r1505 chloramphenicol 06-05-02 nueva versión

RIDASCREEN® Chloramphenicol Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von

Chloramphenicol

Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of chloramphenicol

Art. No.: R1505

In vitro Test Lagerung bei 2 - 8 °C Storage at 2 - 8 °C

R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) 61 51 81 02-0 / Telefax: +49 (0) 61 51 81 02-20

2 RIDASCREEN® Chloramphenicol 06-05-02

Anschrift:

R-Biopharm AG Landwehrstr. 54 D-64293 Darmstadt www.r-biopharm.de

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RIDA® und RIDASCREEN® sind eingetragene Warenzeichen der R-Biopharm AG Hersteller: R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland

R-Biopharm AG ist ISO 9001 zertifiziert.

RIDA® and RIDASCREEN® are registered trademarks of R-Biopharm AG Manufacturer: R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany R-Biopharm AG is ISO 9001 certified.

RIDASCREEN® Chloramphenicol 06-05-02 3

Kurzinformation

Der RIDASCREEN® Chloramphenicol-Test (Art. Nr.: R1505) ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Chloramphenicol in Milch, Milchpulver, Honig, Shrimps, Fleisch, Fischmehl und Eiern. Alle Reagenzien für die Durchführung des Enzymimmunoassays - inkl. Stan-dards - sind im Testkit enthalten. Ein Testkit ist ausreichend für 96 Bestimmungen (einschl. Standardbestim-mungen). Zur Auswertung benötigt man ein Mikrotiterplatten-Photometer. Probenvorbereitung: homogenisieren, extrahieren, zentrifugieren und zur

Trockene einengen (Milch: auch direkter Einsatz im Test möglich) Zeitbedarf: Probenvorbereitung (für 10 Proben) Je nach Probenmatrix ............................... 1,5 bis 2 h Testdurchführung (Inkubationszeit)....................1,5 h Nachweisgrenze: Milch...................................................................5 ppt Milch (direkter Einsatz im Test)........................25 ppt Milchpulver ......................................................25 ppt Honig................................................................25 ppt Shrimps, Fleisch, Fischmehl .........................6,25 ppt Eier...................................................................25 ppt Wiederfindungsrate: Milch / Milchpulver ........................................ > 80 % Honig.............................................................. > 80 % Shrimps, Fleisch, Fischmehl .......................... > 80 % Eier................................................................. > 80 % Spezifität: Die Spezifität des RIDASCREEN® Chloramphenicol-

Tests wurde durch Bestimmung der Kreuzreaktivität zu entsprechenden Antibiotika ermittelt.

Chloramphenicol ............................................. 100 % Chloramphenicol-Base...................................... 12 % Thiamphenicol............................................... < 0,1 %


1. Verwendungszweck

Der RIDASCREEN® Chloramphenicol-Test ist ein kompetitiver Enzymimmuno-assay zur quantitativen Bestimmung von Chloramphenicol-Rückständen in Milch, Milchpulver, Honig, Shrimps, Fleisch, Fischmehl und Eiern. Im September 1998 wurde ein Suchverfahren auf das Vorhandensein von Chloramphenicol-Rückständen in Milch nach §35 LMBG (01.00 68) zuge-lassen. Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein Screeningverfahren im Mikrotiterplattensystem (ELISA).

2. Allgemeines

Chloramphenicol ist ein Breitbandantibiotikum, das wegen seiner hervorragenden antibakteriellen und pharmakokinetischen Eigenschaften in der Tierproduktion häufig eingesetzt wird. Beim Menschen können allerdings hämatotoxische Ne-benwirkungen hervorgerufen werden, vor allem die Chloramphenicol-induzierte aplastische Anämie, für die bisher keine Dosis-Wirkungsbeziehung abgeleitet werden konnte. Dies führte zu einem generellen Verbot, Chloramphenicol zur Behandlung von Nutztieren einzusetzen.

3. Testprinzip

Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Vertiefungen der Mikrotiter-streifen sind mit anti-Chloramphenicol-Antikörpern beschichtet. Zugegeben werden Standards bzw. Probelösung und enzymmarkiertes Chloramphenicol (Enzymkonjugat). Freies und enzymmarkiertes Chloramphenicol konkurrieren um die Chloramphenicol-Antikörperbindungsstellen (kompetitiver Enzymimmuno-assay). Nicht gebundenes, enzymmarkiertes Chloramphenicol wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Der Nachweis erfolgt durch Zugabe von Substrat-/Chromogenlösung. Gebun-denes Enzymkonjugat wandelt das Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe des Stopp-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm; die Extinktion der Lösung ist umgekehrt proportional zur Chloramphenicol-Konzentration in der Probe.


4. Packungsinhalt

Mit den Reagenzien einer Packung können 96 Bestimmungen durchgeführt werden (einschließlich Standardbestimmungen). Jeder Testkit enthält: 1 x Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten (12 Streifen à 8 Einzelkavitäten) beschichtet mit Antikörpern gegen Chloramphenicol 6 x Standardlösungen, je 1,3 ml

0 ppt (Nullstandard), 25 ppt, 50 ppt, 100 ppt, 250 ppt, 750 ppt Chloramphenicol in wässriger Lösung, gebrauchsfertig

1 x Konjugat (0,7 ml) ...................................................................roter Verschluss Peroxidase-konjugiertes Chloramphenicol Konzentrat

1 x Substrat-/Chromogenlösung (10 ml) ................................brauner Verschluss rötlich gefärbt 1 x Stopp-Reagenz (14 ml) ...................................................... gelber Verschluss enthält 1 N Schwefelsäure 1 x Puffer (100 ml) Konjugat- und Probenverdünnungspuffer 1 x Waschpuffer (Salz) zur Herstellung eines 10 mM Phosphatpuffers (pH 7,4) enhält 0,05 % Tween 20

5. Zusätzlich benötigte Reagenzien – erforderliches Zubehör

5.1. Geräte:

− Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm) − Zentrifuge − Schüttler − Vortex − Mixer (Stomacher, Ultraturrax) − Evaporator − Messpipetten − Variable 20 µl - 200 µl- und 200 - 1000 µl-Mikropipetten

5.2. Reagenzien:

− Ethylacetat − n-Hexan


für Milch (Extraktion mit Ethylacetat): − Carrez I: 0,36 M Kaliumhexacyanoferrat (II) x 3 H2O − Carrez II: 1,04 M Zinksulfat x 7 H2O

6. Vorsichtsmaßnahmen

Die Standards enthalten Chloramphenicol. Vorsicht ist geboten.

Das Stopp-Reagenz enthält 1 N Schwefelsäure (R36/38, S2-26).

7. Reagenzien und ihre Lagerung

Die Reagenzien bei 2 - 8 °C lagern. Komponenten des Testkits auf keinen Fall einfrieren.

Nicht benötigte Kavitäten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2 - 8 °C lagern.

Die Substrat-/Chromogenlösung ist lichtempfindlich, deshalb direkte Lichteinwir-kung vermeiden.

Nach Ablauf des Verfallsdatums (siehe Testkit-Außenetikett unter Expiration) kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden.

Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennum-mern ist nicht zulässig.

8. Anzeichen für Reagenzienverfall

− Bläuliche Färbung der rötlich gefärbten Substrat-/Chromogenlösung vor Zugabe in die Kavitäten

− Extinktion kleiner 0,6 (E450 nm < 0,6) für den Nullstandard


9. Probenvorbereitung

Die Proben kühl und lichtgeschützt lagern.

9.1. Milch (direkter Einsatz im Test)

− Milchproben bis zur Homogenität kurz vortexen − 50 µl Milch pro Kavität im Test einsetzen

Verdünnungsfaktor: ............................... 1 Nachweisgrenze: ................................... 25 ng/kg (ppt) Bestimmungsgrenze:............................. 25 ng/kg (ppt)

9.2. Milch (Extraktion mit Ethylacetat)

− 10 ml Milch in ein Zentrifugenröhrchen überführen − 500 µl Carrez I (siehe 5.2.) hinzugeben und kräftig mischen − 500 µl Carrez II (siehe 5.2.) hinzugeben − kräftig mischen (Vortex) und zentrifugieren: 10 min / 3000 g / 4 - 12 °C

(ist keine Kühlzentrifuge vorhanden, sollten die Proben auf ca. 8 °C vorgekühlt werden)

− von dem Überstand 4,4 ml (entspricht 4 ml Milch) in ein neues Röhrchen überführen

− 8 ml Ethylacetat hinzufügen und unter Schütteln 10 min extrahieren − zur Phasentrennung zentrifugieren: 10 min / 3000 g / Raumtemperatur

(20 - 25 °C) − 4 ml Ethylacetat-Überstand (entspricht 2 ml Milch) in ein neues Röhrchen

überführen und unter Stickstoff bei ca. 60 °C bis zur Trockene einengen − den trockenen Rückstand in 400 µl Puffer aufnehmen und vortexen − 50 µl pro Kavität im Test einsetzen

Verdünnungsfaktor: ............................... 0,2 Nachweisgrenze: ................................... 5 ng/kg (ppt) Bestimmungsgrenze:............................. 10 ng/kg (ppt)

Bitte Anmerkung nach 9.6. beachten!


9.3. Milchpulver

− 2 g Milchpulver mit 10 ml dest. Wasser in einem Zentrifugenröhrchen lösen − zu diesem Ansatz 1 ml Carrez I (siehe 5.2.) hinzugeben und kräftig mischen − 1 ml Carrez II (siehe 5.2.) hinzugeben − kräftig mischen (Vortex) und zentrifugieren: 10 min / 3000 g / 4 - 12 °C

(ist keine Kühlzentrifuge vorhanden, sollten die rekonstituierten Milchpulver-proben auf ca. 8 °C vorgekühlt werden)

− von dem Überstand 3,6 ml (entspricht 0,6 g Milchpulver) in ein neues Röhrchen überführen

− 6 ml Ethylacetat hinzufügen und unter Schütteln 10 min extrahieren − zur Phasentrennung zentrifugieren: 10 min / 3000 g / Raumtemperatur

(20 - 25 °C) − 4 ml Ethylacetat-Überstand (entspricht 0,4 g Milchpulver) in ein neues

Röhrchen überführen und unter Stickstoff bei ca. 60 °C bis zur Trockene einengen

− den trockenen Rückstand in 400 µl Puffer aufnehmen und vortexen − 50 µl pro Kavität im Test einsetzen



9.4. Honig

− 2 g Honig mit 4 ml dest. Wasser in einem Zentrifugenröhrchen lösen − 4 ml Ethylacetat hinzufügen und unter Schütteln (über Kopf) 10 min extrahieren − zur Phasentrennung zentrifugieren: 10 min / 3000 g / Raumtemperatur

(20 - 25 °C) − 1 ml Ethylacetat-Überstand (entspricht 0,5 g Honig) in ein neues Röhrchen

überführen und unter Stickstoff bei ca. 60 °C bis zur Trockene einengen − den trockenen Rückstand in 0,5 ml Puffer aufnehmen und vortexen − 50 µl pro Kavität im Test einsetzen



Nach dem Einengen des Ethylacetat-Extrakts entsteht ein Rückstand, der sich in Puffer nicht vollständig auflöst. Trotzdem ist die Wiederfindung von CAP mit > 80 % absolut zufriedenstellend.


9.5. Shrimps, Fleisch und Fischmehl

− eine repräsentative Probenmenge (z.B. 100 g) mit einem geeigneten Gerät (z.B. Ultraturrax oder Mixer) homogenisieren

− 3 g homogenisierte Probe mit 3 ml dest. Wasser mischen und mit 6 ml Ethylacetat versetzen

− 10 min intensiv mischen (z.B. über Kopf rotieren) − zur Phasentrennung zentrifugieren: 10 min / 3000 g / Raumtemperatur

(20 - 25 °C) − 4 ml Ethylacetat-Überstand (entspricht 2 g Probe) in ein neues Röhrchen

überführen und unter Stickstoff bei ca. 60 °C bis zur Trockene einengen − den trockenen Rückstand in 1 ml n-Hexan aufnehmen − zu dieser Lösung 0,5 ml Puffer geben und ca. 1 min auf dem Vortex intensiv

mischen − zur Phasentrennung zentrifugieren: 10 min / mind. 3000 g / Raumtemperatur

(20 - 25 °C) − 50 µl der unteren, wässrigen Phase pro Kavität im Test einsetzen

Verdünnungsfaktor: ............................... 0,25 Nachweisgrenze: ................................... 6,25 ng/kg (ppt) Bestimmungsgrenze:............................. 12,5 ng/kg (ppt)


9.6. Eier (rohes Vollei)

− eine repräsentative Probenmenge (z.B. 100 g) mit einem geeigneten Gerät (z.B. Ultraturrax oder Mixer) homogenisieren

− 2 g homogenisierte Eiprobe einwiegen und mit 12 ml Ethylacetat versetzen − 10 min intensiv mischen (z.B. über Kopf rotieren) − zur Phasentrennung zentrifugieren: 10 min / 3000 g / Raumtemperatur

(20 - 25 °C) − 6 ml Ethylacetat-Überstand (entspricht 1 g Probe) in ein neues Röhrchen

überführen und unter Stickstoff bei ca. 60 °C bis zur Trockene einengen − den trockenen Rückstand in 1 ml n-Hexan aufnehmen


− zu dieser Lösung 1 ml Puffer geben und ca. 1 min auf dem Vortex intensiv mischen

− zur Phasentrennung zentrifugieren: 10 min / mind. 3000 g / Raumtemperatur (20 - 25 °C)

− 50 µl der unteren, wässrigen Phase pro Kavität im Test einsetzen


Anmerkung:

Für die genannten Probenaufarbeitungen mit Ethylacetat empfehlen wir den Cut-off für positive Proben auf die angegebene Bestimmungsgrenze zu setzen, da negative Proben Hintergrundwerte aufweisen können.

Lösungsmittelproben können größer Standard 2 gefunden werden. Wir empfehlen deshalb bei jedem Testlauf eine Lösungsmittelprobe mitlaufen zu lassen (Probenaufarbeitung ohne Matrix, Start mit Ethylacetat-Überstand zur Trockene einengen und fortfahren wie beschrieben) und das Resultat der Lösungsmittelkontrolle von dem Probenergebnis zu subtrahieren.

Auf Anfrage sind zusätzliche Applikationen für Serum / Plasma, Mischfutter und Urin (CAP-Glucuronid) bei R-Biopharm erhältlich.

10. Testdurchführung

10.1. Testvorbereitungen

Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20 - 25 °C) bringen.

Als Waschpuffer wird ein PBS-Tween-Puffer benötigt, benutzen Sie dazu bitte das beiliegende Puffersalz (siehe 4.). Zur Herstellung des Puffers wird der gesamte Inhalt des Beutels in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst. Der gelöste Waschpuffer ist ca. 4 - 6 Wochen bei 2 - 8 °C haltbar.


Alternativ: Inhalt des Beutels in 100 ml dest. Wasser lösen (10fach Konzen-trat). Die Lösung ist ca. 8 - 12 Wochen bei Raumtemperatur (20 - 25 °C) haltbar. Um die gebrauchsfertige Lösung herzustellen 1 Teil des 10fach Konzentrats mit 9 Teilen dest. Wasser mischen.

Das Chloramphenicol-Enzymkonjugat (Flasche mit rotem Verschluss) liegt als Konzentrat vor. Da das rekonstituierte Konjugat nur begrenzte Haltbarkeit auf-weist, immer nur soviel Konjugat mit Puffer verdünnen, wie unmittelbar benötigt wird. Das Konjugat vor Entnahme vorsichtig mischen. Um das gebrauchsfertige Konjugat herzustellen, muss das Konzentrat 1:11 (1+10) mit Puffer verdünnt werden (z.B. 200 µl Konzentrat + 2 ml Puffer, ausreichend für 4 Mikrotiterstreifen).

10.2. Testdurchführung

Sorgfältiges Waschen ist sehr wichtig. Ein Eintrocknen der Kavitäten zwischen den Arbeitsschritten vermeiden.

1. So viele Kavitäten in den Halterahmen einsetzen, wie für alle Standards und Proben in Doppelbestimmung benötigt werden. Die Positionen der Standards und der Proben protokollieren.

2. Je 50 µl der Standardlösung bzw. der vorbereiteten Proben als Doppel-bestimmung in die entsprechenden Kavitäten pipettieren.

3. Je 50 µl verdünnte Enzymkonjugat-Lösung in die entsprechenden Kavitäten pipettieren, vorsichtig manuell mischen und 1 h bei Raumtemperatur (20 - 25 °C) inkubieren.

4. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüs-sigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 250 µl Waschpuffer (siehe 10.1.) waschen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen.

5. 100 µl Substrat-/Chromogenlösung in die entsprechenden Kavitäten pipet-tieren. Vorsichtig manuell mischen und 15 min bei Raumtemperatur (20 - 25 °C) im Dunkeln inkubieren.

6. Je 100 µl Stopp-Reagenz in jede Kavität pipettieren und vorsichtig manuell mischen. Die Extinktion bei 450 nm innerhalb von 30 min nach Zugabe des Stopp-Reagenzes messen. Der Abgleich des Nullwertes erfolgt gegen Luft.


11. Auswertung

Für die Auswertung ist bei R-Biopharm eine speziell für die RIDASCREEN® ELISA-Tests entwickelte Software, die RIDA®SOFT Win (Art. Nr. Z9999), erhältlich.

Wir empfehlen für Einzelbestimmungen die Auswertung mit Logit/log und für Doppel- oder Mehrfachbestimmungen sollte Cubic Spline verwendet werden.

Der Verlauf der Standardkurve kann dem beigefügten Analysenzertifikat entnom-men werden.

Hinweis für die Berechnung ohne Software:

Extinktion Standard (bzw. Probe)

Extinktion Nullstandard x 100 = % Extinktion

Den Nullstandard somit gleich 100 % setzen und die Extinktionswerte in Prozent angeben. Die errechneten Werte für die Standards in einem Koordinatensystem auf halblogarithmischem Millimeterpapier gegen die Chloramphenicol-Konzen-tration in [ng/kg] auftragen.

Um die in einer Probe enthaltene tatsächliche Chloramphenicol-Konzentration in ng/kg (ppt) zu erhalten, muss die aus der Eichkurve abgelesene Konzentration noch mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor (siehe 9.1. bis 9.6.) multipliziert werden.

Diese Angaben entsprechen dem heutigen Stand unserer Kenntnisse und sollen über unsere Produkte und deren Anwendungsmöglichkeiten informieren. Sie haben somit nicht die Bedeutung, bestimmte Eigenschaften der Produkte oder deren Eignung für einen konkreten Einsatzzweck zuzusichern. R-Biopharm übernimmt keine Gewährleistung, außer für die standardisierte Qualität der Reagenzien. Defekte Produkte werden ersetzt. Darüber hinaus gehende Ansprüche für direkte oder indirekte Schäden oder Kosten aus der Nutzung der Produkte entstehen nicht.


RIDASCREEN® Chloramphenicol

Brief information

RIDASCREEN® Chloramphenicol (Art. No.: R1505) is a competitive enzyme immunoassay for the quantitative analysis of chloramphenicol in milk, milk powder, honey, shrimps, meat, fish meal and eggs. All reagents required for the enzyme immunoassay - including standards - are contained in the test kit. The test kit is sufficient for 96 determinations (including standards). A microtiter plate spectrophotometer is required for quantification. Sample preparation: homogenization, extraction, centrifugation and

reduction to dryness (milk: direct use in the assay is possible) Time requirement: sample preparation (for 10 samples) according to sample matrix .........................1.5 to 2 h test implementation (incubation time) ................1.5 h Detection limit: milk.....................................................................5 ppt milk (direct use)................................................25 ppt milk powder......................................................25 ppt honey ...............................................................25 ppt shrimps, meat, fish meal ...............................6.25 ppt egg ...................................................................25 ppt Recovery rate: milk / milk powder .......................................... > 80 % honey ............................................................. > 80 % shrimps, meat, fish meal ................................ > 80 % egg ................................................................. > 80 % Specificity: The specificity of the RIDASCREEN® Chlorampheni-

col test was established by analyzing the cross-reactivity to corresponding antibiotics:

Chloramphenicol ............................................. 100 % Chloramphenicol base ...................................... 12 % Thiamphenicol.............................................. < 0.1 %


1. Intended use

RIDASCREEN® Chloramphenicol is a competitive enzyme immunoassay for the quantitative analysis of chloramphenicol in milk, milk powder, honey, shrimps, meat, fish meal and eggs. In september 1998 a screening method for Chloramphenicol-residues in milk samples, §35 LMBG (01.00 68) has been licensed officially for Germany. This screening method is an ELISA in microtiter plate formate.

2. General

Chloramphenicol is a broad spectrum antibiotic which is frequently employed in animal production for its excellent antibacterial and pharmacokinetic properties. However, in humans it leads to hematotoxic side effects, in particular chloramphenicol-induced aplastic anaemia for which a dosage-effect relationship has not yet been established. This has led to a prohibition of chloramphenicol for the treatment of animals used for food production.

3. Test principle

The basis of the test is the antigen-antibody reaction. The microtiter wells are coated with antibodies directed against chloramphenicol. Chloramphenicol standards or sample solution and chloramphenicol enzyme conjugate are added. Free chloramphenicol and chloramphenicol enzyme conjugate compete for the chloramphenicol antibody binding sites (competitive enzyme immunoassay). Any unbound enzyme conjugate is then removed in a washing step. Substrate/ chromogen solution is added to the wells, bound enzyme conjugate converts the chromogen into a blue product. The addition of the stop solution leads to a color change from blue to yellow. The measurement is made photometrically at 450 nm. The absorption is inversely proportional to the chloramphenicol concentration in the sample.


4. Reagents provided

Each kit contains sufficient materials for 96 measurements (including standard analyses). Each test kit contains: 1 x Microtiter plate with 96 wells (12 strips with 8 removable wells each) coated with antibodies against chloramphenicol 6 x Standard solutions, 1.3 ml each

0 ppt (zero standard), 25 ppt, 50 ppt, 100 ppt, 250 ppt, 750 ppt chloramphenicol in aqueous solution, ready to use

1 x Conjugate (0.7 ml) ...............................................................................red cap peroxidase conjugated chloramphenicol concentrate

1 x Substrate/chromogen solution (10 ml)............................................ brown cap stained red 1 x Stop solution (14 ml) ......................................................................yellow cap contains 1 N sulfuric acid 1 x Buffer (100 ml) conjugate- and sample dilution buffer 1 x Washing buffer (salt) for preparation of a 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) contains 0.05 % Tween 20

5. Materials required but not provided

5.1. Equipment:

− Microtiter plate spectrophotometer (450 nm) − Centrifuge − Shaker − Vortex − Mixer (Stomacher, Ultraturrax) − Evaporator − Graduated pipettes − variable 20 µl - 200 µl- and 200 - 1000 µl-micropipettes


5.2. Reagents:

− Ethyl acetate − n-hexane for milk (extraction with ethyl acetate): − Carrez I: 0.36 M Potassium ferrocyanide (II) x 3 H2O − Carrez II: 1.04 M Zinc sulfate x 7 H2O

6. Warnings and precautions for the users

The standards contain chloramphenicol, particular care should be taken.

The stop solution contains 1 N sulfuric acid (R36/38, S2-26).

7. Storage instructions

Store the kit at 2 - 8 °C (35 - 46 °F). Do not freeze any test kit components.

Return any unused microwells to their original foil bag and reseal them together with the desiccant provided at 2 - 8 °C (35 - 46 °F).

The substrate/chromogen solution is light sensitive, therefore, avoid exposure to direct light.

No quality guarantee is accepted after expiry of the kit (see kit label).

Do not interchange individual reagents between kits of different lot numbers.

8. Indication of deterioration of reagents

− Any bluish coloration of the reddish substrate/chromogen solution prior to test implementation

− A value of less than 0.6 absorbance units (A450 nm < 0.6) for the zero standard


9. Preparation of Samples

The samples should be stored in a cool place, protected against light.

9.1. Milk (direct use in the assay)

− vortex the milk samples shortly for homogenization − use 50 µl milk per well in the assay

dilution factor: ........................................ 1 limit of detection: ................................... 25 ng/kg (ppt) limit of quantification: ............................. 25 ng/kg (ppt)

9.2. Milk (extraction with ethyl acetate)

− transfer 10 ml of milk into a centrifugal vial − add 500 µl Carrez I (see 5.2.) and mix thoroughly − add 500 µl Carrez II (see 5.2.) − mix thoroughly (vortex) and centrifuge: 10 min / 3000 g / 4 - 12 °C (39 - 54 °F)

(if a refrigerated centrifuge is not available, chill sample to approx. 8 °C (46 °F) prior to centrifugation)

− transfer 4.4 ml of the supernatant (corresponding to 4 ml milk) into a new vial − add 8 ml of ethyl acetate and extract by shaking for 10 min − centrifuge for separation: 10 min / 3000 g / room temperature (20 - 25 °C /

68 -77 °F) − transfer 4 ml of ethyl acetate supernatant (corresponding to 2 ml milk) into a

new vial and reduce to dryness at 60 °C (140 °F) by nitrogen − dissolve the dried residue in 400 µl buffer and vortex − use 50 µl per well in the assay

dilution factor: ........................................ 0.2 limit of detection: ................................... 5 ng/kg (ppt) limit of quantification: ............................. 10 ng/kg (ppt)

Please notice the remark after 9.6.!

9.3. Milk powder

− dissolve 2 g of milk powder with 10 ml distilled water into a centrifugal vial − add 1 ml Carrez I (see 5.2.) and mix thoroughly − add 1 ml Carrez II (see 5.2.)


− mix thoroughly (vortex) and centrifuge: 10 min / 3000 g / 4 - 12 °C (39 - 54 °F) (if a refrigerated centrifuge is not available, chill sample to approx. 8 °C (46 °F) prior to centrifugation)

− transfer 3.6 ml of the supernatant (corresponding to 0.6 g milk powder) into a new vial

− add 6 ml ethyl acetate and extract by shaking for 10 min − centrifuge for separation: 10 min / 3000 g / room temperature (20 - 25 °C /

68 - 77 °F) − transfer 4 ml of ethyl acetate supernatant (corresponding to 0.4 g milk powder)

into a new vial and reduce to dryness at 60 °C (140 °F) by nitrogen − dissolve the dried residue in 400 µl buffer and vortex − use 50 µl per well in the assay



9.4. Honey

− dissolve 2 g of honey with 4 ml distilled water into a centrifugal vial − add 4 ml ethyl acetate and shake for approx. 10 min up side down − centrifuge for separation: 10 min / 3000 g / room temperature (20 - 25 °C /

68 - 77 °F) − transfer 1 ml of ethyl acetate supernatant (corresponding to 0.5 g honey) into a

new vial and reduce to dryness at 60 °C (140 °F) by nitrogen − dissolve the dried residue in 0.5 ml buffer and vortex − use 50 µl per well in the assay


After evaporation of the ethyl acetate extract the resulting residue is not completely dissolvable. Nevertheless the recovery of CAP is absolutly satisfying with > 80 %.



9.5. Shrimps, meat and fish meal

− homogenize a reasonable amount of sample (e.g. 100 g) with a suitable equipment (e.g. ultra turrax or mixer)

− weigh 3 g of homogenized sample and mix with 3 ml of distilled water and add 6 ml ethyl acetate

− mix intensively for 10 min (e.g. up side down) − centrifuge for separation: 10 min / 3000 g / room temperature (20 - 25 °C /

68 - 77 °F) − transfer 4 ml of ethyl acetate supernatant (corresponding to 2 g of sample) into

a new vial and reduce to dryness at 60 °C (140 °F) by nitrogen − dissolve the dried residue in 1 ml n-hexane − add 0.5 ml buffer to this solution and mix intensively for approx. 1 min on a

vortex − centrifuge for separation: 10 min / at least 3000 g / room temperature

(20 - 25 °C / 68 - 77 °F) − use 50 µl of the aqueous lower phase per well in the assay

dilution factor: ........................................ 0.25 limit of detection: ................................... 6.25 ng/kg (ppt) limit of quantification: ............................. 12.5 ng/kg (ppt)


9.6. Egg (row whole egg)

− homogenize a reasonable amount of sample (e.g. 100 g) with a suitable equipment (e.g. ultra turrax or mixer)

− weigh 2 g of homogenized sample and add 12 ml ethyl acetate − mix intensively for 10 min (e.g. up side down) − centrifuge for separation: 10 min / 3000 g / room temperature (20 - 25 °C /

68 - 77 °F) − transfer 6 ml of ethyl acetate supernatant (corresponding to 1 g of sample) into

a new vial and reduce to dryness at 60 °C (140 °F) by nitrogen − dissolve the dried residue in 1 ml n-hexane − add 1 ml buffer to this solution and mix intensively for approx. 1 min on a vortex − centrifuge for separation: 10 min / at least 3000 g / room temperature

(20 - 25 °C / 68 - 77 °F) − use 50 µl of the aqueous lower phase per well in the assay



Remark:

For the sample preparations with ethyl acetat we recommend the given limit of quantification to be set as the cut off value for positive samples because negative samples can show matrix effects.

Solvent samples can be found above standard 2. Therefore we recommend to run a solvent blank sample in each test procedure (sample preparation without matrix, start with the reduction of ethyl acetate supernatant to dryness and continue onward as decribed in the corresponding procedure) and subtract the result of the solvent control from the sample results.

Additional application notes for serum / plasma, mixed feed and urine (CAP-glucuronid) are available on request. Please contact your local distributor.

10. Test implementation

10.1. Preliminary comments

Bring all reagents to room temperature (20 - 25 °C / 68 - 77 °F) before use.

As washing buffer a PBS tween buffer is needed. Please use the washing buffer salt (see 4.) contained in the kit. Dissolve the entire buffer salt in one liter of distilled water. The ready to use washing buffer expires after approx. 4 - 6 weeks at 2 - 8 °C (36 - 46 °F).

Alternative: Dissolve the contents of the envelope in only 100 ml of distilled water to obtain a 10fold concentrated washing buffer. This solution expires after approx. 8 - 12 weeks, store at room temperature (20 - 25 °C / 68 - 77 °F). Use 1 part of this concentrate and dissolve with 9 parts of distilled water to obtain the ready to use washing buffer.


The chloramphenicol enzyme conjugate (bottle with red cap) is provided as a concentrate. Since the diluted enzyme conjugate has a limited stability, only the amount which actually is needed should be reconstituted. Before pipetting, the enzyme conjugate should be shaken carefully. For reconstitution, the concentrate is diluted 1:11 (1+10) in buffer (e. g. 200 µl conjugate concentrate + 2 ml buffer, sufficient for 4 microtiter strips).

10.2. Test procedure

Carefully follow the recommended washing procedure. Do not allow microwells to dry between working steps.

1. Insert a sufficient number of wells into the microwell holder for all standards and samples to be run in duplicate. Record standard and sample positions.

2. Add 50 µl of each standard solution or prepared sample to separate duplicate wells.

3. Add 50 µl of the diluted enzyme conjugate to the bottom of each well, mix gently by shaking the plate manually and incubate for 1 h at room temperature (20 - 25 °C / 68 - 77 °F).

4. Pour the liquid out of the wells and tap the microwell holder upside down vigorously (three times in a row) against absorbent paper to ensure complete removal of liquid from the wells. Fill all the wells with 250 µl washing buffer (see 10.1.) and pour out the liquid again. Repeat two more times.

5. Add 100 µl of substrate/chromogen solution to each well. Mix gently by shaking the plate manually and incubate for 15 min at room temperature (20 - 25 °C / 68 - 77 °F) in the dark.

6. Add 100 µl of the stop solution to each well. Mix gently by shaking the plate manually and measure the absorbance at 450 nm against an air blank. Read within 30 minutes after addition of stop solution.

11. Results

A special software, the RIDA®SOFT Win (Art. No. Z9999), is available to evaluate the RIDASCREEN® ELISA assays.

For single determinations we recommend logit/log evaluation and for double or multiple determinations cubic spline should be used.

The course of the standard curve is shown in the joined Quality Assurance Certificate.


Remark for the calculation without software:

absorbance standard (or sample)

absorbance zero standard x 100 = % absorbance

The zero standard is thus made equal to 100 % and the absorbance values are quoted in percentages. The values calculated for the standards are entered in a system of coordinates on semilogarithmic graph paper against the chloramphe-nicol concentration in [ng/kg]. In order to obtain the chloramphenicol concentration in ng/kg (ppt) actually contained in a sample, the concentration read from the calibration curve must be further multiplied by the corresponding dilution factor (see 9.1. to 9.6.).

R-Biopharm makes no warranty of any kind, either expressed or implied, except that the materials from which its products are made are of standard quality. If any materials are defective, R-Biopharm will provide a replacement product. There is no warranty of merchantability of this product, or of the fitness of the product for any purpose. R-Biopharm shall not be liable for any damages, including special or consequential damage, or expense arising directly or indirectly from the use of this product.

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