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© PX’THERAPEUTICS – ALL RIGHTS RESERVED - 2016.

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De l’ingénierie des protéines

recombinantes

jusqu’à la production de lots cliniques

Stanislas LHOMMEConférence AST – 11 MARS 2016

2© PX’THERAPEUTICS – ALL RIGHTS RESERVED - 2016.

La société PX’Therapeutics

Les protéines médicaments

Les applications

Production et systèmes d’expression

Plan


– Des milliers de molécules en phase de R&D

– Quelques dizaines d’AMM chaque année

– Un risque d’échec très important

– Un coût de développement de plusieurs centaines de Million d’€

– Un secteur extrêmement réglementé

– 50% des nouveaux produits seront issus des biotechnologies

Research &Drug Disc.

Preclinical studies

PhasesI and II

Phase III

ACADEMIC

DISCOVERY

PATIENTS

Secteur pharmaceutiqueQuelques spécificités


2000 : Création de Protein’eXpert (Grenoble)

Activités de services de Recherche et Développement pour la production deprotéines recombinantes

2004 : 1er site de production pharmaceutique dédié à des services debioproduction (Grenoble)

2007: Lancement de la plateforme anticorps monoclonaux (Lyon)

2008: Protein’eXpert devient PX’Therapeutics

2010: Création de la filiale PROMISE ADVANCED PROTEOMICS

Oct 2012: Aguettant acquiert PX’Therapeutics

2016: 16 ans d’expérience, équipe de 35 personnes, 250 clients

PX’TherapeuticsHistorique de la société


800 protein-related projects performed (R&D + GMP grade)250 clients (60% International) / 10 collaborative R&D programs (3/5-year duration)

• Alfact Innovation (FR)• BioMérieux (FR)• Cerep (FR)• CNRS, INSERM (FR)• Cyclacel (GB)• Devgen (BE)• Delta Crystallon (NL)• Diagnostic Grifols (ES) • Effimune (FR)• ElsaLys (FR)• ExonHit Therapeutics (FR/US)• ESRF (FR)• Fovea Pharmaceuticals (FR) • Galderma (FR)• Geneuro (CH)• Genticel (FR)• Glycoform (GB)• GSK (GB)

• Oncomatrix (ES)• OPI/EUSA Pharma (US)• Oxyrane (BE)• Pfizer (FR)• Pangenetics (GB)• Pharmis (PT)• Predix Pharmaceuticals (IL) • Pronota (BE)• Sanofi (FR)• Sisene (FR)• Stallergenes (FR)• Syngenta (GB)• Trophos (FR)• Tibotec (BE)• TSI (US)• UNSW (AU)• Vironova (SE)

• Hopital Necker (FR)• IBS(FR)• IGS (FR)• ImmunNovative Developments(ES)• Innate Pharma (FR)• Intervacc (SE)• Iolite (CA)• LFB (FR)• Mayoli Spindler Laboratory (FR)• MedDiscovery (CH) • Merial (FR) • Merck Italia (IT)• Muroplex (US)• Mymetics (CH/US)• Netris Pharma (FR)• Oncobiopharm (GB)

(non-confidential clients)

PX’TherapeuticsRéférences


Cycle de vie d’un médicament


Transfert/Mise à l’échelle industriellePX: services de R&D et de bioproduction

Ingénierie de protéineHumanisation d’AcTests d’expression

Etude de Faisabilité

Développement de lignée cellulaire

Banque cellulaireDéveloppement de ProcédésDéveloppement analytique

Lots Préclinique

Lots CliniqueCaractérisation de produit

LibérationSupport réglementaire

PX’TherapeuticsPositionnement




Les applications


Plan


Biotechnologie : « application des principes scientifiques et de l'ingénierie à la transformation de

matériaux par des agents biologiques pour produire des biens et services », Définition OCDE.

Biotechnologies généralement restreintes au domaine du génie génétique et aux technologies

issues de la transgénèse, permettant en particulier d'intervenir sur le patrimoine génétique des

espèces pour le décrypter ou le modifier.

Les biomédicaments sont produits à partir de cellules vivantes (biosynthèse) contrairement aux

médicaments classiques qui sont issus de la synthèse chimique. Ils sont formés de molécules

beaucoup plus complexes.

Les acteurs historiques : Amgen, Genentech, Transgene,…

Biotechnologies & BiomédicamentsDéfinitions


Insuline, EPO, anticorps monoclonaux,…

Les remèdes du « Moyen-âge »

Les molécules chimiques (XIXe siècle,…)

Les médicaments biologiques (XXe siècle,…)

Paracétamol

L’évolution de l’industrie du médicament Les médicaments biologiques


Les premières générations de biomédicaments étaient obtenues par extraction d’organes et ou

de tissus d’êtres vivants.

La première protéine pharmaceutique : l’insuline, Banting et Best en 1922

(extrait de pancréas de bœuf ou de porc), Canada.

Depuis les années 1980, elle est produite par des OGM.

75 % de ces médicaments ont été mis sur le marché dans les dix dernières années.

Le rythme de mise sur le marché de nouveaux biomédicaments diminue (~ 6 / an entre 2010 et

2014).

Si l’on exclut insulines et vaccins, 84 % de ces traitements sont délivrés sur prescription

hospitalière initiale ou systématique.

Les BiomédicamentsIntroduction


Les protéinesIntroduction


1. Les protéines sont généralement plus spécifiques, et peuvent couvrir davantage de fonctions,

qu’une « simple » molécule,

2. Du fait de leur spécificité, les effets secondaires attendus peuvent être limités,

3. Les protéines sont potentiellement mieux tolérées et moins immunogènes, du fait de leur

similitudes avec les protéines du soi,

4. Les protéines peuvent être des molécules de substitutions (gène muté, délété ou mal

exprimé),

5. Les développements cliniques sont en moyenne 1 an plus court que pour les petites

molécules (statistiques FDA entre 1980 et 2002 comparant 33 protéines thérapeutiques avec 294 petites molécules),

6. La protection des inventions (brevet) peut être plus importante du fait de la complexité des

protéines (formes, fonctions,…).

Reference: Benjamin Leader et al, Nature Reviews, 2008

Les BiomédicamentsQuels avantages ?




Les applications


Plan


Les protéines de substitution qui permettent de combler un déficit du corps humain. C’est le

cas de l’anémie, de l’hémophilie, du nanisme, du diabète,…

Les vaccins qui sont une substance issue d’un organisme pathogène et injecté au patient pour

l’immuniser contre le pathogène correspondant.

Les anticorps thérapeutiques. De la même façon que le corps humain produit ses propres

anticorps, les anticorps thérapeutiques sont conçus grâce à l’ingénierie moléculaire. Ils

permettent de lutter contre des maladies comme le cancer, la polyarthrite rhumatoïde, ..

Les protéines thérapeutiquesApplications : 3 principales catégories


Les 173 biomédicaments disponibles sur le marché français en 2014 se répartissent en neuf

classes pharmacologiques majeures (LEEM, 2014).

Les biomédicamentsClasses pharmacologiques


Exemple #1L’insuline



Principe de liaison du médicament à sa cible:

Les substances n’agissent pas si elles ne se fixent pas, Paul Ehrlich (1854-1945).


Exemple #2Les vaccins

Vaccins vivants recombinants : les souches des micro-organismes sont rendues

totalement inoffensives en inactivant ou en éliminant les gènes de la virulence.

Antigène recombinant : le vaccin est constitué d’une ou plusieurs protéines antigéniques

spécifiques.

Exemple d’un antigène couplé à une particule afin d’augmenter l’immunogénicité de

l’antigène.


Exemple #2Les vaccins

Electronic microscopy, antigen presence (arrows)

AntigèneProtéine échafaudageProtéine échafaudage

Protéine échafaudage d’un complexe protéique de la Baccillus Stearothermophilus


Exemple #3Les anticorps : structure et fonctions

Complementarity-determining regions (CDRs), ou region hypervariables

Activation du

complément

Site fixation

macrophage *

*: nature du Fc (quand il y en a un) conditionne la fonctionnalité de l’anticorps


Exemple #3Les anticorps : structure et fonctions


CH

2CH

3

FAbscFAb

scFv

diabody

minibody scFv-zipper(Fab)2

VHH

nanobody

Exemple #3Les anticorps : ingénierie des fragments

Il est possible de produire des fragments d’anticorps offrant des bénéfices en termes de facilité de

production, de bio-dispersion, de fonctionnalités, …

Exemple des FAb antagoniste ou neutralisant (fixation à une molécule membranaire ou soluble).


immunogénicité

durée d’action & efficacité

Exemple #3Les anticorps : ingénierie des fragments

CDR


Exemple #3Les anticorps : optimisation des anticorps

L’optimisation des anticorps repose sur le remplacement total ou partiel des domaines murins par

des domaines humains.

Gains d’immunogénicité, de ½ vie et modulation des fonctions effectrices.


ExemplesLes conjugués anticorps-médicament (ADC)

Exemple du Kadcyla (trastuzumab emtansine), Roche. AMM en 2013.

Application :

Traitement du cancer du sein métastatique HER2- positif.

Le concept consiste à utiliser la spécificité d’un anticorps

pour cibler la cellule tumorale et vectoriser un agent

hautement toxique qui lui est associé.


ExemplesLes anticorps bispécifiques

Un anticorps possède deux bras. Il serait dommage de ne pas en profiter !

Les anticorps bispécifiques sont des anticorps manipulés de manière à ce que chacun de leurs deux

bras puisse se lier à un antigène différent.

Applications :

Gains de spécificité : ciblage de deux types de récepteurs spécifiques de l’organisme que l’on veut

éliminer. Les risques de toucher des cellules saines, non visées par la thérapie, diminuent d’autant.

Nouvelle fonctionnalité : rapprochement de deux cibles pour faciliter leur interaction.

Au lieu de se contenter de saisir ou la fiche électrique, ou la prise électrique comme l’anticorps mono-spécifique,

l’anticorps bispécifique tient la fiche électrique d’une main et la prise électrique dans l’autre main.


ExemplesLes anticorps bispécifiques


ExemplesLes nouvelles voies d’administration

& modifications post-traductionnelles

Objectifs:

Remplacer la voie d’administration intraveineuse,

Augmenter la demi-vie, diminuer l’immunogénicité.

L’utilisation des voies sous cutanée, pulmonaires et orales représentent plusieurs challenges:

Diminuer les volumes, donc concentrer les protéines à > 100 mg/mL,

Stress physiques liés à la nébulisation,

Vectorisation et stabilisation des protéines pour passer les muqueuses,…

Certaines modification des protéines permettent d’augmenter leur demi-vie:

Encapsulation,

Pegylation

Interféron alpha pegylé,

EPO pegylé




Les applications


Plan


Les protéines médicamentsDes protéines animales aux protéines recombinantes

Les premières protéines thérapeutiques étaient extraites de fluides biologiques ou d’organes

animaux ou humains :

Insuline

Hormone de croissance

Facteur VIII



Cette voie comporte des risques:

Risque de contamination (sujets malades non détectés)

Hormone de croissance (extraction hypophyse bovin, prions, 117 décès en France)

Hétérogénéité des protéines d'extraction animales, pouvant provoquer des réactions

immunitaires chez les patients

Disponibilité limitée de matière première

l'hypophyse humaine (hormone de croissance) : 10 cadavres / patient / an

Insuline : 70 pancréas de cochon (1 kg pour soigner 1 patient pendant 1 an)

Facteur VII : 4 000 L de sang / 1 patient / an)



La connaissance des gènes et les procédés biotechnologiques ont ouvert, au début des années

1980, une nouvelle voie pour la production des protéines thérapeutiques.

Le procédé se déroule en quatre phases :

Détection et isolation du gène humain codant pour la protéine recherchée,

Intégration de ce gène dans une cellule-hôte

Culture des cellules qui expriment la protéine,

Extraction et purification de la protéine.

La protéine thérapeutique ainsi fabriquée est

dite recombinante.


Chez les procaryotes, la transcription et la traduction sont effectuées dans le cytoplasme

Chez les eucaryotes, la transcription et la maturation de l’ARNm sont effectués dans le noyau.

La traduction est effectuée dans le cytoplasme et dans le RE

Les systèmes d’expressionTranscription et traduction


Les systèmes d’expressionPrincipe de production


Les systèmes d’expressionLes grandes étapes de production

La production de biomasse par fermentation



Un fermenteur industriel



La purification



ligA s75prep 070815:10_UV1_280nm ligA s75prep 070815:10_UV2_254nm ligA s75prep 070815:10_Fractions ligA s75prep 070815:10_Logbook

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Protéine Fabriquant Indication Système d’expression

Facteur de coagulation VIII (Advate1, Helixate nexgen2, Kogenate3, Novoseven4, …)

Baxter1, Bayer2,3, Novo Nordisk4

Hemophilia A Baby Hamster Kidney(BHK) cells BHK 2,3,4 ;

Chinese hamster ovary (CHO) cells 1

Facteur de coagulation IX (BeneFix1, Refacto2)

Pfizer1, Wyeth2 Hemophilia B Chinese hamster ovary (CHO) cells 1,2

Tissue plasminogen activatorTPA (Actilyse1, Metalyse2,

Rapilysin3)

Boehringer1,2, Roche (Genetech)3

Acute myocardialinfarction

CHO1,2,3

Insulin Eli Lilly, Novo Nordisk, Sanofi,…

Diabetes mellitus E. Coli, Saccharomyces cerevisiae

Human growth hormone Eli Lilly, Genetech, Upjohn, Novo Nordisk

GH deficiency in children (dwarfism)

Principalement E. Coli

Erythropoietin Janssen, Amgen, Ortho Biotech

Anemia CHO

DNase I (Pulmozyme) Roche (Genetech) Cystic fibrosis CHO

Various interferons (IFN) Schering, Biogen, Chiron,

Genetech

Hepatitis B and C, multiple sclerosis

E coli

Exemple de protéines thérapeutiqueset leurs systèmes d’expression


- Contraintes économiques- Contraintes réglementaires- Contraintes scientifiques et techniques

Choix du systèmed’expression

Les systèmes d’expression2 grandes tendances


Les systèmes d’expressionAppercu des +/-


Les biomédicamentsDes grandes tendances …

Les biomédicaments représentent 1 nouveau médicament sur 2, cette part devrait encore croitre.

Ils sont au cœur des innovations thérapeutiques, beaucoup de promesses reposant en particulier

sur les anticorps.

Les biosimilaires font leur apparition.

(20 à 30 % moins chers,

CA : 100 M€ / 5 B€ en 2014, + 34 % de croissance annuelle,

opportunités liées aux prochaines péremptions des brevets)

On peut anticiper une diminution des couts de production; les systèmes d’expression microbiens et

en cellules mammifères resteront la règle, mais certaines protéines seront produites dans des

animaux transgéniques, et dans des plantes.

Les couts de développements continuent d’augmenter.


Les biomédicamentset quelques hypothèses

La thérapie génique (correction et modulation de l’expression des protéines du soi) joue, et jouera

un rôle complémentaire dans les approches thérapeutiques.

L’utilisation d’ADN recombinant peut devenir une alternative, par exemple pour les protéines qui

ne peuvent être produites par culture cellulaire ou qui sont instables,…

Les cellules du patient se chargeront de produire la protéine médicament, ouvrant également des

possibilités prometteuses liées au ciblage de l’expression dans les cellules spécifiques.


Stanislas LHOMMEDirecteur de projet

PX'Therapeutics7, parvis Louis Néel

MINATEC / BHT - 52 ACS20050

38040 Grenoble Cedex 9FRANCE

www.px-therapeutics.com

Merci pour votre attention !

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