regulatorni molekuli rnk skriveni jezik rnkbiolozi.bio.bg.ac.rs/attachments/article/2194/mirnk...
TRANSCRIPT
1
REGULATORNI MOLEKULI RNK — "SKRIVENI JEZIK
RNK"
Prema hipotezi RNK sveta rani život bio je zasnovan na molekulima RNK koji su kasnije čuvanje
informacije "prepustili" stabilnijem molekulu DNK, a katalitičke funkcije svestranijim proteinima. Zbog
toga, bez obzira na njihove ključne uloge u procesima translacije i splajsovanja, molekuli RNK su
donedevno shvatani kao prolazni intermedijeri izmeĎu gena i proteina, kako i predviĎa centralna dogma
molekularne biologije. MeĎutim, fascinantno otkriće da se najveći deo genoma eukariota transkribuje na
vremenki i prostorno regulisan način (93% kod čoveka!), kao i otkriće različitih klasa nekodirajućih
RNK, dovelo je u pitanje tradicionalno shvatanje RNK i ukazalo da su molekuli RNK nastavili da
evoluiraju uporedo sa DNK i proteinima. Uzbudljiva otkrića vezana za molekule RNK u poslednjih
desetak godina ukazuju da oni obavljaju najraznovrsnije funkcije u današnjim eukariotskim ćelijama,
uključujući i čitav niz regulatornih funkcija.
Otkriće novog RNK sveta bitno je izmenilo naše shvatanje o organizaciji i funkcionisanju
eukariotskog genoma, a sa tim i osnovne koncepte molekularne biologije, kao što su definicija i
organizacija gena u genomu i centralna dogma molekularne biologije. Danas je jsano da kod eukariota
genom eksprimira dva nivoa informacija: iRNK, koje kodiraju proteine, i nekodirajuće RNK, uglavnom
sa regulatornom funkcijom. Regulatorne RNK su esencijalne u kontroli svih nivoa ekspresije genoma i
formiraju složenu regulatornu mrežu koja funkcioniše paralelno sa regulatornom mrežom proteina. Geni
se danas smatraju delovima genoma koji se transkribuju i koji su modularno, a ne linearno rasporeĎeni u
genomu.
1. MALE NEKODIRAJUĆE RNK - PREGLED
Nekodirajuće RNK su svi funkcionalni molekuli RNK koji se ne translatiraju u proteine. Najveći broj
njih obavlja regulatornu funkciju, a neki imaju strukturnu i/ili katalitičku ulogu. Regulatorni molekuli
RNK se dele u dve grupe: duge nekodirajuće RNK i male regulatorne RNK. Prema podacima projekta
ENCODE (The Encyclopedia of DNA Elements) iz 2013. godine broj gena za duge nekodirajuće RNK u
genomu čoveka je 13 870, a broj gena za male nekodirajuće RNK je 9 013
(http://www.gencodegenes.org/stats.html).
Duge nekodirajuće RNK (eng. long non-coding RNA, lncRNK) su duže od 200 nukleotida (nt),
ne sadrže jasan okvir čitanja i, uglavnom, predstavljaju regulatorne molekule koji su uključeni u svim
nivoima ekspresije genoma: epigenetičku, transkripcionu, post-transkripcionu, translacionu i post-
tanslacionu regulaciju.
Male nekodirajuće RNK (eng. small non-coding RNA) su dužine 20 do 30 nt, prepoznaju
komplementarnu sekvencu u ciljnim RNK i kroy interakciju sa proteinima familije Argonaut regulišu
invazivne nukleinske kiseline (virusne RNK i transpozone), post-transkripcionu ekspresiju genoma i
epigenetičku memoriju. Familija proteina Argonaut je evoluciono visoko konzervisana i
2
specijalizovana za vezivanje i ostvarivanje funkcije malih regulatornih RNK. Dve velike subfamilije
proteina Argonaut su proteini AGO i proteini PIWI (eng. P-element induced wimpy testis).
Represija ili utišavanje ciljnih nukleinskih kiselina koje su komplementarne malim nekodirajućim
RNK naziva se RNK interferencija (RNKi). RNKi je modularan mehanizam u kome male nekodirajuće
RNK prepoznaju ciljne nukleinske kiseline, a proteini familije Argonaut obavljaju efektorne funkcije,
samostalno ili kroz interakciju sa dodatnim proteinima.
Utišavanje ekspresije gena pomoću RNKi ostvaruje se (1) post-transkripcionom
represijom/utišavanjem komplementarne ciljne RNK i (2) epigenetičkom utišavanjem komplementarnih
sekvenci u genomu. Na post-transkripcionom nivou RNKi reguliše stabilnost i translaciju ciljnih RNK
sledećim mehanizmima: endonukleolitičkom degradacijom, translacionim represijom/utišavanjem i
destabilizacijom ciljne iRNK. Poslednjih godina akumuliraju se podaci da male nekodirajuće RNK mogu
stimulisati translaciju ciljnih RNK. U epigenetičkoj regulaciji male nekodirajuće RNK usmeravaju
uspostavljanje odreĎne strukture hromatina u regionima genoma koji sadrže sekvence komplemantarne sa
malim RNK. Ovaj proces zahteva aktivnu transkripciju u regionu koji se epigenetički reguliše i uključuje
dva mehanizma: ko-transkripciono epigenetičko utišavanje i RNK-usmerenu metilaciju DNK (eng. RNA-
directed DNA methylation, RdDM).
RNKi otkrivena je 1998. godine kao veštački fenomen, kada je opisano da unošenje sintetičke
dvolančane RNK u C. elegans dovodi do produkcije malih RNK koje na sekvenca-specifičan način
degraduju iRNK. Samo osam godina kasnije, 2006. godine, za otkriće RNKi dodeljena je Nobelova
nagrada. Danas je poznato da je RNKi prirodan fenomen, široko zastupljen meĎu eukariotima. Biološki
procesi u kojima je uključena su odbrana od invazivnih nukleinskih kiselina (virusa i transpozona), i
epigenetička i post-transkripciona regulacija ekspresije gena povezana sa svim aspektima funkcionisanja
eukariotskih ćelija tokom razvića i u normalnim i patološkim uslovima. Od 2013. godine poznato je da
RNKi nije ekskluzivno svojstvo eukariota, već je reč o drevnom mehanizmu koji i prokarioti koriste kako
bi kontrolisali strane nukleinske kiseline.
Tabela 1. Klase malih nekodirajućih RNK
Vrsta Dužina
(nt) Prekursor
Obrada
prekursora
Subamilija
Argonaut Mehanizam delovanja Funkcija
siRNK 21-25
Egzogena ili
endogena duga
dvolančana RNK
Dicer AGO
Endonukleolitička
degradacija
Epigenetičko utišavanje
Odbrana od virusa
Regulacija transpozona
Regulacija ekspresije gena
miRNK 21-23
Jednolančana RNK
koja formira
strukturu ukosnice
Drosha i
Dicer AGO
Translaciona represija
Endonukleolitička
degradacija
Translaciona aktivacija
Regulacija ekspresije
gena
piRNK 24-32 Duge jednolančane
RNK Nepoznata PIWI
Endonukleolitička
degradacija
Epigenetičko utišavanje
Translaciona represija i
aktivacija?
Regulacija transpozona
Regulacija ekspresije gena
nt – nukleotid
Funkcije koje se primarno vezuju za odreĎenu klasu malih nekodirajućih RNK prikazane su u boldu
3
Veštačka RNKi primenjuje se kao veoma efikasna ekspreimentalna alatka za utišavanje gena.
Ona omogućava i novi pristup u dizajniranju genetičkih terapija koje mogu specifično isključiti funkciju
nekog gena.
Prema široko prihvaćenoj podeli, male nekodirajuće RNK dele se u tri klase, koje se meĎusobno
razlikuju po biogenezi (poreklu i načinu obrade prekursornog molekula od kojeg nastaju), proteinima
familije Argonaut sa kojima stupaju u interakciju, mehanizmima kojim ostvaruju RNKi i funkcijama koje
obavljaju (tabela 1).
Male interferirajuće RNK (eng. small interfering RNA, siRNA) su dužine 21-25 nt, nastaju
obradom dugog dvolančanog prekursora endoribonukleazom Dicer i stupaju u interakciju sa proteinima
AGO (slika 1, tabela 1). Dugi dvolančani prekursori siRNK su ili egzogeno unete (virusna RNK ili
sintetička RNK) ili endogeno sintetisane RNK. Ove regulatorne RNK imaju funkciju u odbrani od virusa,
kontoli transpozona i regulaciji ekspresije gena. Funkcije ostvaruju endonukleolitičkom degradacijom
ciljnog transkripta ili usmeravanjem epigenetičkog utišavanja.
MikroRNK (miRNK) su dugačke 21 do 23 nt, nastaju obradom jednolančanog prekursora RNK
u obliku ukosnice endoribonukleazama Drosha i Dicer, i stupaju u interakciju sa proteinima AGO.
MikroRNK imaju esencijalnu ulogu u post-transkripcionoj regulaciji ekspresije gena, koju ostvaruju
endonukleolitičkom degradacijom ciljne RNK, translacionom represijom i destabilizacijom ciljne iRNK,
ali i translacionom aktivacijom (slika 1, tabela 1).
RNK koje stupaju u interakciju sa proteinima PIWI (eng. PIWI-interacting RNA, piRNK) su
dugačke 24 do 32 nt, nastaju od veoma dugačkih jednolančanih prekursora čija obrada ne uključuje enzim
Dicer, stupaju u interakciju sa proteinima PIWI i dovode do degradacije ciljnih RNK (slika 1, tabela 1).
Piwi RNK su karakteristične samo za životinje i imaju ključnu ulogu u kontroli transpozona i razviću i
diferencijaciji polnih ćelija. Endonukleolitički degraduju transkripte prepisane sa transpozona i
usmeravaju epigenetičko utišavanje genomskih kopija transpozona. Noviji podaci ukazuju da piRNK
mogu kontrolisati i ekspresiju gena translacionim represijom ili translacionom aktivacijom.
4
Slika1. Male nekodirajuće RNK. Tri klase malih nekodirajućih RNK razlikuju se prema biogenzi, proteinima
familije Argonaut sa kojima stupaju u interakciju, mehanizmima delovanja i funkcijama koje obavljaju. Male
interferirajuće RNK (siRNK) nastaju od egzogeno unetih ili endogeno sintatisanih dvolančanih prekursora koje u
citoplazmi obraĎuje Dicer. Stupaju u interakciju sa proteinima AGO i dovode do endonukleolitičke degradacije
ciljnog transkripta ili usmeravaju epigenetičko utišavanje ciljnih sekvenci u genomu (nije prikazano na slici).
MikroRNK (miRNK) nastaju od prekursora prepisanog sa gena za miRNK koji formira strukturu ukosnice i
obraĎuje se sa Drosha i Dicer. Stupaju u interakciju sa proteinima AGO i ukoliko se perfektno spare se ciljnom
RNK dovode do njene endonukleolitičke degradacije. U slučaju neperfektnog sparivanja sa ciljnom RNK, miRNK
dovode do translacione represije interferiranjem sa cirkularizacijom iRNK ili stabilnošću iRNK. Alternativni put
biogeneze miRNK iz mirtrona, prekursora miRNK kodiranog celim intronom, ne zahteva učešće Drosha več
iskrajanjem mirtorona nastaje pre-miRNK. RNK koje stupaju u interakciju sa proteinima PIWI (piRNK) nastaju od
veoma dugačkih jednolančanih prekursora čija obrada ne uključuje enzim Dicer i stupaju u interakciju sa proteinima
PIWI. Karakteristične su za životinje. Dovode do post-transkripcione degradacije aktivnih transpozona i
epigenetičkog utišavanja genomskih kopija transpozona (nije prikazano na slici).
5
2. MIKRORNK (MIRNK)
MikroRNK su otkrivene 2004. godine kod C. elegans, a kasnije su opisane kod svih izučavanih životinja,
biljaka i nekih virusa. Predstavljaju male nekodirajuće RNK sa esencijalnom funkcijom u
post-transkripcionoj regulaciji ekspresije gena kod životinja i biljaka. Procenjuje se da je jedna
polovina gena za proteine kod čoveka regulisana sa miRNK. Jedna miRNK može imati veliki broj
(stotine, čak i hiljade) ciljnih iRNK, dok jedna iRNK može biti regulisana sa većim brojem miRNK. Uz
to, eksprasija miRNK je tkvino i razvojno regulisana. Navedeno ukazuje da je regulacija ekspresije gena
sa miRNK veoma složena i da direktno ili indirektno utiče na skoro svaki aspekt razvića i funkcionisanja
u fiziološkim i patološkim stanjima. Mutacije u putu miRNK dovode do poremećaja razvića, i često su
letalne za embrion. Poremećaji u ekspresiji i funkciji miRNK vezuju se i za razna patološka stanja kao što
su maligne bolesti, razvojni poremećaji i bolesti imusnkog sistema.
2.1. Geni za mikroRNK
MikroRNK su kodirane genima koji su nezavisno rasporeĎeni u genomu ili su delovi gena za proteine,
gena za duge nekodirajuće RNK ili pseudogena (slika 2a). U okviru drugih gena, geni za miRNK nalaze
se u intronima, ali su opisani i u netranslatirajućim i kodirajućim delovima gena za proteine (slika 2a).
TakoĎe, geni za miRNK kod sisara mogu se nalaziti u ponovljenim sekvencama genoma, pre svega u
transpozonima. Neki geni za miRNK kod biljaka imaju introne, alternativno se splajsuju i sadrže
alternativne signale za poliadenilaciju.
Transkripti prepisani sa gena za miRNK formiraju strukturu ukosnice. U "ručici" dvolančane
drške nalazi se informaciju za zrelu miRNK (slika 2b). Sve je veći broj primera da obe "ručice" iz drške
sadrže informaciju za po jednu zrelu miRNK, od kojih svaka ima svoju grupu ciljnih transkripata.
Karakteristična sekundarna struktura ukosnice omogućava da se bioinformatičkim predikacijama
identifikuju nove miRNK i njihovi ciljni geni. Bioinformatički identifikovane miRNK označavaju se
prefiksom miR i rednim brojem. Baza podataka za miRNK, MiRBase (http://www.mirbase.org/), sadrži
24 521 bioinformatički predviĎenih prekursora miRNK u genomima 206 vrsta, za koje je procenjeno da
mogu eksprimirati 30 424 zrele miRNK (Release 20, 2013. godina). U odnosu na 2011. godinu broj
predviĎenih zrelih miRNK se skoro udvostručio. Potvrda da je predviĎena sekvenca ćelijska miRNK
podrazumeva njeno identifikovanje u ćelijama, kao i utvrĎivanje da ekspresija ciljnog gena zavisi od
prisustva ispitivane miRNK. Za preko 300 prijavljenih sekvenci iz genoma čoveka postoji
eksperimentalna potvrda da predstavljaju miRNK.
6
Slika 2. Geni za mikroRNK i njihovi transkripti : a) geni za miRNK nalaze se u okviru različitih regiona gena,
najčešće u intronima; b) Transkripti prepisani sa gena za miRNK formiraju karakterističnu strukturu ukosnice i u
ručici ukosnice sadrže sekvence za jednu ili dve različite miRNK (sekvence označene crvenim i plavim slovima).
2.2. Biogeneza mikroRNK i formiranje utišavajućeg kompleksa miRISC
Funkcionalne miRNK su obično dugačke 21 do 23 nt i nastaju od prekursornog molekula, primarne
miRNK (pri-miRNK) koja ima strukturu ukosnice (slike 1 i 4). Pri-miRNK sa nezavisnih gena
transkribuje Pol III, a gene za miRNK koji su deo drugih gena najverovatnije transkribuje Pol II. U
nukleusu, delovanjem endoribonukleaze Drosha od pri-miRNK nastaje prekursor miRNK
(pre-miRNK), koji se transportuje u citoplazmu (slike 1 i 4). U citoplazmi, pre-miRNK je supstrat za
drugu endoribonukleazu Dicer, čijom aktivnošću nastaje dvolanĉana miRNK. Ona stupa u interkaciju sa
jednim od proteina AGO, nakon čega se formira kompleks jednolančana miRNK-AGO. Ovaj kompleks
sa dodatnim proteinima, formira utišavajući kompleks miRISC (eng. miRNA-induced silencing
complexes), koji deluje na ciljne iRNK (slike 1 i 4).
Ključni proteini u biogenezi miRNK su Drosha i Dicer. Pripadaju endoribonukleazama iz
familije RNaza III. RNaze III deluju na dvolančane RNK uvodeći po jedan prekid u oba lanca. Drosha i
Dicer imaju vezivne domene za dvolanĉanu RNK (eng. double strand RNA binding domains, dsRBDs),
duge oko 65 aminokiselina, pomoću kojih prepoznaju i vezuju dvolančanu RNK (slika 3). Pomoću dva
simetrična RNazna domena uvode po jedan prekid u oba lanca dvolančane RNK. Mesto sečenja
selektuju merenjem, a ne prepoznavanjem specifične sekvence RNK (slika 4). Dvolančani prekid u RNK
supstartu je asimetričan, tako da oba proteina ostavljaju jednolančane 3'-krajeve dužine dva nt (eng.
3'-overhang) (slika 4). Drosha sadrži još dva domena za protein-protein interakcije(slika 3). Dicer sadrži
još četiri funkcionalna domena, od kojih domen PAZ specifično prepoznaje i vezuje jednolančani 3'-kraj
dužine dva nt. Naziv je dobio po proteinima u kojima se nalazi (Piwi, Argonaute i Zwille) (slika 3).
7
Kičmenjaci i C. elegans sadrže po jedan gen za Dicer, dok D. melanogaster sadrži dva. Biljke
imaju veći broj proteina sličnih Diceru (eng. Dicer-like proteins), koji obavljaju specijalizovane funkcije
u kompleksu sa različitim proteinima koji se vezuju za dvolančane RNK. Genomi biljka ne sadrže ortolog
gena za Drosha, i svi koraci u biogenezi miRNK kod Arabidopsis thaliana obavljaju se pomoću jednog
od četiri proteina sličnih Diceru.
Slika 3. Domenska organizacija ribonukleaza Drosha i Dicer i njihovih pomoćnih proteina: Drosha i Dicer,
kao i njihovi pomoćni proteini DGCR8 (eng. DiGeorge syndrome critical region gene 8) i TRBP (eng. TAR RNA
binding protein), imaju jedan ili više domena za prepoznavanje i vezivanje dvolančane RNK (plavi pravougaonici).
Drosha i Dicer imaju simetrične RNazne domene odgovorne za RNaza III endonukleolitičku reakciju. Drosha sadrži
još dva funkcionalna domena za protein-protein interakcije - domen P bogat Pro, i domen RS, bogat Arg i Ser. Dicer
sadrži još četri funkcionalna domena - domen PAZ, koji vezuje 3'-kraj pre-miRNK dugačak dva nt, i domene
nepoznate funkcije (DEAD-boks RNK helikazni domen, helikazni domen i domen DUF). Protein DGCR8 sadrži i
domen WW odgovoran za interakcije protein-protein. Veličina svakog proteina izražena je u broju aminokiselina.
Drosha i Dicer svoje funkcije obavljaju u kompleksu sa partner proteinima (kofaktorima) koji
sadrže vezivne domene za dvolančanu RNK (slika 3). Partneri Drosha su protein pasha kod D.
melanogaster i protein DGCR8 (eng. DiGeorge syndrome critical region gene 8) kod sisara. Partener
Dicera kod D. melanogaster je produkt gena loquacious i kod sisara protein TRBP (eng. TAR RNA
binding protein).
Pri-miRNK se savija u dvolančanu strukturu ukosnice koja sadrži dršku i kratku jednolančanu
petlju. Dvolančana bazno sparena drška je dugačka 33 bp (tri helijačna okreta dvolančane RNK) i sadrži
samo nekoliko pogrešno sparenih baza (slike 2b i 4a). Region drške sadrži dva funkcionalna dela: donji
deo, približne dužine 11 bp, i gornji deo, približne dužine 22 bp u kome se nalazi buduća zrela miRNK
(slike 4a i b). Na vrhu drške je petlja različite veličine (obično oko 10 nt), čija sekvenca nije bitna za
obradu.
U nukleusu, kompleks Drosha-DGCR8, poznat i kao mikroprocesorski kompleks, uvodi dva
prekida u pri-miRNK oslobaĎajući samu strukturu ukosnice, koja predstavlja pre-miRNK (slika 4). Za
obradu kompleksom Drosha-DGCR8 neophodn je jednolančani region RNK koja ograničava 5'- i
3'-krajeve drške i dvolančana drška. Granica jednolančane i dvolančane RNK u pri-miRNK odreĎuje
mesto sečenja, jer Drosha uvodi prekide na mestima koja su po 11 bp udaljena od te granice, odnosno
izmeĎu gornjeg i donjeg funkcionalnog dela drške. Sa dva uvedena asimetrična prekida formira se
pre-miRNK dugačka oko 65 do 70 nt, koja je izgraĎena iz jednolančanog 3'-kraja dužine dva nt,
dvolančane drške dužine 22 bp i jednolančane petlje (slika 4b).
8
Slika 4. Obrada primarne miRNK (pri-miRNK) i prekursora miRNK (pre-miRNK) a) Pri-miRNK formira
strukturu ukosnice koja se sastoji od dvolančane drške dugačke ~33 bp i jednolančane petlje. Dvolančana drška je
izgraĎena od dva funkcionalna domena: donjeg od ~11 bp i gornjeg od ~22 bp. b) Drosha se zajedno sa proteinom
DGCR8 vezuje za pri-miRNK i uvodi dva asimetrična jednolančana prekida u dršci i to 11 nt od granice
jednolančane i dvolančane RNK, formirajući prekursor miRNK (pre-miRNK). Pre-miRNK je dugačka ~65 do 70 nt
i izgraĎena je iz jednolančanog 3'-kraja dužine dva nt, dvolančane drške dužine 22 bp i jednolančane petlje; c)
Trodimenzionalna struktura Dicera podseća na sekiru: kraj drške sekire predstavlja domen PAZ, koji prepoznaje
jednolančani 3'-kraj dužine dva nt u pre-miRNK, dršku sekire sadrži vezivnu površinu za RNK, dok je sečivo
predstavljeno sa dva simetrična RNazna domena.
Pre-miRNK se transportuje u citoplazmu pomoću eksportina 5 (slika 1), gde dolazi do druge
endonukleazne reakcije katalizovane kompleksom Dicerom-TRBP. Trodimenzionalna struktura Dicera
podseća na sekiru (slika 4c). Domen PAZ je na kraju drške sekire, gde formira vezivni džep za
jednolančani 3' kraj pre-miRNK. Region izmeĎu domena PAZ i RNaznih domena formira dršku sekirice,
i sadrži pozitivno naelektrisanu vezivnu površinu za RNK. "Sečivo" sekire se sastoji od dva RNazna
domena, rasporeĎenih kao simetričan dimer. Dicer deluje na dvolančanu RNK nezavisno od njene
sekvence, i uvodi dva jednolančana prekida na udaljenosti od 22 nt od njenog kraja.
Rezultat aktivnosti proteina Drosha i Dicer je dvolanĉana miRNK dužine od 21 do 23 bp, koja
ima jednolančane 3'-krajeve dužine dva nt, od kojih je jedan nastao aktivnošću Droshe, a drugi aktivnošću
Dicera. Jedan lanac iz dvolančane miRNK biće selektovan da bude funkcionalna jednolančana zrela
miRNK, dok će drugi lanac biti degradovan. Lanac koji postaje zrela miRNK označava se kao lanac
9
"vodiĉ", a onaj koji se degraduje kao lanac "putnik". Po opštem pravilu, lanac čiji se 5'-kraj nalazi u
termodinamički manje stabilnom delu dvolančane miRNK se selektuje da bude lanac "vodič".
Pored kanonskog, opisani su i alternativni putevi biogeneze pre-miRNK. Neki introni kod C.
elegans, D. melanogaster i sisara, nazvani mirtroni, u pogledu dužine i strukture u potpunosti
odgovaraju genu za miRNK. Njihova obrada ne zahteva učešće kompleksa Drosha-DGCR8, već se
samim njihovim iskrajanjem splajsozomom formira pre-miRNK (slika 1). TakoĎe, neke klase malih
nukleolarnih RNK (snoRNK) obraĎuju se alternativnim putevima do malih RNK koje deluju slično kao
miRNK.
MikroRNK sa AGO i drugim proteinima formiraju ribonukleoproteinske čestice označene kao
utišavajući kompleksi miRISC. Formiranje miRISC je obično povezano sa obradom pre-miRNK
pomoću Dicera, ali svi detalji procesa nisu poznati. Dvolančana miRNK nastala aktivnošću Dicera
inkorporira se u miRISC, zatim denaturiše kako bi nastao lanac "vodič". Lanac "putnik" ili biva
degradovan proteinom AGO ili se kompletan otklanja iz kompleksa miRISC i zatim degraduje.
Proteini familije Argonaut su visoko-specijalizovani proteini za vezivanje malih regulatornih
RNK. Ime su dobili po fenotipu AGO-knockout biljke A. thaliana koji podseća na krake hobotnice
Argonauta argo. Familija proteina Argonaut je visoko-konzervisana u sva tri domena živih bića.
Interesantno je da model organizam Saccharomyces cerevisiae nema proteine Argonaut i puteve RNKi.
Na osnovu homologije u sekvenci članovi familije proteina Argonaut dele se u dve velike
subfamilije. Prema srodnosti sa proteinom AGO1 A. thaliane jedna subfamilija se označava AGO, dok
se druga naziva PIWI po srodnosti sa proteinom PIWI Drosophile (videti kod piRNK). Subfamilija
proteina AGO kod sisara i čoveka sadrži četiri člana: AGO1, AGO2, AGO3 i AGO4. Oni se eksprimiraju
u svim ćelijama i asociraju sa različitim malim regulatorinim RNK.
Argonaut proteini su mali proteini (~100 kD) koji sadrže domene PAZ, PIWI i MID, i N-kraj koji
se odlikuje najvećom heterogenošću meĎu članovima (slika 5). Ključni domeni za RNKi su PAZ i PIWI.
Domen PAZ, kao i kod proteina Dicer, formira specifičan džep koji vezuje 3'-jednolančani kraj dužine
dva nt lanca "vodiča" iz dvolančane male regulatorne RNK. Domen PIWI je odgovoran za
endonukleolitičku aktivnost i sličan je bakterijskoj RNazi H, koja specifično seče RNK u hibridu
DNK-RNK. Dok komponente miRISC kompleksa nisu bile poznate, opisivalo se da on ima slicer
aktivnost. Nakon otkrtića domena PIWI proteina Argonaut, postalo je jasno da je slicer aktivnost vezana
za sam protein Argonaut. MeĎutim, domen PIWI kod svih proteina Argonaut nije endonukleolitički
kompetentan. MeĎu proteinima AGO sisara, samo AGO2 ima očuvanu endonukleaznu aktivnost. Domen
MID se nalazi izmeĎu domena PAZ i PIWI i formira specifičan džep koji vezuje 5'-fosfatni kraj male
regulatorne RNK. Pored vezivanja 3'-i 5'-kraja lanca "vodiča" male regulatorne RNK, Argonaut protein
uspostavlja intrakcije sa njenom šećerno-fosfatnom okosnicom, ostavljajući tako baze slobodnim da se
spare sa komplemantarnim bazama u ciljnoj RNK (slika 5). Ciljna RNK ne uspostavlja interakcije sa
proteinom Argonaut.
Ukoliko se miRNK perfektno spari sa ciljnom iRNK, ulogu efektora u miRISC ima sam protein
AGO, čiji domen PIWI katalizuje endonukleolitičku degradaciju iRNK. U slučaju neperfektnog baznog
sparivanja miRNK i ciljne RNK, efektornu ulogu ostvaruju proteini sa kojima AGO stupa u interakciju.
Naime, pored proteina AGO miRISC sadrže i druge proteine koji imaju funkciju efektora ili regulatora u
10
GW182 binding
posredovanju represivne ili aktivirajuće funkcije miRNK. Kod životinja, grupa proteina koja je, pored
proteina AGO, ključna za represiju posredovanu sa miRNK su proteini familije GW182 (eng. glycine-
tryptophan (GW) repeat-containing protein of 182 kDa). Oni stupaju u direktnu u interkaciju sa C-krajem
proteina AGO i deluju kao efektori translacione represije i destabilizacije iRNK. Jedan od proteina koji
deluje kao regulatorni faktor miRISC je FMRP (eng. fragile X mental retardation protein). FMRP je
RNK-vezivni protein za koji je poznato da moduliše translaciju, posebno u neuronima, i dovodi se u vezu
sa stimulacijom translacije pomoću miRISC.
Slika 5. Domenska organizacija proteina Argonaut i struktura kompleksa miRNK-AGO: a) Proteini Argonaut
sadrže domene PAZ, MID i PIWI, dok N-kraj pokazuje heterogenost izmeĎu članova familije. Domen PAZ
specifično prepoznaje i vezuje jednolančani 3'-kraj lanca "vodiča" miRNK. Domen MID vezuje 5'-fosfatni kraj lanca
"vodiča". Domen PIWI je sličan RNazi H i poseduje endonukleolitičku aktivnost, koja nije očuvana kod svih
članova. C-kraj proteina AGO uspostavlja interakcije sa proteinom GW182. b) Perfektno komplementarno
sparivanje miRNK iz kompleksa miRNK-AGO i ciljne iRNK dovodi do endonukleolitičkog sečenja iRNK.
2.3. Principi interakcije miRNK-iRNK i vezivna mesta za miRNK (MIR)
Interakcija miRNK sa ciljnom iRNK ostvaruje se baznim sparivanjem. Kod biljaka, većina miRNK se
skoro perfektno sparuje sa svojim ciljnim iRNK. Suprotno, kod metazoa miRNK se uglavnom
neperfektno sparuju sa ciljnim iRNK, prateći nekoliko pravila (slika 6a). Najznačajnije i najrigoroznije
pravilo podrazumeva perfektno i kontinuirano bazno sparivanje regiona miRNK izmeĎu nukleotida 2 i 8
sa ciljnom iRNK. Ovaj region miRNK označen je kao "seme" i ono započinje interakciju sa iRNK.
Adeninski ostatak u iRNK naspram pozicije 1 miRNK, ili adeninski ili uracilski ostaci naspram pozicije 9
miRNK poboljšavaju interakciju, iako nije neophodno da se spare sa miRNK. Sledeće pravilo je da
pogrešno sparene baze i izbočine mogu biti prisutne samo u centralnom regionu dupleksa miRNK-iRNK.
Na ovaj način onemogućava se endonukleolitičko sečenje sa proteinom AGO. Treće pravilo je postojanje
odreĎenog stepena komplementarnosti u 3'-polovini miRNK, kako bi se interakcija stabilizovala.
Pogrešno sparene baze i izbočine u ovom regionu se uglavnom tolerišu, iako ispravno bazno sparivanje,
posebno u regionu miRNK od nukleotida 13 do 16, postaje značajno kada podudaranje u regionu
"semena" nije optimalno.
Mnoge iRNK sadrže komplementarna ili parcijalno komplementarna mesta za veći broj miRNK,
koja se nazivaju miRNK-vezivna mesta (eng. microRNA response elements, MRE). Najveći broj
PIWI
11
bioinformatički predviĎenih i eksperimantalno dokazanih MRE nalaze se u 3'-netranslatirajućem regionu
(eng. untranslated region, UTR) (slika 6b), a reĎe u 5'-UTR-u ili čak u kodirajućim regionima.
Slika 6. Principi interakcije miRNK sa iRNK i vezivna mesta za miRNK (MRE) u iRNK: a) Region "semena"
od nukleotida 2 do 8 u miRNK je ključan za interakciju sa ciljnom iRNK. Adeninski ostatak u iRNK naspram
pozicije 1 miRNK, ili adeninski ili uracilski ostaci naspram pozicije 9 miRNK doprinose poboljšanju interakcije,
iako nije neophodno da se bazno spare sa miRNK. Pogrešno sparene baze i izbočine mogu biti prisutne samo u
centralnom regionu dupleksa miRNK-iRNK. 3'-kraj miRNK poseduje odreĎeni stepen komplementarnost sa ciljnom
iRNK. Ispravno bazno sparivanje, posebno u regionu miRNK od nukleotida 13 do 16, postaje značajno kada
podudaranje u regionu "semena" nije optimalno. b) Najveći broj miRNK-vezivnih mesta (MRE) nalazi se u
3'-UTR-u iRNK. Jedna iRNK sadrži MRE za veći broj istih i različitih miRNK, dok jedna miRNK može regulistati
na stotine ciljnih iRNK, što ukazuje na složenu post-transkripcionu regulaciju pomoću miRNK koja se ostvaruje u
okviru regulatornih mreža.
Dugački 3'-UTR eukariotskih gena sadrže brojne regulatorne elemente za koje se vezuju miRNK
i RNK-vezivni proteini. Regulatorni elementi predstavljaju platforme za asembliranje kompleksa
RNK-proteini i proteinskih kompleksa koji zajedno utiču na lokalizaciju, translaciju i stabilnost iRNK.
Kod metzoa, u 3'-UTR iRNK nalazi se veći broj broj MRE koji je su komplementaran ili parcijalno
komplementaran sa većim brojem miRNK. Uz to najveći broj MRE za pojedinačnu miRNK prisutan je u
većem broju kopija. Pokazano je da su višestruka MRE za istu ili razliĉite miRNK neophodna su za
efikasno utišavanje translacije (slika 6b). Kada se nalaze blizu jedno drugom, na udaljenosti od 10 do 40
nukleotida, MRE deluju kooperativno, tako da njihov zajednički efekat prevazilazi sumu pojedinačnih
efekata. Faktori koji doprinose manjem struktuisanju 3'-UTR iRNK čine MRE dostupnijim za intrakciju
sa miRNK. Na primer, regioni bogati parovima AU mogu poboljšati interakciju miRNK i iRNK i
doprineti efikasnijoj translacionoj represiji posredovanoj sa miRNK. U kodirajućim regionima, MRE su
manje efikasni, ali se smatra da korišćenje retkih kodona koji usporavaju napredovanje ribozoma čine
takva mesta dostupnijim za vezivanje miRNK. Asocijacija miRNK sa pojedinačnim ili višestrukim
vezivnim mestima u 5'-UTR može dovesti do aktivacije translacije.
Kao što je već napomenuto, post-transkripciona regulacija ekspresije gena sa miRNK je veoma
složena i ne samo da je jedna iRNK regulisana sa većim brojem miRNK, već i jedna miRNK reguliše cele
grupe ciljnih iRNK, koje broje na stotine, čak i hiljade transkripata, u okviru složenih regulatornih mreža.
2.4. Modeli utišavanja iRNK posredovani sa miRNK
Efekat miRNK na ciljnu iRNK zavisi od njihovog stepena komplementarnosti, tipa proteina AGO sa
kojim asocira miRNK i od partner-proteina iz kompleksa miRISC. Ukoliko se miRNK perfektno spari sa
iRNK indukuje se endonukleolitička degradacija iRNK katalizovana proteinom AGO, koji seče iRNK na
sredini perfektnog dupleksa miRNK-iRNK. Ukoliko je sparivanje miRNK i iRNK neperfektno dolazi do
represije translacije posredovane partner-proteinima iz miRISC.
12
2.4.1. Model endonukleolitičke degradacije iRNK
Kod biljaka i retko kod životinja, protein AGO iz kompleksa miRISC indukuje degradaciju ciljne iRNK
endonukleolitičkim sečenjem. Lanac "vodič" iz kompeksa miRISC se skoro perfektno bazno sparuje sa
ciljnom iRNK, a arhitektura kompleksa je takva da ovo vezivanje pozicionira aktivno mesto domena
PIWI tako da ono može da iseče ciljnu iRNK. Sečenje se dešava približno na sredini dupleksa
miRNK-iRNK, izmeĎu nukleotida 10 i 11 miRNK (slika 5b). MeĎu proteinima AGO sisara, samo AGO2
ima očuvanu endonukleaznu aktivnost, koji zbog ove osobine jedini učestvuje i u putu RNKi posredovane
sa siRNK.
Novija istraživanja ukazuju da miRNK biljaka mogu reprimirati translaciju bez efekta na
degradaciju ciljnih iRNK, što je slično mehanizmima represije translacije sa miRNK kod životinja.
2.4.2. Modeli utišavanja iRNK posredovani sa GW182 - translaciona represija i destabilizacija
Najveći broj miRNK životinja je samo delimično komplementaran svojim ciljnim iRNK, a u velikom
broju slučajeva proteini AGO nisu dovoljni da sami posreduju u translacionoj represiji. Najbolje proučene
komponente kompleksa miRISC koje imaju efektornu ulogu u utišavanju translacije su proteini familije
GW182.
Proteini familije GW182 stupaju u direktnu interakciju sa proteinima AGO i sa proteinima koji se
u citoplazmi vezuju za poli(A) rep (eng. poly(A) binding protein, cytoplasmic 1, PABPC1). Interakcija
GW182 sa PABPC1 reguliše ciljnu iRNK na dva načina (slika 8): 1) interferiranjem sa cirkularizacijom
iRNK smanjuje se efikasnost translacije i inhibira se inicijacije translacije zavisne od 5'-kape, što vodi
translacionoj represiji (i eventualnoj degradaciji iRNK) i 2) olakšavanjem deadenilacije iRNK, što
destabilizuje iRNK i pokreće put degradacije iRNK smera 5'3' zavisan od deadenilacije1. Da bi se
rezumeli ovi modeli potrebno je upoznati se sa domenskom organizacijom proteina PABPC1 i GW182.
Protein PABPC1 je visoko-konzervisani protein eukariota koji se vezuje za poli-A rep iRNK u
citoplazmi. Na N-kraju sadrži četri domena za prepoznavanje i vezivanje jednolančane RNK (eng. RNA
recognition motifs, RRM), označena kao RRM1-RRM4, zatim sledi nestruktuisani linker bogat prolinima,
i na C-kraju sadrži domen MLLE za interakciju sa proteinima (slika 7a). Prva tri domena RRM, pored
vezivanja za iRNK, služe za uspostavljanje interakcije sa eukariotskim inicijacionim faktorom 4G
(eIF4G), koji drugim svojim domenom uspostavlja interakciju sa eIF4E vezanim za 5'-kapu iRNK.
Rezultat interakcija PABPC1-eIF4G-eIF4E je cirkularizacija iRNK i stabilizacija vazivanja eIF4E za
5'-kapu (slika 7a). Nastala kružna struktura iRNK stimuliše translaciju i štiti krajeve iRNK od
degradacije. Sa druge strane, PABPC1 služi i kao platforma za regrutovanje brojnih proteina uključenih u
1 Putevi degradacije iRNK u citoplazmi zavisni od deadenilacije - Degradacija najvećeg broja iRNK
započinje skraćivanjem poli(A) repa, označenom kao deadenilacija. Deadenilacija je katalizovana kompleksom
deadenilaza koje su 3’5’ egzoribonukleaze. Skraćivanje poli(A) repa destabilizuje iRNK narušavajući njenu
kružnu strukturu i čineći krajeve iRNK dostupnim enzimskim mašinerijama za degradaciju iRNK koje deluju ili sa
5' ili sa 3'-kraja. U putu degradacije zavisnom od deadenilacije smera 5’3’, deadenilacija stimuliše otklanjanje
5’-kape linearizovane iRNP pomoću kompleksa enzima za otklanjanje 5’-kape (Dcp1-Dcp2), nakon čega sledi
egzonukleolitička degradacija nezaštićenog transkripta u smeru 5’3’ aktivnošću egzonukleaze (Xrn1). U putu
degradacije zavisnom od deadenilacije smera 3’5’, skraćivanje poli(A) repa čini iRNK dostupnu citoplazmatičnoj
formi egzozoma, kompleksu od devet egzonukleaza, koji degraduje iRNK u smeru 3’5’. Otklanjanje 5’-kape sa
kratkog fragmenta RNK nastalog nakon delovanja egzozoma vrši enzim DcpS.
13
N-GW M-GW C-GW
P-body targeting
regulaciji translacije i stabilnosti (deadenilacije) iRNK. Tako, proteini koji sadrže motive PAM1 (eng.
PABP-interacting motif 1) uspostavljaju interakciju sa prva tri domena RRM PABPC1 i kompetiraju sa
eIF4G, utičući na formiranje kružne strukture iRNK. Proteini koji sadrže motiv PAM2 (eng.
PABP-interacting motif 2) uspostavljaju interakciju sa domenom MLLE, što redukuje afinitet PABPC1 za
poli(A) rep, čineći ga dostupnijim delovanju deadenilaza.
Slika 7. Domenske organizacije proteina PABPC1 i GW182: a) PABPC1 sadrži četiri konzervisana motiva za
prepoznavanje RNK (eng. RNA recognition motifs, RRM) na N-kraju (RRM1-4), nestruktuisani linker bogatim
prolinom, i konzervisani MLLE domen na C-kraju. Prva tri domena RRM stupaju u interakciju i sa eukariotskim
inicijacionim faktorom 4G (eIF4G) i proteinima koji sadrže domen PAM1(eng. PABP-interacting motif).
Interkacijom PABPC1 sa eIF4G, koji je vazan za eIF4E, uspotavalja se kružna struktura iRNK. Kompeticija eIF4G
sa proteinima koji sadrže PAM1 može naruštiti kružnu strukturu iRNK, neophodnu za efikasnu translaciju i
stabilnost iRNK. Proteini koji sadrže motiv PAM2 stupaju u intrakciju sa domenom MLLE, što redukuje afinitet
PABPC1 za poli(A) rep čineći ga dostupnijim delovanju deadenilaza. b) Proteini GW182 sastoje se iz četri
nestruktuisana regiona i dva strukturna domena. Nestruktuisani regioni su N-GW, M-GW i C-GW, koji redom
predstavljaju N-terminalni, središnji i C-terminalni region sa ponovljenim motivima GW (Gly-Trp), i region bogat
glutaminom (Q). IzmeĎu ovih regiona nalaze se dva strukturna domena: domen asociran sa ubikvitinom (domen
UBA) i motiv za prepoznavanje RNK (domen RRM). Za reprsesiju iRNK bitni su: N-GW koji stupa u interakciju sa
proteinom AGO, i bipartitni region za utišavanje na središnjem i C-kraju koji sadrže motive za interakciju sa
PABPC1: motiv sličan sa PAM2 i motiv sličan sa PAM1. Region koji uključuje N-GW, domen UBA i region bogat
glutaminom odgovoran je za usmeravanje GW182 proteina u P tela.
Proteini GW182 imaju karakterističnu strukturu koja se sastoji iz četiri nestruktuisana regiona i
dva strukturna domena (slika 7b). Nestruktuisani regioni su N-GW, M-GW i C-GW, koji redom
predstavljaju N-terminalni, središnji i C-terminalni region sa ponovljenim motivima GW (Gly-Trp), i
region bogat glutaminom (Q). IzmeĎu ovih regiona nalaze se dva strukturna domena: centralni domen
asociran sa ubikvitinom, označen kao UBA, i domen RRM za prepoznavanje i vezivanje jednolančane
RNK na C-kraju.
Dva regiona proteina GW182 imaju esencijalnu ulogu u utišavanju ciljne iRNK u putu miRNK:
1) domen N-GW, koji direktno vezuje C-kraj proteina AGO (slika 6) i 2) bipartitni domen za utišavanje
na središnjem i C-kraju, koji promoviše narušavanje kružne strukture iRNK i destabilizaciju ciljnih
14
iRNK. U okviru bipartitnog domena za utišavanje nalaze se dva motiva koja mogu uspostaviti interkciju
sa dva različita regiona proteina PABPC1 (slika 7b). U regionu M-GW nalazi se motiv koji pokazuje
sličnost sa PAM2, i vezuje se za domen MLLE u PABPC1. U zadnjem delu regiona M-GW i u regionu
C-GW nalazi se manje definisana sekvenca koja funkcionalno imitira motiv PAM1. Motiv sličan PAM1
posreduje u vezivanju proteina GW182 za motive RRM u PABPC1.
Slika 8. Utišavanje iRNK sa miRICS posredovano sa GW182. PAM1 motiv (C) iz bipartitnog domena za
utišavanje GW182 kompetira sa eIF4G za vezivanje RRM domena u PABPC1. Kada se GW182 veže za RRM
domene u PABPC1 narušava se kružna strukture iRNK, što vodi do represije translacije, i na kraju mogućoj
degradaciji iRNK. PAM 2 motiv(M) iz bipartitnog domena za utišavanje GW182 uspostavlja interakciju sa
domenom MLLE iz PABPC1, čime se formira platforma za vezivanje deadenilaza (kompleks CAF1-CCR4-NOT),
što destabilizuje iRNK, i krajnje reprimira translaciju. Naime, deadenilacija je praćena otklanjanjem 5'-kape pomoću
DCP2 i egzonukleolitičkom degradacijom u smeru 5'3' pomoću proteina XRN1. Protein DCP2 zahteva dodatne
proteine za potpunu aktivnost i/ili stabilnost, kao što su protein DCP1, pojačivač za otklanjanje 5'-kape 4 (eng.
enhancer of decapping 4, EDC4) i RNK helikaza DDX6 (eng. DEAD-box protein 6).
Činjenica da bipartitni domen za utišavanje proteina GW182 stupa u interakciju i sa N- i sa
C-domenima PABPC1 ukazuje da kompleks miRNK-AGO-GW182 interferira sa funkcijom PABPC1 u
cirkularizaciji i stabilizaciji iRNK korišćenjem dva modela (slika 8). Jedan model predviĎa da proteini
GW182 i eIF4G kompetiraju za motive RRM na N-kraju PABPC1. Ukoliko se za RRM motive PABPC1
veže bipartitni domen GW182 narušava se kružna struktura iRNK, što rezultuje smanjenom efikasnošću
translacije, doprinosi inhibiciji inicijacije translacije i krajnje smanjuje stabilnost iRNK (slika 8).
Smanjena stabilnost iRNK vezana je za činjenicu da je linearizovana iRNK dostupnija sistemima za
degradaciju iRNK koji deluju sa njenih krajeva.
Drugi model predviĎa interakciju bipartitnog domena GW182 sa domenom MLLE u PABPC1
(slika 8). Smatra se da ova interakcija redukuje afinitet PABPC1 za poli(A) rep, čineći ga dostupnijim
delovanju deadenilaza. Naime, slično nekim drugim proteinma koji poseduju motiv PAM2, i interakcija
PAM2 motiva GW182 sa PABPC1 stvara platformu za vezivanje deadenilaza, iako kružna struktura
iRNK nije narušena. Deadenilacija dalje aktivra put degradacije iRNK smera 5'3' zavisnog od
deadenilacije, koji podrazumeva otklanjanjem 5'-kape pomoću enzima za otklanjanje 5'-kape i
egzonukleolitičku degradaciju u smeru 5'3' pomoću proteina egzoribonukleaze (slika 8). Efekti i jednog
i drugog modela su smanjenje efikasnosti translacije ciljne iRNK i smanjenje njene stabilnosti, usled čega
se iRNK degraduje.
15
Komponente kompleksa miRISC (uključujući miRNK, AGO i GW182) i reprimirane iRNK
lokalizuju u P telima, ribonukleoproteinskim citoplazmatičnim granulama u kojima se čuvaju i degraduju
translaciono reprimirane iRNK. Protein GW182 je jedna od osnovnih komponenti P tela, koja se po
njemu označavaju i kao GW tela, a ujedno je važan i za efikasnu represiju translacije sa miRNK.
2.4.3. Drugi modeli translacione represije sa miRNK
Utišavanja iRNK sa miRISC posredovano sa GW182 predviĎa takvu represiju translacije i smanjenje
stabilnosti iRNK, što krajnje vodi njenoj degradaciji. MeĎutim, prema eksperimentalnim podacima nivo
iRNK utišanih sa miRNK može biti skoro nepromenjen. Ovi rezultati ukazuju da se translaciona represija
može desiti i bez značajnije degradacije iRNK, i da bi mogla uključivati mehanizme koji inhibiraju sam
proces translacije. Još uvek nije poznato da li se ovi efekti miRNK ostvaruju tokom inicijacije i/ili u
koracima nakon incijacije translacije. Više eksperimentalnih podataka podržava model inhibicije
transalcije u koraku inicijacije.
Slika 9. Domenska organizacija proteina AGO2 ĉoveka sa potencijalnim domenom za vezivanje 5'-kape. AGO2 sadrži domen DUF (nepoznate funkcije), domen PAZ (specifično prepoznaje i vezuje 3'-kraj lanca vodiča
miRNK) i domen PIWI (domen sličan RNazi H koji je endonukleolitički kompetentan). Region koji razdvaja
domene PAZ i PIWI sadrži dve aromatične aminokiseline (fenilalanin na pozicijama 470 i 505) u kojima mutacije
sprečavaju represiju translacije.
Model po kome miRNK dovode do inhibicije translacije u koraku inicijacije potiče iz
eksperimenata koji su pokazali da je funkcionalna 5'-kapa esencijalna za represiju translacije sa miRNK.
Poznato je da mnogi faktori koji se vezuju za 3'-UTR iRNK inhibiraju incijaciju translacije regrutovanjem
proteina koji ometaju interakciju eIF4E-eIF4G ili direktno vezuju 5'-kapu. Faktori koji dirketno vezuju
5'-kapu su u kompeticiji sa eIF4E i ne stupaju u interkaciju sa eIF4G, što vodi inhibiciji incijacije
translacije. Takav faktor bi mogao biti protein AGO2, jer njegov centralni domen pokazuje ograničenu
homologiju sa regionom proteina eIF4E koji vezuje 5'-kapu, uključujući dva ključna aromatična
aminokiselinska ostatka (slika 9). Model inhibicije incijacije translacije vezivanjem AGO za 5'-kapu
može objasniti potrebu za većim brojem miRISC kako bi se postiglo značajno utišavanje translacije sa
miRNK: veći broj miRISC, u okviru kojih se nalazi AGO2 sa manjim afinitetom za 5'-kapu u odnosu na
eIF4E, bi povećao verovatnoću asocijacije AGO2 sa 5'-kapom. MeĎutim, ovaj model je doveden u pitanje
eksperimantima koji su pokazali da mutacije dva aromatična ostatka u AGO2 interferiraju sa interakciom
AGO sa GW182, koja je neophodna za translacionu represiju posredovanu sa miRNK.
Neki eksprimentalni podaci su pokazali da se u izolovanim kompleksima miRICS-iRNK nalaze
40S subjedinice ribozoma, što je ukazalo da bi miRNK mogle inhibirati incijaciju translacije
sprečavanjem vezivanja 60S subjedince ribozoma nepoznatim mehanizmom (slika 10).
16
Slika 10. Modeli utišavanje iRNK sa miRNK: (gornji levi deo slike) miRISC vezan za 3'-UTR iRNK može
narušiti kružnu strukturu iRNK ili destabilizovati iRNK usled interkacije proteina GW182 iz miRISC sa PABPC1
vezanim za poli(A) rep iRNK. (donji levi deo slike) miRISC može inhibirati inicijaciju translacije u koraku
prepoznavanja 5'-kape ili u koraku pridruživanja 60S subjedinice ribozoma. Utišana iRNK se povlači u
citoplazmatične RNK granule (P tela), gde se degraduje ili čuva dok opet ne bude potrebna ćeliji. (slika dole desno)
Represija translacije sa miRISC bi se mogla desiti i nakon inicijacije translacije, usled usporene elongacije ili
spadanja ribozoma. (slika desno gore) miRNK bi mogla reprimirati translaciju pokretanjem proteolitičke degradacije
rastućeg polipeptida, nazavisno od degradacije proteazomom. Od navedenih modela, ekspreimntalni dokazi postoje
samo za utišavanje iRNK posredovano sa GW182 iz miRISC.
Kosedimentacija značajne frakcije miRNK ili proteina AGO sa polizomima u mnogim studijama
podržava pretpostavku da bi inhibicija translacije sa miRNK mogla da se ostvaruje i u koracima nakon
inicijacije transalcije, za sada nepoznatim mehanizmima. Predloženi je da bi miRISC mogao da dovede
do usporavanja elongacije transalcije ili do spadanja ribozoma sa iRNK (eng. ribosome drop off)
posredovani (slika 10). TakoĎe, predloženo je da bi miRISC mogao da regrutuje proteazu koja bi brzo
degradovala rastuće polipetide (slika 10). Ovaj model bi uključivao aktivnost nepoznate proteazu jer je
pokazano da inhibitori proteazoma nemaju efekat na represiju translacije posredovano sa miRNK.
MeĎutim, treba istaći da je represija ciljne iRNK sa jednom miRNK generalno samo parcijalna, tako da
vezivanje jednog kompleksa miRISC za iRNK često nema efekat na represiju transalcije. Stoga,
kosedimentacija miRISC sa polizomima ne mora neophodno da ukazuje na represiju nakon incijacije
translacije, već može odražavati neefikasnu asocijaciju miRISC sa iRNK, tako da iRNK podeleže
produktivnoj translaciji.
17
2.5. MikroRNK kao aktivatori transalcije
Iako prihvaćene kao opšti post-transkripcioni represori, miRNK u izmenjenim fiziološkim uslovima
mogu aktivirati ili stimulisati translaciju.
Regulacija translacije sa nekim miRNK može oscilirati izmeĎu represije i aktivacije u zavisnosti
od stanja ćelijskog ciklusa uslovljenog fiziološkim uslovima. Kada se ćelija normalno deli odreĎene
miRNK imaju funkciju represora translacije, a kada se ćelija zarobi u G1 fazu imaju funkciju aktivatora
translacije (slika 11). U kulturama ćelija sisara pokazano je da 3'-UTR iRNK za TNF-α (eng. tumor-
nekrosis factor α) stimuliše translaciju u uslovima nedostatka hranljivih sastojaka i faktora rasta, što
dovodi do zarobljavanja ćelija u G1 fazu. Ova stimulacija translacije je zavisna od miRNK miR369-3 i
proteina AGO2. U istim uslovima, u odsustvu miR369-3 ne dolazi do stimulacije translacije. U uslovima
kada se ćelijski ciklus normalno odvija miR369-3 reprimira translaciju iRNK za TNF-α.
Smatra se da fiziološki uslovi utiču na regrutovanje komponenti miRISC koje mogu promeniti
efekat miRNK. U normalnim fiziološkim uslovima miRISC regrutuje represivne partnere, kao što je
GW182. Kada je ćelija zarobljena u G1 fazu ćelijskog ciklusa kompleks miRNK-AGO regrutuje protein
FXR1 (eng. Fragile X Mental Retardation, Autosomal Homolog) i stimuliše se translacija (slika 11). Da li
se na kompleks miRNK-AGO regrutuju i drugi aktivatori i da li represivni partneri napuštaju kompleks
nije poznato.
Slika 11. Dvostruka funkcija miRNK u regulaciji transalcije. Ista miRNK može reprimirati ili aktivirati
translaciju ciljne iRNK u zavisnosti od fizioloških uslova. Fiziološki uslovi utiču na regrutovanje partner-proteina u
miRISC. U normalnim uslovima u miRISC regrutuje se GW182 koji promoviše represiju translacije, tako da
miRNK deluju kao represori translacije. U izmenjenim fiziološkim uslovima koji dovode do zarobljavanja ćelije u
G1 fazu ćelijskog ciklusa, u miRISC regrutuje se FXR1 (eng. Fragile X Mental Retardation, Autosomal Homolog) i
stimuliše se transalcija ciljne RNK, tako da miRNK deluju kao aktivatori translacije.
MikroRNK koje se vezuju za 5'-UTR ciljnih iRNK takoĎe mogu stimulisati translaciju, ali
korišćenjem drugačijeg mehanizma. Informacione RNK za komponente transalcione mašinerije
(ribozomske proteine i translacione faktore) u 5'-UTR sadrže regulatorne sekvence TOP (eng. 5'-terminal
oligopyrimidine tract). One vezuju specifičan protein (TIA-1/TIAR), koji reprimira njihovu transalciju u
uslovima nedostatka aminokiselina. Neposredno nizvodno od sekvence TOP u ovim iRNK nalazi se
vezivno mesto za miR10a. U normalnim uslovima, miR10a je vezana za 5'-UTR ovih iRNK i verovatno
18
sprečava vezivanje represornih proteina TIA-1/TIAR za TOP sekvence, čime stimuliše njihovu
translaciju. Interesantno je da vezivanje miR10a za 5'-UTR iRNK koje sadrže TOP sekvence izgleda ne
prati uobičajna pravila interakcije regiona "semena" miRNK sa iRNK.
Aktivacija translacije sa miRNK u opisanim primerima dešava se na specifičnim iRNK i pod
odreĎenim uslovima u ćeliji, što ukazuje da je reč o specijalizovanom i regulisanom procesu. Smatra se da
aktivacija translacije sa miRNK nije opšti mehanizam u ćelijama koje se ne dele i u normalnim
fiziološkim uslovima. Male regulatorne RNK koje imaju funkciju i represora i aktivatora ekspresije
ciljnih gena mogle bi, pored miRNK da obuhvate i siRNK i piRNK.
2.6. Regulacija miRNK i proteina miRISC
Regulacija ekspresije miRNK je prostorno i vremenski precizno regulisana. Glavni modulatori ekspresije
miRNK se proteini ADAR, koji katalizuju editovanje A-u-I u pri- i pre-miRNK (videti kod Editovanja
RNK). Nivo koncentracije efektornih miRNK reguliše se kompetirajućim endogenim RNK (iRNK,
transkriptima pseudogena, lnc RNK, kružnim RNK), koje funkcionišu kao "endogeni" sunĎeri za miRNK
(videti kod Kompetirajućih endogenih RNK).
Proteini AGO imaju specifičan obrazac ekspresije, specifične partner proteine i specifične
biohemijske osobine. Iako se malo se zna o reguaciji miRISC, sve je više podataka da reverzibilne
post-trasnlacione modifikacije imaju ulogu u regulaciji aktivnosti osnovnih komponenti kompleksa.
Poznato je da proteini AGO, PIWI i GW182 podležu reverzibilnoj post-translacionoj fosforilaciji.
Da bi obavile svoju funkciju, ne samo da je potrebno da se odreĎena miRNK i proteinske
komponenete miRISC regulisano eksprimiraju, već odreĎena miRNK mora asocirati sa specifičnim
komponentama miRISC. Zbog toga se danas intenzivno istražuje sortiranje malih regulatornih molekula
RNK u odnosu na AGO proteine, odnosno šta i kako odreĎuje specifičnost interakcije odreĎene
regulatorne RNK sa odreĎenim proteinom familije Argonaut.
KLJUĈNI KONCEPTI
Regulatorne RNK su novootkrivena klasa molekula RNK koja je esencijalna u kontroli svih nivoa ekspresije
genoma eukariota. Formiraju složenu regulatornu mrežu koja funkcioniše paralelno sa regulatornom mrežom
proteina. Dele se na male nekodirajuće RNK i duge nekodirajuće RNK.
Male nekodirajuće RNK su dužine 20 do 30 nt, prepoznaju komplementarnu sekvencu u ciljnim RNK i kroz
interakciju sa proteinima familije Argonaut regulišu invazivne nukleinske kiseline (virusne RNK i transpozone),
post-transkripcionu ekspresiju genoma i epigenetičku memoriju.
Familija proteina Argonaut je visoko-konzervisna i specijalizovana za vezivanje i funkcionisanje malih
nekodirajućih RNK. Poseduju domene za vezivanje malih RNK i domen PIWI sa endonukleaznom aktivnošču, koja
nije očuvana kod svih članova. Obuhvata dve subfamilije: AGO i PIWI.
Male nekodirajuće RNK sa proteinima Argonaut formiraju utišavajući kompleks (RISC), u okviru koga male RNK
komplementarnim sparivanjem prepoznaju ciljne nukleinske kisleine, a proteini Argonaut obavljaju efektornu
funkciju i/ili regrutuju proteine koji obavaljaju efektornu funkciju.
Represija ili utišavanje ciljnih nukleinskih kiselina kompeksom RISC naziva se RNK interferencija (RNKi). RNKi
se ostvaruje na post-transkripcionom nivou, kada reguliše stabilnost i translaciju ciljnih RNK, i na epigenetičkom
nivou, kada vrši utišavanje koje zahteva aktivnu transkripciju ciljnih regiona genoma. Smatra se da je RNKi
19
evoluirala kao efikasan imunski sistem za odbranu od endogenih i egzogenih invazivnih nukleinskih kiselina kod
prokariota i eukariota, a da je kasnije prilagoĎena i regulatornim funkcijama u ekspresiji genoma eukariota.
Male nekodirajuće RNK se na osnovu biogeneze, proteina Argonaut sa kojima stupaju u interakciju, mehanizmima
kojima ostvaruju RNKi i funkcijama koje obavljaju dele u tri klase: male-interferirajuće RNK (siRNK), mikroRNK
(miRNK) i RNK koje stupaju u interkaciju sa proteinima PIWI (piRNK).
MikroRNK (miRNK) su dugačke 21 do 23 nt, nastaju obradom jednolančanog prekursora u obliku ukosnice
delovanjem ednonukleaza Drosha i Dicer, asociraju sa proteinima AGO i esencijalne su za post-transkripcionu
regulaciju ekspresije gena u svim aspektima funkcionisanja eukariotske ćelije. Mutacije u putu miRNK dovode do
poremećaja razvića, i često su letalne za embrion.
Jednolančani prekursor miRNK naziva se primarna miRNK (pri-miRNK) i prepisuje se sa samostalnih gena za
miRNK ili sa gena za miRNK koji su delovi gena za proteine, duge nekodirajuće RNK ili pseudogena. Pri-miRNK
formira strukturu ukosnice i u nukleusu se obraĎuje sa Drosha do prekurskora miRNK (pre-miRNK). Pre-miRNK se
transportuje u citoplazmu i obraĎuje sa Dicer do dvolančane miRNK. Ona se udružuje sa jednim od proteina AGO i
dodatnim proteinima, formirajući kompleks miRISC. U kompleksu miRISC jedan lanac miRNK se selektuje da
postane zrela miRNK, a drugi lanac se degraduje.
Kompleks miRISC reguliše post-transkripcionu ekspresiju gena endonukleolitičkom degradacijom, destabilizacijom,
translacionim represijom (i aktivacijom) ciljne iRNK. Ukoliko je miRNK perfektno komplementarna ciljnoj RNK i
asocirana sa endonukleolitički kompetentnim proteinom AGO, ciljna iRNK se degraduje aktivnošću AGO. Ukoliko
miRNK nije perfektno komplementarna sa ciljnom iRNK, dolazi do njene destabilizacije ili translacione represije.
Kod životinja, u kompleksu miRISC koji dovodi do transalcione represije i destabilizacije ciljne iRNK efektornu
ulogu ima protein GW182, koji stupa u interakciju sa proteinom AGO i proteinom vezanim za pol(A) rep iRNK
(PABPC1). Jednim delom bipartitnog domena za utišavanje GW182 kompetira sa PABPC1 za interakciju sa
eukariotskim incijacionim faktorom 4G (eIF4G), što može narušiti kružnu strukturu iRNK vodeći do represije
translacije, i eventualno do degradacije iRNK. Drugim delom bipartitnog domena za utišavanje GW182 vezuje deo
PABPC1 važan za stabilzaciju njegove interkcije sa poli(A) repom, čime se olakšava vezivanje deadenilaza, dolazi
do destabilizacije iRNK i njene degradacije. U zavisnosti od fizioloških uslova i stanja ćelijskog ciklusa jedna
miRNK može delovati kao represor ili aktivator translacije. Aktivacija translacije u izmenjenim fizološkim
uslovima, kada dolazi do zarobljavanja ćelije u G1 fazu ćelijskog ciklusa, posredovana je zamenom represivnih
partnera kompleksa miRISC sa partnerima koji aktiviraju translaciju.
Vezivna mesta za miRNK u iRNK (MRE) uglavnom se nalaze u 3'-UTR, a reĎe u 5'-UTR ili kodirajućem regionu.
Jedna iRNK može imati veći broj MRE za jednu ili različite miRNK, dok jedna miRNK može regulisati na stotine
iRNK. Ovakava interakcija miRNK i iRNK ukazuje da MRE mogu delovati kooperativno, i da se
post-transkripciona regulacija sa miRNK ostvaruje u složenim regulatornim mrežama.
Regulacija ekspresije miRNK je prostorno i vremenski precizno regulisana. Glavni modulatori ekspresije miRNK su
proteini ADAR koji katalizuju editovanje A-u-I u pri- i pre-miRNK. Nivo koncentracije efektornih miRNK u
citoplazmi reguliše se kompetirajućim endogenim RNK (iRNK, transkriptima pseudogena, lnc RNK, kružnim
RNK), koje deluju kao "endogeni" sunĎeri za miRNK. Proteini AGO imaju specifičan obrazac ekspresije, a njihova
funkcija, kao i funkcija drugih komponenti miRISC reguliše se revezibilnim post-translacionim modifikacijama.
PITANJA
1. Šta su regulatorni molekuli RNK, koja je njihova funkcija i kako se dele?
2. Šta su male nekodirajuće RNK, kako se dele i na osnovu kojih osobina?
3. Šta je RNK interferencija i kojim mehanizmima se ostvaruje?
4. Kojim mehanizmima RNK interferncija ostvaruje regulaciju ekspresije gena na post-transkripcionom nivou?
5. Kojim mehanizmima RNK interferncija ostvaruje regulaciju epigenetičke memorije?
6. Koje su osnovne komponente utišavajućeg kompleksa RISC i koje funkcije obavljaju u RNK interferenciji?
7. Šta su miRNK i koje biološke procese regulišu?
20
8. Opišite biogenezu miRNK i formiranje kompleksa miRISC?
9. Opišite mehanizme kojim miRNK utišavaju ciljne iRNK.
10. Kako su regulisane miRNK?