Diagnosticul,de,laborator,,Etapele,diagnosticului,virusologic:,1,orientarea,diagnosticului,2,recoltarea,produsului,patologic,3,transportul,produselor,patologice,4,directiile,diagnosticului,virusologic,1.,Orientarea,diagnosticului:,;,se,iau,date,de,la,pacient,,in,cursul,anamnezei,;,ne,intereseaza:,data,debutului,simptomatologiei,,date,epidemiologice,(contact,cu,boli,infectioase,,transmisibile),,calatorii,in,zone,endemice,,vaccinari,2.,Recoltarea,produsului,patologic,;,se,face,cu,tampon,steril,dupa,decontaminarea,zonei,de,alti,germeni,bacteriologici,Produse,patologice,,;,sange:,punctie,venoasa,aseptica,pe,anticoagulant:,virusuri,care,disemineaza,viremic,si,agentii,etiologici,ai,febrelor,hemoragice.,,;,materiile,fecale:,4;8,g,in,solutie,de,MgSO4.,Se,izoleaza,enterovirusuri,,rotavirusuri,,calicivirusuri,,;,secretii,nazo,faringiene,,,;,spalatura,nazofaringiana:,tampoane,sterile,,,;,aspirat,nazofaringian:,speculum,nazal,,,;,lavaj,traheobronsic:,bronhoscopie,,,Se,izoleaza:,virusuri,gripale,A,si,B,,paragripale,,adenovirusuri,,rhinovirusuri,,coronavirusuri,,VRS,,rujeolos,,rubeolos,,urlian,;,LCR:,virus,rabic,,arbovirusuri,;,saliva:,cu,tampon,steril;,pentru,virus,rabic.,;,lichid,vezicular:,colectare,din,vezicule,,bule,,pustule,se,face,dupa,dezinfectarea,prealabila,a,regiunii,cutanate,sau,mucoase.,Virusuri,izolate:,HSV1,,HSV2,,VZV,;,urina:,CMV,,virus,rujeolos,;,tampoane,vaginale,,lavaj,cervico;vaginal,,tampon,uretral:,de,la,nivelul,colului,uterin,si,uretrei.,Virusuri,izolate:,herpetic,,HPV;,diagnostic,uretrite,,leziuni,veziculare,;,biopsia,tisulara:,fragmente,de,organ,3.,Transportul,probelor,recoltate,;,rapid,,la,rece,si,sigur,;,ambalare,riguros,corecta,,etichetare,cu,semn,biorisc,,documentatie,in,legatura,cu,agentul,etiologic,transportat,4.,Directiile,diagnosticului,virusologic,,a.,izolare,virala,,b.,demonstrarea,prezentei,virusului/componentelor,sale,,c.,diagnostic,serologic,a.,Izolarea,virusurilor:,,Exista,3,sisteme,de,izolare:,culturi,celulare,,OGE,,animal,de,laborator,Izolarea,pe,culturi,de,celule,determina,efecte,citopatice,Ex:,Rabia,da,incluzii,Negri,in,neuron.,,Izolarea,prin,inoculare,la,animal,de,laborator:,Ex:,Rabia,produce,modificari,patognomonice,in,SNC.,,,

b.,Demonstrarea,prezentei,virusului/componentelor,sale,;,prin,microscopie,electronica,;,prin,detectie,directa:,a,acidului,nucleic,sau,antigenelor,virale,,,;,PCR,,,;,ELISA:,test,imuno,enzimatic,,,;,reactia,de,imunofluorescenta,,,;,neutralizarea,efectului,citopatogen:,reactia,de,seroneutralizare,(enterovirusuri),,,;,inhibarea,efectului,viral:,hemaglutinoinhibare,;,virusuri,gripale,C.,Diagnostic,serologic,;,pe,proba,unica,de,ser:,anticorpi,antivirali,de,tip,IgM,;,ELISA,de,captura,;,pe,probe,pereche,de,ser:,proba,1,la,debut,si,proba,2,la,2;3,saptamani,;,ELISA,tehnica,indirecta,(de,competitie):,,,,;,seroconversia,,,,;,cresterea,semnificativa,a,titrului,de,anticorpi,intre,cele,2,probe,,

Izolarea(virusurilor(in(culturi(celulare.(Efecte(citopatice((Directiile(diagnosticului(virusologic(1.(Izolare(virala(in:(culturi(celulare,(OGE,(animal(de(laborator(2.(Detectia(directa(a:(particulelor(virale,(antigenelor(virale,(genomului(viral(3.(Teste(serologice:(Ac(virus(specific(de(tip(IgM;(seroconversia(in(anticorp(specific(de(tip(IgG.(Culturi(celulare:(metodologia(propagarii(in(vitro(a(unui(fragment(de(tesut(sau(a(unor(celule(dispersate(obtinute(din(tesuturi(cu(ajutorul(unor(enzime(proteolitice(si(introduse(intrFun(mediu(nutritiv(capabil(sa(le(asigura(homeostazia(si(proliferarea.(Clasificare(culturi:(F(culturi(de(organ:(mentinerea(in(vitro(a(unor(fragmente(de(organ(in(vederea(pastrarii(arhitecturii(si(functiei(intacte(a(celulelor.(Corona,(rhinovirusurile(nu(se(cultiva(decat(pe(culturi(de(trahee.(F(culturi(de(celule(dispersate:(provin(din(disocierea(tesuturilor(intrFo(suspensie(de(celule(prin(tratare(enzimatica(asociata(cu(agitare(mecanica.(Se(clasifica(dupa(timpul(de(supravietuire(in:(culturi(primare,(tulpini(celulare(si(linii(celulare.(((Culturile(primare:(((Se(formeaza(direct(din(dispersia(enzimatica(a(unui(tesut(proaspat(recoltat.(Formeaza(monostrat.(Celulele(tind(sa(mentina(caracteristicile(organului(din(care(deriva.(Pot(aparea(proprietati(de(suprafata(noi.(Se(mentine(in(vitro(timp(limitat,(adica(3F5(pasaje((reinoculari).((Tulpini(celulare(((Sunt(omogene(si(au(o(durata(de(viata(de(50F60(de(pasaje.(Virusurile(respiratorii(cresc(foarte(bine(pe(tulpini(derivate(din(piele,(intestin(si(amigdale.(Cariotipul(cromozomial(este(cel(de(origine(diploida.(Pot(fi(utilizate(in(producerea(de(vaccinuri(virale(si(pentru(diagnosticul(virusologic((Liniile(celulare(((Sunt(populatii(de(celule(derivate(din(tesut(normal(sau(mailgn(ce(pot(fi(subcultivate(un(timp(nelimitat.(Au(caracter(heteroploid.(Nu(pot(fi(folosite(in(producerea(de(vaccinuri(din(cauza(instabilitatii(genomului.((Componente(culturi(de(celule(dispersate:((F(celule(vii:(Reflecta(tesutul(de(provenienta:(tesut(embrionar,(adult(sau(tumoral((F(mediu(nutritiv:(saruri(tamponate(izotone,(aminoacizi(esentiali,(ser(de(vitel,(vitamine,(antibiotice(si(antifungice((Conditii(necesare(pentru(pastrarea(in(viata(a(celulelor(din(cultura(celulara:(pH(adecvat,(temperatura(constanta,(atmosfera(cu(10%(CO2,(conditii(aseptice.((Obtinerea(unei(culturi(celulare:(F(se(preleva(tesutul(sursa(in(conditii(aseptice(F(se(fragmenteaza(tesutul(in(bucati,(se(spala(cu(solutie(salina(tamponata(F(disocierea(enzimatica(a(celulelor:(tripsinizare(F(suspendarea(celulelor(in(mediu(nutritiv(F(controlul(viabilitatii(celulelor(cu(coloratie(vitala(albastru(de(tripan(F(repartizarea(celulelor(in(volume(egale(in(flacoane(de(culturi(F(incubare(in(pozitie(culcata(F(urmarirea(formarii(culturii(cu(microscopul(invers((Subcultivarea(culturilor(celulare:((Dupa(5F7(zile(de(la(realizarea(culturii(se(epuizeaza(substantele(nutritive,(sursele(de(energie(si(se(acidifica(mediul.(Pentru(mentinerea(celulelor(in(viata,(acestea(trebuie(pasate(si(subcultivate.(Celuele(se(detaseaza(de(pe(peretele(flaconului(cu(solutie(de(tripsina(si(EDTA,(se(centrifugheaza,(se(spala(cu(solutie(salina(tamponata(si(se(seuspendeaza(in(mediu(nutritiv.(Se(verifica(viabilitatea(

celulelor,(se(numara(celulele(si(se(ajusteaza(la(concentratia(optima.(Se(repartizeaza(volume(egale(in(flacoane(de(cultura(celulara:(((F(culturile(primare(se(subcultiva(de(3F5(ori(((F(tulpinile(celulare(se(subcultiva(de(50F60(de(ori(((F(liniile(celulare(se(subcultiva(la(infinit((Culturi(provenite(din(celule:((F(normale:(celulele(se(ataseaza(de(peretele(flaconului,(se(multiplica(pana(acopera(peretele(si(realizeaza(o(cultura(monostrat((F(tumorale:(se(multiplica(si(dupa(acoperirea(suprafetei(disponibile,(cresc(in(mai(multe(straturi(si(in(suspensie.((Celulele(transformate:((Sunt(linii(celulare(care(au(suferit(o(modificare(stabila,(spontana(sau(prin(expunere(la(diferiti(agenti;(modificare(care(este(mentinuta(indefinit(prin(cultivare(in(vitro(sau(transplant(in(vivo.(((Sunt(morfologic(distincte(si(se(dispun(dezordonat.(Daca(se(inoculeaza(la(animale(produc(tumori.(Se(multiplica(haotic,(nu(au(inhibitie(de(contact,(nu(adera(la(substratul(de(izolare.(Au(cerinte(nutritive(mici,(se(divid(la(concentratii(mici(de(ser(de(vitel.(Prezinta(antigene(de(suprafata(diferite(de(celulele(normale.(Prezinta(modificari(cromozomiale,(cariotip(aneuploid.(((Inocularea(virusurilor(in(culturi(celulare((Se(arunca(mediul(nutritiv(si(se(introduce(suspensia(virala.(Incubare(1(ora((pentru(adsorbtie).(Se(adauga(mediu(de(intretinere,(se(incubeaza.(In(3F5(zile(apar(modificarile(survenite(in(cultura(celulara.(Izolarea(urmareste(efectele(citopatice.(Efectele(citopatice:((F(sincitial:(HIV,(rujeolos,(VRS((F(picnotic(litic:(enterovirusuri((F(incluzionar:((((F(intranuclear(acidofil:(papovavirusuri(((F(intranuclear(bazofil:(adenovirusuri:(se(multiplica(in(nucleu(unde(proteinele(capsidare,(produse(in(exces,(formeaza(incluziile(intranucleare(((F(intracitoplasmatic(acidofil:(virus(rabic,(vaccinia(((F(mixt:(virusuri(herpetice,(rujeolos((

Diagnostic*in*viroze*respiratorii**Orientare*clinica:*febra*(375*zile),*mialgie,*cefalee,*astenie,*tuse*neproductiva,*faringita,*rinoree.*Gripa*nu*se*diagnosticheaza*clinic.*Are*simptomatologie*asemanatoare*cu:*mycoplasma*pneumoniae,*adenovirusuri,*VRS,*rhinovirusuri,*Legionella*Sunt*Orhtomixovirusuri.*Sunt*tipuri*A,*B,*C*i*au*subtipuri*n*funcie*de*hemaglutinina*sau*neuraminidaza*pe*care*o*contin.**Sunt*formate*din:*HA,*NA,*nucleocapsida*helicoidala*ARNss,*anvelopa,*transcriptaza*si*matrice.**Produse*patologice:*7*spalatura*nazofaringiana:*se*obtine*cu*tampoane*sterile*in*cornetul*nazal*inferior*7*aspirat*nazofaringian:*cu*speculum*nazal*7*lavaj*traheobronsci:*prin*bronhoscopie*7*exsudat*nazo7faringian:**Se*recolteaza*cu*tampon*steril*secretii*de*pe*peretele*posterior*si*lateral*al*orofaringelui*si*din*orice*zone*cu*inflamatie,*exsudat*sau*ulceratie.*Recoltarea*se*face*folosind*un*tampon*steril.*Stocare*si*transport:*se*inoculeaza*imediat*dupa*recoltare*sau*se*ingheata*la*770C*in*gheata*carbonica.*Prelucrare:*tamponul*este*dispus*intr7un*tub*steril*cu*circa*15ml*de*mediu*de*transport*pentru*elutia*virusului.*Tubul*se*centrifugheaza*la*2500*rot/15*minute*la*4C.*Se*spala*celulele*si*se*formeaza*un*depozit*de*celule*pentru*izolare*virala*sau*efectuare*de*seruri*antivirale*disponibile.*Directii*de*diagnostic:**7*izolare*virala*+*identificare**7*detectie*directa:*RIF,*PCR**7*diagnostic*serologic*Izolarea*virala*7*diagnostic*de*electie:**1.*Culturi*primare*de*rinichi*de*maimuta*rhesus;*linie*continua*epiteliala*de*rinichi*de*caine**2.*Pe*OGE*de*9711*zile,*inoculat*intraamniotic*sau*intaalantoidian.*Izolarea*se*demonstreaza*prin*proprietatea*virusurilor*gripale*de*a*aglutina*hematii.*Hemadsorbtia:**Demonstreaza*izolarea*virusurilor*gripale*pe*culturi*de*celule.**Virusurile*nu*sunt*citopatogene.*La*48*de*ore*dupa*inocularea*virusului*gripal*se*incearca*detectia*virusului*prin*hemadsorbtie*obisnuit*cu*eritrocite*de*cobai*la*4C.*Hemadsorbtia*rezulta*din*incorporarea*in*membrana*plasmatica*celulara*a*HA*virale.*Hematiile*adsorbite*specific*rozeteaza*la*periferia*celulelor*infectate.**Reactia*de*hemaglutinare:**Este*capacitatea*unor*virusuri*de*a*aglutina*hematiile*unor*specii*de*animale.*Virusurile*care*poseda*capacitatea*de*a*aglutina*hematii*se*numesc*virusuri*hemaglutinante*(rubeola,*rujeola,*urlian,*adenovirusuri,*enterovirusuri,*gripale*si*paragripale).*Se*pun*in*contact*dilutii*succesive*binare*de*antigen*hemaglutinant*cu*hematiile*corespunzatoare*virusului*incriminat.*

*Demonstrarea*prezentei*virusului*prin*RHA:**Etape:****7*dilutii*binare*de*antigen*viral***7*suspensie*de*hematii***7*se*incubeaza*la*temperatura*camerei*7*60*de*minute*Se*produce*titrarea*antigenului*hemaglutinant*inaintea*reactiei*de*hemaglutino7inhibare.*Clasificare*virusuri*hemaglutinante:*1.*HA*structurala*care*distruge*R:*gripale,*paragripale*2.*HA*structurala*care*nu*distruge*R:*arbovirusuri,*rubeola*3.*HA*non*structurala:*poxvirusuri**Reactia*de*hemaglutino7inhibare:*Se*produc*dilutii*binare*din*ser*imun*de*referinta*cu*antigen*viral*hemaglutinant*(60*min*la*37C).*Se*foloseste*sistem*indicator7suspensia*de*hematii.*Se*incubeaza*60*minute*la*temperatura*camerei.*Ultima*unitate*hemaglutinanta:*ultimul*godeu*in*care*s7a*produs*hemaglutinarea.**Detectie*directa:*a.*Reactia*de*imunoflorescenta:*7*test*rapid,*ieftin,*reproductibil*7*pentru*gripa,*herpes,*rabie*7*incubare*cu*anticorp*fluorescent,*spalare*si*citire*la*MO*in*lumina*UV.**RIF+:*minim*2*celule*fluorescente*RIF7:*minim*20*de*celule*negative**b.*PCR:*acid*nucleic**Diagnosticul*serologic:**Necesita*recoltarea*de*probe*de*ser*pereche*de*la*acelasi*pacient.*Nu*se*practica*in*mod*curent*decat*in*caz*de*epidemii*pentru*diagnostic*retrospectiv.*Diagnosticul*necesita*demonstrarea*unei*cresteri*semnificative*a*titrului*de*Ac*specifici*antivirali*intre*proba*de*faza*acuta*si*cea*din*convalescenta.**Metoda*preferata*de*evidentiere*a*anticorpilor*anti7virali*specific*e*hemaglutinoinhinarea.**

Diagnostic*in*infectia*cu*virusuri*herpetice*!Herpesviridae:!,!Alfaherpesvirinae:!HSV1,!HSV2,!VZV!,!Betaherpesvirinae:!CMV,!HHV6,!HHV7!,!Gamaherpesvirinae:!Epstein!barr,!HHV8,kapsoi!associated!!Diagnostic*in*infectia*cu*alfaherpesvirusuri*Produse!patologice:!lichid!vezicular,!tampon!conjunctival,!tampoane!vaginale,!lavaj!cervico,vagina;,!tampon!uretral!Recoltarea!este!recomandata!in!cazul!leziunilor!active.!Directii!de!diagnostic:!a.!izolare!virala:!diagnostic!de!electie!b.!diagnostic!direct:!PCR,!RIF!c.!diagnostic!indirect:!valoarea!testelor!serologice!!a.!Izolarea!virala:!Are!efect!citopatic!mixt:!,!sincitial:!formeaza!celule!balonizate,!multinucleate!,!incluzionar!acidofil:!corpii!Cowdry!A!b.!Diagnostic!direct:!Reactia!de!imunofluorescenta!directa:!,!este!test!specific!reproductibil!si!ieftin.!,!se!face!amprenta!direct!pe!lama!si!impersie!in!acetona!la!2,8C!timp!de!10!minute,!apoi!uscare!,!se!face!incubare!cu!anticorp!fluorescent!apoi!spalare!si!citire!la!MO!in!lumina!UV.!,!Anticorpii!monoclonali!marcati!cu!ITC!fluoresceina!sau!rhodamina!sunt!anti!epitopi!specifici!de!la!nivelul!anvelopei:!!!,!glicoproteina!C!si!ICP35:!HSV1!!!,!polipeptide:!HSV2!PCR:!metoda!mai!sensibila!de!confirmare!a!diagnosticului!de!infectie!!,!util!in!detectia!infectiei!in!excretia!asimptomatica,!evaluarea!riscului!transmiterii!HSV!in!cupluri!discordante,!eficienta!supresiei!replicarii!virale!in!terapia!antivirala.!!Diagnostic*in*infectia*cu*betaherpesvirusuri*4*CMV*4*prenatal:!malformatii!congenitale!severe!,!perinatal:!boala!cu!incluzii!citomegalice!a!nou,nascutului!,!postnatal:!infectie!asimptomatica!sau!asemanatoare!mononucleozei!Produse!patologice:!lavaj!bronhoalveolar,!LCR,!biopsii!tisulare,!sange,!urina!Directii!de!diagnostic:!1.!Izolare!virala:!pe!culturi!de!fibroblaste!diploide!umane.!Are!loc!replicare!lenta.!Efectul!citopatic!apare!dupa!2,3!saptamani.!Acesta!este!reprezentat!de!citomegalie!si!incluzii!intranucleare!tipice!in!ochi!de!bufnita!Directii!de!diagnostic:!2.!IF!directa:!pentru!detectia!antigenelor!pp65!din!fractia!limfocitara.!3.!PCR!pentru!ADN!CMV!din!sange!sau!lichid!amniotic.!4.!ELISA!pe!captura:!pentru!anticorpi!anti!CMV!IgM.!Se!poate!face!si!ELISA!cantitativa!pentru!evidentierea!seroconversiei!in!anticorpi!antiCMV!IgG!pe!probe!pereche!de!ser.!!*Diagnostic*in*infectia*cu*gamaherpesvirusuri*4*EBV*Se!efectueaza!EIA!si!IF,!din!ser,!cu:!!,!anticorpi!anticapsidari!IgM!(antiVCA)!!,!anticorpi!antinucleari!(anti!EBNA)!Se!face!PCR,!din!biopsie!tisulara!sau!sange,!pentru!ADN!EBV!

Diagnostic*de*laborator*in*hepatite*virale*Orientarea(diagnosticului(

1.(Tablou(clinic:(durere(in(hipocondru(drept,(greata,(voma,(pierderea(apetitului,(icter,(oboseala,(

mancarimi,(eritroza(palmara(

2.(Teste(Biochimice:(markerii(necrozei(hepatocitare((transaminaze,(LDH),(markeri(colestaza((FAL,(

GGT,(bilirubina),(markeri(ai(incapacitatii(de(sinteza(la(nivel(hepatic((proteine(serice,(colesterol,(TG)(

3.(Date(epidemiologice:(cale(de(transmitere,(contact(infectant,(perioada(incubatie,(vaccinuri(

(H(transmitere(enterica:(A,(E(

(H(transmitere(parenterala:(B,(C,(D(

alte(virusuri(care(dau(hepatite:(VHF,(VHG,(Coxackie,(EBV,(CMV,(arbovirusuri(

4.(Diagnostic(etiologicH>(detectia(markerilor(virali:(antigene(virale,(anticorpi,(acid(nucleic(

(

Diagnostic(VHB(

(Antigenele(VHB:(

((H(Ag(HBs(H>(Ac(antiHBs:(markeri(de(vindecare.(Daca(e(pozitiv(inseamna(ca(pacientul(este(infectat.(Daca(

este(negativ(sunt(mai(multe(optiuni:(nu(este(infectat,(are(hepatita(acuta(B,(are(hepatita(oculta(cronica(

B,(este(vindecat,(este(vaccinat.(

((H(Ag(HBc(H>(IgM(si(IgG(anti(HBc.(E(prezent(in(hepatocite.(Daca(e(pozitiv,(e(fals(pozitiv.(Este(clivat(in(Ag(

HBe.(((

((H(Ag(HBe(H>(Ac(anti(HBe;(marker(de(replicare(virala(

Pacientii(vindecati(pot(pastra(ADN(viral(in(hepatocit(si(se(poate(reactiva(ducand(la(hepatita(B(

fulminanta(in(caz(de(imunosupresie(

ADN$VHB$este$marker$de$replicare$virala$si$de$diagnostic.$$(

(

( IgM(anti(HBc(+( IgM(anti(HBc(H(

Ag(HBs(+( hepatita(acuta(B( hepatita(cronica(

Ah(HBs(H( hepatita(acuta(B( nu(e(hepatita(acuta(

(

( Hep(cronica(

agresiva(activa(

Hep(cronica(

persistenta(

Vaccinat( Vindecat( Hep(cronica(

oculta(

Ag(HBs(( +( +( H( H( H(

IgM(anti(HBc( H( H( H( H( H(

IgG(anti(HBC( +( +( H( +( +(

Ag(HBe( +( H( H( H( (

Ac(anti(HBe( H( +( H( +( (

Ac(anti(HBs( H( H( +( +( (

(

Hepatita(B(poate(fi:(

(H(acuta(

(H(cronica(persistenta(

(H(cronica(agresiva:(ciroza,(carcinom(hepatoHcelular(

Pentru(detectia(antigenelor(virale(se(face(ELISA.(

(H(Tehnica:(Incubare(ser(pacient;(spalare;(Incubare(conjugat(Ac(anti(HBs(cuplat(cu(o(enzima);(spalare;(

Incubare(substrat;(solutie(de(stopare;(citire(la(spectrofotometru(

(

(

(

Diagnostic(molecular:(1.(Monitorizarea(evolutiei(naturale(sau(sub(tratament(a(hepatitei(virale(B:(riscul(de(ciroza/cancer(creste(cu(nivelul(viremiei,(atat(pentru(persoanele(Ag(HBe(negative(cat(si(pentru(cele(pozitive.((Mortalitatea(datorata(bolilor(hepatice(prin(infectie,(este(de(vreo(20x(mai(mare(in(cazul(coinfectiei(HIV.(2.(Initierea(tratamentului(pentru(hepatita(cronica(B.(Tratamentul(este(initiat(pe(baza:(H(testelor(serologice,(teste(moleculare,(transaminazelor(serice(La(persoanele(AgHBe(negative,(incarcatura(virala(mai(mare(de(10000(de(copii(indica(infectie(activa.(3.(Criterii(de(evaluare(a(raspunsului(la(terapie(in(hepatita(cronica(B(a.(Virusologice:((H(mentinerea(nedetectabila(a(ADNHVHB(plasmatic((H(seroconversie(sustinuta(la(antiHBe(la(pacientii(AgHBe(pozitivi((H(eliminarea(AgHBs(seroconversie(antiHBs(b.(Biochimice:((H(normalizarea(sustinuta(a(nivelului(transaminazelor(c.(Histologice:((H(reducerea(stadiului(de(fibroza(sau(absenta(a(progresiei((H(reducerea(activitatii(necroHinflamatorii((Diagnostic(VHD(H(are(transmitere(parenterala(H(infectia(cu(VHD(apare(doar(la(cei(care(sunt(infectati((au(avut(infectia)(VHB(H(hepatita(D(se(trateaza(doar(cu(PegInterferon(H(in(caz(de(cronicizare(poate(duce(la(cancer;(nu(se(vindeca(si(nici(nu(are(tratament(( Hepatita(acuta(

concomitent(Suprainfectie(H(cronicizare(

Hepatita(cronica(D(

Ag(HBs( +( +( +(

IgM(anti(HBc( +( H( H(

IgM(anti(VHD( +( +( H(

Ag(VHD( +( +( H(

IgG(anti(VHD( H( H( +(

(Diagnostic(VHC(1.(Teste(serologice:((H>(nu(pot(diferentia(intre(o(infectie(acuta,(cronica(sau(vindecata((H(ELISA:(detectie(Ac(anti(VHC.(Are(sensibilitate(mare.(In(populatii(cu(risc(scazut(de(infectie(are(valoare(predictiva(mica.(H(RIBA/(Western(Blot(2.(Teste(moleculare:(H(teste(calitative:(RTHPCR:(pentru(diagnosticul(infectiei(active.(Ajuta(la(detectia(timpurie(a(infectiei.(Dar(o(singura(determinare(negativa(este(neconcludenta(H(teste(cantitative:(RTHPCR,(BHDNA:(aprecierea(rezultatelor(terapiei((pentru(raspuns(virusologic(sustinut).(Nu(exclude(diagnosticul(infectiei(3.(Teste(de(genotipare:(H(secventierea(nucleotidica,(RFLP,(LiPA.(Se(pot(identifica(genotipuri,(subtipuri(si(qvasispecii.(Apreciaza(durata(tratamentului(si(prognosticul(raspunsului(virusologic(sustinut((((

Patternul(serologic(al(infectiei(VHC(acute(cu(vindecare:((H(simptome(;(ARN(VHC(este(detectabil(doar(in(primele(cateva(luni.(Transaminazele(au(un(maxim(la(inceput(apoi(incep(sa(scada(pana(la(normal.(Anticorpii(anti(VHC(cresc(si(se(mentin(la(un(nivel(crescut(Patternul(serologic(al(infectiei(VHC(care(se(cronicizeaza:(H(simptome(;(ARN(VHC(este(persistent(avand(cateva(momente(in(care(poate(fi(nedetectabil.(Transaminazele(variaza(tot(timpul,(iar(anticorpii(anti(VHC(cresc(si(se(mentin(la(un(nivel(crescut.((( Anticorpi( ARN( Explicatii(1( H( H( absenta(infectiei(VHC(2( +( +( infectie(acuta/cronica((activa)(3( H( +( infectie(acuta(recenta(in(fereastra(serologica(/(infectie(cronica(la(

un(pacient(imunosupresat(4( +( H( infectie(vindecata(/(viremie(redusa(sau(fluctuanta;(intermitent(

negativa((Succesul(terapeutic(in(hepatita(cronica(C:((H(Raspunsul(virusologic(sustinut:(duce(la(vindecare;(inseamna(mentinerea(ARN(VHC(nedetectabil(la(mai(mult(de(6(luni(de(la(oprirea(tratamentului.((H(Nonresponderi:(pacienti(care(nu(raspund(la(tratament((H(la(unii(pacienti(poate(aparea(o(recadere(dupa(oprirea(tratamentului((Genotipul(1(este(cel(mai(rezistent(la(tratament(Efecte(adverse(interferon:(leucopenie,(trombocitopenie,(psihologice((Teste(de(genotipare:(LiPA:((H(hibirdizare(cu(sonde(moleculare(cu(specificitate(pentru(regiuni(conservate(din(cadrul(genotipurilor(si(subtipurilor((H(evidentierea(profilului(specific(unui(genotip(prezent(in(ampliconii(din(5NTR(si(miez.((Diagnostic(VHA((H(hepatita(A(nu(cronicizeaza((H(hepatita(A(se(face(o(singura(data((H(simptomatologia(poate(fi(sau(nu(prezenta((Pentru(diagnostic(se(realizeaza(detectie(de(Ac(anti(VHA(IgM,(prin(ELISA(de(caputra.(Prezenta(Ac(anti(VHA(IgG(semnifica(vindecarea(sau(vaccinarea.((ELISA(de(captura(pentru(Ac(IgM:(((H(tehnica:(incubare(ser(pacient;(spalare;(incubare(conjugat((antigen(marcat(enzimatic);(spalare;(incubare(substrat;(citire(la(spectrofotometru(( IgM(

antiVHA(IgG(antiVHA(

Tipul(de(infectie(

1( +( H( hepatita(acuta(2( H( +( vindecat/vaccinat(3( H( H( nu(e(infectat(4( +( +( spre(sfarsitul(infectiei(acute(((((

Utilizarea(metodelor(moleculare(in(infectiile(virale:((H(infectia(HIV((H(infectia(VHB:(monitorizarea(evolutiei(naturale(/(sub(tratament(a(hepatitei(virale(B;(initierea(tratamentului(pentru(hepatita(B((H(infectia(VHC:(diagnosticul(infectiei(active;(aprecierea(rezultatelor(terapiei;(aprecierea(duratei(tratamentului(si(prognosticul((genotipare)((H(infectia(HPV:(detectia(ADN(HPV((PCR);(identificare(genotipuri(high(risk(si(low(risk((genotipare)(

Diagnostic*in*infectia*HIV/SIDA*!Beneficii:!tratament,!monitorizare,!cresterea!calitatii!vietii!Temeri:!agravarea!bolii,!scaderea!calitatii!vietii,!contagiozitatea!!Incarcarea!virala:!In!faza!acuta!creste!incarcarea!virala!mult,!apoi!scade!si!se!mentine!la!un!nivel!sesizabil!dar!mai!scazut,!pana!in!perioada!SIDA,!cand!iar!creste!mult!(10^7).!!Numarul!de!celule!CD4+:!In!faza!acuta!scade!pana!la!un!punct!in!care!incarcarea!virala!este!cea!mai!mare,!apoi!creste!iar,!dar!doar!pana!la!vreo!600,!dupa!care!incepe!sa!scada!progresiv!pana!la!moarte,!cand!vor!fi!doar!cateva.!Complicatii!infectie!HIV:!encefalopatie!!I.!Diagnostic!serologic:!K!teste!de!triaj!(sensibilitate):!ELISA,!teste!rapide!K!teste!de!confirmare!(specificitate):!western!blot,!radioimunoprecipitare,!imunofluorescenta!indirecta!II.!Detectia!directa!a!virusului!sau!a!produselor!virale:!izolare!virala,!detecia!antigenemiei!p24,!detectia!acidului!nucleic!viral!(ARN!plasmatic!sau!ADN!limfocitar)!!I.!Diagnostic!serologic!ELISA:!1.!Incubare!ser!pacient!1h!la!37C!2.!Spalare!3.!Incubare!conjugat!(Ac!anti!IgG!x!enzima)!1h!la!37C!4.!Spalare!5.!Incubare!substrat!20K30!min!la!temperatura!camerei!6.!Citire!la!sectrofotometru:!probe,!martori!si!cut!off.!Substratul!adaugat!este!colorat!de!catre!enzima!in!functie!de!cantitatea!de!anticorpi!prezenti!in!cuva.!!ELISA!de!competitie:!!!1.!Incubare!ser!pacient!1h!la!37C!!2.!Spalare!!3.!Incubare!substrat!20K30!min!la!temp!camerei!!4.!Citire!la!spectrofotometru!!Western!Blot:!!K!test!imunoblot!folosit!pentru!confirmarea!prezentei!anticorpilor!in!diferite!infectii.!Se!bazeaza!pe!detectia!anticorpilor!defalcati!pe!grupe!antigenice!K!Se!foloseste!pentru:!detectia!proteinelor!virale,!caracterizarea!preparatelor!de!anticorpi!mono!si!policlonali,!determinarea!specificitatii!raspunsului!imun!imptriva!antigenelor!virale.!!K!Principiu:!proteinele!dintrKun!lizat!viral!sunt!separate!electroforetic!dupa!greutatea!moleculara!prind!SDSKPAGE;!apoi!sunt!transferate!pe!o!membrana!de!nitroceluloza.!Apoi!se!realizeaza!detectie!prin!anticorpi!marcati!radioactiv!saun!enzimatic!(colorimetric)!!!K>!electroforeza:!se!realizeaza!pe!gel!de!poliacrilamida,!apoi!proteinele!sunt!transferate!pe!o!membrana!de!nitroceluloza!prin!difuzie,!electroforeza!sau!prin!afinitate.!Fixarea!se!face!prin!simpla!absorbtie!pasiva,!prin!legaturi!covalente,!pe!membrana!diazotata!sau!prin!legare!specifica!pe!membrana!acoperita!de!anticorpi.!!K!Tehnica:!SDSKPAGE;!transfer;!detectia!anticorpilor!K!criteriu!de!pozitivitate:!2!env!+!1!gag!!!K!gag:!gp120,!gp41,!gp160!!!K!env:!p24,!p17,!p7/p9!!!!

!Diagnostic:!!Daca!ELISA!e!negativ,!se!face!duplicat.!Daca!si!acesta!este!negativ!inseamna!ca!ori!nu!este!infectat!ori!se!afla!in!fereastra!serologica!K>!in!care!se!determina!Ag!p24,!ADN!proviral!sau!ARN!HIV.!!Daca!ELISA!este!pozitiv!se!face!western!blot.!Daca!acesta!este!negativ,!pacientul!se!poate!afla!in!fereastra!serologica!si!se!detecteaza!Ag!p24,!ADN!proviral!sau!ARN!HIV.!Dar!poate!fi!necesara!si!repetarea!sau!executarea!unui!alt!test!de!confirmare.!Daca!WB!e!pozitiv!inseamna!ca!are!infectie!HIV.!!II.!Diagnostic!molecular!!K!Amplificarea!tintei:!PCR,!NASBA!!K!Amplificarea!semnalului:!BKDNA!!PCR:!polymerase!chain!reaction.!Este!metoda!utilizata!pentru!detectia!ADNKului!de!orice!tip.!Se!bazeaza!pe!obtinerea!unui!numar!mare!de!catene!tinta!prin!repetarea!unui!nr!de!N!cicluri!ce!contin!in!principal!3!etape:!!K!denaturarea:!incalzire!pentru!separarea!catenelor!!K!aditia!primerilor!la!captele!secventei!tinta:!prin!racire!!K!extensia!primerilor!(sub!actiunea!ADN!polimeraza!Taq):!se!extinde!capatul!3'!al!fiecarui!primer;!prin!incalzire!RT5PCR:*reverstranscriere!+!PCR.!!!Etape:!!K!aditie!primer!la!secventa!tinta!de!ARN!!K!reverstranscriptazele!catalizeaza!extensia!primerului!prin!incorporarea!nucleotidelor!complementare!!K!rezulta!sinteza!ADN!complementar!pe!secventa!tinta!ARN!!Apoi!se!face!PCR.!!Detectia!ampliconului:!!K!electroforeza!in!gel!de!agar,!colorare!cu!bromura!de!ethidiu!si!comparare!cu!markeri!de!greutate!moleculare!cunoscuta!!K!hibridizare!cu!sonde!moleculare!marcate!complementar!si!apoi!detectie!(spectrofotometrica)!!Utilizarea!metodelor!moleculare!in!infectia!HIV!!!Pacienti!aflati!in!fereastra!serologica,!nouKnascuti!din!mame!seopozitive!HIV,!initierea!si!monitorizarea!terapiei!antiretrovirale:!!!!!K!incarcatura!virala!>5.000K10.000!corelat!cu!nr!CD4!si!status!clinic!!!!K!incarcatura!virala!>!30.000K50.000!indiferent!de!nr!CD4!si!status!clinic!!!!K!monitorizarea:!reducerea!incarcaturii!sub!50!de!copii!ARN!HIV/ml!la!24!de!saptamani!!!

Papilomavirusuri,!Determina!tumori!benigne!ale!pielii!care!pot!regresa!spontan.!Papiloamele!mucoasei!genitale!determinate!de!genotipuri!specifice,!mai!ales!tipurile!16,18,6,11,!45!si!31!se!pot!maligniza!daca!persista!mai!multi!ani.!!Papovavirusurile!pot!interactiona!cu!celulele!gazda!in!2!moduri:!!A!infectie!litica!in!celule!permisive!cu!productia!de!virioni!infectanti!!A!infectie!persistenta!in!celule!nepermisive!care!duce!la!transformare!maligna!!Diagnostic,HPV,!Scopul!diagnosticului:!!A!detectia!prezentei!virusului!!A!demonstrarea!infectiei!active!!A!decelarea!tipului!de!virus!implicat!in!infectie!Diagnosticul!direct!vizeaza!detectia!ADNAului!viral!din!leziune!prin!diverse!tehnici.!Se!vizeaza!detectia!secventei!ADN!L1,!E6,!E7.!!!A!hibridizare!cu!sonde!ARN!sintetice!care!captureaza!ADN!viral!prin!real!time!PCR!!A!tehnica!microarray!Diagnosticul!indirect,!serologic,!monitorizeaza!prezenta!anticorpilor!anti!L1!si!poate!decela!infectia!in!curs!de!desfasurare!sau!infectia!vindecata!pentru!a!fi!utilizate!cu!beneficiu!in!clinica.!Genotipare,HPV:!!A!Inno!lipa:!Unul!din!testele!comerciale!folosite!in!Romania!este!destinat!identificarii!a!26!de!genotipuri!diferite!de!HPV!prin!detectia!unro!secvente!specifice!din!regiunea!L1!a!genomului!HPV.!Testul!se!bazeaza!pe!hibridizare!inversa.!O!parte!din!regiunea!L1!a!HPV!este!amplificata!prin!PCR!si!ampliconii!rezultati!sunt!denaturati!si!hibridizati!cu!sonde!oligonucleotidice!specifice.!!Sondele!sunt!imobilizate!ca!liniii!paralele!pe!stripuri!de!celuloza.!Dupa!hibridizare!si!spalare!se!adauga!un!conjuvat!cu!steptavidina!ce!se!cupleaza!cu!orice!hibrid!format!anterior.!Pentru!vizualizarea!si!interpretarea!rezultatelor!se!incubeaza!un!substrat!cromogen.!Rezultatul!acestui!test!poate!fi!pozitiv,!negativ!sau!pozitiv!pentru!alt!genotip!HPV!fara!a!se!cunoaste!genotipul!HPV!responsabil!de!leziune.!!A!Linear!Array!HPV:!bazat!pe!PCR!urmat!de!hibridizarea!acizilor!nucleici!Prevenirea!cancerului!de!col!uterin:!!A!Gardasil:!anti!HPV!6,11,16,18!!A!Cervarix:!anti!HPV!16!si!18!!