red de biodegradaciÓn de lignina y hemicelulosa “ estudio comparativo de la acción de mediadores...
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RED DE BIODEGRADACIÓN RED DE BIODEGRADACIÓN DE LIGNINA Y HEMICELULOSADE LIGNINA Y HEMICELULOSA
“ “ Estudio comparativo de la acción de Estudio comparativo de la acción de mediadores redox de lacasa en la transformación mediadores redox de lacasa en la transformación
de ligninasde ligninas””
K. González ArzolaK. González Arzola aa, M.C. Arévalo , M.C. Arévalo bb, M.A. Falcón , M.A. Falcón aa
a. Departamento de Microbiología y Biología Celular, Universidad de La Laguna, Tenerife.a. Departamento de Microbiología y Biología Celular, Universidad de La Laguna, Tenerife.b. Departamento de Química Física, Universidad de La Laguna, Tenerife.b. Departamento de Química Física, Universidad de La Laguna, Tenerife.
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OBJETIVOSOBJETIVOS
• Caracterización electroquímica de los Caracterización electroquímica de los mediadores redoxmediadores redox
• Desarrollo de sistemas acuosos lacasa-Desarrollo de sistemas acuosos lacasa-mediador para la transformación de ligninasmediador para la transformación de ligninas
• Estudio de las transformaciones mediante técnicas Estudio de las transformaciones mediante técnicas cromatográficas, espectrofotométricas y electroquímicascromatográficas, espectrofotométricas y electroquímicas
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MediadoresMediadores
S
N
N N
S
NO3S
SO3
N
N
N OHH
H
O
OO
2,2’-azino-bis-3- etilbenzotiazolin2,2’-azino-bis-3- etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico-6-ácido sulfónico (ABTS)ABTS)
Ácido violúricoÁcido violúrico ((VAVA))
1-Hidroxibenzotriazol 1-Hidroxibenzotriazol ((HBTHBT))
N
N
N
OH
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LigninasLigninas
Lignina de Kraft (Indulina AT, Lignina de Kraft (Indulina AT, Westvaco): Westvaco): KLKL
Lignina Björkman de pino: Lignina Björkman de pino: PLPL
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1 mM 1 mM HBT HBT
Sistema Lacasa-mediador Sistema Lacasa-mediador (LMSs)(LMSs)
ComponentesComponentes
1 mg 1 mg LigninaLignina (KL o PL) (KL o PL)en 5 mM NaOHen 5 mM NaOH
0.2 U 0.2 U LacasaLacasaen Tampón Mc Ilvaine 0,1 M en Tampón Mc Ilvaine 0,1 M
pH 6 pH 6
1 mM 1 mM ABTSABTS
10 mM 10 mM VAVA
37ºC 1400 rpm37ºC 1400 rpm
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Después de 48 h de incubación:Después de 48 h de incubación:
Espectrofotometría UV-Vis Espectrofotometría UV-Vis
Cromatografía de Exclusión Cromatografía de Exclusión molecular (SE) en HPLCmolecular (SE) en HPLC
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Cromatografía de exclusión Cromatografía de exclusión molecular en HPLCmolecular en HPLC
Aliquat 336 20 mM en Tetrahidrofurano
Bomba binaria Waters 1525
Inyector automático
ColumnasGHXL
HXL 3000HXL 4000
Fotodiodo Array
0
1
2
3
210 260 310 360 410 460
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)
Abs
orba
ncia
280
nm
Perfiles de MM
Espectros UV-Vis
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Voltametría CíclicaVoltametría Cíclica
Electrodo de trabajo (grafito)Electrodo de trabajo (grafito)
Electrodo de ref. Electrodo de ref. (ECS)(ECS)
Contraelectrodo Contraelectrodo (Pt)(Pt)
Potenciostato-Potenciostato-galvanostatogalvanostato
-18
-12
-6
0
6
12
18
0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,1Potencial (V)
Co
rrie
nte
(u
A)
Citrato sódico pH 6 Citrato sódico pH 6 37ºC37ºC
CiclovoltagramasCiclovoltagramas
• Mediadores 0,2 mMMediadores 0,2 mM
• Ligninas 0,2 mg/mlLigninas 0,2 mg/ml
• Velocidad 5 mV/sVelocidad 5 mV/s
• 37ºC37ºC
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Voltametría Cíclica: Voltametría Cíclica: ABTSABTS
ABTS·+
E0’ 440 mV
ABTS2+
E0’ 854 mV
ABTS
KL
KL + ABTS
ABTS
PL + ABTS
PL
Potencial (V)
0.2 0.6 10.80.4
9
14
-1
4
19
Co
rrie
nte
(μ
A)
0.2 0.6 10.80.4
7
11
-1
3
15
Co
rrie
nte
(μ
A)
Potencial (V)
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Potencial (V)
0.2 0.6 10.80.4
4
7
-2
1
10
Co
rrie
nte
(μ
A)
Voltametría Cíclica: Voltametría Cíclica: VAVA
VA
PL + VA
E0’ 632 mV
KL
KL + VA
VAPL
Potencial (V)
0.2 0.6 10.80.4
2.8
4.8
-1.2
0.8
6.8
Co
rrie
nte
(μ
A)
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Potencial (V)
0.2 0.6 10.80.4
4
6
0
2
8
Co
rrie
nte
(μ
A)
Potencial (V)
0.2 0.6 10.80.4
5
7.5
0
2.5
10
Co
rrie
nte
(μ
A)
KL + HBT
Voltametría Cíclica: Voltametría Cíclica: HBTHBT
PL + HBT
HBT
E0’~ 840 mV
KL
HBT
PL
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Lac activa
10 20 30 40 50 60 70
0.03
0
0.06
0.09
0.12
Tiempo (min)
Ab
sorb
anci
a 28
0 n
m
0.0125
0
0.025
0.0375
0.05
Tiempo (min)
Ab
sorb
ance
280
nm
10 20 30 40 50 60 70
Cromatografía SE : Cromatografía SE : ABTSABTS
Control
87 kDa 0,8 kDa
KL PL
Control
Lac activa
87 kDa 0,8 kDa
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Espectrofotometría UV- VISEspectrofotometría UV- VIS
nmnm 230230 240240 260260 270270 280280 300300 340340 395395
KLKL
ABTS(66 min)(66 min)
62.4 160.9 89.9 658.9 58.5 166.4 113.2 7.7
VA(32 min)(32 min)
4.6 3.1 3.6 3.5 3.4 3.7 4.0 4.7
HBT(32 min)(32 min)
1.4 1.5 1.6 1.6 1.6 1.7 1.3 1.7
PLPL
ABTS(46 min)(46 min)
16.9 17.4 12.2 13.5 14.1 22.7 203.2 4.2
VA(26 min)(26 min)
23.6 30.2 19.9 6.7 6.7 3.5 4.8 3.9
HBT(24 min)(24 min)
0.9 4.1 4.3 3.5 2.8 2.7 3.3 3.4
89.9 658.9 113.2
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Tiempo (min)
0.03
0
0.06
0.09
0.12
10 20 30 40 50 60 70
Ab
sorb
anci
a 28
0 n
m
KL
400 kDa 5,6 kDa
Cromatografía SE : Cromatografía SE : VAVA
Control
Lac activa
PL
Control
Lac activa
400 kDa 5,6 kDa
Tiempo (min)
0.015
0
0.03
0.045
0.06
10 20 30 40 50 60 70
Ab
sorb
anci
a 28
0 n
m
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Tiempo (min)
Ab
sorb
anci
a 28
0 n
m
0.12
0
0.24
0.36
0.48
10 20 30 40 50 60 70
Cromatografía SE : Cromatografía SE : HBTHBT
KL
ControlLac activa
400 kDa 5,6 kDa
PL
ControlLac activa
400 kDa 5,6 kDa
Tiempo (min)
0.045
0
0.09
0.135
0.18
10 20 30 40 50 60 70
Ab
sorb
anci
a 28
0 n
m
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Los mediadores HBT y VA inactivan a las Los mediadores HBT y VA inactivan a las lacasas (Li et al. 1999).lacasas (Li et al. 1999).
La estabilidad de los sistemas lacasa-La estabilidad de los sistemas lacasa-mediador se incrementa en presencia de las mediador se incrementa en presencia de las ligninas.ligninas.
Por tanto, la gran despolimerización Por tanto, la gran despolimerización detectada podría deberse a este efecto. detectada podría deberse a este efecto.
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CONCLUSIONESCONCLUSIONES
1. Los estudios electroquímicos revelaron que el ABTS presentó los mejores resultados catalíticos. El radical ABTS.+ oxidó la KL con mayor intensidad, mientras que el dicatión ABTS2+ catalizó mejor a la PL.
2. El sistema lacasa-ABTS despolimerizó ambas ligninas, despolimerización que resultó más importante para la PL.
3. Los sistemas constituidos por los mediadores N-OH (VA y HBT) polimerizaron ambas ligninas. Esta polimerización fue más intensa que con lacasa sola, lo que se podría atribuir parcialmente a la mayor estabilidad en presencia de estos mediadores y de ligninas.