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Revista Iberoamericana de Polmeros Volumen 15 1), Enero de 2014

Colina et als. Obtencin de Quitina y Quitosano

Rev. Iberoam. Polim., 151),21-43 2014)21

EVALUACIN DE LOS PROCESOS PARA LA OBTENCIN QUMICA DEQUITINA Y QUITOSANO A PARTIR DE DESECHOS DE CANGEJOS.

ESCALA PILOTO E INDUSTRIAL

Marinela Colina1.2, Andrs Ayala2, Dianela Rincn1, Jos Molina1, Jairo Medina1, RubnYnciarte1, Jos Vargas1, Brinolfo Montilla2

1. Empresa Mixta Innovacin Ambiental Quitosano CA (INNOVAQUITO). Av 4 San Francisco No 2925Sector San Benito. Maracaibo. Venezuela. Correo electrnico:[email protected]. Laboratorio de Qumica Ambiental. Departamento de Qumica. Facultad Experimental de Ciencias.Universidad del Zulia. Maracaibo 4011. Venezuela

Recibido: Agosto 2013; Aceptado: Noviembre 2013

RESUMEN

En este trabajo, se evaluaron las condiciones de operacin de los procesos qumicos que se realizan parala obtencin de quitina y quitosano en un reactor piloto y se compar con un reactor industrial.. utilizando losexoesqueletos de cangrejo de la variedad de cangrejo azul (Callinectes sapidus). Se evalu el proceso dedesproteiniacin, desmineralzacin, decoloracin para la obtencin de quitina y luego las mejores condiciones

para la desacetilacin. Se obtuvo quitosano, con distintos grados de desacetilacin comprendidos entre 82,52hasta 95,01% calculados por espectrometra infrarroja de transformada de Fourier tomando en cuenta larelacin de bandas A1320/A1420. La quitina y el quitosano se elaboraron a partir de desechos de la industriacangrejera El proceso para la obtencin de quitosano se realiz siguiendo los cuatro pasos fundamentales, ladesproteinizacin del exoesqueleto con NaOH al 10%, para la desmineralizacin se utilizaron dos cidos (cidoclorhdrico y cido fosfrico) a diferentes concentraciones y variando el tiempo de reaccin para determinar quecido es ms apto para la remocin de los minerales, la decoloracin se realiz con etanol y comparado con otrosalcoholes, por ltimo la hidrlisis termoalcalina de los grupos acetamida de la quitina con NaOH al 30%. Losquitosanos obtenidos se caracterizaron mediante FTIR donde se observaron las bandas de los grupos funcionales

caractersticos de la molcula de quitosano, como es la banda del grupo amino a 1.621 y 1.650 cm1

del grupoacetamida. Adicionalmente, se midieron los parmetros de porcentaje de ceniza, humedad. Los resultadosmuestran que la deproteinizacin se debe hacer en menos de 2 horas, el cido clorhdrico y el cido fosfrico sonigualmente buenos en la desmineralizacin. Con un buen tratamiento se pueden obtener quitosanos con alta masamolar y alto grado de desacetilacin.

Palabras claves:Quitina, quitosano, reactor piloto, procesos de obtencin.

ABSTRACTIn this work, the operation conditions for the chemical processes to obtain chtin and chitosan were

evaluated in a pilot reactor and it was compared with an industrial one. The process of deproteinization,demineralization and decoloration were evaluated and the better conditions for the deacetylation. Chitosan withdegree of deacetylation berween 82.52 and 95.01 % were obtained calculated by Infrared FourierTransformed

Spectrometry, using which take in account the relations between the bands A1320/A1420. The chitosan obtentionwas performance using crab wastes from the industry with the exoskeleton of blue crab ( Callinectes sapidus).The main four steps for chitosan obtation were desproteinization with NaOH 10%, a desmineralization using twoacids (Hydrochloric acid and phosphoric acid) of two different concentrations with reaction time variations todetermine the more acceptable acid for the remotion of minerals, the decoloration was made with ethanol andcompared with other alcohol the last step by thermoalcaline hydrolysis of the chitin with 30% NaOH. Theobtained chitosan were characterized by FTIR where the bands of the functional groups characterics for chitosanwere observed, the amine group band at 1,621 and 1,650 cm1, the acetamide group (amide I). Additionally ashes

percentage and humidity were measured.Keywords:chitin, chitosan, pilot reactor, obtention process.

INTRODUCCIN

La quitina y su principal derivado el quitosano son considerados como polmeros bio

funcionales con amplia aplicacin en el rea de la biotecnolgica, ya que adems de ser recursos
mailto:[email protected]:[email protected]


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abundantes y renovables, tambin presentan diversas propiedades que incluyen: la

biodegradabilidad y biocompatibilidad [1].

Tanto la quitina como el quitosano son copolimeros lineales de residuos de Nglucosamina

(DGlcN) y NAcetil glucosamina (DGlcNAc) distribuidos al azar y unidos mediante un enlace

1,4 que produce una estructura rgida no ramificada (Figura 1).

Figura 1. Estructura primaria de la quitina y el quitosano.

La quitina se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza (hongos, algas, protozoos,

moluscos, artrpodos entre otros), sin embargo el exoesqueletos de artrpodos es la fuente ms

accesible, en especial los crustceos marinos como cangrejos y camarones ya que se encuentran

disponibles como desecho de la industria marisquera [2]. Los crustceos son la mayor fuente de

quitina a nivel industrial con una produccin de entre 2.200 Ton [3]. El contenido de quitina en

crustceos vara entre 212% del total de masa corporal, el contenido de quitina, protena, minerales

y carotenoides en el exoesqueleto de crustceos vara dependiendo de la especie, parte del

organismo, estado de nutricin y ciclo reproductivo. El exoesqueleto contiene alrededor del 15

40% de quitina (quitina), protenas alrededor del 20 al 40% y carbonato de calcio entre 2050%,

como componentes principales, y presenta en menor cantidad pigmentos y otras sales metlicas. La

protena proviene del tejido conectivo, el contenido de minerales est influenciado con la edad y

ciclo reproductivo del crustceo, las especies ms viejas presentan un exoesqueleto mucho mas

calcificado y baja cantidad de quitina y la cantidad de lpidos es generalmente debido a resido de

musculo o vsceras. En la Tabla 1 se muestran los porcentajes de protenas, cenizas, lpidos y

quitina presentes en algunas especies de crustceos estudiados.

El exoesqueleto de crustceos es una capa no celular secretada por la epidermis, el cual se

encuentra formando una organizacin jerrquica de varios niveles estructurales. En el nivel

molecular se encuentra la quitina, la cual mediante su alineamiento antiparalelo forma estructuras

altamente cristalinas, el siguiente nivel estructural es el arreglo entre las molculas que se

encuentran ligadas en la periferia a protenas globulares formando estrechas unidades llamadas


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nanofibrillas, el tipo de protenas presentes contiene aminocidos como la glicina, tirosina,

glicoprotenas conteniendo residuos histidilo y aspartilo, acido asprtico, serina y glicina [4].

Tabla 1 Composicin qumica proximal en porcentaje (v/v)% en base seca del exoesqueleto

de crustceos.

Las nanofibrillas de quitinaprotena se agrupan formando racimos, que a su vez forman capaz

planas horizontales y paralelas de fibrillas que cambian de direccin de un plano a otro en continua

rotacin, Este complejo forma una red o lmina que agrupa a la quitina y protenas con minerales que se

encuentran por lo general en forma de cristales de CaCO3y lpidos [5] (Figura 2). Dentro del complejo

quitinaprotenaminerales se encuentran distintos tipos de carotenoides como la lutena, caroteina,

astaxantina y derivados que se encuentran formando conjugados con las protenas, combinados con los

grupos amino de la quitina mediante enlaces carbonilamino [4].

Figura 2. Estructura microfibrilar del exoesqueleto de crustceos de acuerdo a [5].

El quitosano presenta una baja toxicidad, es inerte en el tracto intestinal de mamferos, es

biodegradable debido a la presencia de quitinasas distribuidas ampliamente en la naturaleza en

bacterias, hongos y plantas, as como en el sistema digestivo de diversos animales. La Tabla 2


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muestra las aplicaciones ms comunes del quitosano.

Obtencin de quitina y quitosano. Las tcnicas de extraccin encontradas en la literatura

son muy variadas, pues dependen en gran medida de las caractersticas de la fuente, la composicin

del material de partida vara notablemente de una especie a otra. La mayor parte de las tcnicas

desarrolladas descansan en procesos qumicos de hidrlisis de la protena y la remocin de la

materia inorgnica. Algunos incluyen un paso de decoloracin de la quitina extrada, mediante una

extraccin con solvente o la oxidacin de los pigmentos remanentes.

Tabla 2. Aplicaciones del quitosano de acuerdo al rea [3,6].

En general los procesos de obtencin de quitina se realizan mediante los siguientes pasosconsecutivos: acondicionamiento de la materia prima, extraccin de la protena (desproteinizacin),

eliminacin de las impurezas inorgnicas (desmineralizacin), y decoloracin de la quitina. La

quitina resultante es desacetilada, si por este tratamiento la quitina es desacetilada en ms de un

50% se produce el quitosano y cuando el grado de desacetilacin alcanza el 100% el polmero se

conoce como quitano Figura 2 [7].

Procesos para la obtencin de quitina y quitosano. A continuacin se brindar una breve

informacin sobre cada uno de estos procesos.


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Acondicionamiento de la materia prima. Consiste en el lavado con agua de los caparazones

a procesar y separacin de la masa que pueda quedar adherida a los mismos. Posteriormente se

procede a su molienda hasta el tamao de partculas adecuado para la extraccin, que generalmente

es de varios milmetros.

Figura 2. Proceso de obtencin de quitina, quitosano y quitano [7].

Deproteinizacin. El procedimiento ms comnmente utilizado para desproteinizar consiste

en tratar los caparazones de los crustceos con una solucin acuosa diluida de NaOH a temperatura

ms bien alta (65100C), con el fin de disolver la protena. El tiempo de tratamiento suele variar

entre 0,5 y 72 horas. En ocasiones se prefiere realizar dos tratamientos consecutivos por tiempos

cortos. Hay que tener en cuenta que tratamientos por largo tiempo o a temperaturas muy altas

pueden provocar ruptura de las cadenas y la desacetilacin parcial del polmero. Tambin se han

utilizado otros agentes para extraer la protena, entre los cuales se mencionan los siguientes:

Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, Ca(OH)2, Na2SO3, NaHSO3, Na3PO4y Na2S [8].

Los procesos de desproteinizacin usando extractos enzimticos o enzimas aisladas y

fermentaciones microbiolgicas se han probado con relativo xito, pero la alternativa del

tratamiento enzimtico/microbiolgico, adems de consumir largo tiempo, suele dejar de 17% de

protena residual [9].

Desmineralizacin. El principal componente inorgnico de los caparazones de los crustceoses el CaCO3, el cual se suele eliminar empleando soluciones diluidas de HCl (hasta 10%) a

temperatura ambiente, aunque tambin se han utilizado otros cidos (HNO3, HCOOH, HNO3,

H2SO4, y CH3COOH). La concentracin del cido y el tiempo de tratamiento dependen de la fuente,

pero deben evitarse los tratamientos a temperaturas ms altas, que provocan la degradacin del

polmero [8]. Un tratamiento alternativo para disminuir la degradacin consiste en el empleo del

agente acomplejante EDTA (cido etilendiaminotetractico) [10].

Decoloracin. La coloracin de los caparazones de crustceos se debe fundamentalmente a lapresencia de pigmentos tales como la astaxantina, la cantaxantina, el astaceno, la lutena y el


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caroteno. Los tratamientos anteriores generalmente no son capaces de eliminar estos pigmentos, los

que suelen extraerse a temperatura ambiente con acetona, cloroformo, ter, etanol, acetato de etilo o

mezcla de disolventes [9]. Tambin se han empleado agentes oxidantes tradicionales, como el H2O2

(0,53%) y el NaClO (0,32%), aunque debe tenerse presente que stos suelen atacar los grupos

aminos libres e introducir modificaciones en el polmero. En caparazones fuertemente coloreados,

como el de la langosta comn, se ha reportado la utilizacin exitosa de tratamientos con mezclas de

acetona y NaOCl a temperatura ambiente [11].

Obtencin de quitosano.La desacetilacin de la quitina se lleva a cabo por hidrlisis de los

grupos acetamida en medio fuertemente alcalino, a altas temperaturas. Generalmente la reaccin se

realiza en fase heterognea empleando soluciones concentradas de NaOH o KOH (3050%) a

temperaturas superiores a 100C, preferiblemente en atmsfera inerte o en presencia de sustancias

reductoras como el NaBH4o el Na2SO3 para evitar la despolimerizacin del polmero. Las

condiciones especficas de la reaccin dependern de diversos factores, tales como el material de

partida, el tratamiento previo, y el grado de desacetilacin deseado. No obstante, con un solo

tratamiento alcalino, el mximo grado de desacetilacin alcanzado no suele sobrepasar del 75 al

85%. Tratamientos prolongados suelen provocar la degradacin del polmero sin traducirse en un

aumento sensible del grado de desacetilacin [12, 13].

Al igual que la celulosa, la quitina es un polmero semicristalino, de manera que cuando la

desacetilacin se realiza en fase heterognea la reaccin tiene lugar fundamentalmente en las

regiones amorfas. La reaccin en condiciones homogneas permite una modificacin ms uniforme

del polmero, y se realiza sobre lcali quitina. La misma se obtiene sometiendo una suspensin

alcalina de quitina a tratamientos de congelacindescongelacin hasta producir una solucin

acuosa de quitina en hidrxido de sodio. La desacetilacin homognea se lleva a cabo a

concentraciones de lcali ms moderadas (alrededor del 30%), a 2540C por tiempos de 12 a 24

horas [14].

Se ha podido demostrar que mientras que las quitosanas obtenidas en el proceso heterogneopresentan polidispersidad en cuanto al grado de acetilacin de sus cadenas, las obtenidas por va

homognea tienen todas la misma composicin [15].

En este trabajo se hace una evaluacin de los diferentes parmetros para la obtencin qumica

de quitina y quitosano a partir de los desechos de cangrejo

PARTE EXPERIMENTAL

Materiales. Todos los reactivos empleados se utilizaron sin ningn mtodo de purificacinprevia. La desmineralizacin de la quitina se realiz con HClRiedel de Han), H3PO4Merck. Para
http://es.wikipedia.org/wiki/Sodiohttp://es.wikipedia.org/wiki/Sulfatohttp://es.wikipedia.org/wiki/Sulfatohttp://es.wikipedia.org/wiki/Sulfatohttp://es.wikipedia.org/wiki/Sulfatohttp://es.wikipedia.org/wiki/Sulfatohttp://es.wikipedia.org/wiki/Sodio


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la obtencin del quitosano se utiliz sulfito de sodio (Merck, G.A.) como agente antioxidante, las

reacciones de hidrlisis alcalina se llevaran a cabo con NaOH (98%, Riedel de Han), y las

reacciones de decoloracin se llevaron a cabo con etanol (99%, Fluka, Riedel de Han), se

solubilizo con cido actico (99,9%,Merck), se utilizaron patrones de quitina y quitosano de la casa

comercial SigmaAldrich. A escala industrial se utilizaron reactivos grado tcnico suministrados

porMasuca.

Equipos. Se utiliz un molino (Trapp TRF 400) para la molienda de los desechos, para medir

las masas de los desechos industriales de cangrejos y Hidrxido de Sodio durante la extraccin de la

quitina y obtencin del quitosano se uso una balanza digital (Premier) con sensibilidad 5 g, para

el resto del proceso se utilizo una balanza analtica (Kern 44033N) con sensibilidad 0,01 g, para

las reacciones de desproteinizacin, y desacetilacin se utilizo un reactor de capacidad de 8 kg de

diseo propio (fabricado por la empresa Acerinox) elaborado en acero inoxidable con camisa de

calentamiento, vlvula de seguridad y enfriamiento con agua. Se utiliz un agitador de fabricacin

propia. El reactor industrial fue diseado y fabricado por la empresa Innovacin Ambiental

Quitosano CA, Maracaibo, Venezuela. Para la caracterizacin fisicoqumica se utiliz un

Espectrmetro FTIR marca Shimadzu modelo FTIR 8300, viscosmetro capilar tipo Ubbelhode

ASTM D445, estufa (Oven SO030), y una mufla (Thermolynefb131511).

Procedimiento

Obtencin de la quitina y el quitosano. Para la obtencin de la quitina y el quitosano se

utilizaron exoesqueletos de cangrejo de la variedad (Callinectessapidus) provenientes delLago de

Maracaibo, fueron suministradas por la empresa PROMARCA, ubicado en el Municipio San

Francisco del Estado Zulia. Se recolectaron 8 kg de desechos al azar los cuales se molieron en un

molino (Trapp TRF 400), para posteriormente realizar la desproteinizacin colocando la muestra en

un reactor piloto de capacidad de 8 kg de diseo propio fabricado por la empresa Acerinox, en el

cual se trataron con una solucin de NaOH al 10% m/v en una proporcin 1:1 (m:v) y sulfito de

sodio al 1% como agente antioxidante para evitar la degradacin del material y se calent a 100110C durante 60 minutos, para disolver los restos de protenas. Luego de lavar repetidas veces con

abundante agua, se secaron los desechos a temperatura ambiente por 24 horas. Este procedimiento

se realiz en un reactor de 10,3 m3 de capacidad en los cuales se introdujeron 2.000 kg de desechos

molidos y se adicion NaOH al 10 % en una relacin 1:1 m/V. Se le determin humedad y cenizas a

los desproteinizados obtenidos en los dos reactores piloto e industrial. Luego se evalu la

efectividad del HCl y H3PO4 para la desmineralizacin de la quitina, utilizando diferentes

concentraciones de cido (1, 2, 3) molar con distintos tiempos de reaccin (30 minutos, 1, 2, 3 y 4h).


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Se evalu la mejor desmineralizacin variando la relacin slido/lquido 1/3, 1/5 y 1/7 a

temperatura ambiente, para evitar la degradacin del polmero. Se determin la cantidad de Ca que

pasa a solucin para evaluar la desmineralizacin La concentracin de Ca se evalu mediante

Espectrofotometra de absorcin atmica con un equipoPerkin Elmer3110. La quitina obtenida se

lavo con abundante agua, hasta un pH cercano a 7, para eliminar el cido en exceso. Luego se filtr

y lav con abundante agua para decolorarlo repetidamente con etanol al 99%. Posteriormente, se

desacetil sometindola a un tratamiento termo alcalino con una solucin al 30% de NaOH y sulfito

de sodio al 1% durante 6 horas a 110120C, con el fin de hidrolizar los grupos acetamida en el C2

de la quitina. Por ltimo, el quitosano se sec a temperatura ambiente por 48 horas.

Caracterizacin de la quitina y el quitosano

Espectroscopia de Infrarrojo con Transformada de Fourier (FTIR). Los espectros de

quitina se tomaron elaborando pastillas de KBr mezclando 2 mg de quitina con 148 mg de KBr

seco. Para el espectro de quitosano se prepararon pelculas del mismo disolviendo 250 mg de

quitosano en 50 mL de cido actico al 6% (v/v) formndose un gel transparente y viscoso, este gel

se coloco en moldes plsticos con un rea de 13 cm de dimetro y luego se secaron a temperatura

ambiente en ausencia de luz hasta la obtencin de la pelcula.

Las pastillas y pelculas fueron medidas con 50 escaneos a una resolucin de 4 cm1 en un

intevalo 4004.000 cm1. Los espectros obtenidos se compararon con un patrn comercial de la casa

SigmaAldrich. El grado de desacetilacin (GD) se determin utilizando las ecuaciones (1) y (2)

propuestas porBrugnerotto [16]:

A1320 / A1420 = 0,3822 + 0,03133GA (1)

GDA= 100GA (2)

Medidas viscosimtricas. Se realizaron en un viscosmetro capilar tipoUbbelhode

ASTMD445 a una temperatura de 25C, Las muestras de quitosano se prepararon por disolucin en una

mezcla compuesta de cido actico 0,1 M y cloruro de sodio 0,2 M. La concentracin inicial del

polmero fue 1,0103gmL1en todos los casos. Una vez establecidas las condiciones de trabajo se

procedi a determinar el tiempo de cada de la disolucin polimrica, para finalmente hallar la

viscosidad [17]

0

rel

(3)

1sp rel (4)


9/23




1/2

2 2lnsp rel

c

(5)

aVKM (6)

donde reles la viscosidad relativa, spla viscosidad especfica, [] la viscosidad intrnseca, K y

dos constantes empricas que dependen del sistema establecido de disolventepolmero a una

determinada temperatura.

Caracterizacin fsicoqumica del quitosano.

Determinacin de la humedad. El contenido de humedad se determino por el Mtodo Oficial

de Anlisis Qumico (AOAC) 930.15 [18].

Determinacin de cenizas. El contenido de cenizas se determin por el Mtodo Oficial de

Anlisis Qumico (AOAC) 924.05 [19]. Se basa en la prdida de peso de la materia fresca, despus

de la incineracin a 550C.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Molienda. El tamao de partcula tiene efecto en los procesos de desproteinizacin y

desmineralizacin. El tamao debe ser uniforme y no mayor de 0,5 cm. Tamao superiores a este, a

nivel industrial, afecta la eficiencia en stos procesos, requiriendo mayor cantidad de lcali o cido.

Tamaos de partculas muy pequeos menores a 1 mm van a producir quitosano en polvo que tiene

mejores propiedades de solubilidad. Sin embargo, se necesita mayor cantidad de quitosano para la

formacin de un gel concentrado con cido actico y de pelculas resistentes.

Desproteinizacin. El primer paso de obtencin de quitosano es la desproteinizacin de los

desechos de cangrejo, en este se trataron las conchas de cangrejo de la variedad

(CallinectesSapidus) con NaOH a altas temperaturas (aproximadamente 110115C) logrndose

desnaturalizar la protena presente, esto se debe a que el NaOH rompe los enlaces de hidrogeno que

mantienen unidas a las molculas de las protenas, esto hace que se separen y se dispersen en la

solucin, la adicin de un antioxidante como el Na2SO3evita la rupturas de la unin 14 glicosdica

de las cadenas polimricas de la quitina, lo cual producira la disminucin del peso molecular de la

misma.[20]

El efecto de de la concentracin de NaOH y el tiempo de reaccin ha sido estudiado

anteriormente por miembros de nuestro grupo de investigacin. Lpez [21] encontr que en un

tiempo entre 0,5 y 1,5 horas se genera la mayor eficiencia en la extraccin de protenas. De manera

similar a un tiempo constante al aumentar la concentracin de NaOH se produce una mayor

concentracin de protenas, sin embargo este aumento no es muy significativo comparado a la

cantidad de protenas totales obtenidas (vase la Tabla 3).


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Como se puede observar en las tabla para las tres concentraciones de NaOH hay un aumento

promedio con la concentracin de 8,5%, o sea lo que se aumenta en la recuperacin de las protenas

usando una concentracin de NaOH del 2,5 M durante 2,5 h de reaccin es en el mejor de los casos

un 8,5%.

Tabla 3. Extraccin de protenas del caparazn de cangrejo a diferentes concentraciones deNaOH y tiempos de reaccin [21].

Concentracin

de NaOHM

Tiempo de reaccin

h

Concentracin de protenas

g/mL

0,5 0,51,01,5

4.333 234.660 324.720 29

1,5 0,51,01,5

4.470 284.670 314.866 27

2,5 0,51,01,5

4.513 324.690 294.992 33

Esto industrialmente no es factible pues implica un costo del triple en NaOH y tambin de

energa por el tiempo de reaccin. A nivel de laboratorio se puede trabajar a estas concentraciones y

tiempo, pero a nivel industrial para una concentracin de 0,5 M y un tiempo de reaccin de 0,5

horas ya se han recuperado un 92% de las protenas que contiene el caparazn lo cual es aceptable y

ms econmico.

Estas protenas se pueden recuperar, lavar y secar para su comercializacin. Para esto nuestro

grupo ha experimentado con cidos como el HCl, CH3COOH y cido ctrico, teniendo buenos

resultados con ste ltimo.

Tambin se ha encontrado que para tiempos de reaccin de 2 horas esta extraccin tiene su

mximo [21]. A tiempos de reaccin mayores, las protenas extradas pueden estarse hidrolizando,

dificultando su determinacin por el mtodo deLowry. Adems conviene destacar que las protenas

tienen mayor potencial de utilizacin que pptidos y aminocidos. Para el caso que se quiera

obtener su recuperacin industrial conviene no utilizar tiempos mayores a 2 hoas.

A escala industrial se elabor quitosano con un proceso de desproteinizacin de 3 horas. El

quitosano obtenido present un peso molecular inferior a 110.000 gmol1. Estos tiempos altos de

desproteinizacin probablemente tambin degraden el quitosano.

Desmineralizacin. En la desmineralizacin se remueven sales de carbonato de calcio(CaCO3) y fosfato de calcio (Ca3(PO4)2) y otros minerales presentes en el exoesqueleto .


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En este proceso, diversos investigadores han realizado la desmineralizacin con diferentes

tipos de cidos fuertes como (HCl, HNO3, H2SO4) o dbiles (CH3COOH, HCOOH) [22, 23]. No se

encontr literatura sobre la utilizacin del cido fosfrico, por este motivo, en esta investigacin se

realiz la desmineralizacin con el cido dbil (H3PO4), l cual podra ser una fuente importante en

la produccin masiva de quitina a escala industrial debido a que es un cido ms econmico que el

cido clorhdrico y de fcil adquisicin ya que presenta menor control por parte de los organismos

de reguladores de sustancias qumicas. Tambin se ha utilizado el cido fuerte (HCl) utilizado

frecuentemente por la mayora de los investigadores de quitina, por presentar excelentes resultados

en la eliminacin completa de sales inorgnicas.

Lpez[21] encontr que los iones ms abundantes en los caparazones de cangrejos son el Ca

y el Mg (Tabla 4). Esta encontr una correlacin entre la concentracin de cido clorhdrico y la

eficiencia de la extraccin de los minerales siendo R = 0,97 para el Ca y R = 0,98 para el Mg. En la

Tabla 4 se presentan estos resultados de la extraccin de minerales utilizando HCl a diferentes

concentraciones y distintos tiempos de reaccin.

En la Tabla 4 puede observarse que a medida que el tiempo de reaccin se incrementa

ligeramente la concentracin de los minerales aproximadamente un 2%. Esto a nivel industrial no es

significativo por lo que el tiempo de 1 hora es suficiente para la desmineralizacin. Con respecto a

la concentracin de HCl se observa que se incrementa la extraccin en casi un 100% al pasar de 1

M a 2 M. Para el caso del HCl una concentracin de 2 M y un tiempo de 2 horas es suficiente para

una buena extraccin.

Tabla 4. Extraccin de minerales del caparazn de cangrejo a diferentes concentraciones deHCl y tiempos de reaccin [21].

Concentracin

HCl (M)

Tiempo

h

Ca

mg/kg

Mg

mg/kg

Na

mg/kg

Sr

mg/kg

K

mg/kg

1 1

2

95.750

98.500

3.513,5

3.659,0

1.244,0

1.248,0

668,0

656,5

25,0

25,8

2 12

150.250153.600

3.854,53.881,0

1.747,01.704,5

962,0972,5

55,056,0

Para el caso del H3PO4en la Figura 3 se observa la variacin de la concentracin de Ca en

solucin extrado del desproteinizado de cangrejo con cido fosfrico a diferentes concentraciones

de cido y a distintos tiempos de reaccin. Se puede observar que a los 30 minutos ya se obtiene

una buena extraccin para concentraciones de cido entre 3 y 4 M, a partir de all comienza a

disminuir la concentracin de calcio. Industrialmente a una concentracin 3 M y 30 minutos se

puede obtener una buena extraccin.


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Figura 3. Extraccin de calcio del desproteinizado de cangrejo utilizando cidofosfrico a diferentes concentraciones y distintos tiempos de reaccin.

En la Figura 4 se observa como vara la concentracin de calcio en la solucin

desmineralizada cuando se cambia la relacin slido/lquido (cantidad desproteinizado/volumen

cido fosfrico). Para una relacin 1/5 (0,2) ya se obtiene una buena extraccin de calcio. Para

relaciones mayores 1/7 ya se hace constante la cantidad de Ca extrada.

Figura 4: Efecto de la relacin slido/lquido en la desmineralizacin de quitinacon cido fosfrico.

Decoloracin. La etapa de decoloracin fue optimizada por un miembro del grupo de

investigacin [24] obteniendo los siguientes resultados en trminos de rendimiento de extraccin y

absorbancias de los extractos lquidos aislados durante la decoloracin de los caparazones de

cangrejos. La Figura 5 muestra el rendimiento obtenido dependiendo del disolvente utilizado.


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Figura 5. Distintos alcoholes utilizados en la decoloracin del disolvente.

Como se aprecia en la Figura 5, los mayores rendimientos de extraccin se obtuvieron

cuando se emplearon butanol e ibutanol como disolventes. Esto es congruente con lo esperado s

se considera que tienen mayor longitud de cadena que el resto de los disolventes y, por tanto, una

mayor afinidad hacia los pigmentos. Por otro lado, en trminos de absorbancia no se encontraron

diferencias significativas a una longitud de onda de 468 nm (correspondiente a la absorcin de la

astaxantina). En vista de que el material slido obtenido luego de la decoloracin con ibutanol se

caracteriz por la ausencia de color, este fue seleccionado como agente extractante.Una vez seleccionado el disolvente a emplear, se estudi el efecto de la relacin

slido/lquido, tiempo de agitacin, nmero de extracciones y temperatura en la extraccin de los

pigmentos. En la Figura 6, se exponen los resultados obtenidos en trminos de rendimiento de

extraccin a las diferentes relaciones slido/lquido empleadas.

Figura 6. Efecto de la relacin slido/lquido en la extraccin de pigmentos.


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Como se observa, el mayor rendimiento de extraccin se obtuvo cuando se emple la

relacin 0,1333 (20 g/150 mL). Conforme a lo esperado, cuando se emplea menor volumen del

agente extractante para la misma cantidad de muestra, menor es la eficiencia de extraccin.

En cuanto a la influencia del tiempo en el rendimiento de extraccin de los pigmentos se

obtuvo lo siguiente: De los resultados obtenidos se desprende que existe una correlacin entre el

tiempo de agitacin y la eficiencia de la extraccin, siendo el valor de R igual a 0,9975. No

obstante, debido a que el incremento en el tiempo de agitacin no es directamente proporcional al

incremento del rendimiento de extraccin, se seleccion 1 hora como tiempo de agitacin ptimo.

Adems, conviene mencionar que existe la posibilidad de que a tiempos de agitacin superiores a 6

horas podran estarse solubilizndose otros componentes presentes en los caparazones. La Figura 8

muestra los resultados obtenidos en las experiencias de extracciones sucesivas de 1 hora.

Figura 7. Influencia del tiempo de agitacin en la extraccin de los pigmentos.

Figura 8.Efecto del nmero de extracciones en la remocin de los pigmentos.

En virtud de lo anterior puede decirse que no hay diferencia significativa entre los

rendimientos de extraccin obtenidos. El incrementar el nmero de extracciones sucesivas no

afecta, aparentemente, la eficiencia de la extraccin de los pigmentos. Esto sugiere que se requieren


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de tiempos de agitacin superiores para que se produzca una mayor remocin de pigmentos.

En el presente trabajo, industrialmente se utiliz etanol como agente decolorante en el cual se

eliminaron los pigmentos como: astaceno, astaxantinas, cantaxantinas, lutena y caroteno

encontrados en los exoesqueletos de los crustceos. El etanol es comercialmente ms econmico y

de ms fcil disponibilidad en el pas

Caracterizacin de la quitina por espectroscopia infrarroja con Transformada de

Fourier. En la Figura 9 se muestra los espectros infrarrojos de las quitinas obtenidas con los

diferentes cidos, en este pueden distinguirse las seales tpicas del infrarrojo de la quitina, como es

la seal de vibracinOH a 3.6003.500 cm1, se observan las bandas de la amida I y II a 1.650 y

1.550 cm1 correspondientes a la quitina, tambin se observan bandas correspondientes a los

pigmentos presentes en la muestra, los cuales presentan grupos funcionales C = C en 1.650 cm1

adems de los alargamientos de la banda en 2.923 cm1. Las bandas comprendidas entre 898 y

1.156 cm 1 representan las estructuras de polisacridos [1418]. En la misma figura se muestra el

espectro de quitina comercial SigmaAldrich, donde se aprecia los mismos grupos funcionales de

las quitinas obtenidas, lo que confirma que el producto obtenido luego de la desproteinizacin y

desmineralizacin es quitina.

Figura 9. Espectros FTIR de quitina: Comercial SigmaAldrich, desmineralizada con cidoclorhdrico y fosfrico.

Desacetilacin de la quitina. La reaccin de Ndesacetilacin de la quitina con el hidrxido

de sodio, ocurre con una hidrlisis en la que el in hidrxido, fuertemente nuclefilo, atac


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inicialmente a los grupos acetamida presentes en el C(2) mediante un mecanismo de adicin

eliminacin nuclefila, para generar el quitosano [25] (Figura 10a y 10b).

Figura 10. Mecanismo de reaccin de la desacetilacin de la quitina para obtener quitosano. a) Reaccingeneralizada, y b) Detalle del mecanismo de reaccin.

La desacetilacin se realiz con un tratamiento trmico a altas temperaturas, debido a la

combinacin de tres factores: 1) la baja reactividad debida a la configuracin trans de los

sustituyentes acetamida con respecto al grupo OH unido al tomo de C3 del anillo piransico de la

unidad monomrica [26], la presencia de puentes de hidrgeno entre los grupos hidroxilo y

carbonilo y amida de cadenas adyacentes; y 3) el denso empaquetamiento de las cadenas en el

enrejado cristalino de la quitina, que previene el acceso del lcali a los sitios reactivos.La presencia de oxgeno durante la desacetilacin influye en la degradacin del polisacrido y

da como resultado una disminucin en la viscosidad y el peso molecular de los productos, por tal

motivo se planteo la adicin de un antioxidante como el Na2SO3 el cual evita que el NaOH

reaccione con los grupos hemiacetlicos, formados durante la desmineralizacin oxidndolos y

formando grupos carboxilos.

Caracterizacin fsicoqumica del quitosano. En la Tabla 5 se presentan los resultados

obtenidos en el anlisis fsicoqumico de los quitosanos obtenidos de las quitinas desmineralizadascon los cidos clorhdrico y fosfrico. El contenido de humedad de las muestras de quitosano

obtenidos de las quitinas desmineralizadas por el cido clorhdrico y fosfrico presentaron

diferencias significativas (p 0,05).

El contenido de cenizas es un indicador de la efectividad del proceso de desmineralizacin

debido a la eliminacin de los minerales presentes conformado entre el 3055% constituido

principalmente por carbonato de calcio (CaCO3) y fosfato de calcio, (CaPO4)2, en menor proporcin

[27].


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Tabla 5. Contenido de ceniza y humedad de los quitosanosobtenidos de la desacetilacin de las muestras de quitinadesmineralizadas con los cidos clorhdrico y cido fosfrico a lasdistintas condiciones de reaccin.

Concentracin

M

Tiempo

min

cido clor hdrico cido fosfr ico

Humedad Ceniz Humeda Ceniz

1

30 13,16 4,48 1,33 61,00

40 7,48 4,46 1,80 59,00

50 7,50 4,00 2,33 53,50

2

30 7,53 2,48 3,32 32,00

40 7,23 2,09 9,00 26,00

50 8,44 1,99 5,33 25,00

3

30 7,46 1,98 6,20 12,50

40 6,82 1,97 7,00 7,00

50 8,31 1,97 7,62 5,50

En la Tabla 6 Se observa diferencias significativas (p 0,05), en la desmineralizacin

realizada con el cido fosfrico durante las concentraciones de 1 y 2 M a los tiempos de reaccin no

hubo variacin considerable en el contenido de cenizas, a una concentracin de 3 M se evidencia

una mayor remocin de minerales en los distintos tiempos de reaccin estudiados presentando

diferencias significativas entre ellos a (p 0,05), obtenindose un contenido de cenizas de 5,50%

para 50 minutos de reaccin. En cambio, la desmineralizacin con cido clorhdrico disminuyo

considerablemente el contenido de cenizas no habiendo diferencia significativa entre ellos a (p

0,05). Se puede observar que el tratamiento realizado con el cido clorhdrico a 2 M y a un tiempo

de reaccin de 50 minutos, presenta un contenido de cenizas de 1,99%, el cual est dentro del

intervalo aceptado para este tipo de productos (< 2%) grado alimenticio especificado por varias

casas fabricantes. Este tratamiento se considera como el ms efectivo para la remocin de los

minerales presentes en el exoesqueleto aunque no exista diferencias significativas a (p 0,05) entre

este tratamiento y los de 3 M en los distintos tiempos de reaccin estudiados, ya que el tratamiento

de desmineralizacin se debe evitar concentraciones altas de cido por la posibilidad de

degradacin de la quitina por ruptura de las uniones 14 glicosdicas, esto ocurre al protonarse la

unin etrica 14, provocando que el grupo acetal en C(1), se repliegue formando un hemiacetal lo

cual divide la molcula polimrica, esto no permite que el proceso de desmineralizacin se realice avalores de pH menores de 3, por lo que esta concentracin de cido no es adecuada para la


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desmineralizacin.

Caracterizacin del quitosano por espectroscopia infrarroja con Transformada de

Fourier. En la Figura 11 se pueden observar los espectro FTIR de los quitosanos obtenidos por

medio de la desacetilacin parcial de las quitinas desmineralizadas con acido clorhdrico y acido

fosfrico. Se pueden observar las bandas de los grupos funcionales caractersticos de la molcula de

quitosano, evidencindose la aparicin de la banda del grupo amino a 1.621 cm1y se observa una

mejor definicin de las bandas de los grupos OH a 3.447 cm1 y NH a 3.258 cm1, respecto al

espectro de la quitina, debido al proceso de desacetilacin a 2.924 cm1, se evidencia el estiramiento

CH, a 1.655 cm1aparece la tensin por vibracin del C = O, a 1.571 cm1se ve la frecuencia de

torsinNH2, a 1.423 cm1la torsinCH2, a 1.318 cm

1la tensin CN, el estiramiento simtrico

CO aparece a 1.076 cm1, y el estiramiento COC glucosdico se ve a las frecuencias 895, 709 y

556 cm1. Ntese como las seales correspondientes al COC, CH y OH, se mantienen presentes

durante todas las etapas, mientras que las bandas correspondientes al grupo NH de la amina se

definen mejor conforme la muestra se somete a cada proceso qumico [14,15]. En lo que respecta a

las bandas encontradas para ambas muestras, resultaron acordes a las caractersticas del quitosano

comercial (SigmaAldrich) y se corresponde con lo planteado porHidalgo et al. [28,29].

Figura 11. Espectro FTIR de quitosano comercial (SigmaAldrich) y de los obtenidos de lasquitinas desmineralizadas con cido clorhdrico y fosfrico.

El anlisis mediante IR mostr la similitud en los espectros para cada una de las muestras,


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confirmando con estos resultados que la utilizacin de diferentes quitinas obtenidas por la

desmineralizacin con HCl y H3PO4 no afect la identidad del producto, pues se mantienen las

bandas de los grupos funcionales ms importantes, demostrndose as que las quitinas se

transformaron en una nueva materia prima importante como el quitosano.

Grado de desacetilacin. Los grados de desacetilacin calculados considerando la

absorbencia de dos bandas patrn de (1.420/1.620) para las muestras de quitosanos obtenidos se

muestran en la Tabla 6.

El grado de desacetilacin se determin mediante espectrometra infrarroja de transformada

de Fourier, utilizando la ecuacin propuesta por Brugnerotto y col. [16], para las muestras de

quitosanos obtenidos se muestran en la Tabla 6.

Se observa que los dos factores estudiados tienen una influencia significativa sobre el grado

de desacetilacin del quitosano. Los quitosanos obtenidos de la Ndesacetilacin de las quitinas

desmineralizadas con el cido clorhdrico presentaron grados de desacetilacin comprendidos

(82,5289,82%), presentando un grado de desacetilacin menor que los obtenidos por la N

desacetilacin de las quitinas desmineralizadas con el cido fosfrico (91,0995,01%). Por otro

lado, el quitosano obtenido por la Ndesacetilacin de las quitinas desmineralizadas con el cido

fosfrico presentan mayor intensidad en la banda a 2.870 cm1, correspondiente al estrechamiento

CH del anillo de glucosa; esta banda es sensible a variaciones en el grado de desacetilacin, un

incremento en la intensidad de la misma est directamente relacionado con un incremento en el

grado de desacetilacin. De manera similar la banda a 3.291 cm1es ms intensa correspondiente al

estrechamiento NH, sensible al grado de desacetilacin [30].

Tabla 6. Grado de desacetilacin y peso molecular viscosimtricode los quitosanos obtenidos.

Concentracin

(M)

Tiempo

(min)

cido clorhidr ico cido fosfor ico

GD

%

Mv103

gmol1 GD,

%

Mv103

gmol1

130 82,52 717 91,09 10940 82,75 677 91,56 251

50 83,26 596 91,69 309

2

30 84,38 586 93,71 324

40 88,20 568 93,80 33350 89,34 554 94,01 356

330 89,66 401 94,36 506

40 89,82 350 94,71 515

50 89,80 3324 95,01 522GD: Grado de desacetilacin obtenido por espectroscopia de FTIR con las ecuaciones(1) y (2).


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Peso molecular. En la Tabla 6 se muestran los pesos moleculares obtenidos por la tcnica de

viscosimetra capilar mediante la ecuacin de MarkHouwinkSakurada [17]. Los quitosanos

obtenidos de la Ndesacetilacin de las distintas quitinas desmineralizadas con los dos cidos

presentaron diferencias significativas a (p 0,05). Los quitosanos obtenidos por la Ndesacetilacin

de las quitinas desmineralizadas con el cido clorhdrico disminuyen gradualmente sin presentar un

patrn de disminucin aparente, esto se debe por el aumento de las concentraciones del cido

utilizado, discutido anteriormente.

En la misma tabla se observa que los quitosanos desmineralizados con el cido fosfrico

contienen un mayor porcentaje de material inorgnico residual comparado con el quitosano

obtenido de la Ndesacetilacin de las quitinas desmineralizadas con el cido clorhdrico, lo que

puede explicar el comportamiento creciente sin patrn aparente del peso molecular, ya que lascenizas residuales, especficamente el calcio, puede afectar la solubilidad, e influir en la viscosidad

del mismo, y por ende, en el peso molecular calculado [31]. La Tabla 7 muestra los resultados de

porcentaje de cenizas, humedad, grado de desacetilacin y masa molecular para quitosanos

comerciales y los quitosanos obtenidos en este trabajo.

Tabla 7. Caractersticas de los quitosanos obtenidos experimentalmente y comerciales.

Muestra Ceni zas % Humedad%

GD % MV 103

gmol

1

Con HCl 1,99 0,02 8,4 0,9 89,34 553,88Con H3PO4 5,50 0,20 7,6 0,5 95,01 522,10

Pronova Biopolymergrado industrial 2,50 13,10 85,00 Qingdao Develop Chemistrygradoagricultura

2,0 10,00 85,00

SigmaAldrich HMW 0,48 11,69 79,00 140220SigmaAldrich MMW 0,61 13,67 81,40 110150

Se aprecia que el valor de cenizas obtenido experimentalmente es superior respecto a lasmuestras comerciales, este resultado depende en gran medida, del origen, propiedades y

condiciones en la obtencin del quitosano. Tomando en consideracin la presencia de materiales

inorgnicos en las muestras de quitosanos, con respecto a las de referencia, pueden justificar estos

resultados.

El contenido de humedad obtenido es menor que el reportado (Tabla 7). La prdida de agua

en la muestra es debida a procesos fsicos y qumicos durante la etapa de obtencin del quitosano.

Durante la trituracin, la eliminacin del contenido de agua de hidratos es resultado del

calentamiento localizado por friccin. Tambin se considera la eliminacin de grupos acetilo como

resultado de la desacetilacin termoalcalina de la quitina que genera grupos amino libres en la


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cadena polimrica y es un sitio sensible a la formacin de enlaces de hidrgeno con el oxgeno de

radicales libres OH y dado que el grado de desacetilacin de los quitosanos obtenidos de la quitina

desmineralizada con el cido clorhdrico y cido fosfrico fueron de 89,34 y 95,01%

respectivamente, la posibilidad de formacin de molculas de agua disminuye debido a una menor

presencia de grupos amino.

Se obtuvieron masas moleculares superiores a las muestras comerciales (Tabla 7). Esto se

deba probablemente al tratamiento utilizado para la desacetilacin de la quitina, tratamientos muy

extremos pueden romper las cadenas del polmero y disminuir su masa molecular, por otro lado,

segn la especie de crustceo utilizada se puede obtener distintas variedades de quitina, las altas

masas moleculares encontradas evidenciaron que tanto las condiciones de aislamiento y

purificacin de quitina como las de obtencin de quitosano preservaron una estructura del

polisacrido original [32,33].

Los quitosanos obtenidos a partir de la desacetilacin de la quitinas deproteinizadas en el

reactor industrial (2.000 kg) por tres horas presentaron masas moleculares de 68.000 gmol1para

los desmineralizados con cido fosfrico (3M) y 110.000 gmol1para los desmineralizados con

cido clorhdrico (2M). Este resultado nos indica que el un tiempo mayor de 2 horas en la

desproteinizacin degrada la molcula y presentan pesos moleculares menores. Adems con el

cido fosfrico se obtienen molculas de ms baja masa molecular. Sin embargo, si se utiliza cido

clorhdrico ms concentrado (3 M) esta relacin cambia y baja apreciablemente la masa molecular.

CONCLUSIONES

Se logr obtener quitosano de exoesqueletos de cangrejo de la variedad Callinectes sapidus,

con un rendimiento promedio del 11,29%, segn las condiciones de reaccin empleadas.

Se caracterizaron las quitinas y quitosanos mediante la espectrometra de infrarrojo con

transformada de Fourier (FTIR). La caracterizacin de quitina y quitosano por el mtodo de

espectroscopia infrarrojo se basa principalmente en la comparacin de los espectros relacionadoscon la presencia o ausencia del grupo carbonilo y el radical acetilo. La quitina presenta un espectro

con las bandas de absorcin correspondiente al enlace COC, enlace C=O y grupo funcional

amida, mientras que en los espectros del quitosano se hace evidente la aparicin de la banda del

grupo amino a 1.650 cm1y se observa una mejor definicin en las bandas de los grupos OH, NH

y COC debido al proceso de desacetilacin al que fue sometida la quitina. Comprobando que el

quitosano obtenido presenta las bandas de los grupos funcionales caractersticos de esta molcula.

El grado de desacetilacin se determin por espectrometra infrarroja de transformada deFourier, utilizando la ecuacin propuesta por Brugnerotto y col. [16] mediante la relacin de las


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bandas de A1320/A1420, en donde los valores obtenidos se encuentran en el intevalo entre 82,52

89,80% para los quitosano obtenidos por la desacetilacin de las quitinas obtenidas por la

desmineralizacin del cido clorhdrico y para los del cido fosfrico de 91,0995,01%, es decir,

con un alto grado de desacetilacin.

Los resultados indican que la desmineralizacin con cido clorhdrico 2 molar por un tiempo

de reaccin de 50 minutos es el tratamiento ms adecuado para la desmineralizacin, ya que

disminuye considerablemente el contenido de cenizas en el quitosano obtenido. Sin embargo, en

trminos de grado de desacetilacin y peso molecular, los quitosanos elaborados con cidos

fosfricos presentaron mayor grado de desacetilacin y los pesos moleculares fueron parecidos a los

que se encontraron con HCl. Los porcentajes de cenizas y humedad demuestran que la pureza del

quitosano obtenido es aceptable, para aplicaciones alimenticias.

Agradecimientos. Parte de este trabajo fue financiado por el Fondo Nacional de Ciencia,Tecnologa e Innovacin, FONACIT (Venezuela)a travs del Proyecto PEI 2011 1382.

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