t h t h eh o m o l o g o u s s t r a i n o f K . p n e u m o n i a e .To d o c u m e n t t h a t t h e p r o t e c t i o n o b s e r v e d a b o v e w a s n o td u e t o a n t i b o d y e l i c i t e d t o t h e p r o t e i n o r LP S c o n t a m i n a n t sp r e s e n t i n t h e K P 1 - 0 CP S v a c c i n e , t h e f o l l o w i n g e x p e r i m e n t sw e r e p e r f o r m e d . G r o u p s o f m i c e ( 1 5 i n e a c h g r o u p ) w e r ei m m u n i z e d w i t h P B S , K P 1 - 0 C P S , o r K P 1 - 0 CP S t r e a t e dw i t h p r o n a s e a n d s u b s e q u e n t l y b u r n e d a n d c h a l l e n g e d w i t hK . p n e u m o n i a e K P 1 - 0 . T h e m o r t a l i t y r a t e s f o r t h e s e t h r e eg r o u p s w e r e 8 7 , 2 6 , a n d 2 0 % , r e s p e c t i v e l y . T h e r e w a s n os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e p r o t e c t i v e c a p a c i t y o f n a t i v e o rp r o n a s e - t r e a t e d K P 1 - 0 C P S , w i t h b o t h p r e p a r a t i o n s p r o v i d -i n g s i g n i f i c a n t p r o t e c t i o n ( P < 0 . 0 1 ) a g a i n s t f a t a l i n f e c t i o n ,i n d i c a t i n g t h a t t h e p r o t e i n p r e s e n t i n CP S i s n o t r e s p o n s i b l ef o r e l i c i t i n g a p r o t e c t i v e immune r e s p o n s e . To d e t e r m i n e i f ap r o t e c t i v e i m m u n e r e s p o n s e w a s e l i c i t e d a g a i n s t r e s i d u a lLP S i n C P S , g r o u p s o f m i c e r e c e i v e d human a l b u m i n ,

p r e i m m u n e human I g G , o r I g G p r e p a r e d f r o m v o l u n t e e r si m m u n i z e d w i t h N a O H - t r e a t e d K P 1 - 0 CP S ( p o s t i m m u n eI g G ) ( T a b l e 6 ) . T h e t r a n s f e r o f p r e i m m u n e I g G , w h i c h

TABLE 3 . M o l e c u l a r w e i g h t o f K l e b s i e l l a CPSs b e f o r e a n d a f t e rNaOH t r e a t m e n tC a p s u l a r K d K d S 0 . 5s e r o t y p e N a t i v e NaOH t r e a t e d N a t i v e NaOH t r e a t e d

2 0 . 0 4 0 . 0 3 9 9 . 4 9 9 . 23 0 . 0 4 0 . 0 5 9 8 9 87 0 . 0 1 0 . 0 8 1 0 0 1 0 09 0 . 0 3 0 . 0 7 9 8 . 7 9 7 . 81 0 0 . 0 8 0 . 1 1 9 8 . 5 9 8 . 72 0 0 . 1 1 0 . 1 1 1 0 0 9 9 . 22 1 0 . 1 0 0 . 0 5 9 8 . 3 9 9 . 22 4 0 . 0 5 0 . 0 5 9 9 . 8 9 9 . 32 5 0 . 0 2 0 . 0 8 1 0 0 9 9 . 23 0 0 . 0 5 0 . 0 2 9 9 1 0 03 5 0 . 0 2 0 . 0 1 9 9 . 8 9 7 . 94 3 0 . 0 2 0 . 0 1 9 7 . 8 1 0 04 7 0 . 0 6 0 . 0 6 9 7 . 9 9 8 . 95 4 0 . 0 2 0 . 0 1 9 9 1 0 05 5 0 . 1 0 0 . 0 6 9 9 . 7 9 9 . 25 6 0 . 0 6 0 . 1 6 1 0 0 9 86 0 0 . 0 7 0 . 0 1 1 0 0 9 8 . 16 1 0 . 0 6 0 . 0 5 9 9 . 9 9 8 . 1

V O L . 5 0 , 1 9 8 5


5/7

2 2 8 CRYZ ET AL.

3 . 22 . 82 . 42 . 0

V0

X=nA1 . 2 30

c o 0Q 8 0 . 8 20 x .0.4

20 3 0 4 0 50 60 70 80 90 100F r a c t i o n N r .F I G . 1 . G e l f i l t r a t i o n o f n a t i v e K 7 CP S over: S e p h a r o s e C L - 4 B (0; m e a s u r e d a t 4 8 5 nm; p h e n o l - s u l f u r i c a c i d m e t h o d ) ; b l u e d e x t ra n 2 0 0 0( A E m e a s u r e d a t 6 1 5 n m ) ; [ ' 4 C ] s o d i u m a c e t a t e ( 0 ; q u a n t i t a t e d b y d e t e r m i n i n g t h e c o u n t s p e r m i n u t e o f a 2 0 0 - , u l f r a c t i o n ) . V 0 =V o i d v o l u m eb a s e d upon t h e e l u t i o n p r o f i l e o f b l u e d e x t r a n 2 0 0 0 . V , = T o t a l b e d v o l u m e b a s e d u p o n t h e e l u t i o n p r o f i l e o f [ 1 4 C ] s o d i u m a c e t a t e .

c o n t a i n e d n o d e t e c t a b l e a n t i - C P S a n t i b o d y b u t p o s s e s s e da n t i - K P 1 - 0 LP S a n t i b o d y , was n o t f o u n d t o b e p r o t e c t i v e ( P> 0 . 0 5 ) . I n c o n t r a s t , p o s t i m m u n e I g G e n r i c h e d i n a n t i - C P Sa n t i b o d y b u t n o t i n a n t i - L P S a n t i b o d y a f f o r d e d s i g n i f i c a n tp r o t e c t i o n a g a i n s t m o r t a l i t y when c o m p a r e d w i t h b o t h t h ehuman a l b u m i n - t r e a t e d a n d t h e p r e i m m u n e I g G - t r e a t e dgroups ( P < 0 . 0 1 ) . T h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t , w h i l ei m m u n i z a t i o n o f h u m a n s w i t h N a O H - t r e a t e d K P 1 - 0 CP S

TABLE 4 . I g G a n t i b o d y r e s p o n s e f o l l o w i n g i m m u n i z a t i o n w i t hn a t i v e a n d N a O H - t r e a t e d K l e b s i e l l a p o l y s a c c h a r i d e S aC a p s u l a r M e a n I g G E L I S A t i t e r ( r a n g e ) bs e r o t y p e N a t i v e NaOH t r e a t e d

2 7 2 ( 4 4 - 8 0 ) 1 0 7 ( < 1 0 - 7 2 0 ) N S C3 4 5 ( < 1 0 - 9 0 ) 3 9 ( < 1 0 - 6 0 ) NS7 3 6 2 ( 2 7 0 - 1 , 0 0 0 ) 1 9 2 ( 9 0 - 2 8 0 ) NS9 7 8 ( 4 4 - 1 6 0 ) 6 3 ( 3 3 - 7 7 ) NS1 0 5 1 9 ( 2 0 0 - 1 , 5 0 0 ) 3 0 ( < 1 0 - 9 4 ) < 0 . 0 12 0 2 2 5 ( 1 4 0 - 3 6 0 ) 2 1 4 ( 1 3 0 - 4 6 0 ) NS2 1 4 9 ( < 1 0 - 1 1 0 ) 3 2 ( < 1 0 - 1 2 5 ) NS2 4 1 6 9 ( 1 0 0 - 2 4 0 ) 3 0 7 ( 1 3 5 - 1 , 2 5 0 ) NS2 5 6 8 ( 4 8 - 1 6 0 ) 6 8 ( 6 3 - 9 7 ) NS3 0 4 3 1 ( 1 9 0 - 8 0 0 ) 1 3 5 ( 7 8 - 2 0 0 ) < 0 . 0 13 5 5 4 ( < 1 0 - 1 9 0 ) 3 2 ( 1 0 - 1 3 0 ) NS4 3 9 . 9 ( < 1 0 - 5 5 ) 8 ( < 1 0 - 8 0 ) NS4 7 4 7 ( < 1 0 - 1 8 0 ) 1 4 ( < 1 0 - 4 6 ) NS5 4 6 7 ( 5 0 - 1 0 0 ) 2 0 ( < 1 0 - 6 5 ) < 0 . 0 55 5 5 5 ( 1 7 - 8 0 ) 8 ( < 1 0 - 3 2 ) < 0 . 0 15 6 1 6 3 ( 9 0 - 1 , 0 0 0 ) 1 2 8 ( 4 5 - 5 3 0 ) NS6 0 1 5 5 ( 3 0 - 2 9 0 ) 1 3 6 ( 8 0 - 3 3 0 ) NS6 1 1 9 ( < 1 0 - 5 5 ) 2 ( < 1 0 - 2 4 ) < 0 . 0 5

a E a c h mouse r e c e i v e d 1 R g o f a n t i g e n i n t r a m u s c u l a r l y o n d a y s 0 a n d 1 4 .B l o o d w a s c o l l e c t e d o n d a y 2 8 .b G r o u p s o f 1 0 m i ce w e r e u s e d .N S , N o t s i g n i f i c a n t .

e v o k e s a g o o d a n t i - C P S a n t i b o d y response, i t d o e s n o te n g e n d e r an a n t i - L P S r e s p o n s e . F u r t h e r m o r e , p r o t e c t i o na g a i n s t f a t a l e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n c o r r e l a t e s o n l y w i t h t h et r a n s f e r o f a n t i - C P S a n t i b o d y .DISCUSSION

I n f e c t i o n s c a u s e d b y K l e b s i e l l a spp. c o n s t i t u t e a m a j o rt h r e a t t o i m m u n o c o m p r o m i s e d p a t i e n t s ( 1 , 2 3 , 2 4 , 3 3 ) .A n t i b i o t i c t h e r a p y appears t o h a v e o n l y a m o d e r a t e i m p a c ton t h e m o r t a l i t y r a t e f o r K l e b s i e l l a b a c t e r e m i a a n d p n e u m o -n i a ( 1 5 , 2 3 ) . T h e r e c e n t e m e r g e n c e o f m u l t i p l y r e s i s t a n ts t r a i n s g r e a t l y c o m p l i c a t e s a n t i b i o t i c r e g i m e n s ( 2 0 , 2 2 ) . A tp r e s e n t , n o i m m u n o p r o p h y l a c t i c or i m m u n o t h e r a p e u t i ca g e n t s e x i s t f o r t h e c o nt r o l o f K l e b s i e l l a i n f e c t i o n s .S e v e r a l s t u d i e s h a v e d e s c r i b e d t h e c r i t i c a l r o l e p l a y e d b yCP S d u r i n g t h e course o f e x p e r i m e n t a l K l e b s i e l l a i n f e c t i o n s( 5 , 1 0 ) . I n a d d i t i o n , t h e p r o t e c t i v e c a p a c i t y o f t y p e - s p e c i f i cCP S h a s b e e n w e l l d o c u m e n t e d i n m o d e l i n f e c t i o n s ( 2 , 6 , 6 a ) .H o w e v e r , F o u r n i e r e t a l . ( 1 2 ) r e p o r t e d t h a t , w h i l e r i b o s o m a lv a c c i n e s p r o v i d e d s e r o t y p e - s p e c i f i c p r o t e c t i o n a g a i n s t K i e b -s i e l l a i n f e c t i o n s i n m i c e , i m m u n i z a t i o n w i t h p u r i f i e d CP Swas i n e f f e c t i v e . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t n e i t h e r t h e immuneresponse t o v a c c i n a t i o n w i t h t h e v a r i o u s a n t i g e n s n or t h e

TABLE 5 . P r o t e c t i o n a g a i n s t f a t a l K . p n e u m o n i a e K P 1 - 0 s e p s i sb y p a s s i v e t r a n s f e r o f a n t i - K P 1 - 0 CP SA n t i s e r u m ' M o r t a l i t y pntiserum5 ~ ~ ~ ( n o . d e a d / t o t a l )

Human a l b u m i n 1 4 / 1 5A n t i - n a t i v e K P 1 - 0 C P S 2 / 1 5 < 0 . 0 1A n t i - N a O H - t r e a t e d K P 1 - 0 CP S 3 / 1 5 < 0 . 0 1a M i c e e a c h r e c e i v e d 0 . 3 m l o f a n t i s e r u m o r h u r n a n a l b u m i n i n t r a v e n o u s l y2 4 h p r i o r t o c h a l l e n g e w i t h 7 0 CFU o f K . p n e u m o n i a e K P 1 - 0 .

I N F E C T . IMMUN.


6/7

KLEBSIELLA CP S 2 2 9TABLE 6 . P r o t e c t i o n a g a i n s t f a t a l K . p n e u m o n i a e K P 1 - 0i n f e c t i o n b y p a s s i v e t r a n s f e r o f p r e i m m u n e a n d p o s t i m m u n ehuman I g G a

I g G ELISA t i t e r M o r t a l i t yI g G t r a n s f e r r e d ' ( n o . d e a d / PK P 1 - 0 CP S K P 1 - 0 LP S t o t a l )Human a l b u m i n ND c ND 1 4 / 1 5P r e i m m u n e I g G 0 . 5 dP o s t i m m u n e I g G e 1 2 8 4 5 . 8 2 / 1 5 < 0 . 0 1 f

a P r e i m m u n e I g G w a s o b t a i n e d f r o m t h e s e r a o f human v o l u n t e e r s p r i o r t oi m m u n i z a t i o n w i t h N a O H - t r e a t e d K P 1 - 0 C P S . P o s t i m m u n e I g G w a s o b t a i n e df r o m t h e s e r a o f v o l u n t e e r s 2 8 d a y s a f t e r i m m u n i z a t i o n .b M i c e e a c h r e c e i v e d 0 . 3 m l o f h u m a n a l b u m i n o r h u m a n I g G i n t r a v e n o u s l y2 4 h p r i o r t o c h a l l e n g e w it h 6 4 CFU o f K . p n e u m o n i a e K P 1 - 0 .c ND, N o t d e t e r m i n e d .d C o m p a r e d w i t h h u m a n a l b u mi n -t r e at e d g r o u p.e F o l l o w i n g v a c c i n a t i o n w i t h N a O H - t r e a t e d K P 1 - 0 C P S .f C o m p a r e d w i t h b o t h h u m a n a l b u m i n - t r e a t e d g r o u p a n d p r e i m m u n e I g G -t r e a t e d g r o u p .

m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e CP S p r e p a r a t i o n w a s d e t e r m i n e d ,t h e r e f o r e m a k i n g i t d i f f i c u l t t o e x p l a i n t h e s e f i n d i n g s i n l i g h to f t h e p r e s e n t o b s e r v a t i o n s .A l t h o u g h 7 7 K l e b s i e l l a c a p s u l a r s e r o t y p e s h a v e b e e ni d e n t i f i e d ( 2 7 ) , t h e i r d i s t r i b u t i o n among b l o o d i s o l a t e s i ss o m e w h a t l i m i t e d . T h e 1 8 s e r o t y p e s c u r r e n t l y i n v e s t i g a t e dw o u l d e n c o m p a s s r o u g h l y 70 % o f K l e b s i e l l a b a c t e r e m i cs t r a i n s ( 2 1 , 2 4 ; M o r t i m e r a n d C r y z , i n p r e p a r a t i o n ) . T h e s ef i n d i n g s , t o g e t h e r w i t h t h e f a c t t h a t K l e b s i e l l a s e r o t y p e 1CP S h a s b e e n f o u n d t o b e s a f e a n d i m m u n o g e n i c i n h u m a n s ,i n d i c a t e t h a t c a p s u l a r a n t i g e n s s h o u l d b e c o n s i d e r e d a sp r i m e v a c c i n e c a n d i d a t e s a g a i n s t K l e b s i e l l a i n f e c t i o n s . W eh a v e t h e r e f o r e s t u d i e d t h e f e a s i b i l i t y o f s u c h a n a p p r o a c h b ya n a l y z i n g t h e c h e m i c a l , b i o l o g i c a l , a n d i m m u n o l o g i c a l c h a r -a c t e r i s t i c s o f t h e s e 1 8 c a p s u l a r a n t i g e n s r e l e v a n t t o v a c c i n ed e v e l o p m e n t .C P S s c o u l d b e r e a d i l y i s o l a t e d a n d p u r i f i e d f r o m a l ls e r o t y p e s o f K l e b s i e l l a s t r a i n s s t u d i e d . A l t h o u g h p u r i t y , i n

r e g a r d t o c o n t a m i n a t i n g p r o t e i n , n u c l e i c a c i d , a n d L P S ,v a r i e d s o m e w h a t among t h e d i f f e r e n t s e r o t y p e s , i t w a sc o m p a r a b l e t o t h e s t a n d a r d s c u r r e n t l y s e t f o r t h f o r c a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d e - b a s e d v a c c i n e s a g a i n s t N e i s s e r i a m e n i n g i t i -d i s a n d S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e ( 3 0 , 3 2 ) .A l l K l e b s i e l l a c a p s u l a r p r e p a r a t i o n s c o n t a i n e d v a r y i n ga m o u n t s o f L P S , w h i c h , f o r t h e m o s t p a r t , c o r r e l a t e d c l o s e l yw i t h t h e i r p y r o g e n i c i t y . T h e m a j o r i t y o f n a t i v e c a p s u l a ra n t i g e n s w e r e c o n s i d e r e d t o b e t o o p y r o g e n i c f o r e v e n t u a lu s e a s c o m p o n e n t s o f a m u l t i v a l e n t v a c c i n e f o r human u s e .D e t o x i f i c a t i o n o f c o n t a m i n a t i n g LP S b y d e a c y l a t i o n i n t h ep r e s e n c e o f d i l u t e NaOH w a s f o u n d t o b e a n e f f e c t i v em e t h o d f o r l o w e r i n g t h e p y r o g e n i c i t y o f K l e b s i e l l a c a p s u l a rp r e p a r a t i o n s . A f t e r NaOH t r e a t m e n t , . 5 , u g o f a n t i g e n p e rk g o f b o d y w e i g h t w a s n e e d e d t o e v o k e a f e v e r r e s p o n s e( . 0 . 3 % ) i n r a b b i t s . T h i s r e p r e s e n t s a d o s e 1 0 0 - f o l d g r e a t e rt h a n t h a t c u r r e n t l y a l l o w e d f o r t h e N . m e n i n g i t i d i s c a p s u l a rv a c c i n e ( 3 2 ) .O f e q u a l i m p o r t a n c e was t h e f a c t t h a t K l e b s i e l l a C P S sw e r e r e s i s t a n t t o d e g r a d a t i o n b y NaOH. T h e r e f o r e , t h eh i g h - m o l e c u l a r - w e i g h t c h a r a c t e r i s t i c o f t h e s e c a ps u l a r a n t i -g e n s n e c e s s a r y f o r t h e i r i m m u n o g e n i c i t y w a s p r e s e r v e d .T h i s w a s e v i d e n c e d b y t h e f a c t t h a t NaOH t r e a t m e n t h a dl i t t l e e f f e c t o n t h e I g G r e s p o n s e m o u n t e d b y m i c e t o i m m u -n i z a t i o n w i t h t h e m a j o r i t y o f C P S s . A l t h o u g h NaOH t r e a t -m e n t d i d s i g n i f i c a n t l y d i m i n i s h t h e i m m u n o g e n i c i t y o f f i v ec a p s u l a r s e r o t y p e s , i n n o c a s e w a s t h e immune r e s p o n s ec o m p l e t e l y a b r o g a t e d .

I g G a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t e i t h e r n a t i v e o r NaOH-t r e a t e d s e r o t y p e 1 CP S was e q u a l l y e f f e c t i v e a t p r e v e n t i n gf a t a l e x p e r i m e n t a l b u r n wound s e p s i s . A n t i b o d y d i r e c t e da g a i n s t LP S o r p r o t e i n a n t i g e n s d i d n o t a p p e a r t o c o n t r i b u t es i g n i f i c a n t l y t o p r o t e c t i o n . A l t h o u g h p r o t e c t i o n s t u d i e s werel i m i t e d t o a s i n g l e s e r o t y p e ( d u e t o t h e f a c t t h a t s e r o t y p e s o fK l e b s i e l l a s p p . , o t h e r t h a n 1 a n d 2 , a r e n o n v i r u l e n t f o rb u r n - t r a u m a t i z e d m i c e a t a r e a s o n a b l e c h a l l e n g e d o s e [ - 1 0 4b a c t e r i a ] ) , t h e r e s u l t s o b t a i n e d s u g g e s t t h a t t h e p r o t e c t i v ea n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s e x p r e s s e d b y K l e b s i e l l a CPSs may b er e s i s t a n t t o d e s t r u c t i o n o r a l t e r a t i o n b y NaOH.T h e p r e s e n t s t u d y d e m o n s t r a t e s t h a t h i g h - m o l e c u l a r -w e i g h t c a p s u l a r a n t i g e n s c a n b e i s o l a t e d a n d p u r i f i e d f r o mn u m e r o u s c l i n i c a l l y r e l e v a n t s e r o t y p e s o f K l e b s i e l l a s p p .F u r t h e r m o r e , t h e u s e o f NaOH t r e a t m e n t t o r e d u c e t h ep y r o g e n i c p o t e n t i a l o f p u r i f i e d c a p s u l a r m a t e r i a l may p r o v et o b e a u s e f u l t e c h n i q u e f o r p r o d u c i n g a s a f e a n d i m m u n o -g e n i c K l e b s i e l l a p o l y s a c c h a r i d e v a c c i n e .

ACKNOWLEDGMENTSW e t h a n k E . K o h l e r f o r e x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e a n d V . R u p pf o r h e l p i n p r e p a r a t i o n o f t h i s m a n u s c r i p t .

LITERATURE CITED1 . B r y a n , C . S . , K . L . R e y n o l d s , a n d E . R . B r e n n e r . 1 9 8 3 . A n a l y s i so f 1 , 1 8 6 e p i s o d e s o f g r a m - n e g a t i v e b a c t e r e m i a i n n o n - u n i v e r s i t yh o s p i t a l s : t h e e f f e c t s o f a n t i m i c r o b i a l t h e r a p y . R e v . I n f e c t . D i s .5 : 6 2 9 - 6 3 8 .2 . C o o p e r , J . M . , a n d D . R o w l e y . 1 9 8 2 . R e s i s t a n c e t o K l e b s i e l l ap n e u m o n i a e a n d t h e i m p o r t a n c e o f two b a c t e r i a l a n t i g e n s . A u s t .J . E x p . B i o l . M e d . S c i . 6 0 : 6 2 9 - 6 4 1 .3 . C r o s s , A . , J . R . A l l e n , J . B u r k e , G . D u c e l , A . H a r r i s , J . J o h n , D .J o h n s o n , M. L e w , B . M c M i l l a n , P . M e e r s , R . S k a l o v a , R .W e n z e l , a n d J . T e n n e y . 1 9 8 3 . N o s o c o m i a l i n f e c t i o n s d u e t oP s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a : r e v i e w o f r e c e n t t r e n d s . R e v . I n f e c t .D i s . 5 ( S u p p l . ) : S 8 3 7 - S 8 4 5 .4 . C r y z , S . J . , J r . 1 9 8 3 . P r o g r e s s i n i m m u n i z a t i o n a g a i n s t K l e b -s i e l l a i n f e c t i o n s . E u r . J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 : 5 2 3 - 5 2 8 .5 . C r y z , S . J . , J r . , E . F u r e r , a n d R . G e r m a n i e r . 1 9 8 4 . E x p e r i m e n -

t a l K l e b s i e l l a b u r n wound s e p s i s : r o l e o f c a p s u l a r p o l y s a c c h a -r i d e . I n f e c t . I m m u n . 4 3 : 4 4 0 - 4 4 1 .6 . C r y z , S . J . , J r . , E . F u r e r , a n d R . G e r m a n i e r . 1 9 8 4 . P r o t e c t i o na g a i n s t f a t a l K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e b u r n w o u n d s e p s i s b yp a s s i v e t r a n s f e r o f a n t i - c a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e . I n f e c t . I m m u n .4 5 : 1 3 9 - 1 4 2 .6 a . C r y z , S . J . , J r . , E . F u r e r , a n d R . G e r m a n i e r . 1 9 8 4 . P r e v e n t i o n o ff a t a l K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e b u r n wound s e p s i s f o l l o w i n g i m m u -n i z a t i o n w i t h h o m o l o g o u s c a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e . J . I n f e c t .D i s . 1 5 0 : 8 1 7 - 8 2 2 .7 . C r y z , S . J . , J r . , E . F u r e r , a n d R . G e r m a n i e r . 1 9 8 4 . P r o t e c t i o na g a i n s t f a t a l P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a b u r n wound s e p s i s b yi m m u n i z a t i o n w i t h l i p o p o l y s a c c h a r i d e a n d h i g h - m o l e c u l a r -w e i g h t p o l y s a c c h a r i d e . I n f e c t . I m m u n . 4 3 : 7 9 5 - 7 9 9 .8 . C r y z , S . J . , J r . , E . F u r e r , a n d R . G e r m a n i e r . 1 9 8 5 . S a f e t y a n di m m u n o g e n i c i t y o f K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e K l c a p s u l a r p o l y s a c -c h a r i d e v a c c i n e i n h u m a n s . J . I n f e c t . D i s . 1 5 0 : 8 1 7 - 8 2 2 .9 . D a s c h n e r , F . , H . L a n g m a a c k , H . A n d r e , U . B e u c h e l , H . G u l a t z ,E . S a a l , E . S c h e r e r - K l e i n , W. S c h l e i p e n , a n d L . W e b e r . 1 9 8 1 .K r a n k h a u s i n f e k t i o n e n i n e i n e m U n i v e r s i t a t s k l i n i k u m . P r o s p e k -t i v e A n a l y s e von 3 9 , 8 0 2 P a t i e n t e n . D t s c h . M e d . W o c h e n s c h r .1 0 6 : 1 0 1 - 1 0 5 .1 0 . D o m e n i c o , P . , W. G . J o h a n s o n , J r . , a n d D . S t r a u s . 1 9 8 2 . L o b a rp n e u m o n i a i n r a t s p r o d u c e d b y c l i n i c a l i s o l a t e s o f K l e b s i e l l ap n e u m o n i a e . I n f e c t . I m m u n . 3 7 : 3 2 7 - 3 3 5 .1 1 . D u b o i s , M . , K . A . G i l e s , J . K . H a m i l t o n , P . A . R e b e r s , a n d F .S m i t h . 1 9 5 6 . C o l o r i m e t r i c m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n o f s u g a r sa n d r e l a t e d s u b s t a n c e s . A n al . C h e m . 2 8 : 3 5 0 - 3 5 6 .1 2 . F o u r n i e r , J . - M . , C . J o l i v e t - R e y n a u d , M.-M. R i o t t o t , a n d H .J o u i n . 1 9 8 1 . M u r i n e i m m u n o p r o t e c t i v e a c t i v i t y o f K l e b s i e l l ap n e u m o n i a e c e l l s u r f a c e p r e p a r a t i o n s : c o m p a r a t i v e s t u d y w i t h

VOL. 5 0 , 1 9 8 5


7/7

2 3 0 CRYZ ET A L .r i b o s o m a l p r e p a r a t i o n s . I n f e c t . I m m u n . 3 2 : 4 2 0 - 4 2 6 .1 3 . G o t s c h l i c h , E . C . , T . Y . L i u , a n d M. S . A r t e n s t e i n . 1 9 6 9 . Humani m m u n i t y t o t h e m e n i n g o c o c c u s . I I I . P r e p a r a t i o n a n d i m m u n o -c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e g r o u p A , g r o u p B a n d g r o u p Cm e n i n g o c o c c a l p o l y s a c c h a r i d e s . J . E x p . M e d . 1 2 9 : 1 3 4 9 - 1 3 6 5 .1 4 . G o t s c h l i c h , E . C . , M. R e y , R . T r i a u , a n d K . S p a r k s . 1 9 7 2 .Q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f t h e h u man im m un e r e s p o n s e t oi m m u n i z a t i o n w i t h m e n i n g o c o c c a l v a c c i n e s . J . C l i n . I n v e s t .5 1 : 8 9 - 9 4 .1 5 . G r a y b i l l , J . R . , L . W. M a r s h a l l , P . C h a r a g h e , C . K . W a l l a c e ,a n d V . B . M e l v i n . 1 9 7 3 . N o s o c o m i a l p n e u m o n i a . A c o n t i n u i n gm a j o r p r o b l e m . Am . R e v . R e s p i r . D i s . 1 0 8 : 1 1 3 0 - 1 1 4 0 .1 6 . G r i f f i s s , T . , J . M c L e o d , B . L . B r a n d t , P . L . A l t i e r i , G . B . P i e r ,a n d S . L . B e r m a n . 1 9 8 1 . S a f e t y a n d i m m u n o g e n ic i t y o f g r o u p Ya n d g r o u p W135 m e n i n g o c o c c a l c a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e v a c -c i n e s i n a d u l t s . I n f e c t . I m m u n . 3 4 : 7 2 5 - 7 3 2 .1 7 . H o w a r d , J . G . , H . Z o l a , G . H . C h r i s t i e , a n d B . M. C o u r t e n a y .1 9 7 1 . S t u d i e s o n i m m u n o l o g i c a l p a r a l y s i s . V . T h e i n f l u e n c e o fm o l e c u l a r w e i g h t o n t h e i m m u n o g e n i c i t y , t o l e r o g e n i c i t y a n da n t i b o d y - n e u t r a l i z i n g a c t i v i t y o f t y p e I I I p n e u m o c o c c a l p o l y -s a c c h a r i d e . I m m u n o l o g y 2 1 : 5 3 5 - 5 4 6 .1 8 . K e n n e , L . , a n d B . L i n d b e r g . 1 9 8 3 . B a c t e r i a l p o l y s a c c h a r i d e s , p .2 8 7 - 3 6 3 . I n G . 0 . A s p i n a l l ( e d . ) , T h e p o l y s a c c h a r i d e s , v o l . 2 .A c a d e m i c P r e s s , I n c . , Ne w Y o r k .1 9 . L o w r y , 0 . H . , N . J . R o s e b r o u g h , A . L . F a r r , a n d R . J . R a n d a l l .1 9 5 1 . P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e F o l i n p h e n o l r e a g e n t . J .B i o l . C h e m . 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .2 0 . M a , M. Y . , M. E . M u l l i g a n , M. H . F r i e d m a n , a n d M. J .A n d e r s e n . 1 9 8 3 . P r o g n o s i s o f K l e b s i e l l a b a c t e r e m i a : p o s s i b l ea s s o c i a t i o n w i t h a n t i - m i c r o b i a l u s a g e a n d b a c t e r i a l r e s i s t a n c e ,p . 2 1 1 - 2 1 3 . I n C . S . F . Easmon a n d H . G a y a ( e d . ) , S e c o n dI n t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m o n I n f e c t i o n s i n t h e I m m u n o c o m p r o -m i s e d H o s t . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , Ne w Y o r k .2 1 . M a i z t e g u i , J . I . , J . Z . B i e g e l e i s e n , W. B . C h e r r y , a n d E . H . K a s s .1 9 6 5 . B a c t e r e m i a d u e t o g r a m - n e g a t i v e r o d s . A c l i n i c a l , b a c t e -r i o l o g i c , s e r o l o g i c a n d i m m u n o f l u o r e s c e n t s t u d y . N . E n g l . J .M e d . 2 7 2 : 2 2 2 - 2 2 9 .

2 2 . M a r k o w i t z , S . M . , J . J . K e a z e y , F . L . M a c r i n a , a n d V . A . L a m b .1 9 8 0 . S e q u e n t i a l o u t b r e a k s o f i n f e c t i o n d u e t o K l e b s i e l l a p n e u -m o n i a e i n a n eo n a t a l i n t e n s i v e c a r e u n i t : i m p l i c a t i o n o f ac o n j u g a t i v e R - p l a s m i d . J . I n f e c t . D i s . 1 9 2 : 1 0 6 - 1 1 2 .2 3 . McGowan, J . E . , M. W. B a r n e s , a n d M. F i n l a n d . 1 9 7 5 . B a c t e -r e m i a a t B o s t o n C i t y H o s p i t a l : o c c u r r e n c e a n d m o r t a l i t y d u r i n g1 2 s e l e c t e d y e a r s ( 1 9 35 - 1 9 7 2 ), w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o h o s p i t a la c q u i r e d c a s e s . J . I n f e c t . D i s . 1 3 2 : 3 1 6 - 3 3 5 .2 4 . M o n t g o m e r i e , J . Z . , a n d J . K . O t a . 1 9 8 0 . K l e b s i e l l a b a c t e r e m i a .A r c h . I n t e r n . M e d . 1 4 0 : 5 2 5 - 5 2 7 .2 5 . N i m m i c h , W. 1 9 6 8 . Z u r I s o l i e r u n g u n d q u a l i t a t i v e n B a u s t e i n -a na l y s e d e r K - A n t i g e n e v o n K l e b s i e l l e n . Z . M e d . M i k r o b i o l .I m m u n o l . 1 5 4 : 1 1 7 - 1 3 1 .2 6 . N o v o t n y , A . 1 9 6 9 . B a s i c e x e r c i s e s i n i m m u n o c h e m i s t r y , p . 3 - 6 .S p r i n g e r - V e r l a g , Ne w Y o r k .2 7 . 0 r s k o v , I . , a n d M . A . F i f e - A s b e r g . 1 9 7 7 . Ne w K l e b s i e l l a c a p s u -l a r a n t i g e n , K 8 2 , a n d t h e d e l e t i o n o f 5 o f t h o s e p r e v i o u s l ya s s i g n e d . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 2 7 : 3 8 6 - 3 8 7 .2 8 . 0 r s k o v , I . , a n d F . 0 r s k o v . 1 9 8 4 . S e ro t y p i n g o f K l e b s i e l l a , p .1 43 - 1 64 . I n T . B e r g a n ( e d . ) , M e t h o d s i n m i c r o b i o l o g y , v o l . 1 4 .A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n .2 9 . O s b o r n , M. J . 1 9 6 3 . S t u d i e s o n t h e g r a m - n e g a t i v e c e l l w a l l . I .E v i d e n c e f o r t h e r o l e o f 2 - k e t o - 3 - d e o x y o c t o n a t e i n t h e l i p o p o l y -s a c c h a r i d e o f S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m . P r o c . N a t l . A c a d . S c i .US A 5 0 : 4 9 9 - 5 0 6 .3 0 . R o b b i n s , J . B . 1 9 7 9 . T h e c o n t r o l o f p o l y v a l e n t p n e u m o c o c c a lp o l y s a c c h a r i d e v a c c i n e s . J . I n f e c t . l ( S u p p l . 2 ) : 6 1 - 7 2 .3 1 . S e i d , R . C . , a n d J . C . S a d o f f . 1 9 8 1 . P r e p a r a t i o n a n d c h a r a c t e r -i z a t i o n o f d e t o x i f i e d l i p o p o l y s a c c h a r i d e - p r o t e i n c o n j u g a t e s . J .B i o l . C h e m . 2 5 6 : 7 3 0 5 - 7 3 1 0 .3 2 . W o n g , K . H . , 0 . B a r r e r a , A . S u t t o n , J . M a y , D . H . H o c h s t e i n ,J . D . R o b b i n s , J . B . R o b b i n s , P . D . P a r k m a n , a n d E . B .S e l i g m a n n , J r . 1 9 7 7 . S t a n d a r d i z a t i o n a n d c o n t r o l o f m e n i n g o -c o c c a l v a c c i n e s , g r o u p A a n d g r o u p C p o l y s a c c h a r i d e s . J . B i o l .S t a n d . 5 : 1 9 7 - 2 1 5 .3 3 . Y o u n g , L . S . 1 9 8 1 . N o s o c o m i a l i n f e c t i o n s i n t h e immunocom-p r o m i s e d a d u l t . Am . J . M e d . 7 0 : 3 9 8 - 4 0 4 .

I N F E C T . I M M U N .

purification and vaccine potential of klebsiella capsular

Documents